Summary
Kritik Uzuv İskemisinde (CLI) tıkalı damarların anjiyoplastiden sonra bile alt eksüda amputasyonu oluşabilir. Mononükleer Progenitör Hücreler (MPC' ler) vasküler onarımı yansıtır. Mevcut protokol, MPC'lerin anjiyoplastiye yakın dolaşımdan nicelliğini ve endotel disfonksiyonu ile ilişkisini ve alt ektremite amputasyonunu tahmin etmeyi açıklamaktadır.
Abstract
Kritik uzuv iskemisi (CLI), periferik arteriyel hastalığın ileri evresini temsil eder. Anjiyoplasti alt ekstuziteye kan akışını iyileştirir; bununla birlikte, bazı hastalar geri dönüşümsüz olarak uzuv amputasyonuna ilerler. Vasküler hasarın boyutu ve damar onarım mekanizmaları anjiyoplasti sonrası sonucu etkileyen faktörlerdir. Mononükleer Progenitör Hücreler (MPC'ler) damar hasarlarına ve onarımına, damar hastalıklarını yansıtma yeteneğine sahiptir. Mevcut protokol, anjiyoplasti bölgesine yakın damardan kan dolaşımından elde edilen MPC'lerin nicelliğinin yanı sıra endotel disfonksiyonu ile ilişkisini ve CLI'li hastalarda anjiyoplastiden sonraki 30 gün içinde uzuv amputasyonu için tahmin yeteneğini açıklamaktadır.
Introduction
Periferik Arteriyel Hastalık (PAD), kan akışının sınırlandırılması ile kronik ve ilerleyici bir damar tıkanıklığı ile karakterizedir1. Küresel ölçekte, alt uzuvların PAD'i yaşlı nüfusun yaklaşık% 10'unu etkilerken, bu tür vakaların% 7'sine kadar uzuv amputasyon2,3.
Kritik Uzuv İskemisi (CLI), PAD1'inen ciddi sunumunun temsilini temsil eder. Hastalar genellikle tıkalı arterlere atfedilebilecek istirahat, ülser veya kangren ağrısı yaşarlar; klinik prognoz elverişsiz iken ve 1 yıl boyunca% 30 uzuv amputasyon ve mortalite riski ile işaretlenmiştir3,4,5.
Anjiyoplasti, CLI'li hastalarda alt ektremiteye kan akışını geri getirebilen minimal invaziv bir endovasküler prosedürdür; bununla birlikte, bazı hastalar kaçınılmaz olarak anjiyoplasti tedavisinden sonra bile büyük uzuv amputasyonu gerektirecektir1,5. Anjiyoplasti sonrası elverişsiz sonuçların erken tanımlanması, tedavi uygulama olasılığı nedeniyle oldukça değerlidir.
Geleneksel risk faktörleri, anjiyoplasti uygulanan hastalarda majör uzuv amputasyonu için sınırlı bir tahmin yeteneği sağlayabilir6. Patofizyoloji odaklı biyobelirteçler, vasküler yaralanmaya bağlı hastalıklarda özellikle yararlı olabilecek potansiyel klinik uygulamalarla yeni yöntemleri temsil eder7. Günümüzde, aterosklerotik plak yerinde endotel onarım özelliklerine sahip hücresel popülasyonların katılımı giderek daha fazla tanınmaktadır8,9.
Mononükleer Progenitör Hücreler (MPC' ler) kemik iliğinden türetilir ve damar rejeneratif yetenekleri olan kök hücrelerin kendi yapısal ve fonksiyonel özelliklerine sahiptir. MPC'nin çoğalma, göç etme ve damar yapışması gösterme yeteneği nedeniyle; bu hücreler iskemi 10 , 11,12'ye yanıt olarak endotel onarımını yansıtmak için iyi adaylarhaline gelmiştir. Ek olarak, vasküler yaralanmanın altında kalan mekanizmalara sürekli ilgi, lokal meydana gelen biyobelirteçlerin prognostik rolünü keşfetmeye motive olmuştur, çünkü damar hasarını yansıttığı veonarım 7,13,14.
