חיזוי קטיעה באמצעות תאי אב מונונוקלאואריים במחזור מקומי בחולים שטופלו באנגיופלסטיקה עם איסכמיה קריטית של הגפיים

Summary

קטיעה בגפיים התחתונות עלולה להתרחש גם לאחר אנגיופלסטיקה של כלי דם חסומים באיסכמיה של גפיים קריטיות (CLI). תאי אב מונונוקולריים (MPCs) משקפים תיקון כלי דם. הפרוטוקול הנוכחי מתאר את הכימות של MPCs מהמחזור קרוב אנגיופלסטיקה, ואת הקשר שלה עם תפקוד אנדותל וחיזוי של קטיעה בגפיים התחתונות.

Abstract

איסכמיה קריטית של הגפיים (CLI) מייצגת שלב מתקדם של מחלת העורקים ההיקפית. אנגיופלסטיקה משפרת את זרימת הדם לגפה התחתונה; עם זאת, חלק מהחולים להתקדם באופן בלתי הפיך לקטיעה בגפיים. היקף הנזק לכלי הדם ואת המנגנונים של תיקון כלי הדם הם גורמים המשפיעים על התוצאה שלאחר אנגיופלסטיקה. תאי אב מונונוקולריים (MPCs) מגיבים לנזק כלי דם ותיקון, עם היכולת לשקף מחלות כלי דם. הפרוטוקול הנוכחי מתאר כימות של MPCs המתקבלים ממחזור הדם מכלי קרוב לאתר אנגיופלסטיקה, כמו גם את הקשר שלה עם תפקוד אנדותל ואת יכולת החיזוי שלה לקטיעה גפיים ב -30 הימים הבאים לאחר אנגיופלסטיקה בחולים עם CLI.

Introduction

מחלת עורקים היקפית (PAD) מאופיינת בחסימה כלי דם כרונית ומתקדמת עם הגבלת אספקת הדם¹. בקנה מידה עולמי, PAD של הגפיים התחתונות משפיע על כ -10% מהאוכלוסייה המבוגרת, בעוד עד 7% מהמקרים האלה מוגשים לקטיעה גפיים^2,3.

איסכמיה גפיים קריטיות (CLI) מייצגת את המצגת החמורה ביותר של PAD¹. חולים בדרך כלל חווים כאב במנוחה, כיבים, או נמק המיוחס לעורקים occluded; בעוד פרוגנוזה קלינית היא שלילית מסומן על ידי סיכון של 30% של קטיעה ותמותה במהלך 1 שנה^3,4,5.

אנגיופלסטיקה היא הליך אנדווסקולרי זעיר פולשני שיכול להחזיר את זרימת הדם לגפה התחתונה בחולים עם CLI; עם זאת, חלק מהחולים בהכרח דורשים קטיעה גדולה של הגפיים, גם לאחר טיפול אנגיופלסטיקה^1,5. זיהוי מוקדם של תוצאות שליליות לאחר אנגיופלסטיקה הוא בעל ערך רב למדי, בשל האפשרות של אכיפה טיפולית.

גורמי סיכון מסורתיים עשויים לספק יכולת חיזוי מוגבלת לקטיעה משמעותית של הגפיים בחולים עם CLI העוברים אנגיופלסטיקה⁶. סמנים ביולוגיים מונחי פתופיזיולוגיה מייצגים שיטות חדשניות עם יישומים קליניים פוטנציאליים, אשר עשוי לגרום שימושי במיוחד במחלות הקשורות לפציעה בכלי הדם⁷. כיום, ההשתתפות של אוכלוסיות הסלולר בעלות תכונות תיקון אנדותל, באתר של לוח טרשת עורקים, הוכרה יותר^{ויותר 8,9}.

תאי אב מונונוקולריים (MPCs) נגזרים ממח העצם ומאפיינים מבניים ותפקודיים משלו של תאי גזע עם יכולות רגנרטיביות של כלי הדם. בשל היכולת של MPC להתרבות, לנדוד ולהראות דבקות בכלי הדם; תאים אלה הפכו מועמדים טובים כדי לשקף תיקון אנדותל בתגובה איסכמיה^10,11,12. בנוסף, עניין מתמשך במנגנונים שבבסיס פגיעה בכלי הדם הניע לחקור את התפקיד הפרוגנוסטי של סמנים ביולוגיים מקומיים המתרחשים, שכן הם נחשבים לשקף נזק לכלי הדם ולתקן^7,13,14.

