Summary
क्रिटिकल लिफ इस्केमिया (सीएलआई) में बाधित जहाजों की एंजियोप्लास्टी के बाद भी निचले अंग विच्छेदन हो सकते हैं। मोनोन्यूक्लियर प्रोजेनिटर सेल (एमपीसी) संवहनी मरम्मत को दर्शाते हैं। वर्तमान प्रोटोकॉल एंजियोप्लास्टी के करीब परिसंचरण से एमपीसी के परिमाणीकरण और एंडोथेलियल डिसफंक्शन और निचले अंग विच्छेदन की भविष्यवाणी के साथ इसके संबंधों का वर्णन करता है।
Abstract
क्रिटिकल लिंब इस्केमिया (सीएलआई) परिधीय धमनी रोग के एक उन्नत चरण का प्रतिनिधित्व करता है। एंजियोप्लास्टी निचले अंग में रक्त प्रवाह में सुधार करती है; हालांकि, कुछ रोगियों को अपरिवर्तनीय रूप से अंग विच्छेदन के लिए प्रगति । संवहनी क्षति की सीमा और संवहनी मरम्मत के तंत्र एंजियोप्लास्टी के बाद के परिणाम को प्रभावित करने वाले कारक हैं। मोनोन्यूक्लियर प्रोजेनिटर कोशिकाएं (एमपीसी) संवहनी क्षति और मरम्मत के लिए प्रतिक्रियाशील होती हैं, जिसमें संवहनी रोगों को प्रतिबिंबित करने की क्षमता होती है। वर्तमान प्रोटोकॉल एंजियोप्लास्टी साइट के करीब पोत से रक्त परिसंचरण से प्राप्त एमपीसी के मात्राकरण के साथ-साथ सीएलआई के साथ रोगियों में एंजियोप्लास्टी के बाद अगले 30 दिनों में एंडोथेलियल डिसफंक्शन और अंग विच्छेदन के लिए इसकी भविष्य कहनेवाला क्षमता के साथ अपने संबंधों का वर्णन करता है ।
Introduction
परिधीय धमनी रोग (पैड) रक्त की आपूर्ति की सीमा के साथ एक पुरानी और प्रगतिशील संवहनी बाधा की विशेषता है1। वैश्विक स्तर पर, निचले अंगों का पैड लगभग 10% बुजुर्ग आबादी को प्रभावित करता है, जबकि ऐसे मामलों का 7% तक अंग विच्छेदन2,3 में प्रस्तुत कियाजाताहै।
क्रिटिकल लिम्ब इस्केमिया (सीएलआई) पैड1की सबसे गंभीर प्रस्तुति का प्रतिनिधित्व करता है । रोगी आमतौर पर आराम, अल्सर, या गैंग्रीन में दर्द का अनुभव करते हैं जो ओक्लाइड धमनियों के कारण होते हैं; जबकि क्लीनिकल रोग का निदान प्रतिकूल है और 1 वर्ष 3 , 4,5के दौरान अंग विच्छेदन और मृत्यु दर के30%जोखिम से चिह्नित है .
एंजियोप्लास्टी एक न्यूनतम आक्रामक एंडोवैस्कुलर प्रक्रिया है जो सीएलआई के रोगियों में निचले अंग में रक्त प्रवाह को बहाल कर सकती है; हालांकि, कुछ रोगियों को अनिवार्य रूप से प्रमुख अंग विच्छेदन की आवश्यकता होगी, यहां तक कि एंजियोप्लास्टी थेरेपी1,5केबाद . चिकित्सा प्रवर्तन की संभावना के कारण एंजियोप्लास्टी के बाद प्रतिकूल परिणामों की प्रारंभिक पहचान काफी मूल्यवान है।
पारंपरिक जोखिम कारक एंजियोप्लास्टी6से गुजर रहे सीएलआई वाले रोगियों में प्रमुख अंग विच्छेदन के लिए सीमित भविष्य कहनेवाला क्षमता प्रदान कर सकते हैं । रोगविज्ञान उन्मुख बायोमार्कर संभावित नैदानिक अनुप्रयोगों के साथ उपन्यास विधियों का प्रतिनिधित्व करते हैं, जिसके परिणामस्वरूप विशेष रूप से संवहनी चोट7से संबंधित रोगों में उपयोगी हो सकता है। आजकल, एथेरोस्क्लेरोटिक पट्टिका की साइट पर एंडोथेलियल मरम्मत गुणों के मालिक सेलुलर आबादी की भागीदारी को तेजी से8,9मान्यता दी गई है।