Bu çalışmanın amacı, anjiyoplasti uygulanan CLI'li hastalarda damar tıkanıklığına yakın dolaşımda olan MPC miktarının nasıl belirlendiğini tanımlamaktır; ve endotel disfonksiyonu ve uzuv amputasyon göstergeleri ile MPC'ler arasındaki ilişkinin nasıl değerlendirileceği.
Komorbiditelere ve içsel vasküler özelliklere dayalı prognoz ile karşılaştırıldığında, lokal MPC'lerin miktarı endotel disfonksiyonu ve uzuv amputasyonu ile ilgili klinik sonucu tahmin etme konusunda spesifik bir yetenek göstermektedir. Sürekli olarak, bazı çalışmalar PAD15,16ile hastaların değerlendirilmesi sırasında benzer biyobelirteçlerin prognostik rolünü tanımlamaktadır.
Önceki sonuçlara dayanarak7, burada açıklanan yöntem, alt ektöz ve koroner iskemi, inme, vaskülit, venöz tromboz ve damar yaralanması ve onarımı içeren diğerleri gibi çeşitli klinik ortamlarda olumsuz vasküler sonuçlar riski altındaki popülasyonun erken tanımlanması için yararlı olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Centro Médico Nacional "20 de Noviembre" ISSSTE'den kurumsal araştırma etik komitesi bu olası protokolü onayladı, tüm kayıtlı hastalar yazılı bilgilendirilmiş onay verdi.
1. Alt ektremite vasküler bloğun değerlendirilmesi, kan örneklemesi ve balon anjiyoplasti
NOT: Bu deney için kullanılan çalışma örneği, 68 yaşında ve 20 hastadan 10'unun erkek olduğu 20 diyabet hastasından oluşmaktadır. Örneğin yarısı sigara içenlerdi ve en yaygın ko-morbiditeler tip 2 diabetes mellitus, sistemik arteriyel hipertansiyon ve/veya dislipidemiydi. Örneklem yaş, cinsiyet ve yandaş hastalık için standart hale getirilmiştir. MPC'ler ve CLI arasındaki ilişki üzerindeki klinik-demografik etki nedeniyle olası önyargı göz ardı edilemedi.
- Uzuv iskemisinin klinik şiddetini Rutherfordsınıflandırması 13'e göre değerlendirin (bkz. Ek Tablo 1).
- Alt ektremite anjiyografisi, kan örneklemesi ve balon anjiyoplasti gerçekleştirin.
- Ameliyattan önce antikoagülan ve anestezik ilaçlar kullanın.
- Seçilen kasık yerindeki kan damarına 18 G'lik bir iğne yerleştirin.
- Bir indeksleyici yerleştirin ve esnek bir kılavuz tel ilerletin. Ardından, ilk kılavuz bir 6 Fr indirici için daha da değiştirilir.
- Arter yörüngesini ve damar tıkalı bölgeleri tanımlamak için floroskopik kılavuz altında kontrast ortam veya CO2'nin periyodik enjeksiyonunu kullanın (Şekil 1).
NOT: Kontrast medya 40 cc, %0,9 tuzlu suda 1:1 seyreltilmiş veya12 psi basınçta atış başına 10 ila 20 mL'de CO 2 kullanın. - Gemiye iki adet 0.014 Fr navigasyon kılavuz teli ve iki adet 0.014 Fr destek kılavuz teli tanıtın ve bunları engellenen bölgeye kadar ilerletin.
NOT: Navigasyon için iki adet 0.014 Fr kılavuz tel (260 cm uzunluğunda) ve tek bir işlem sırasında destek için iki adet 0.014 Fr kılavuz tel (260 cm uzunluğunda) kullanılır. - 5 Fr ve 3 Fr kateterleri sırayla tanıtın ve damar tıkanıklığına en yakın yerden 10 mL kan toplayın. Kan örneklerini buzda tut.
