Summary
Amputatie van de onderste ledematen kan zelfs optreden na angioplastiek van geblokkeerde vaten in Critical Limb Ischemia (CLI). Mononucleaire progenitorcellen (MPC's) weerspiegelen vasculair herstel. Het huidige protocol beschrijft de kwantificering van MPC's uit de circulatie dicht bij angioplastiek, en de relatie met endotheeldisfunctie en voorspelling van amputatie van de onderste ledematen.
Abstract
Kritieke limbischemie (CLI) vertegenwoordigt een vergevorderd stadium van de perifere arteriële ziekte. Angioplastiek verbetert de bloedtoevoer naar het onderste ledemaat; sommige patiënten gaan echter onomkeerbaar over op amputatie van ledematen. De omvang van vasculaire schade en de mechanismen van vasculaire reparatie zijn factoren die van invloed zijn op de uitkomst van post-angioplastiek. Mononucleaire voorlopercellen (MPC's) zijn reactief op vasculaire schade en herstel, met het vermogen om vasculaire ziekten te reflecteren. Het huidige protocol beschrijft de kwantificering van MPC's verkregen uit de bloedcirculatie van het bloedvat in de buurt van de angioplastiekplaats, evenals de relatie met endotheeldisfunctie en het voorspellende vermogen voor amputatie van ledematen in de komende 30 dagen na angioplastiek bij patiënten met CLI.
Introduction
Perifere arteriële ziekte (PAD) wordt gekenmerkt door een chronische en progressieve vasculaire obstructie met beperking van de bloedtoevoer1. Op wereldschaal treft PAD van de onderste ledematen ongeveer 10% van de oudere bevolking, terwijl tot 7% van dergelijke gevallen worden onderworpen aan amputatie van ledematen2,3.
Critical Limb Ischemia (CLI) vertegenwoordigt de ernstigste presentatie van PAD1. Patiënten ervaren meestal pijn in rust, zweren of gangreen toe te schrijven aan verstopte slagaders; terwijl de klinische prognose ongunstig is en wordt gekenmerkt door een risico van 30% op amputatie en mortaliteit van ledematen gedurende 1 jaar3,4,5.
Angioplastiek is een minimaal invasieve endovasculaire procedure die de bloedtoevoer naar het onderste ledemaat kan herstellen bij patiënten met CLI; sommige patiënten zullen echter onvermijdelijk een grote amputatie van de ledematen nodig hebben, zelfs na angioplastiektherapie1,5. Vroege identificatie van ongunstige uitkomsten na angioplastiek is vrij waardevol, vanwege de mogelijkheid van therapiehandhaving.
Traditionele risicofactoren kunnen een beperkt voorspellend vermogen bieden voor grote amputatie van ledematen bij patiënten met CLI die een angioplastiek ondergaan6. Pathofysiologisch georiënteerde biomarkers vertegenwoordigen nieuwe methoden met potentiële klinische toepassingen, die specifiek nuttig kunnen zijn bij ziekten die verband houden met vasculair letsel7. Tegenwoordig is de deelname van cellulaire populaties die endotheelhersteleigenschappen bezitten, op de plaats van de atherosclerotische plaque, steeds meer erkend8,9.
Mononucleaire voorlopercellen (MPC's) zijn afgeleid van het beenmerg en eigen structurele en functionele kenmerken van stamcellen met vasculaire regeneratieve vermogens. Vanwege het vermogen van MPC om zich te verspreiden, te migreren en vasculaire therapietrouw te vertonen; deze cellen zijn goede kandidaten geworden om endotheelherstel te reflecteren als reactie op ischemie10,11,12. Bovendien heeft de voortdurende belangstelling voor mechanismen die ten grondslag liggen aan vasculair letsel het onderzoeken van de prognostische rol van lokale optredende biomarkers gemotiveerd, aangezien zij worden beschouwd als een weerspiegeling van vasculaire schade en herstel7,13,14.
Het doel van deze studie is om te beschrijven hoe de hoeveelheid MPC's kan worden bepaald die dicht bij de vasculaire obstructie circuleren bij patiënten met CLI die een angioplastiek ondergaan; en hoe de relatie tussen MPC's te evalueren met indicatoren van endotheliale disfunctie en amputatie van ledematen.