मोनोन्यूक्लियर प्रोजेनिटर सेल (एमपीसी) बोन मैरो और संवहनी पुनर्योजी क्षमताओं के साथ स्टेम कोशिकाओं की अपनी संरचनात्मक और कार्यात्मक विशेषताओं से प्राप्त होते हैं। एमपीसी की पैदा करने की क्षमता के कारण, माइग्रेट करें और संवहनी पालन दिखाएं; इन कोशिकाओं को इस्केमिया10 , 11,12के जवाब में एंडोथेलियल रिपेयर को प्रतिबिंबित करने के लिए अच्छे उंमीदवार बन गए हैं . इसके अलावा, संवहनी चोट अंतर्निहित तंत्र में निरंतर रुचि ने स्थानीय होने वाले बायोमार्कर की शकुन भूमिका की खोज करने के लिए प्रेरित किया है, क्योंकि उन्हें संवहनी क्षति को प्रतिबिंबित करने और7,13, 14की मरम्मत करने के लिए मानाजाताहै।
वर्तमान अध्ययन का उद्देश्य यह वर्णन करना है कि एमपीसी की मात्रा का निर्धारण कैसे किया जाए जो सीएलआई के साथ एंजियोप्लास्टी के साथ रोगियों में संवहनी बाधा के करीब प्रसारित होता है; और एंडोथेलियल डिसफंक्शन और अंग विच्छेदन के संकेतकों के साथ एमपीसी के बीच संबंध का मूल्यांकन कैसे करें।
comorbidities और आंतरिक संवहनी सुविधाओं के आधार पर पूर्वानुमान की तुलना में, स्थानीय एमपीसी की मात्रा एंडोथेलियल दोष और अंग विच्छेदन के बारे में नैदानिक परिणाम की भविष्यवाणी करने की विशिष्ट क्षमता दिखाती है। लगातार, कुछ अध्ययनों ने पैड15,16वाले रोगियों के मूल्यांकन के दौरान समान बायोमार्कर की शकुन भूमिका का वर्णन किया है ।
पिछले परिणामों के आधार पर7,यहां वर्णित विधि कई नैदानिक सेटिंग्स में प्रतिकूल संवहनी परिणामों के खतरे में जनसंख्या की प्रारंभिक पहचान के लिए उपयोगी हो सकती है, जैसे निचले अंग और कोरोनरी इस्केमिया, स्ट्रोक, वैक्यूलाइटिस, वेनस थ्रोम्बोसिस और संवहनी चोट और मरम्मत से जुड़े अन्य।
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Protocol
सेंट्रो मेडिको नैसिनल "20 डी नोविम्ब्रे" आईएसएसटीई से संस्थागत अनुसंधान आचार समिति ने इस संभावित प्रोटोकॉल को मंजूरी दी, सभी नामांकित रोगियों ने लिखित सूचित सहमति प्रदान की।
1. निचले अंग, रक्त नमूना और गुब्बारा एंजियोप्लास्टी के संवहनी ब्लॉक का मूल्यांकन
नोट: इस प्रयोग के लिए इस्तेमाल किया अध्ययन नमूना 20 मधुमेह रोगियों, आयु वर्ग के ६८ साल पुराने और 20 में से 10 पुरुषों थे शामिल थे । नमूने के आधे धूम्रपान करने वालों और सबसे प्रचलित सह रुग्णता प्रकार 2 मधुमेह मेलिटस, प्रणालीगत धमनी उच्च रक्तचाप और/या डिस्लिपिडेमिया थे । नमूने का उद्देश्य आयु, लिंग और सह-रुग्णताओं के लिए मानकीकृत किया जाना था । एमपीसी और सीएलआई के बीच संबंधों पर नैदानिक-जनसांख्यिकीय प्रभाव के कारण संभावित पूर्वाग्रह से इनकार नहीं किया जा सकता है ।
- रदरफोर्ड वर्गीकरण13 के अनुसार अंग इस्केमिया की नैदानिक गंभीरता का मूल्यांकन करें (अनुपूरक तालिका 1देखें)।
- लोअर लिंब एंजियोग्राफी, ब्लड सैंपलिंग और बैलून एंजियोप्लास्टी करें।
- सर्जरी से पहले एंटीकोगुलैंट और एनेस्थेटिक दवाओं का इस्तेमाल करें।
- चयनित कमर स्थल पर रक्त वाहिका में एक 18 जी सुई रखें।
- एक परिचयकर्ता रखें और एक लचीला गाइड तार अग्रिम। फिर, प्रारंभिक गाइड आगे एक 6 एफआर परिचयकर्ता के लिए बदल दिया है।