NOT: Kateter boyutları 5 Fr ve 3 Fr olabilir ve işlem sırasında değiştirilir. - Kılavuz teli tekrar ilerletin. Ardından, kateterin ucunda bulunan şişme bir balon içeren anjiyoplasti balon kateterini tanıtın. Anjiyoplasti balon kateterini ilerletin ve balonu lezyon bölgesine yerleştirin. Balonu damar duvarında bulunan blokaj plağı ile şişirerek anjiyoplastiyi gerçekleştirin. Kan akışı restorasyonu doğrulayın.
NOT: İşlemden sonra atardamarın açık kalmasına yardımcı olmak için tıkalı bölgeye stent yerlenebilir. - Bir kateter tanıtın ve damar bloğuna en yakın bölgeye ilerleyin. Anjiyoplastiden sonra 30 dakika zaman aralığında 10 mL kan toplayın. Kan örneklerini buzda tut.
NOT: Anjiyoplasti öncesi ve sonrası kan örneklerinin toplanması, anjiyoplasti'nin MPC sayısı üzerindeki etkisini daha fazla değerlendirmek için önerilir. - Floroskopik rehberlik altında tüm telleri çıkarın.
- Her 12 saatte bir 1 mg/kg deri altı, aspirin 100 mg, statin ve analjezi kullanarak anti-koagülasyon tedavisi de dahil olmak üzere ameliyat sonrası bakım prosedürleri sağlayın. 24 saat boyunca vasküler delinme yerinde sıkıştırın.
2. Dolaşımdaki mononükleer progenitör hücrelerin (MPC' ler) nicelleştirilmesi (Şekil 2)
- Taze bir 15 mL konik tüpe, toplanan kanın 6 mL'lik kısmını aktarın ve PBS ile 1:1 (v/v) seyreltin.
NOT: Kanı toplama işleminden itibaren 1 saat içinde işleyin. - Her biri 3 test tüpüne 2 mL yoğunluk degrade ortası ekleyerek yoğunluk degrade ayrımına hazırlanın. Ardından, her test tüpüne seyreltilmiş kanın 3 eşit hacimli aliquots ekleyin.
NOT: Test tüpü maksimum kapasitesinin dörtte üçünü aşmayın. - 4 °C'de 30 dakika boyunca 1.800 x g'da santrifüj. Pipet kullanarak halka olarak mevcut arayüz katmanını toplayın ve yeni bir tüpe aktarın. 2 mL PBS ekleyin ve 4 °C'de 6 dakika boyunca 1.800 x g'da döndürün. Bu MPC'ler içereceği için peleni kaydedin.
- MPC'ler içeren peleti, 2.3. Her yıkama için taze PBS kullanın ve 4 °C'de 2 dakika boyunca 1.800 x g'da döndürün. İşlemi 6 kez tekrarlayın.
- Son yıkamadan sonra, hücre peletini yeniden kullanmak için 1 mL PBS kullanın. Hücre süspansiyonunun 20 μL'sini % 0,4 trippan mavisi, 1:1 (v/v) 20 μL ile seyreltin. Hemositometre ve hafif mikroskop kullanarak hücre sayımı için bu hücre süspansiyonunun 10 μL'liğini kullanın.
- Aliquot 1 x 106 MPC'ler daha önce etiketlenmiş 5 mL akış sitometri tüplerinde.
NOT: karşılık gelen izotip uyumlu kontrol antikorlarını hazırlayın. - Tüpleri 4 °C'de 6 dakika boyunca 1.800 x g'da santrifüj edin. Aspirat ve üstnatant atmak.
- Birincil antikoru 100 μL antikor inkübasyon çözeltisinde seyreltin [1x PBS, pH 7.4, EDTA 2 mM, BSA% 0.05] ve tüpe ekleyin. 10 sn için yeniden satın ve karanlıkta 4 °C'de 20 dakika kuluçkaya yaslanın.
NOT: Mevcut protokolde kullanılan primer antikorların son konsantrasyonları CD45 1:50, CD34 1:20, KDR 1:50, CD184 1:20, CD133 1:50 olarak belirlendi. PBS'de %4 paraformaldehitte lenfositler sabitlenerek ve numuneler 4 °C'de 24 saate kadar depolanarak protokol bu adımda durdurulabilir. - 4 °C'de 2 dakika boyunca 1.800 x g'da santrifüj ve süpernatantı atın. 500 μL 1x PBS, pH 7.4, EDTA 2 mM'de yeniden biriktirin.