מטרת המחקר הנוכחי היא לתאר כיצד לקבוע את כמות חברי הפרלמנט המסתובבים קרוב לחסימת כלי הדם בחולים עם CLI שעברו אנגיופלסטיקה; וכיצד להעריך את הקשר בין חברי פרלמנט עם אינדיקטורים של תפקוד לקוי של אנדותל וכריתת איברים.

בהשוואה לפרוגנוזה המבוססת על מחלות רקע ותכונות כלי דם מהותיות, כמות חברי הפרלמנט המקומיים מראה יכולת ספציפית לחזות תוצאה קלינית לגבי תפקוד לקוי של אנדותל וכריתת גפיים. באופן עקבי, מספר מחקרים תיארו את התפקיד הפרוגנוסטי של סמנים ביולוגיים דומים במהלך הערכת חולים עם PAD^15,16.

בהתבסס על תוצאות^{קודמות 7}, השיטה המתוארת כאן עשויה להיות שימושית לזיהוי מוקדם של האוכלוסייה בסיכון לתוצאות כלי דם שליליות במספר הגדרות קליניות, כגון גפיים תחתונות ואיסכמיה כלילית, שבץ מוחי, דלקת כלי דם, פקקת ורידית ואחרים הכרוכים בפגיעה בכלי הדם ותיקון.

Protocol

ועדת האתיקה של המחקר המוסדי של Centro Médico Nacional "20 de Noviembre" ISSSTE אישרה פרוטוקול פוטנציאלי זה, כל המטופלים הרשומים סיפקו הסכמה מדעת בכתב.

1. הערכת בלוק כלי הדם של הגפה התחתונה, דגימת דם ואנגיופלסטיקה בלון

הערה: מדגם המחקר המשמש לניסוי זה כלל 20 חולי סוכרת, בני 68 ו -10 מתוך 20 היו גברים. מחצית מהמדגם היו מעשנים ורוב התחלואה המשותפת השכיחה הייתה סוכרת מסוג 2, יתר לחץ דם עורקי מערכתי ו/או דיסליפידמיה. המדגם נועד להיות סטנדרטי לגיל, מין ותחלואה משותפת. לא ניתן לשלול הטיה אפשרית עקב השפעה קלינית-דמוגרפית על הקשר בין MPCs לבין CLI.