- धमनी प्रक्षेप पथ और संवहनी अवरुद्ध साइटों(चित्रा 1)की पहचान करने के लिए फ्लोरोस्कोपिक गाइड के तहत कंट्रास्ट मीडिया या सीओ2 के आवधिक इंजेक्शन का उपयोग करें।
नोट: 12 साई के दबाव पर 10 से20 एमएल प्रति शॉट पर कंट्रास्ट मीडिया 40 सीसी, पतला 1:1 में 0.9% नमकीन, या सीओ 2 का उपयोग करें। - पोत में दो 0.014 एफआर नेविगेशन गाइड तारों और दो 0.014 एफआर समर्थन गाइड तारों का परिचय दें और उन्हें अवरुद्ध साइट तक आगे बढ़ाएं।
नोट: दो 0.014 एफआर गाइड तारों (260 सेमी लंबे) नेविगेशन के लिए उपयोग किया जाता है और दो 0.014 एफआर गाइड तारों (260 सेमी लंबे) का उपयोग एक ही प्रक्रिया के दौरान समर्थन के लिए किया जाता है। - क्रमिक रूप से 5 एफआर और 3 एफआर कैथेटर पेश करें और निकटतम साइट से 10 एमएल रक्त एकत्र करें। बर्फ पर रक्त के नमूने बनाए रखें।
नोट: कैथेटर आकार 5 Fr और 3 Fr हो सकता है, और वे प्रक्रिया के दौरान बदल रहे हैं । - एक गाइड तार फिर से अग्रिम। फिर, एक एंजियोप्लास्टी गुब्बारा कैथेटर पेश करें, जिसमें कैथेटर के अंत में स्थित एक इन्फ्लेटेबल गुब्बारा होता है। एंजियोप्लास्टी गुब्बारे कैथेटर अग्रिम और घाव की साइट पर सही गुब्बारा जगह है। संवहनी दीवार पर स्थित अवरुद्ध पट्टिका के खिलाफ गुब्बारे को फुलाने से एंजियोप्लास्टी करें। रक्त प्रवाह बहाली सत्यापित करें।
नोट: प्रक्रिया के बाद धमनी को खुला रखने में मदद करने के लिए अवरुद्ध क्षेत्र में एक स्टेंट रखा जा सकता है। - एक कैथेटर परिचय और संवहनी ब्लॉक के निकटतम स्थल तक अग्रिम। एंजियोप्लास्टी के बाद 30 मिनट के समय अंतराल पर 10 मिलीएल रक्त एकत्र करें। बर्फ पर रक्त के नमूने बनाए रखें।
नोट: एमपीसीएस की संख्या पर एंजियोप्लास्टी के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए एंजियोप्लास्टी से पहले और बाद में रक्त नमूनों के संग्रह की सिफारिश की जाती है। - फ्लोरोस्कोपिक मार्गदर्शन के तहत सभी तारों को हटा दें।
- 1 मिलीग्राम/किलो चमड़े के नीचे हर 12 घंटे, एस्प्रिन १०० मिलीग्राम, स्टेटिन, और एनाल्जेसिया पर एनोक्सेपन का उपयोग करके एंटी-कोगुलेशन थेरेपी सहित पोस्ट-ऑपरेटिव देखभाल प्रक्रियाएं प्रदान करें । 24 घंटे के दौरान संवहनी पंचर के स्थल पर सेक करें।
2. परिसंचारी मोनोन्यूक्लियर प्रोजेनिटर कोशिकाओं (एमपीसी)(चित्र 2) कामात्राकरण
- एक ताजा 15 एमएल शंकु नली के लिए, एकत्र रक्त के 6 एमएल हस्तांतरण और पीबीएस के साथ 1:1 (v/v) पतला ।
नोट: संग्रह से 1 घंटे के भीतर रक्त की प्रक्रिया। - घनत्व ढाल जुदाई के लिए तैयार करें, घनत्व ढाल माध्यम के 2 एमएल को 3 टेस्ट ट्यूब में जोड़कर। फिर, प्रत्येक टेस्ट ट्यूब में पतला रक्त के 3 बराबर मात्रा एलिकोट जोड़ें।
नोट: टेस्ट ट्यूब अधिकतम क्षमता के तीन चौथाई से अधिक नहीं है । - 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 1,800 x ग्राम पर सेंट्रलाइज। एक पिपेट का उपयोग करके रिंग के रूप में मौजूद इंटरफ़ेस लेयर को इकट्ठा करें, और एक नई ट्यूब में स्थानांतरित करें। पीबीएस के 2 एमएल जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 6 मिनट के लिए 1,800 x ग्राम पर स्पिन करें। गोली को बचाएं क्योंकि इसमें एमपीसी शामिल होंगे।