In vergelijking met de prognose op basis van comorbiditeiten en intrinsieke vasculaire kenmerken, toont de hoeveelheid lokale MPC's specifiek vermogen om klinische resultaten te voorspellen met betrekking tot endotheeldisfunctie en amputatie van ledematen. Consequent hebben sommige studies de prognostische rol van vergelijkbare biomarkers beschreven tijdens de evaluatie van patiënten met PAD15,16.
Op basis van eerdere resultaten7kan de hier beschreven methode nuttig zijn voor een vroege identificatie van de populatie met een risico op ongunstige vasculaire uitkomsten in verschillende klinische omgevingen, zoals onderste ledematen en coronaire ischemie, beroerte, vasculitis, veneuze trombose en anderen met vasculair letsel en herstel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De institutionele ethische onderzoekscommissie van Centro Médico Nacional "20 de Noviembre" ISSSTE keurde dit toekomstige protocol goed, alle ingeschreven patiënten gaven schriftelijke geïnformeerde toestemming.
1. Evaluatie van vasculair blok van onderste ledemaat, bloedafname en ballonangioplastiek
OPMERKING: De studiesteekproef die voor dit experiment werd gebruikt, bestond uit 20 diabetespatiënten van 68 jaar oud en 10 van de 20 mannen. De helft van de steekproef bestond uit rokers en de meest voorkomende co-morbiditeiten waren diabetes mellitus type 2, systemische arteriële hypertensie en/of dyslipidemie. Het monster was bedoeld om gestandaardiseerd te worden voor leeftijds-, geslachts- en co-morbiditeiten. Mogelijke vooringenomenheid als gevolg van klinisch-demografische invloed op de relatie tussen MPC's en CLI kon niet worden uitgesloten.
- Evalueer de klinische ernst van ischemie van ledematen volgens de Rutherford-classificatie13 (zie aanvullende tabel 1).
- Voer angiografie van de onderste ledematen, bloedafname en ballonangioplastiek uit.
- Gebruik antistollingsmiddel en verdovingsmiddelen vóór de operatie.
- Plaats een naald van 18 G in het bloedvat op de geselecteerde liesplaats.
- Plaats een inzender en schuif een flexibele geleidingsdraad op. Vervolgens wordt de eerste gids verder gewijzigd voor een 6 Fr-introducer.
- Gebruik periodieke injectie van contrastmiddelen of CO2 onder fluorscopische gids om slagaderbaan en vasculaire geblokkeerde plaatsen te identificeren (figuur 1).
OPMERKING: Gebruik contrastmedia 40 cc, verdund 1:1 in 0,9% zoutoplossing, of CO2 bij 10 tot 20 ml per schot bij een druk van 12 psi. - Introduceer twee 0,014 Fr navigatiegeleidingsdraden en twee 0,014 Fr-ondersteuningsgeleidingsdraden in het schip en breng ze naar de geblokkeerde locatie.
OPMERKING: Twee 0,014 Fr geleidingsdraden (260 cm lang) worden gebruikt voor navigatie en twee 0,014 Fr geleidingsdraden (260 cm lang) worden gebruikt voor ondersteuning, tijdens een enkele procedure. - Introduceer 5 Fr en 3 Fr katheters opeenvolgend en verzamel 10 ml bloed van de dichtstbijzijnde plaats bij de vasculaire obstructie. Houd bloedmonsters op ijs.
OPMERKING: Katheters maten kunnen 5 Fr en 3 Fr zijn, en ze worden gewijzigd tijdens de procedure. - Maak opnieuw een geleidingsdraad. Introduceer vervolgens een angioplastieballonkatheter, die een opblaasbare ballon aan het einde van de katheter bevat. Vervroeg de angioplastiek ballonkatheter en plaats de ballon direct op de plaats van laesie. Voer de angioplastiek uit door de ballon op te blazen tegen de blokkerende plaque aan de vaatwand. Controleer het herstel van de bloedstroom.
OPMERKING: Er kan een stent in het geblokkeerde gebied worden geplaatst om de slagader na de procedure open te houden. - Breng een katheter aan en ga naar de dichtstbijzijnde plaats bij het vasculaire blok. Verzamel 10 ml bloed met een tijdsinterval van 30 minuten na angioplastiek. Houd bloedmonsters op ijs.
OPMERKING: Het verzamelen van bloedmonsters voor en na de angioplastiek wordt aanbevolen om de invloed van de angioplastiek op het aantal MPC's verder te evalueren. - Verwijder alle draden onder fluorscopische geleiding.