1. להעריך את החומרה הקלינית של איסכמיה גפיים על פי סיווג רתרפורד¹³ (ראה טבלה משלימה 1).
2. בצע אנגיוגרפיה של הגפיים התחתונות, דגימת דם ואנגיופלסטיקה של בלון.
   1. יש להשתמש בתרופות נוגדות קרישה ומרדים לפני הניתוח.
   2. מניחים מחט 18 G לתוך כלי הדם באתר המפשעה שנבחר.
   3. הנח מבוא וקדם חוט מדריך גמיש. לאחר מכן, המדריך הראשוני משתנה עוד יותר עבור מבוא 6 Fr.
   4. השתמש בהזרקה תקופתית של מדיית ניגודיות או CO₂ תחת מדריך פלואורוסקופי לזיהוי מסלול עורקים ואתרים חסומים בכלי הדם (איור 1).
      הערה: השתמש במדיית ניגודיות 40 סמ"ק, מדולל 1:1 ב 0.9% מלוחים, או CO₂ ב 10 עד 20 מ"ל לכל ירייה בלחץ של 12 psi.
   5. הצג שני חוטי מדריך ניווט 0.014 Fr ושני חוטי מדריך תמיכה 0.014 Fr לתוך כלי השיט ולקדם אותם עד לאתר החסום.
      הערה: שני חוטי מדריך Fr 0.014 (באורך 260 ס"מ) משמשים לניווט ושני חוטי מדריך Fr 0.014 (באורך 260 ס"מ) משמשים לתמיכה, במהלך הליך יחיד.
   6. הצג 5 Fr ו 3 קטטרים Fr ברצף ולאסוף 10 מ"ל של דם מהאתר הקרוב ביותר לחסימת כלי הדם. לשמור דגימות דם על קרח.
      הערה: גודל קטטרים עשוי להיות 5 Fr ו 3 Fr, והם השתנו במהלך ההליך.
   7. קדם שוב חוט מדריך. לאחר מכן, הציגו קטטר בלון אנגיופלסטיקה, המכיל בלון מתנפח הממוקם בקצה הקטטר. לקדם את קטטר בלון אנגיופלסטיקה ומניחים את הבלון ממש באתר של נגע. בצע את אנגיופלסטיקה על ידי ניפוח הבלון נגד לוח החוסם הממוקם על קיר כלי הדם. לאמת את שיקום זרימת הדם.
      הערה: סטנט עשוי להיות ממוקם באזור החסום כדי לסייע בשמירה על העורק פתוח לאחר ההליך.
   8. הציגו קטטר והתקדמו לאתר הקרוב ביותר לבלוק כלי הדם. לאסוף 10 מ"ל של דם במרווח זמן של 30 דקות לאחר אנגיופלסטיקה. לשמור דגימות דם על קרח.
      הערה: אוסף של דגימות דם לפני ואחרי אנגיופלסטיקה מומלץ להעריך עוד יותר את ההשפעה של אנגיופלסטיקה על מספר MPCs.
   9. הסר את כל החוטים תחת הדרכה פלואורוסקופית.
   10. לספק טיפול לאחר הניתוח נהלים, כולל טיפול נגד קרישה באמצעות enoxaparin ב 1 מ"ג/ק"ג תת עורית כל 12 שעות, אספירין 100 מ"ג, סטטין, משכך כאבים. לדחוס באתר של ניקור כלי דם במהלך 24 שעות.

2. כימות של תאי אב מונונוקאריים במחזור (MPCs) (איור 2)