- चरण 2.3 में वर्णित अपकेंद्रित्र द्वारा पीबीएस के साथ एमपीसी युक्त गोली धोएं। प्रत्येक धोने के लिए ताजा पीबीएस का उपयोग करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए 1,800 x ग्राम पर स्पिन करें। इस प्रक्रिया को 6 बार दोहराएं।
- आखिरी वॉश के बाद, सेल पेलेट को फिर से रीसुस्ट करने के लिए पीबीएस के 1 एमएल का उपयोग करें। 0.4% ट्राइपैन ब्लू, 1:1 (v/v) के 20 माइक्रोन के साथ सेल निलंबन के 20 माइक्रोन पतला। हीमोसाइटोमीटर और एक हल्के माइक्रोस्कोप का उपयोग कर सेल गिनती के लिए इस सेल निलंबन के 10 μL का उपयोग करें।
- अलीकोट 1 x 106 एमपीसी में पहले लेबल 5 एमएल फ्लो साइटोमेट्री ट्यूब।
नोट: इसी आइसोटाइप-मिलान नियंत्रण एंटीबॉडी तैयार करें। - 4 डिग्री सेल्सियस पर 6 मिनट के लिए 1,800 x ग्राम पर ट्यूबों को सेंट्रलाइज करें। अधिष्ठाता को त्यागें और त्यागें।
- एंटीबॉडी इनक्यूबेशन समाधान के 100 माइक्रोन में प्राथमिक एंटीबॉडी पतला [ 1x पीबीएस, पीएच 7.4, EDTA 2 mM, बीएसए 0.05%] और ट्यूब में जोड़ें। 10 एस के लिए पुनर्सुल व्यय और 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट, अंधेरे में ।
नोट: वर्तमान प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले प्राथमिक एंटीबॉडी की अंतिम सांद्रता सीडी 45 1:50, सीडी 34 1:20, केडीआर 1:50, सीडी 184 1:20, सीडी133 1:50 थे। पीबीएस में 4% पैराफॉर्मलडिहाइड में लिम्फोसाइट्स को ठीक करके और 4 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे तक के नमूनों को संग्रहीत करके प्रोटोकॉल को इस कदम पर रोका जा सकता है। - 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए 1,800 x ग्राम पर सेंट्रलाइज करें और सुपरनैंट को त्यागें। 1x पीबीएस, पीएच 7.4, EDTA 2 mM के 500 माइक्रोन में Resuspend।
- प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण करें।
- आइसोटाइप-मिलान नियंत्रण एंटीबॉडी के साथ पृष्ठभूमि स्थापित करें। फिर, एफएससी/एसएससी प्लॉट में फैलने वाले लिम्फोसाइट्स का चयन करें, सेलुलर मलबे, अवशिष्ट ग्रैनुलोसाइट्स और अन्य कणों को बाहर करने की कोशिश कर रहे हैं । इस तरह के वितरण को 100% माना जाता है।
नोट: लिम्फोसाइट्स आमतौर पर साजिश के निचले-बाएं क्षेत्र में फैलते हैं। - सामान्य इम्यूनोफेनोटाइप वाले गेट का उपयोग करें जिसमें उच्च संख्या में कोशिकाएं सीडी 45+ और सीडी 34+ हों। फिर, गेट का उपयोग करके डबल पॉजिटिव इम्यूनोफेनोटाइप के लिए चुनें, जिसने पहले CD45+,CD34+की पहचान की थी, और केडीआर (VEGFR-2)+ +,CD133+ या CD184+को जोड़ना था। एमपीसीएस उप-जनसंख्या को उनके विशिष्ट सेल सतह मार्कर द्वारा पहचानें। गेटेड घटनाओं के प्रतिशत के रूप में रिपोर्ट करें।