- Zorg voor postoperatieve zorgprocedures, waaronder anti-stollingstherapie met enoxaparine bij 1 mg/kg subcutaan om de 12 uur, aspirine 100 mg, statine en analgesie. Kompres op de plaats van vasculaire punctie gedurende 24 uur.
2. Kwantificering van circulerende mononucleaire voorlopercellen (MPC's) (figuur 2)
- Breng in een verse conische buis van 15 ml 6 ml van het verzamelde bloed over en verdun 1:1 (v/v) met PBS.
OPMERKING: Verwerk het bloed binnen 1 uur na het verzamelen. - Bereid u voor op de scheiding van de dichtheidsgradiënt door elk 2 ml van het dichtheidsgradiëntmedium toe te voegen aan 3 reageerbuizen. Voeg vervolgens 3 aliquots van het verdunde bloed toe aan elke reageerbuis.
OPMERKING: Niet meer dan driekwart van de maximale capaciteit van de reageerbuis. - Centrifugeren bij 1.800 x g gedurende 30 min bij 4 °C. Verzamel de interfacelaag die aanwezig is als een ring met behulp van een pipet en breng over in een nieuwe buis. Voeg 2 ml PBS toe en draai op 1.800 x g gedurende 6 minuten bij 4 °C. Sla de pellet op omdat deze MPC's bevat.
- Was de pellet met MPC's met PBS door middel van centrifugatie zoals beschreven in stap 2.3. Gebruik verse PBS voor elke wasbeurt en draai op 1.800 x g gedurende 2 minuten bij 4 °C. Herhaal het proces gedurende 6 keer.
- Gebruik na de laatste wasbeurt 1 ml PBS om de celpellet opnieuw te gebruiken. Verdun 20 μL van de celsuspensie met 20 μL van 0,4% trypan blauw, 1:1 (v/v). Gebruik 10 μL van deze celsuspensie voor het tellen van cellen met behulp van hemocytometer en een lichtmicroscoop.
- Aliquot 1 x 106 MPC's in eerder gelabelde 5 ml flowcytometriebuizen.
OPMERKING: Bereid overeenkomstige isotype-afgestemde controleantilichamen voor. - Centrifugeer de buizen bij 1.800 x g gedurende 6 min bij 4 °C. Aspirateer en gooi het supernatant weg.
- Verdun primair antilichaam in 100 μL antilichaam incubatieoplossing [1x PBS, pH 7,4, EDTA 2 mM, BSA 0,05%] en voeg toe aan de buis. Resuspend gedurende 10 s en incuber gedurende 20 min bij 4 °C, in het donker.
OPMERKING: De uiteindelijke concentraties primaire antilichamen die in dit protocol worden gebruikt, waren CD45 1:50, CD34 1:20, KDR 1:50, CD184 1:20, CD133 1:50. Het protocol kan bij deze stap worden gestopt door lymfocyten in 4% paraformaldehyde in PBS te fixeren en monsters tot 24 uur bij 4 °C op te slaan. - Centrifugeer bij 1.800 x g gedurende 2 min bij 4 °C en gooi het supernatant weg. Resuspend in 500 μL van 1x PBS, pH 7,4, EDTA 2 mM.
- Voer flowcytometrie analyse uit.
- Stel de achtergrond in met isotype-afgestemde controle antilichamen. Vervolgens, bij de FSC / SSC plot select lymfocyten verspreid, proberen uit te sluiten cellulair puin, resterende granulocyten, en andere deeltjes. Een dergelijke verdeling wordt beschouwd als 100%.
OPMERKING: Lymfocyten verspreiden zich meestal in het linkerondergebied van het perceel. - Gebruik een poort met gemeenschappelijk immunofenotype met een hoog aantal cellen CD45+ en CD34+. Selecteer vervolgens voor dubbele positieve immunofenotypen met behulp van gate die eerder CD45+, CD34+identificeerde en voeg KDR (VEGFR-2)+, CD133+ of CD184+toe. Identificeer MPC's subpopulaties aan de den van hun specifieke celoppervlakmarkeringen. Rapporteer als het percentage gated events.
- Stel de achtergrond in met isotype-afgestemde controle antilichamen. Vervolgens, bij de FSC / SSC plot select lymfocyten verspreid, proberen uit te sluiten cellulair puin, resterende granulocyten, en andere deeltjes. Een dergelijke verdeling wordt beschouwd als 100%.
