Summary
下肢切断は、重篤な四肢虚血(CLI)における閉塞血管形成術の後でも起こり得る。単核前駆細胞(Mpc)は血管修復を反映する。本プロトコルは、血管形成術に近い循環からのPPCの定量化、および内皮機能不全との関係および下肢切断の予測を記述する。
Abstract
重篤な四肢虚血(CLI)は末梢動脈疾患の進行期を表す。血管形成術は下肢への血流を改善する;しかし、一部の患者は不可逆的に四肢切断に進行する。血管損傷の程度および血管修復のメカニズムは、血管形成術後の結果に影響を与える因子である。単核前駆細胞(Mpc)は血管損傷および修復に反応し、血管疾患を反映する能力を有する。本プロトコルは、血管形成部位に近い血管からの血液循環から得られたMpCの定量化、ならびに血管形成障害との関係およびCLI患者における血管形成術後30日間における四肢切断の予測能力を記述する。
Introduction
末梢動脈疾患(PAD)は、血液供給の制限を伴う慢性および進行性の血管閉塞を特徴とする1。世界規模では、下肢のPADは高齢者人口の約10%に影響を及ぼし、その最大7%は四肢切断2、3に提出される。
クリティカルリム虚血(CLI)はPAD1の最も深刻なプレゼンテーションを表します。患者は通常、閉塞した動脈に起因する安静時、潰瘍、または壊疽で痛みを経験する。臨床予後は好ましくない一方で、1年3年、4、5の間に四肢切断と死亡の30%のリスクによってマークされています。
血管形成術は、CLI患者の下肢への血流を回復させることができる低侵襲血管内処置である。しかし、血管形成術1,5の後でも、一部の患者は必然的に大きな四肢切断を必要とする。血管形成術後の不利な結果の早期同定は、治療執行の可能性のために非常に貴重である。
従来の危険因子は、血管形成術6を受けるCLI患者における主要な四肢切断に対して限られた予測能力を提供するかもしれない。病態生理性バイオマーカーは、潜在的な臨床応用を有する新規の方法を表し、血管損傷に関連する疾患に特に有用な結果をもたらす可能性がある7。今日では、内皮修復特性を所有する細胞集団の参加は、アテローム硬化性プラークの部位において、8,9にますます認められている。
単核前駆細胞(MPC)は、血管再生能力を有する幹細胞の骨髄および独自の構造的および機能的特性に由来する。増殖するMPCの能力のために、移行し、血管の遵守を示す;これらの細胞は虚血10、11、12に応答して内皮修復を反映する良い候補となっている。また、血管損傷の根底にあるメカニズムへの継続的な関心は、局所的に生じるバイオマーカーの予後的役割を探求する動機となっている。
本研究の目的は、血管形成術を受けているCLI患者の血管閉塞に近い循環するPPCの量を決定する方法を説明することです。内皮機能不全と四肢切断の指標を持つMpC間の関係を評価する方法。
併存症と固有の血管特徴に基づく予後と比較して、局所的なPPCの量は、内皮機能不全および四肢切断に関する臨床結果を予測する特定の能力を示す。一貫して、いくつかの研究は、PAD15、16を有する患者の評価中に同様のバイオマーカーの予後の役割を説明している。
前の結果7に基づいて、ここで説明する方法は、下肢および冠動脈虚血、脳卒中、血管炎、静脈血栓症および血管損傷および修復を伴う他の人々のようないくつかの臨床において、不利な血管転帰の危険性がある集団の早期同定に有用であり得る。
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Protocol
セントロ・メディコ・ナシオナル「20デ・ノビエンブレ」ISSSTEの機関研究倫理委員会は、この将来のプロトコルを承認し、登録されたすべての患者が書面によるインフォームド・コンセントを提供しました。
1. 下肢の血管ブロック、血液採取、バルーン血管形成術の評価
注:この実験に使用された研究サンプルは、68歳と20人中10人の20人の糖尿病患者で構成されていました。サンプルの半分は喫煙者であり、最も一般的な共罹患率は2型糖尿病、全身動脈性高血圧および/または脂質異常症であった。サンプルは、年齢、性別、共罹患率のために標準化されることを意図していました。MPCとCLIの関係に対する臨床的・人口統計学的影響によるバイアスの可能性は排除できなかった。
- ラザフォード分類13 に従って四肢虚血の臨床的重症度を評価する( 補足表1参照)。
- 下肢血管造影、血液採取、バルーン血管形成術を行う。
- 手術前に抗凝固薬と麻酔薬を使用してください。