- आइसोटाइप-मिलान नियंत्रण एंटीबॉडी के साथ पृष्ठभूमि स्थापित करें। फिर, एफएससी/एसएससी प्लॉट में फैलने वाले लिम्फोसाइट्स का चयन करें, सेलुलर मलबे, अवशिष्ट ग्रैनुलोसाइट्स और अन्य कणों को बाहर करने की कोशिश कर रहे हैं । इस तरह के वितरण को 100% माना जाता है।
- एमपीसी की मुख्य उपआबादी की पहचान करें। वर्तमान अध्ययन में विश्लेषण किए गए इम्यूनोफेनोटाइप सीडी 45+सीडी 34+सीडी 133+थे; CD45+CD34+CD184+ CD45+CD34+CD133+CD184+ CD45+CD34+KDR+ CD45+CD34+ KDR+CD133+ और CD45+CD34+KDR+CD1847,17।
नोट: इन सेल सतह मार्कर अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया गया: CD45 (लिम्फोसाइट्स), CD34 (एंडोथेलियल और/या संवहनी कोशिकाओं), KDR (VEGFR-2) (एंडोथेलियल कोशिकाओं की झिल्ली मार्कर), CD133 (एंडोथेलियल प्रोजेनिटर सेल) और CD184 (हेमेटोपोइटिक स्टेम सेल और एंडोथेलियल सेल) ।
3. एंडोथेलियल फ़ंक्शन और हीमोडायनामिक परीक्षण (एफएमडी) के संशोधन के साथ एमपीसी का संबंध
- प्रवाह-मध्यस्थता फैलाव (एफएमडी), प्री-और पोस्ट-एंजियोप्लास्टी निर्धारित करें।
- ब्रैचियल धमनी के व्यास को मापने के लिए एक संवहनी रैखिक ट्रांसड्यूसर का उपयोग करें।
- बांह की कलाई में माप स्थल के ऊपर स्फीग्मोमैनोमीटर के कफ को रखें और सिस्टोलिक रक्तचाप के ऊपर 50 मिमीHg पर 5 मिनट और डिफ्लेट करें।
- अगले 60 s के भीतर ब्रैचियल धमनी का व्यास फिर से निर्धारित करें। एफएमडी का अनुमान लगाने के लिए नीचे दिए गए समीकरण का उपयोग करें।
नोट: समीकरण (%) = (क्षणिक इस्केमिया के बाद अधिकतम व्यास - बेसल व्यास) का उपयोग करके फैलाव की डिग्री की गणना करें × 100 /
- एफएमडी के बेसलाइन एफएमडी वैल्यू और पोस्ट-एंजियोप्लास्टी डेल्टा के साथ एमपीसी की संख्या को सहसंबंधित करें।
4. अंग विच्छेदन के लिए एमपीसी की शकुन क्षमता
- निचले अंग में रक्त प्रवाह की गुणवत्ता का मूल्यांकन करने के लिए गुब्बारा एंजियोप्लास्टी और रोगी निर्वहन के बाद आवधिक चिकित्सा नियुक्तियों को शेड्यूल करें।
- एंजियोप्लास्टी के बाद 2 सप्ताह में अंग इस्केमिया की नैदानिक गंभीरता का मूल्यांकन करें। रदरफोर्ड वर्गीकरण13के अनुसार, आराम दर्द, कम इस्केमिया, और एक कार्यात्मक पैर के संरक्षण को हल करने का मूल्यांकन करें।
- बेसलाइन बनाम अनुवर्ती कार्रवाई पर अंग इस्केमिया की नैदानिक गंभीरता की तुलना करें। प्रतिकूल परिणाम के कारण प्रमुख विच्छेदन की आवश्यकता वाले मामलों की पहचान करें।
- निचले अंग के प्रमुख विच्छेदन की आवश्यकता वाले रोगियों के अनुपात के साथ एमपीसी की संख्या को सहसंबंधित करें।
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Representative Results
एंजियोप्लास्टी के लिए संबोधित स्थल पर अवरुद्ध धमनियों से रक्त के नमूने 20 मधुमेह रोगियों, ६८ साल की आयु के और 20 में से 10 पुरुषों से एकत्र किए गए । नमूना आबादी का आधा धूम्रपान करने वालों थे । वैस्कुलर घावों को मुख्य रूप से रदरफोर्ड कक्षा VI के रूप में अर्जित किया गया था; जबकि रोगियों को टाइप 2 मधुमेह मेलिटस (१००%), उच्च रक्तचाप (७०%) और डिस्लिपिडेमिया (55%)।