- Identificeer de belangrijkste subpopulaties van MPC's. In deze studie waren de geanalyseerde immunofenotypen CD45+CD34+CD133+; CD45+CD34+CD184+; CD45+CD34+CD133+CD184+; CD45+CD34+KDR+; CD45+CD34+KDR+CD133+ en CD45+CD34+KDR+CD1847,17.
OPMERKING: Deze celoppervlakmarkers werden gebruikt voor het onderzoek: CD45 (lymfocyten), CD34 (endotheel- en/of vasculaire cellen), KDR (VEGFR-2) (membraanmarker van endotheelcellen), CD133 (endotheelvereditorcellen) en CD184 (hematopoëtische stamcellen en endotheelcellen).
3. Relatie van MPC's met wijziging van endotheelfunctie en hemodynamische test (FMD)
- Bepaal flow-gemedieerde dilatatie (FMD), pre- en post-angioplastiek.
- Gebruik een vasculaire lineaire transducer om de diameter van de brachiale slagader te meten.
- Plaats de manchet van de sphygmomanometer boven de meetplaats in de onderarm en insufflaat gedurende 5 minuten op 50 mmHg boven de systolische bloeddruk en leeg.
- Bepaal opnieuw de diameter van de brachiale slagader binnen de volgende 60 s. Gebruik de onderstaande vergelijking om MKZ te schatten.
OPMERKING: Bereken de mate van dilatatie met behulp van de vergelijking (%) = (maximale diameter na voorbijgaande ischemie - basale diameter) × 100 / basale diameter.
- Correleer het aantal MPC's met de baseline FMD-waarde en post-angioplastie delta van FMD.
4. Prognostisch vermogen van MPC's voor amputatie van ledematen
- Plan periodieke medische afspraken na ballonangioplastiek en patiëntontlading, om de kwaliteit van de bloedtoevoer naar het onderste ledemaat te evalueren.
- Evalueer de klinische ernst van ledemaatischemie na 2 weken na angioplastiek. Evalueer het oplossen van rustpijn, lagere ischemie en het behoud van een functionele voet, volgens de Rutherford-classificatie13.
- Vergelijk de klinische ernst van ledemaatischemie, bij aanvang versus follow-up. Identificeer die gevallen die een grote amputatie vereisen als gevolg van een ongunstige uitkomst.
- Correleer het aantal MPC's met het percentage patiënten dat een grote amputatie van het onderste ledemaat nodig heeft.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bloedmonsters van geblokkeerde slagaders, op de plaats gericht voor angioplastiek, werden verzameld bij 20 diabetespatiënten, 68 jaar oud en 10 van de 20 mannen. De helft van de steekproefpopulatie was roker. Vasculaire laesies werden voornamelijk gescoord als Rutherford klasse VI; overwegende dat patiënten een hogere prevalentie van type 2 Diabetes Mellitus (100%), hypertensie (70%) dyslipidemie (55%).
Een klinische follow-up van 30 dagen na angioplastiek van de onderste ledematen werd uitgevoerd. Het percentage MPC-subpopulaties bij baseline of dynamica na angioplastiek werd gecorreleerd (Spearman-analyse) met de mate van endotheeldisfunctie, zoals geëvalueerd door FMD; en het uitgangsaantal MPC's werden vergeleken tussen patiënten die al dan niet een amputatie van ledematen ondergingen na angioplastiek (U-Mann Whitney). De studie toonde aan dat baseline MPC's subpopulatie CD45+CD34+KDR+ negatief gecorreleerd met FMD (figuur 3A, links), terwijl de verandering van MPC's CD45+CD34+CD133+CD184+ na angioplastiek significant correleerde met FMD-verbetering(figuur 3B, rechts). Bovendien werd een verhoogd uitgangsgetal van MPC's subpopulatie CD45+CD34+KDR+ (figuur 4A,B, links) waargenomen bij patiënten die evolueerden naar amputatie van ledematen; evenals post-angioplastiek vermindering van MPC's subpopulatie CD45+CD34+CD133+CD184+ (Figuur 4A,C, rechts).