1. לצינור חרוט טרי של 15 מ"ל, העבירו 6 מ"ל מהדם שנאסף ודללו 1:1 (v/v) עם PBS.
   הערה: לעבד את הדם בתוך 1 שעה מן האוסף.
2. היכונו להפרדת הדרגתית בצפיפות, על ידי הוספת 2 מ"ל של מעבר צבע צפיפות בינוני עד 3 מבחנות כל אחת. לאחר מכן, להוסיף 3 aliquots נפח שווה של הדם מדולל לתוך כל מבחנה.
   הערה: אין לחרוג משלושה רבעים מהקיבולת המקסימלית של המבחנה.
3. צנטריפוגה ב 1,800 x גרם במשך 30 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. אסוף את שכבת הממשק הקיימת כטבעת באמצעות פיפטה, והעבר לצינור חדש. הוסף 2 מ"ל של PBS ולסובב ב 1,800 x גרם במשך 6 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. שמור את גלולה כמו זה יכיל MPCs.
4. לשטוף את גלולה המכילה MPCs עם PBS על ידי צנטריפוגה כמתואר בשלב 2.3. השתמש PBS טרי עבור כל לשטוף ולהסתובב ב 1,800 x גרם במשך 2 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. חזור על התהליך במשך 6 פעמים.
5. לאחר הכביסה האחרונה, להשתמש 1 מ"ל של PBS כדי resuspend גלולה התא. לדלל 20 μL של השעיית התא עם 20 μL של 0.4% כחול trypan, 1:1 (v / v). השתמש 10 μL של השעיית תא זה לספירת תאים באמצעות המוציטרומטר ומיקרוסקופ אור.
6. Aliquot 1 x 10⁶ MPCs ב צינורות cytometry זרימה 5 מ"ל שכותרתו בעבר.
   הערה: הכינו נוגדני בקרה תואמי איסוטיפ מתאימים.
7. צנטריפוגה הצינורות ב 1,800 x גרם במשך 6 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. לשאוף ולהשליך את העל טבעי.
8. לדלל נוגדן ראשוני ב 100 μL של פתרון דגירה נוגדנים [1x PBS, pH 7.4, EDTA 2 mM, BSA 0.05%] ולהוסיף לצינור. resuspend עבור 10 s ודגרת במשך 20 דקות ב 4 מעלות צלזיוס, בחושך.
   הערה: הריכוזים הסופיים של נוגדנים ראשוניים המשמשים בפרוטוקול הנוכחי היו CD45 1:50, CD34 1:20, KDR 1:50, CD184 1:20, CD133 1:50. פרוטוקול ניתן לעצור בשלב זה על ידי תיקון לימפוציטים ב 4% paraformaldehyde ב PBS ואחסון דגימות עד 24 שעות ב 4 מעלות צלזיוס.
9. צנטריפוגה ב 1,800 x גרם במשך 2 דקות ב 4 מעלות צלזיוס ולהשליך את supernatant. הוצאה מחדש ב 500 μL של 1x PBS, pH 7.4, EDTA 2 מ"מ.
10. בצע ניתוח ציטומטריית זרימה.
    1. הגדר את הרקע עם נוגדני בקרה תואמי isotype. לאחר מכן, על העלילה FSC / SSC לבחור התפשטות לימפוציטים, מנסה להוציא פסולת הסלולר, גרנולוציטים שיורית, וחלקיקים אחרים. התפלגות כזו נחשבת ל-100%.
       הערה: לימפוציטים מתפשטים בדרך כלל באזור השמאלי התחתון של העלילה.
    2. השתמש בשער עם אימונופנוטיפ משותף המכיל מספר גבוה של תאים CD45⁺ ו- CD34⁺. לאחר מכן, בחר עבור אימונופנוטיפים חיוביים כפולים באמצעות שער שזיהה בעבר CD45⁺, CD34⁺, והוספת KDR (VEGFR-2)⁺, CD133⁺ או CD184⁺. זהה תת-אוכלוסיות MPCs לפי סמני פני התא הספציפיים שלהם. דווח כאחוז האירועים המגודרים.
11. זהה תת-אוכלוסיות ראשיות של קבצי MPC. במחקר הנוכחי האימונופנוטיפים שנותחו היו CD45⁺CD34⁺CD133⁺; CD45⁺CD34⁺CD184^{+ ;} CD45⁺CD34⁺CD133⁺CD184^{+ ;} CD45⁺CD34⁺KDR^{+ ;} CD45⁺CD34⁺KDR⁺CD133⁺ ו- CD45⁺CD34⁺KDR⁺CD184^7,17.
    הערה: סמני משטח תאים אלה שימשו למחקר: CD45 (לימפוציטים), CD34 (תאי אנדותל ו/או כלי דם), KDR (VEGFR-2) (סמן קרום של תאי אנדותל), CD133 (תאי אב אנדותל) ו- CD184 (תאי גזע hematopoietic ותאי אנדותל).

3. יחס של MPCs עם שינוי של תפקוד אנדותל ומבחן המודינמי (FMD)

1. קבע תזוזה בתיווך זרימה (FMD), לפני ואחרי אנגיופלסטיקה.
   1. השתמש מתמר ליניארי כלי דם כדי למדוד את קוטר העורק brachial.
   2. מניחים את השרוול של sphygmomanometer מעל אתר המדידה באמה ואת האי ספיקה ב 50 מ"מ ח"ג מעל לחץ הדם הסיסטולי במשך 5 דקות לנפח.
   3. לקבוע שוב את הקוטר של עורק החזה בתוך 60 s הבא. השתמש במשוואה שלהלן כדי להעריך את FMD.
      הערה: לחשב את מידת החלוקה באמצעות המשוואה (%) = (קוטר מרבי לאחר איסכמיה חולפת - קוטר הבסיס) × 100 / קוטר הבסיס.
2. תאם את מספר קבצי ה- MPC עם ערך FMD הבסיסי והדלתא שלאחר אנגיופלסטיקה של FMD.