निचले अंग एंजियोप्लास्टी के बाद 30 दिनों का नैदानिक अनुवर्ती कार्रवाई की गई। एंजियोप्लास्टी के बाद बेसलाइन या गतिशीलता पर एमपीसी उप-जनसंख्या का प्रतिशत एंडोथेलियल डिसफंक्शन की डिग्री के साथ सहसंबद्ध (स्पीयरमैन विश्लेषण) था, जैसा कि एफएमडी द्वारा मूल्यांकन किया गया है; और एमपीसी की बेसलाइन संख्या की तुलना एंजियोप्लास्टी (यू-मान व्हिटनी) के बाद अंग विच्छेदन के दौर से गुजर रहे रोगियों के बीच की गई थी। अध्ययन से पता चला है कि बेसलाइन एमपीसीएस उपजनसंख्या सीडी 45+सीडी 34+केडीआर+ एफएमडी(चित्रा 3 ए, बाएं)के साथ नकारात्मक रूप से सहसंबद्ध है, जबकि एमपीसी सीडी 45+सीडी 34+सीडी 133+सीडी 184+ के परिवर्तन के बाद एंजियोप्लास्टी काफी FMD सुधार के साथ सहसंबद्ध(चित्रा 3B,सही) । इसके अलावा, एमपीसीएस उप-जनसंख्या सीडी 45 + सीडी 34+केडीआर+ (चित्रा 4ए, बी,बाएं) की बढ़ी हुई बेसलाइन संख्या उन रोगियों में देखी गई जो अंग विच्छेदन के लिए विकसित हुए थे; साथ ही एमपीसीएस उपआबादी सीडी 45 + सीडी 34 + सीडी 133+सीडी 184 +(चित्रा 4ए, सी,दाएं) की एंजियोप्लास्टी में कमी।
चित्रा 1: निचले अंग एंजियोग्राफी और रक्त संग्रह। (क)फ्लोरोस्कोपी के तहत कंट्रास्ट मीडिया द्वारा साक्ष्य संवहनी प्रक्षेपवक्र । (ख)एंजियोप्लास्टी से पहले संवहनी बाधा । (ग)एंजियोप्लास्टी के बाद संवहनी बाधा । (घ)वैस्कुलर सर्जन निकटतम स्थान से संवहनी बाधा और एथेरोमा पट्टिका के लिए रक्त एकत्र करने के लिए एक कैथेटर का उपयोग करता है, और प्रयोगशाला शोधकर्ता रक्त नमूना प्राप्त करने के लिए तैयार है । तीर संवहनी अवरोधों की साइट का संकेत देते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2: रक्त नमूना तैयारी और मोनोन्यूक्लियर प्रोजेनिटर कोशिकाएं (एमपीसी) निर्धारण। (क)घनत्व ढाल की तैयारी। (ख)रक्त अपकेंद्रित्र के बाद लिम्फोसाइट्स रिंग सेपरेशन। (ग)लिम्फोसाइट चरण का संग्रह। (घ)सेंट्रलाइजेशन । (ई)टेस्ट ट्यूब के नीचे पैलेट फॉर्मेशन। (एफ)सेल सस्पेंशन काउंट। (जी)फ्लो साइटोमेट्री के लिए लिम्फोसाइट्स की तैयारी। (ज)फ्लो साइटोमेट्री द्वारा सेल सबपॉलेशन का निर्धारण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्र 3: हीमोडायनामिक संकेतकों के साथ एमपीसी का संबंध। (ए)एफएमडी और प्रतिनिधि परिणाम प्राप्त करने के लिए अल्ट्रासाउंड की स्थिति। (B)बेसलाइन% एमपीसी उपआबादी (बाएं, सीडी 45+सीडी 34+केडीआर++ दाएं, सीडी 45+सीडी 34+सीडी 133+सीडी 184+)और बेसलाइन एफएमडी मूल्यों के बीच संबंध; साथ ही एंजियोप्लास्टी के बाद एफएमडी सुधार के साथ एंजियोप्लास्टी के बाद(सी%एमपीसी) का रिलेशन। संक्षिप्त: एमपीसी, मोनोन्यूक्लियर प्रोजेनिटर सेल; एफएमडी, फ्लो मध्यस्थता फैलाव । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्र 4: एंजियोप्लास्टी के बाद एमपीसी और निचले अंग विच्छेदन का पूर्वानुमान। {एमपीसीएस उपआबादी की प्रतिनिधि प्रवाह साइटोमेट्री छवियां। (B)बेसलाइन% एमपीसी उप-जनसंख्या का संघ (बाएं, सीडी 45+सीडी 34+ केडीआर+;राइट, सीडी 45+सीडी 34+सीडी 133+सीडी184+),या एंजियोप्लास्टी के बाद(सी)%एमपीसी, एंजियोप्लास्टी के बाद निचले अंग विच्छेदन के साथ, 30 दिनों के अनुवर्ती के दौरान । संक्षिप्त: एमपीसी, मोनोन्यूक्लियर प्रोजेनिटर कोशिकाएं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