- 選択した鼠径部の血管に18Gの針を入れます。
- 紹介者を配置し、フレキシブルガイドワイヤーを進めます。次に、初期ガイドは、さらに6Fr導入者に対して変更される。
- 透視的なガイドの下でのコントラスト媒体またはCO2の周期的な注入を使用して、動脈の軌道および血管閉塞部位を同定する(図1)。
注:コントラストメディア40cc、0.9%生理食塩水で1:1、または12 psiの圧力で1ショットあたり10〜20 mLのCO2 を使用してください。 - 2 本の 0.014 Fr ナビゲーション ガイド ワイヤと 2 本の 0.014 Fr サポート ガイド ワイヤを船舶に導入し、ブロックされた場所まで進めます。
注:2つの0.014 Frガイドワイヤ(260 cmの長さ)がナビゲーションに使用され、2つの0.014 Frガイドワイヤー(260 cmの長さ)は、単一の手順の間にサポートのために使用されます。 - 5 Frおよび3 Frのカテーテルを順次導入し、血管閉塞に最も近い部位から10mLの血液を採取する。氷の上の血液サンプルを維持します。
注意:カテーテルサイズは5 Frおよび3 Frであり、手順中に変更されます。 - ガイドワイヤーをもう一度進めます。次に、血管形成術のバルーンカテーテルを導入し、カテーテルの端に位置する膨張可能なバルーンを含む。血管形成術バルーンカテーテルを進め、バルーンを病変部位に置きます。血管壁に位置する遮断歯垢に対してバルーンを膨らませることによって血管形成術を行う。血流の回復を確認します。
注:ステントは、手順の後に動脈を開いたままに保つためにブロックされた領域に配置することができます。 - カテーテルを導入し、血管ブロックに最も近い部位に進む。血管形成術後30分間隔で10mLの血液を採取する。氷の上の血液サンプルを維持します。
注:血管形成術の前後の血液サンプルの収集は、血管形成術がPPCの数に及ぼす影響をさらに評価するために推奨されます。 - 蛍光ガイドですべてのワイヤを取り外します。
- 術後の治療手順を提供します, 1 mg/kg 皮下12時間、アスピリン100mg、スタチン、および鎮痛でエノキサパリンを使用した抗凝固療法を含む.24時間の間に血管穿刺の部位で圧縮する。
循環単核前駆細胞(Mpcs)の定量化 (図2)
- 新鮮な15 mL円錐形チューブに、採取した血液の6 mLを移し、PBSで1:1(v/v)を希釈します。
注:採取から1時間以内に血液を処理してください。 - 密度勾配分離の準備をして、それぞれ3本の試験管に2mLの濃度勾配媒体を加える。次に、希釈した血液の3等量のアリコートを各試験管に加える。
注:試験管の最大容量の4分の3を超えないようにしてください。 - 遠心分離機 1,800 x g で 30 分 4 °C. ピペットを使用してリングとして存在するインターフェイス層を収集し、新しいチューブに転送します。PBSを2mL加え、4°Cで6分間1,800 x g でスピンします。 これは、PPCが含まれるようにペレットを保存します。
- ステップ2.3に記載されているように遠心分離によりPPCを含むペレットをPBSで洗浄する。洗浄ごとに新鮮なPBSを使用し、4°Cで2分間1,800 x g で回転します。 この処理を 6 回繰り返します。
- 最後の洗浄後、1 mLのPBSを使用して細胞ペレットを再懸濁します。20 μLのセル懸濁液を0.4%のトリパンブルー、1:1(v/v)で希釈します。この細胞懸濁液の10 μLを、ヘモサイトメーターと光顕微鏡を用いた細胞計数に使用してください。
- アリコート1 x 106 MPCは、以前にラベル付けされた5 mLフローサイトメトリーチューブに含まれる。
注:対応するアイソタイプ一致対照抗体を準備してください。 - チューブを1,800 x g で4°Cで6分間遠心分離します。 吸引し、上清を捨てる。
- 抗体インキュベーション溶液の100 μLで希薄な一次抗体[1x PBS,pH 7.4, EDTA 2 mM, BSA 0.05%]とチューブに添加します。10 sで再中断し、暗闇の中で4°Cで20分間インキュベートします。
注:本プロトコルで使用される一次抗体の最終濃度はCD45 1:50、CD34 1:20、KDR 1:50、CD184 1:20、CD133 1:50であった。プロトコルは、PBSで4%パラホルムアルデヒド中のリンパ球を固定し、4°Cで24時間までサンプルを保存することによって、このステップで停止することができる。 - 4°Cで2分間1,800xgの遠心分離機を使用し、上清を捨てます。 500 μL の 1x PBS、pH 7.4、EDTA 2 mM で再中断します。