4. יכולת פרוגנוסטית של חברי פרלמנט לקטיעה בגפיים

1. קבעו תורים רפואיים תקופתיים לאחר אנגיופלסטיקה של בלון ופריקה מהמטופל, כדי להעריך את איכות זרימת הדם לגפה התחתונה.
2. להעריך את החומרה הקלינית של איסכמיה גפיים ב 2 שבועות לאחר אנגיופלסטיקה. להעריך את פתרון כאבי מנוחה, איסכמיה נמוכה יותר, ושימור של רגל תפקודית, על פי סיווג רתרפורד¹³.
3. השווה את החומרה הקלינית של איסכמיה גפיים, בבסיס לעומת מעקב. זהה מקרים אלה הדורשים קטיעה גדולה עקב תוצאה שלילית.
4. לתאם את מספר MPCs עם שיעור החולים הדורשים קטיעה גדולה של הגפה התחתונה.

Representative Results

דגימות דם מעורקים חסומים, באתר שטופלו באנגיופלסטיקה, נאספו מ-20 חולי סוכרת, בני 68 ו-10 מתוך 20 היו גברים. מחצית מאוכלוסיית המדגם היו מעשנים. נגעים בכלי הדם הובקעו בעיקר בשם רתרפורד מחלקה 6; בעוד חולים הראו שכיחות גבוהה יותר של סוכרת מסוג 2 (100%), יתר לחץ דם (70%) ודיסליפידמיה (55%).

מעקב קליני של 30 יום לאחר אנגיופלסטיקה בגפיים התחתונות בוצע. אחוז אוכלוסיות המשנה של MPC בקו הבסיס או בדינמיקה לאחר אנגיופלסטיקה היה בקורלציה (ניתוח ספירמן) עם מידת תפקוד לקוי של אנדותל, כפי שהוערך על ידי FMD; ואת המספר הבסיסי של MPCs הושוו בין חולים שעברו, או לא, קטיעה גפיים לאחר אנגיופלסטיקה (U-מאן ויטני). המחקר הראה כי CD45⁺CD34 + KDR⁺ בקורלציה שלילית עם FMD (איור 3A, שמאל), ואילו השינוי של MPCs CD45⁺CD34⁺CD133⁺CD184⁺ לאחר אנגיופלסטיקה בקורלציה משמעותית עם שיפור FMD (איור 3B, ימין). יתר על כן, מספר בסיסי מוגבר של CD45 + CD34⁺KDR⁺(איור 4A,B,שמאל) נצפו בחולים שהתפתחו לקטיעה בגפיים; כמו גם הפחתה שלאחר אנגיופלסטיקה של CD45⁺CD34⁺CD133⁺CD184⁺ (איור 4A, C, זכות).

איור 1: אנגיוגרפיה של איבר תחתון ואיסוף דם. (A)מסלול כלי דם מעיד על ידי מדיה מנוגדת תחת פלואורוסקופיה. חסימתכלי דם לפני אנגיופלסטיקה. (C)חסימת כלי דם לאחר אנגיופלסטיקה. מנתחכלי דם משתמש בקטטר כדי לאסוף דם מהמיקום הקרוב ביותר לחסימת כלי הדם ולוחית האתרומה, וחוקר המעבדה מוכן להשיג את דגימת הדם. החצים מציינים את האתר של חסימות כלי דם. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: הכנת דגימת דם וקביעת תאי אב מונונוקאריים (MPCs). (A)הכנה הדרגתית של צפיפות. (B) הפרדת טבעת לימפוציטים לאחר צנטריפוגת דם. (ג)אוסף שלב הלימפוציטים. (ד)צנטריפוגה. (ה)היווצרות גלולה בתחתית המבחנה. (F) ספירת השעיית תאים. (G)הכנת לימפוציטים לציטומטריית זרימה. (H) קביעת תת-אוכלוסיות תאים לפי ציטומטריית זרימה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: יחס של חברי פרלמנט עם אינדיקטורים המודינמיים. (א)מיקום של אולטרסאונד לרכוש FMD ותוצאות מייצגות. (B) קשרי גומלין בין אוכלוסיות משנה בסיסיות %MPCs (שמאל, CD45⁺CD34⁺KDR⁺; ימין, CD45⁺CD34⁺CD133⁺CD184⁺) וערכי FMD בסיסיים; כמו גם את היחס של (C) %MPCs לאחר אנגיופלסטיקה עם שיפור FMD לאחר אנגיופלסטיקה. קיצורים: MPCs, תאי אב מונונוקאריים; FMD, תברכת זרימה בתיווך. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: MPCs ופרוגנוזה של קטיעה בגפיים התחתונות לאחר אנגיופלסטיקה. (A) תמונות סיטומטריית זרימה מייצגות של אוכלוסיות משנה של MPCs. (B) השיוך של אוכלוסיות משנה %MPCs בסיסיות (שמאל, CD45⁺CD34⁺KDR⁺; ימין, CD45⁺CD34⁺CD133⁺CD184⁺), או (C) %MPCs לאחר אנגיופלסטיקה, עם קטיעה בגפיים התחתונות לאחר אנגיופלסטיקה, במהלך מעקב של 30 יום. קיצורים: MPCs, תאי אב מונונוקאריים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