अनुपूरक फाइल 1: अंग इस्केमिया की गंभीरता का रदरफोर्ड का वर्गीकरण। इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
संवहनी ब्लॉक के सटीक स्थल पर रक्त संग्रह तकनीकी कठिनाइयों को दिखा सकता है; इसलिए, हमने संवहनी ब्लॉक के निकट रक्त संग्रह किया। इसी तरह, संवहनी पट्टिका के करीब एमपीसी की मात्रा अत्यधिक गतिशील प्रतीत होती है और एंजियोप्लास्टी से पहले और बाद में विविधताओं का उद्भव हो सकता है। हमारी टिप्पणियों के अनुसार, एमपीसी की संख्या में बेसलाइन-और 30मिनट-पोस्ट-एंजियोप्लास्टी परिवर्तनों का मूल्यांकन करने की सिफारिश की जाती है, क्योंकि वे संवहनी क्षति और मरम्मत के भीतर होने वाली कई रोगविज्ञानी प्रक्रियाओं को प्रतिबिंबित कर सकते हैं।
एमपीसी निर्धारण के लिए रक्त नमूना प्रसंस्करण को पहले 3 घंटे के भीतर करने की सिफारिश की जाती है; इसलिए, पर्याप्त संगठन योजना, और यहां तक कि पिछले सिमुलेशन अभ्यास, एंजियोलॉजी-संवहनी सर्जरी टीम और प्रयोगशाला शोधकर्ताओं के बीच स्थापित किया जा सकता है। एमपीसीएस अलगाव को सावधानीपूर्वक किया जाना चाहिए, विशेष रूप से रक्त के नमूने को घनत्व ढाल में और एमपीसी युक्त गोली के वॉश में पेश करना चाहिए। हमारा समूह कोशिकाओं को साइटोमेट्री ट्यूब में स्थानांतरित करने, प्राथमिक एंटीबॉडी जोड़ने, ठीक करने और 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात कोशिकाओं को स्टोर करने के लिए उपयोग करता है; समय-प्रशासन सुविधा के कारण, और प्रवाह साइटोमेट्री पढ़ने के बाद दिन किया जाएगा ।
संवहनी क्षति और मरम्मत के एक उपयोगी नैदानिक बायोमार्कर के रूप में एमपीसी परिसंचारी की भूमिका के बारे में,17जनक कोशिकाओं के बीच इम्यूनोफेनोटाइप को मानकीकृत करने के लिए महत्वपूर्ण प्रयासों की सूचना दी गई है। एक व्यापक लक्षण वर्णन में संवहनी रोगों के भीतर विभिन्न नैदानिक परिदृश्यों में भाग लेने वाली परिसंचारी जनक कोशिकाओं की उप-आबादी शामिल होनी चाहिए। यहां वर्णित तरीकों का उपयोग करते हुए, हमने पाया कि एमपीसीएस उप-जनसंख्या सीडी 45 + सीडी 34+सीडी 133+सीडी 184+की एंजियोप्लास्टी में कमी प्रमुख विच्छेदन के लिए भविष्य कहनेवाला है। यह निष्कर्ष इस धारणा का समर्थन करता है कि संवहनी चोट या एंजियोप्लास्टी के दौरान भड़काऊ प्रतिक्रिया एमपीसी के लिए होमिंग संकेतों को उत्तेजित करती है, स्थानीय ऊतक मरम्मत18,19को बढ़ावा देती है।
इसी तरह, अवलोकन सीडी 45+सीडी 34 + सीडी 133+और सीडी 45+सीडी 34+सीडी 133+184 + एमपीसीएस की उपआबादी कोरोनरी एंजियोप्लास्टी7के बाद प्रतिकूल हृदय परिणामों के कारक के रूप में कम संख्या के सूचित प्रभाव के अनुरूप है, जिसे एक्सेक् सी का पालन करने के लिए एंडोथेल प्रोजेनिटर के कम विभेदित फेनोटाइप की बढ़ी हुई क्षमता से समझाया जा सकता है पैदा करना और वैकुलोजेनिक उत्तेजना18का जवाब देना .