Figuur 1: Angiografie van de onderste ledematen en bloedafname. (A) Vasculaire baan die wordt aangetoond door contrastmedia onder fluoroscopie. (B) Vasculaire obstructie vóór angioplastiek. (C) Vasculaire obstructie na angioplastiek. (D) Vaatchirurg gebruikt een katheter om bloed te verzamelen van de dichtstbijzijnde locatie tot de vasculaire obstructie en atheroma plaque, en Lab onderzoeker is klaar om het bloedmonster te verkrijgen. Pijlen geven de plaats van vasculaire obstructies aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Bloedmonstervoorbereiding en mononucleaire voorlopercellen (MPC's) bepaling. (A) Dichtheid gradiënt voorbereiding. (B) Lymfocyten ringscheiding na bloedcentrifugatie. (C) Verzameling van de lymfocytenfase. (D) Centrifugatie. (E) Pelletvorming aan de onderkant van de reageerbuis. (F) Aantal celophangingen. (G) Voorbereiding van lymfocyten voor flowcytometrie. (H) Bepaling van celsubpopulaties door flowcytometrie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Relatie van MPC's met hemodynamische indicatoren. (A) Positie van de echografie om FMD en representatieve resultaten te verkrijgen. (B) Relatie tussen basislijn %MPC's subpopulaties (links, CD45+CD34+KDR+; rechts, CD45+CD34+CD133+CD184+) en baseline FMD-waarden; evenals de relatie van (C) %MPC's na angioplastiek met FMD-verbetering na angioplastiek. Abbreviatures: MPC's, Mononucleaire Voorlopercellen; FMD, Flow Gemedieerde Dilatatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: MPC's en prognose van amputatie van de onderste ledematen na angioplastiek. (A) Representatieve flowcytometriebeelden van MPC's subpopulaties. (B) De associatie van baseline %MPC's subpopulaties (links, CD45+CD34+KDR+; rechts, CD45+CD34+CD133+CD184+), of (C) %MPC's na angioplastiek, met amputatie van de onderste ledematen na angioplastiek, tijdens een follow-up van 30 dagen. Abbreviatures: MPC's, Mononucleaire Voorlopercellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullend dossier 1: Rutherford's classificatie van de ernst van ledemaatischemie. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bloedafname op de precieze plaats van het vasculaire blok kan technische problemen vertonen; daarom hebben we bloedafname uitgevoerd in de nabijheid van vasculair blok. Evenzo lijkt de hoeveelheid MPC's dicht bij de vasculaire plaque zeer dynamisch te zijn en kan variaties ontstaan voor en na angioplastiek. Volgens onze observaties wordt aanbevolen om baseline- en 30min-post-angioplastieveranderingen in het aantal MPC's te evalueren, omdat ze verschillende patofysiologische processen kunnen weerspiegelen die optreden bij vasculaire schade en herstel.
Bloedmonsterverwerking voor de bepaling van MPC's wordt aanbevolen om binnen de eerste 3 uur te worden uitgevoerd; daarom kan een adequaat organisatieplan en zelfs een eerdere simulatiepraktijk worden opgesteld tussen het angiologie-vasculaire chirurgieteam en laboratoriumonderzoekers. De isolatie van MPC's moet zorgvuldig worden uitgevoerd, met name door bloedmonsters in dichtheidsgradiënt en wasbeurten van de pellet met MPC's te gieten. Ons groepsgebruik om cellen over te brengen in cytometriebuis, primaire antilichamen toe te voegen, cellen 's nachts bij 4 °C te fixeren en op te slaan; vanwege het gemak van tijdsbeheer en de cytometrie van de stroom zou de dag erna worden uitgevoerd.
Met betrekking tot de rol van circulerende MPC's als een nuttige klinische biomarker van vasculaire schade en herstel, zijn belangrijke inspanningen gemeld om immunofenotypen tussen voorlopercellen te standaardiseren17. Een alomvattende karakterisering moet subpopulaties omvatten van circulerende voorlopercellen die deelnemen aan de verschillende klinische scenario's binnen vasculaire ziekten. Met behulp van de hier beschreven methoden ontdekten we dat post-angioplastiekreductie van MPC's subpopulatie CD45+CD34+CD133+CD184+ voorspellend is voor grote amputatie. Deze bevinding ondersteunt het idee dat inflammatoire respons tijdens vasculaire letsel of angioplastiek homing signalen voor MPC's stimuleert, ter bevordering van lokaal weefselherstel18,19.