קובץ משלים 1: סיווגו של ראת'רפורד לחומרת איסכמיה של איברים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Discussion

איסוף דם באתר המדויק של בלוק כלי הדם עשוי להראות קשיים טכניים; לכן, ביצענו איסוף דם בסמיכות לבלוק כלי הדם. כמו כן, כמות MPCs קרוב ללוח כלי הדם נראה דינמי מאוד ועשויים מקורם וריאציות לפני ואחרי אנגיופלסטיקה. על פי התצפיות שלנו, מומלץ להעריך שינויים בסיסיים- ו -30 דקות לאחר אנגיופלסטיקה במספר MPCs, שכן הם עשויים לשקף מספר תהליכים פתופיזיולוגיים המתרחשים בתוך נזק כלי דם ותיקון.

עיבוד דגימת דם עבור קביעת MPCs מומלץ להתבצע בתוך 3 h הראשון; לכן, תוכנית ארגונית נאותה, ואפילו תרגול סימולציה קודם, ניתן להקים בין צוות ניתוח אנגיולוגיה-כלי דם וחוקרי מעבדה. בידוד MPCs צריך להתבצע בקפידה, במיוחד הדחת דגימת דם לתוך שיפוע צפיפות ושטיפות של גלולה המכילה MPCs. הקבוצה שלנו להשתמש כדי להעביר תאים לתוך צינור cytometry, להוסיף נוגדנים ראשוניים, לתקן, ולאחסן תאים לילה ב 4 מעלות צלזיוס; בשל נוחות ניהול הזמן, וקריאת ציטומטריית זרימה תבוצע ביום שאחרי.

לגבי התפקיד של הפצת MPCs כמו סמן ביולוגי קליני שימושי של נזק כלי דם ותיקון, מאמצים חשובים דווחו כדי לתקנן immunophenotypes בין תאים אב¹⁷. אפיון מקיף צריך לכלול תת-אוכלוסיות של תאי אב במחזור המשתתפים בתרחישים הקליניים השונים בתוך מחלות כלי דם. באמצעות השיטות המתוארות כאן, מצאנו כי הפחתה שלאחר אנגיופלסטיקה של CD45⁺CD34⁺CD133⁺CD184⁺ הוא חזוי לקטיעה גדולה. ממצא זה תומך ברעיון כי תגובה דלקתית במהלך פגיעה בכלי הדם או אנגיופלסטיקה לעורר אותות ביות עבור MPCs, קידום^{תיקון רקמות מקומיות 18,19}.

כמו כן, התצפית עולה בקנה אחד עם ההשפעה המדווחת של מספר מופחת של CD45⁺CD34⁺CD133⁺ ו- CD45⁺CD34⁺CD133⁺184⁺ אוכלוסיות משנה של MPCs כמנבא של תוצאות קרדיווסקולריות שליליות לאחר אנגיופלסטיקה כלילית⁷, אשר עשוי להיות מוסבר על ידי היכולת המוגברת של פנוטיפים פחות מובחנים של אבות אנדותל לדבוק כדי להתרבות ולהגיב לגירוי vasculogenic¹⁸.