इसके अलावा, हमने देखा कि एंजियोप्लास्टी के बाद एमपीसीएस की सीडी 45+सीडी 34+केडीआर+ उपजनसंख्या की बढ़ी हुई संख्या अंग विच्छेदन से संबंधित थी, हालांकि उन्हें संवहनी मरम्मत में योगदान करने के लिए माना गया है। इस विवाद के कारण समझाया जा सकता है: 1) अध्ययन डिजाइन में भिन्नता, क्योंकि अन्य अध्ययनों ने सीएलआई और स्वस्थ नियंत्रण वाले रोगियों के बीच सीडी 45+सीडी 34+केडीआर+ एमपीसी की संख्या की तुलना की है19; 2) साइट और एंजियोप्लास्टी के बारे में समय सहित रक्त नमूने के तरीकों में भिन्नता; और 3) धमनी के प्रकार अवरुद्ध और संवहनी।
कई बीमारियों में संवहनी मरम्मत के लिए जिम्मेदार तंत्र के आधार पर उपन्यास बायोमार्कर के शकुन चरित्र चित्रण को ट्रांसलेशनल रिसर्च में महत्वपूर्ण ध्यान मिला है। यह एमपीसी की भूमिका का पता लगाने के लिए एक विधि का पहला विवरण है, जो स्थानीय रूप से संवहनी ब्लॉक के करीब एक साइट पर निर्धारित किया जाता है, सीएलआई के साथ मामलों में एंजियोप्लास्टी के बाद अंग विच्छेदन के पूर्वानुमान में। एक सीमा एंजियोप्लास्टी के बाद अधिक समय बिंदुओं पर एमपीसी निर्धारण की कमी है । हालांकि, हम मानते हैं कि हमारे निष्कर्ष सीएलआई के साथ रोगियों में प्रमुख विच्छेदन के लिए संवहनी क्षति, मरम्मत और शकुन क्षमता के दौरान एमपीसी की अनुवादात्मक भूमिका को चित्रित करके संवहनी अनुसंधान के क्षेत्र को समृद्ध करते हैं। विशेष रूप से, हम मानते हैं कि यहां वर्णित विधि नैदानिक सेटिंग्स में प्रतिकूल संवहनी परिणामों की भविष्यवाणी में उपयोगी हो सकती है जिसमें निचले अंग और कोरोनरी इस्केमिया, स्ट्रोक, वैस्कुलिस, और/या वेनस थ्रोम्बोसिस जैसे संवहनी चोट और मरम्मत तंत्र शामिल हैं ।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
लेखक परियोजना आईडी 356.2015 के लिए संस्थागत कार्यक्रम E015 के समर्थन का शुक्रिया अदा करते हैं।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BSA | Roche | 10735086001 | Bovine Serum Albumin (BSA) as a buffering agent, stabilizer, standard and for blending. |
| Calibration Beads | Miltenyi Biotec / MACS | #130-093-607 | MACQuant calibration beads are supplied in aqueous solution containing 0.05% sodium azide. 3.5 ml for up to 100 tests |
| CD133/1 (AC133)-PE | Milteny Biotec / MACS | #130-080-801 | Antibody conjugated to R-Phycoerythrin in PBS/EDTA buffer |
| CD184 (CXCR4)-PE-VIO770 | Miltenyi Biotec / MACS | #130-103-798 | Monoclonal, Isotype recombinant human IgG1, conjugated |
| CD309 (VEGFR-2/KDR)-APC | Miltenyi Biotec / MACS | #130-093-601 | Antibody conjugated to R-Phycoerythrin in PBS/EDTA buffer |
| CD34-FITC | Miltenyi Biotec / MACS | #130-081-001 | The monoclonal antibody clone AC136 detecs a class III epitope of the CD34 |
| CD45- VioBlue | Miltenyi Biotec / MACS | #130-092-880 | Monoclonal CD45 Antibody, human conjugated |
| Conical Tubes | Thermo SCIENTIFIC | #339651 | 15ml conical centrifuge tubes |
| Cytometry Tubes | FALCON Corning Brand | #352052 | 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube. 12x75 style. Sterile. |
| EDTA | BIO-RAD | #161-0729 | Heavy metals, (as Pb) <10ppm, Fe<0.01%, As<1ppm, Insolubles<0.005% |
| Improved Neubauer | Without brand | Without catalog number | Hemocytometer for cell counting. (range 0.1000mm, 0.0025mm2) |
| K2 EDTA Blood Collection Tubes | BD Vacutainer | #367863 | Lilac plastic vacutainer tube (K2E) 10.8mg, 6 mL. |
| Lymphoprep | Stemcell Technologies | 01-63-12-002-A | Sterile and checked on the presence of endotoxins. Density: 1.077±0.001g/mL |
| Paraformaldehyde | SIGMA-ALDRICH | #SZBF0920V | Fixation of biological samples, (powder, 95%) |
| Pipette Transfer 1,3mL | CRM Globe | PF1016, PF1015 | The transfer pipette is a tool that facilitates liquid transfer with greater accuracy. |
| Test Tubes | KIMBLE CHASE | 45060 13100 | Heat-resistant test tubes. SIZE/CAP 13 x 100 mm |
References
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