- フローサイトメトリー解析を行います。
- アイソタイプに一致した対照抗体を使用して背景を設定します。次に、FSC/SSCプロットでは、広がったリンパ球を選択し、細胞の破片、残存顆粒球、および他の粒子を除外しようとした。このような分布は100%と考えられる。
注:リンパ球は通常、プロットの左下領域に広がっています。 - CD45+および CD34 + の細胞数が多い一般的な免疫フェノタイプのゲートを使用します。次に、以前に CD45+、 CD34+を同定したゲートを使用して二重陽性免疫フェノタイプを選択し、KDR (VEGFR-2)+、 CD133+または CD184+のいずれかを追加します。特定のセル表面マーカーによって、Mpc サブ集団を識別します。ゲート イベントの割合としてレポートします。
- アイソタイプに一致した対照抗体を使用して背景を設定します。次に、FSC/SSCプロットでは、広がったリンパ球を選択し、細胞の破片、残存顆粒球、および他の粒子を除外しようとした。このような分布は100%と考えられる。
- MPC の主なサブ人口を識別します。本研究では、分析した免疫フェノタイプはCD45+CD34+CD133+であった。CD45+CD34+CD184+;CD45+CD34+CD133+CD184+;CD45+CD34+KDR+;CD45+CD34+KDR+CD133+および CD45+CD34 +KDR+CD1847,17.
注:これらの細胞表面マーカーは、CD45(リンパ球)、CD34(内皮および/または血管細胞)、KDR(VEGFR-2)(内皮細胞の膜マーカー)、CD133(内皮前駆細胞)およびCD184(造血幹細胞および内皮細胞)の研究に使用された。
3. MPCと内皮機能の変化と血行力学的検査(FMD)の関係
- フロー媒介拡張(FMD)、前および後血管形成術を決定する。
- 血管線形トランスデューサを使用して、上腕動脈の直径を測定します。
- 前腕の測定部位の上に血圧計のカフを置き、収縮期血圧の上に50mmHgで5分間収縮させ、収縮させます。
- 次の60s内の上腕動脈の直径を再び決定する。FMD を推定するには、以下の式を使用します。
注: 100 /基底直径を×式(%)=(一過性虚血後の最大直径 - 基底直径)を使用して拡張の程度を計算します。
- MPC の数を、FMD のベースライン FMD 値および血管形成後デルタと相関します。
4. 四肢切断のためのMpcの予後能力
- バルーン血管形成術および患者の退院後の定期的な医療予約をスケジュールして、下肢への血流の質を評価する。
- 血管形成術後2週間で四肢虚血の臨床的重症度を評価する。ラザフォード分類13に従って、休息の痛み、下の虚血、および機能的な足の保存を解決することを評価する。
- 四肢虚血の臨床的重症度を比較, ベースラインとフォローアップで.不利な結果のために大きな切断を必要とするケースを特定します。
- PPCの数を下肢の大切断を必要とする患者の割合と相関させる。
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Representative Results
閉塞した動脈からの血液サンプルは、血管形成術に対処した部位で、68歳と20人中10人の糖尿病患者から採取された。サンプル人口の半数は喫煙者であった。血管病変は主にラザフォード級VIとして採点された。一方、患者は2型糖尿病(100%)の有病率が高く、高血圧(70%)が高いと脂質異常症 (55%)
下肢血管形成術が行われた後の30日間の臨床フォローアップ。血管形成術後のベースラインまたはダイナミクスにおけるMPC亜集団の割合は、FMDによって評価された内皮機能不全の程度と相関(スピアマン分析)した。そして、血管形成術後に四肢切断を受けている患者間で比較されたMpcのベースライン数(U-Mann Whitney)。この研究は、ベースラインMPCサブ人口CD45+CD34+KDR+がFMD(図3A、左)と負相関しているのに対し、MPCCDCD45+CD34+CD133+CD133+CD184+血管形成術後の変化はFMD改善と有意に相関することを示した(図3B、右)。さらに、亜集団CD45+CD34+KDR+のベースライン数の増加は、四肢切断に進化した患者において観察された。また、MPCサブ人口CD45+CD34+CD133+CD184+(図4A,C,右)の血管形成後の減少。