- Akış sitometrisi analizi gerçekleştirin.
- Arka planı izotiple eşleşen kontrol antikorlarıyla ayarlayın. Daha sonra, FSC / SSC arsasında, hücresel kalıntıları, artık granülositleri ve diğer parçacıkları dışlamaya çalışan lenfositleri seçin. Bu tür bir dağılım% 100 olarak kabul edilir.
NOT: Lenfositler genellikle arsanın sol alt bölgesinde yayılır. - Yüksek sayıda CD45 + veCD34+ içeren ortak immünofenotip içeren bir kapı kullanın. Ardından, daha önce CD45 + , CD34+'yı tanımlayan kapıyı kullanarak ve KDR (VEGFR-2)+, CD133 + veya CD184+ ekleyerek çift pozitif immünofenotipler için seçin. MPC alt nüfuslarını belirli hücre yüzeyi işaretçilerine göre tanımlayın. Geçişli olayların yüzdesi olarak raporla.
- Arka planı izotiple eşleşen kontrol antikorlarıyla ayarlayın. Daha sonra, FSC / SSC arsasında, hücresel kalıntıları, artık granülositleri ve diğer parçacıkları dışlamaya çalışan lenfositleri seçin. Bu tür bir dağılım% 100 olarak kabul edilir.
- MPC'lerin ana alt nüfuslarını tanımlayın. Bu çalışmada analiz edilen immünofenotipler CD45+CD34+CD133+; CD45+CD34+CD184+; CD45+CD34+CD133+CD184+; CD45+CD34+KDR+; CD45+CD34+KDR+CD133+ ve CD45+CD34+KDR+CD1847,17.
NOT: Çalışma için bu hücre yüzey belirteçleri kullanılmıştır: CD45 (lenfositler), CD34 (endotel ve/veya vasküler hücreler), KDR (VEGFR-2) (endotel hücrelerinin zar belirteci), CD133 (endotel progenitör hücreler) ve CD184 (hematopoetik kök hücreler ve endotel hücreleri).
3. MPC'lerin endotel fonksiyonunun ve hemodinamik testin (FMD) değiştirilmesiyle ilişkisi
- Akış aracılı genişlemeyi (FMD), anjiyoplasti öncesi ve sonralarını belirleyin.
- Brakial arterin çapını ölçmek için vasküler doğrusal dönüştürücü kullanın.
- Sfigmomanometrenin manşetini ön koldaki ölçüm alanının üzerine yerleştirin ve sistolik kan basıncının 5 dakika boyunca 50 mmHg üzerinde insufflate edin ve söndürün.
- Sonraki 60 s içinde brakial arterin çapını tekrar belirleyin. FMD'yi tahmin etmek için aşağıdaki denklemi kullanın.
NOT: 100 / bazal çapı × denklemi (%) = (geçici iskemi sonrası maksimum çap - bazal çap) kullanarak dilatasyon derecesini hesaplayın.
- MPC sayısını FMD'nin temel FMD değeri ve anjiyoplasti sonrası deltası ile ilişkilendirin.
4. MPC'lerin uzuv amputasyonu için prognostik yeteneği
- Balon anjiyoplasti ve hasta taburcu olduktan sonra, alt ektriğe kan akışının kalitesini değerlendirmek için periyodik tıbbi randevular planlayın.
- Anjiyoplastiden 2 hafta sonra uzuv iskemisinin klinik şiddetini değerlendirin. Rutherford sınıflandırmasına göre istirahat ağrısını, daha düşük iskemiyi ve fonksiyonel bir ayağın korunmasını değerlendirin13.
- Uzuv iskemisinin klinik şiddetini taban çizgisine ve takibe karşı karşılaştırın. Elverişsiz sonuç nedeniyle büyük amputasyon gerektiren vakaları tanımlayın.