יתר על כן, ראינו כי מספר מוגבר של CD45⁺CD34⁺KDR⁺ תת-אוכלוסיה של MPCs לאחר אנגיופלסטיקה היה קשור לקטיעה בגפיים למרות שהם נחשבו לתרום לתיקון כלי הדם. מחלוקת זו עשויה להיות מוסברת בשל: 1) וריאציות בעיצוב המחקר, שכן מחקרים אחרים השוו את מספר CD45⁺CD34⁺KDR⁺ MPCs בין חולים עם CLI ופקדים בריאים¹⁹; 2) וריאציות בשיטות לדגימת דם, כולל האתר והזמן לגבי אנגיופלסטיקה; ו -3) סוג העורק חסום וכלי דם.

אפיון פרוגנוסטי של סמנים ביולוגיים חדשניים, המבוססים על מנגנונים האחראים לתיקון כלי הדם במספר מחלות, זכה לתשומת לב משמעותית במחקר תרגום. זהו התיאור הראשון של שיטה לחקור את התפקיד של MPCs, נקבע באופן מקומי באתר קרוב לבלוק כלי הדם, בפרוגנוזה של קטיעה בגפיים לאחר אנגיופלסטיקה במקרים עם CLI. מגבלה אחת היא היעדר קביעת MPCs בנקודות זמן נוספות לאחר אנגיופלסטיקה. עם זאת, אנו מאמינים כי הממצאים שלנו מעשירים את תחום המחקר בכלי הדם על ידי אפיון התפקיד התרגום של MPCs במהלך נזק לכלי הדם, תיקון, ופוטנציאל פרוגנוסטי לקטיעה גדולה בחולים עם CLI. במיוחד, אנו רואים כי השיטה המתוארת כאן עשויה להיות שימושית בחיזוי תוצאות כלי דם שליליות בהגדרות קליניות הכוללות פגיעה בכלי הדם ומנגנוני תיקון, כגון גפיים תחתונות ואיסכמיה כלילית, שבץ מוחי, דלקת כלי דם ו /או פקקת ורידית.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
BSA	Roche	10735086001	Bovine Serum Albumin (BSA) as a buffering agent, stabilizer, standard and for blending.
Calibration Beads	Miltenyi Biotec / MACS	#130-093-607	MACQuant calibration beads are supplied in aqueous solution containing 0.05% sodium azide. 3.5 ml for up to 100 tests
CD133/1 (AC133)-PE	Milteny Biotec / MACS	#130-080-801	Antibody conjugated to R-Phycoerythrin in PBS/EDTA buffer
CD184 (CXCR4)-PE-VIO770	Miltenyi Biotec / MACS	#130-103-798	Monoclonal, Isotype recombinant human IgG1, conjugated
CD309 (VEGFR-2/KDR)-APC	Miltenyi Biotec / MACS	#130-093-601	Antibody conjugated to R-Phycoerythrin in PBS/EDTA buffer
CD34-FITC	Miltenyi Biotec / MACS	#130-081-001	The monoclonal antibody clone AC136 detecs a class III epitope of the CD34
CD45- VioBlue	Miltenyi Biotec / MACS	#130-092-880	Monoclonal CD45 Antibody, human conjugated
Conical Tubes	Thermo SCIENTIFIC	#339651	15ml conical centrifuge tubes
Cytometry Tubes	FALCON Corning Brand	#352052	5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube. 12x75 style. Sterile.
EDTA	BIO-RAD	#161-0729	Heavy metals, (as Pb) <10ppm, Fe<0.01%, As<1ppm, Insolubles<0.005%
Improved Neubauer	Without brand	Without catalog number	Hemocytometer for cell counting. (range 0.1000mm, 0.0025mm2)
K2 EDTA Blood Collection Tubes	BD Vacutainer	#367863	Lilac plastic vacutainer tube (K2E) 10.8mg, 6 mL.
Lymphoprep	Stemcell Technologies	01-63-12-002-A	Sterile and checked on the presence of endotoxins. Density: 1.077±0.001g/mL
Paraformaldehyde	SIGMA-ALDRICH	#SZBF0920V	Fixation of biological samples, (powder, 95%)
Pipette Transfer 1,3mL	CRM Globe	PF1016, PF1015	The transfer pipette is a tool that facilitates liquid transfer with greater accuracy.
Test Tubes	KIMBLE CHASE	45060 13100	Heat-resistant test tubes. SIZE/CAP 13 x 100 mm