図1:下肢血管造影と採血。(A)透視下のコントラスト媒体によって証明される血管軌道。(B)血管形成術前の血管閉塞。(C)血管形成術後の血管閉塞。(D)血管外科医はカテーテルを使用して血管閉塞やアテロームプラークに最も近い場所から血液を採取し、ラボの研究者は血液サンプルを入手する準備ができている。矢印は血管閉塞部位を示す。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:血液試料調製および単核前駆細胞(Mpcs)決定(A) 密度勾配準備.(B) リンパ球環分離後血液遠心分離.(C)リンパ球期の回収(D) 遠心分離.(E)試験管の下部にペレット形成。(F)セル懸濁液数。(G) フローサイトメトリーに対するリンパ球の調製(H) フローサイトメトリーによる細胞サブ集団の測定 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:血行力学的指標とのPPCの関係(A)FMDおよび代表的な結果を取得する超音波の位置。(B) ベースライン %MPC サブ人口 (左、CD45+CD34+KDR+; 右、 CD45 + CD34+CD133+CD184 + CD184+) とベースライン FMD 値の関係。血管形成術後のFMD改善と血管形成術後の(C)%MPCの関係と同様に。略称: MPC, 単核前駆細胞;FMD、フロー媒介拡張。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:血管形成術後の下肢切断のPPCおよび予後。(A) Mpc サブ集団の代表的なフロー サイトメトリー 画像。(B) ベースライン %MPC サブオーバサム (左、CD45+CD34+KDR+; 右、 CD45+CD34+ CD133+CD184+血管形成術後の %PPC, 血管形成術後の下肢切断と 30 日の間に.略称: MPC, 単核前駆細胞.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
補足ファイル1:ラザフォードの四肢虚血の重症度の分類。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
血管ブロックの正確な部位での採血は技術的な困難を示す可能性があります。したがって、血管ブロックに近接して採血を行った。同様に、血管プラークに近いPPCの量は非常に動的であり、血管形成術の前後にバリエーションを生じる可能性があります。我々の観察によると、血管損傷および修復内で起こるいくつかの病因生理学的プロセスを反映する可能性があるため、MPCの数のベースラインおよび30分後血管形成術の変化を評価することが推奨される。
Mpcs判定のための血液サンプル処理は、最初の3時間以内に行うことを推奨します。したがって、適切な組織計画、さらには以前のシミュレーションの実践は、血管管外科チームと研究室の研究者との間で確立される可能性があります。MPCの分離は慎重に行われるべきであり、特に血液サンプルを密度勾配およびMPCを含むペレットの投下に分解する。我々のグループは細胞を細胞測定管に移し、一次抗体を加え、固定し、細胞を4°Cで一晩保存するために使用する。時間管理の便宜性のために、フローサイトメトリーの読み取りは翌日に行われる。
血管損傷および修復の有用な臨床バイオマーカーとしての循環性のPPCの役割に関しては、前駆細胞17間の免疫フェノールを標準化するための重要な努力が報告されている。包括的な特性評価には、血管疾患内のさまざまな臨床シナリオに参加している循環前駆細胞の亜集団が含まれるべきです。ここで説明する方法を用いて、Mpcサブ人口CD45+CD34+CD133+CD184+の血管形成後の減少が大切断の予測的であることを発見した。この知見は、血管損傷または血管形成術時の炎症反応が、PPCのホーミングシグナルを刺激し、局所組織修復18,19を促進するという概念を支持する。
同様に、この観察は、CD45+CD34+CD133+およびCD45+CD34+CD133+184+冠状血管形成術後の有害な心血管転帰の予測値としてMPCの亜集団の減少数の減少効果と一致し、これは、内皮形成術の分化表現型の増加能力によって説明され得る 増殖し、脈管形成刺激に応答する18.