Evenzo is de observatie consistent met het gerapporteerde effect van een verminderd aantal CD45+CD34+CD133+ en CD45+CD34+CD133+184+ subpopulaties van MPC's als voorspeller van ongunstige cardiovasculaire uitkomsten na coronaire angioplastiek7, wat kan worden verklaard door het toegenomen vermogen van minder gedifferentieerde fenotypen van endotheelvoorlopers om zich te hechten aan extracellulaire matrix, om zich te verspreiden en te reageren op vasculogene stimulus18.
Bovendien merkten we op dat een verhoogd aantal CD45+CD34+KDR+ subpopulatie van MPC's na angioplastiek verband hield met amputatie van ledematen, hoewel ze werden beschouwd als een bijdrage aan vasculaire reparatie. Deze controverse kan worden verklaard als gevolg van: 1) variaties in het studieontwerp, aangezien andere studies het aantal CD45+CD34+KDR+ MPC's tussen patiënten met CLI en gezonde controles hebben vergeleken19; 2) variaties in de methoden voor bloedafname, met inbegrip van de plaats en de tijd met betrekking tot de angioplastiek; en 3) het type slagader geblokkeerd en vascularized.
Prognostische karakterisering van nieuwe biomarkers, gebaseerd op mechanismen die verantwoordelijk zijn voor vasculaire reparatie bij verschillende ziekten, heeft veel aandacht gekregen in translationeel onderzoek. Dit is de eerste beschrijving van een methode om de rol van MPC's te onderzoeken, lokaal bepaald op een locatie dicht bij het vasculaire blok, in de prognose van amputatie van ledematen na angioplastiek in gevallen met CLI. Een beperking is het gebrek aan mpc's bepaling op meer tijdstipn na angioplastiek. We geloven echter dat onze bevindingen het gebied van vasculair onderzoek verrijken door de translationele rol van MPC's te karakteriseren tijdens vasculaire schade, herstel en prognostisch potentieel voor grote amputatie bij patiënten met CLI. In het bijzonder zijn we van mening dat de hier beschreven methode nuttig kan zijn bij de voorspelling van ongunstige vasculaire uitkomsten in klinische omgevingen met een vasculair letsel en reparatiemechanismen, zoals onderste ledematen en coronaire ischemie, beroerte, vasculitis en/ of veneuze trombose.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs danken de steun van Institutioneel Programma E015 voor het project ID 356.2015.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BSA | Roche | 10735086001 | Bovine Serum Albumin (BSA) as a buffering agent, stabilizer, standard and for blending. |
| Calibration Beads | Miltenyi Biotec / MACS | #130-093-607 | MACQuant calibration beads are supplied in aqueous solution containing 0.05% sodium azide. 3.5 ml for up to 100 tests |
| CD133/1 (AC133)-PE | Milteny Biotec / MACS | #130-080-801 | Antibody conjugated to R-Phycoerythrin in PBS/EDTA buffer |
| CD184 (CXCR4)-PE-VIO770 | Miltenyi Biotec / MACS | #130-103-798 | Monoclonal, Isotype recombinant human IgG1, conjugated |
| CD309 (VEGFR-2/KDR)-APC | Miltenyi Biotec / MACS | #130-093-601 | Antibody conjugated to R-Phycoerythrin in PBS/EDTA buffer |
| CD34-FITC | Miltenyi Biotec / MACS | #130-081-001 | The monoclonal antibody clone AC136 detecs a class III epitope of the CD34 |
| CD45- VioBlue | Miltenyi Biotec / MACS | #130-092-880 | Monoclonal CD45 Antibody, human conjugated |
| Conical Tubes | Thermo SCIENTIFIC | #339651 | 15ml conical centrifuge tubes |
| Cytometry Tubes | FALCON Corning Brand | #352052 | 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube. 12x75 style. Sterile. |
| EDTA | BIO-RAD | #161-0729 | Heavy metals, (as Pb) <10ppm, Fe<0.01%, As<1ppm, Insolubles<0.005% |
| Improved Neubauer | Without brand | Without catalog number | Hemocytometer for cell counting. (range 0.1000mm, 0.0025mm2) |
| K2 EDTA Blood Collection Tubes | BD Vacutainer | #367863 | Lilac plastic vacutainer tube (K2E) 10.8mg, 6 mL. |
| Lymphoprep | Stemcell Technologies | 01-63-12-002-A | Sterile and checked on the presence of endotoxins. Density: 1.077±0.001g/mL |
| Paraformaldehyde | SIGMA-ALDRICH | #SZBF0920V | Fixation of biological samples, (powder, 95%) |
| Pipette Transfer 1,3mL | CRM Globe | PF1016, PF1015 | The transfer pipette is a tool that facilitates liquid transfer with greater accuracy. |
| Test Tubes | KIMBLE CHASE | 45060 13100 | Heat-resistant test tubes. SIZE/CAP 13 x 100 mm |
References
- Serrano-Hernando, F. J., Martín-Conejero, A. Peripheral artery disease: Pathophysiology, diagnosis and treatment. Revista Española de Cardiología. 60 (9), 969-982 (2007).