さらに、血管形成術後のCD45+CD34+KDR+亜集団の増加は、血管修復に寄与すると考えられているものの、四肢切断と関連していると考えられた。この論争は、他の研究がCLIと健康なコントロールを有する患者間のCD45+CD34 +KDR +CPCの数を比較しているので、1)研究設計の変動のために説明することができます。2)血液採取方法のバリエーション,部位および血管形成術に関する時間を含む;3)閉塞および血管化された動脈の種類。
新しいバイオマーカーの予後特性解析は、いくつかの疾患における血管修復を担うメカニズムに基づいて、翻訳研究において大きな注目を集めている。これは、血管ブロックに近い部位で局所的に決定される、血管形成術後の血管形成術の予後において、CLIを有する場合におけるPPCの役割を探索する方法の最初の説明である。1つの制限は、血管形成術後のより多くの時点でのMpcの決定の欠如である。しかし、我々の知見は、血管損傷、修復、およびCLI患者における主要な切断の予後可能性におけるMpcの翻訳的役割を特徴付け、血管研究の分野を豊かにすると考えています。特に、ここで説明する方法は、下肢や冠動脈虚血、脳卒中、血管炎、静脈血栓症などの血管損傷や修復機構を含む臨床現場における不利な血管転帰の予測に有用であり得ると考える。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
著者らは、プロジェクトID356.2015の機関プログラムE015のサポートに感謝しています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BSA | Roche | 10735086001 | Bovine Serum Albumin (BSA) as a buffering agent, stabilizer, standard and for blending. |
| Calibration Beads | Miltenyi Biotec / MACS | #130-093-607 | MACQuant calibration beads are supplied in aqueous solution containing 0.05% sodium azide. 3.5 ml for up to 100 tests |
| CD133/1 (AC133)-PE | Milteny Biotec / MACS | #130-080-801 | Antibody conjugated to R-Phycoerythrin in PBS/EDTA buffer |
| CD184 (CXCR4)-PE-VIO770 | Miltenyi Biotec / MACS | #130-103-798 | Monoclonal, Isotype recombinant human IgG1, conjugated |
| CD309 (VEGFR-2/KDR)-APC | Miltenyi Biotec / MACS | #130-093-601 | Antibody conjugated to R-Phycoerythrin in PBS/EDTA buffer |
| CD34-FITC | Miltenyi Biotec / MACS | #130-081-001 | The monoclonal antibody clone AC136 detecs a class III epitope of the CD34 |
| CD45- VioBlue | Miltenyi Biotec / MACS | #130-092-880 | Monoclonal CD45 Antibody, human conjugated |
| Conical Tubes | Thermo SCIENTIFIC | #339651 | 15ml conical centrifuge tubes |
| Cytometry Tubes | FALCON Corning Brand | #352052 | 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube. 12x75 style. Sterile. |
| EDTA | BIO-RAD | #161-0729 | Heavy metals, (as Pb) <10ppm, Fe<0.01%, As<1ppm, Insolubles<0.005% |
| Improved Neubauer | Without brand | Without catalog number | Hemocytometer for cell counting. (range 0.1000mm, 0.0025mm2) |
| K2 EDTA Blood Collection Tubes | BD Vacutainer | #367863 | Lilac plastic vacutainer tube (K2E) 10.8mg, 6 mL. |
| Lymphoprep | Stemcell Technologies | 01-63-12-002-A | Sterile and checked on the presence of endotoxins. Density: 1.077±0.001g/mL |
| Paraformaldehyde | SIGMA-ALDRICH | #SZBF0920V | Fixation of biological samples, (powder, 95%) |
| Pipette Transfer 1,3mL | CRM Globe | PF1016, PF1015 | The transfer pipette is a tool that facilitates liquid transfer with greater accuracy. |
| Test Tubes | KIMBLE CHASE | 45060 13100 | Heat-resistant test tubes. SIZE/CAP 13 x 100 mm |
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