- Agarwal, S., et al. Burden of re-admissions among patients with critical limb ischemia. Journal of the American College of Cardiology. 69 (15), 1897-1908 (2017).
- Kolte, D., et al. Thirty-day re-admissions after endovascular or surgical therapy for critical limb ischemia: Analysis of the 2013 to 2014 nationwide re-admissions databases. Circulation. 136 (2), 167-176 (2017).
- Rowlands, T. E., Donnelly, R. Medical therapy for intermittent claudication. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 34, 314-321 (2007).
- Cronewett, J. L. Acute limb ischemia and lower extremity chronic arterial disease: Rutherford's vascular surgery (8th ed.). , Saunders Elsevier. Philadelphia, PA. (2014).
- Dick, F., et al. Surgical or endovascular revascularization in patients with critical limb ischemia: influence of diabetes mellitus on clinical outcome. Journal of Vascular Surgery. 45 (4), 751-761 (2007).
- Suárez-Cuenca, J. A., et al. Coronary circulating mononuclear progenitor cells and soluble biomarkers in the cardiovascular prognosis after coronary angioplasty. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (7), 4844-4849 (2019).
- Franz, R., et al. Use of autologous bone marrow mononuclear cell implantation therapy as a limb salvage procedure in patients with severe peripheral arterial disease. Journal of Vascular Surgery. 50 (6), 1378-1390 (2009).
- Benoit, E., O'Donnell, T. F., Patel, A. N. Safety and efficacy of autologous cell therapy in critical limb ischemia: A systematic review. Cellular Transplantation. 22 (3), 545-562 (2013).
- Hill, J. M., et al. Circulating endothelial progenitor cells, vascular function, and cardiovascular risk. New England Journal of Medicine. 348 (7), 593-600 (2003).
- Schmidt-Lucke, C., et al. Reduced number of circulating endothelial progenitor cells predicts future cardiovascular events: proof of concept for the clinical importance of endogenous vascular repair. Circulation. 111 (22), 2981-2987 (2005).
- Smadja, D. M. Early endothelial progenitor cells in bone marrow are a biomarker of cell therapy success in patients with critical limb ischemia. Cytotherapy. 14 (2), 232-239 (2012).
- Kremastinos, D. T., et al. Intracoronary cyclic-GMP and cyclic-AMP during percutaneous transluminal coronary angioplasty. International Journal of Cardiology. 53 (3), 227-232 (1996).
- Truong, Q. A., Januzzi, J. L., Szymonifka, J., Thai, W. E., Wai, B., Lavender, Z. Coronary sinus biomarker sampling compared to peripheral venous blood for predicting outcomes in patients with severe heart failure undergoing cardiac resynchronization therapy: the BIOCRT study. Heart Rhythm. 11 (12), 2167-2175 (2014).
- Ding, N., et al. Fibrosis and inflammatory markers and long-term risk of peripheral artery disease: The ARIC study. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 40 (9), 2322-2331 (2020).
- Potier, L., et al. Plasma copeptin and risk of lower-extremity amputation in Type 1 and Type 2 diabetes. Diabetes Care. 40 (12), 2290-2297 (2019).
- Schmidt-Lucke, C., et al. Quantification of circulating endothelial progenitor cells using the modified ISHAGE protocol. PLoS One. 5 (1), 13790 (2010).
- Marboeuf, P., et al. Inflammation triggers colony forming endothelial cell mobilization after angioplasty in chronic lower limb ischemia. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 6 (1), 195-197 (2008).
- Regueiro, A., et al. Mobilization of endothelial progenitor cells in acute cardiovascular events in the PROCELL study: Time-course after acute myocardial infarction and stroke. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 80, 146-155 (2015).