- MPC sayısını alt ekstremitenin majör amputasyonu gerektiren hastaların oranı ile ilişkilendirin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tıkalı arterlerden alınan kan örnekleri, anjiyoplasti için ele alınan yerde, 68 yaşında ve 20 hastadan 10'unun erkek olduğu 20 diyabet hastasından alındı. Örneklem nüfusunun yarısı sigara içenlerdi. Vasküler lezyonlar esas olarak Rutherford sınıf VI olarak puanlandı; hastalar tip 2 Diabetes Mellitus (%100), hipertansiyon (%70) prevalansı daha yüksekti. ve dislipidemi (%55).
Alt ektremite anjiyoplasti sonrası 30 günlük klinik takip yapıldı. Anjiyoplasti sonrası taban çizgisi veya dinamiklerdeki MPC alt nüfuslarının yüzdesi, FMD tarafından değerlendirildiği gibi endotel disfonksiyon derecesi ile ilişkiliydi (Spearman analizi); ve mpc'lerin temel sayısı anjiyoplasti sonrası uzuv amputasyonu geçiren veya olmayan hastalar arasında karşılaştırıldı (U-Mann Whitney). Çalışma, temel MPC'lerin alt nüfus CD45+CD34+KDR+ fmd ile negatif korelasyon gösterdiğini göstermiştir (Şekil 3A, sol), MPC'lerin değişimi CD45+CD34+CD133+CD184+ anjiyoplasti sonrası FMD gelişimi ile önemli ölçüde ilişkilidir(Şekil 3B, sağ). Ayrıca, uzuv amputasyonuna evrilen hastalarda CD45+CD34+KDR+ (Şekil 4A,B, solda) mpc alt nüfus sayısının arttığı gözlenmiştir; MPC alt nüfus CD45 + CD34 + CD133 + CD184+(Şekil 4A,C, sağ) anjiyoplasti sonrası azaltma yanı sıra.
Şekil 1: Alt ektremite anjiyografisi ve kan toplanması. (A) Floroskopi altında kontrast ortam ile kanıtlanan vasküler yörünge. (B) Anjiyoplasti öncesi damar tıkanıklığı. (C) Anjiyoplasti sonrası damar tıkanıklığı. (D) Vasküler cerrah, damar tıkanıklığı ve aterom plağında en yakın yerden kan toplamak için kateter kullanır ve Laboratuvar araştırmacısı kan örneğini almaya hazırdır. Oklar damar tıkanıklıklarının olduğunu gösteriyor. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Kan örneği hazırlama ve mononükleer progenitör hücrelerin (MPC) belirlenmesi. (A) Yoğunluk gradyan hazırlığı. (B) Lenfositler kan santrifüjlemeden sonra halka ayrımı. (C) Lenfosit fazının toplanması. (D) Santrifüjleme. (E) Test tüpünün alt kısmında pelet oluşumu. (F) Hücre süspansiyon sayısı. (G) Lenfositlerin akış sitometrisi için hazırlanması. (H) Hücre alt nüfuslarının akış sitometrisi ile belirlenmesi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: MPC'lerin hemodinamik göstergelerle ilişkisi. (A) FMD ve temsili sonuçlar elde etmek için ultrasonun konumu. (B) Temel %MPC alt nüfusları (sol, CD45+CD34+KDR+; sağ, CD45+CD34+CD133+CD184+) ve taban çizgisi FMD değerleri arasındaki ilişki; anjiyoplasti sonrası(C) %MPC'lerin anjiyoplasti sonrası FMD gelişimi ile ilişkisi. Kısaltmalar: MPC'ler, Mononükleer Progenitör Hücreler; FMD, Akış Aracılı Genişleme. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: MPC'ler ve anjiyoplasti sonrası alt ektremite amputasyon prognozu. (A) MPC alt nüfuslarının temsili akış sitometri görüntüleri. (B) Temel %MPC alt nüfuslarının ilişkisi (sol, CD45+CD34+KDR+; sağ, CD45+CD34+CD133+CD184+) veya (C) %MPC'ler anjiyoplasti sonrası, anjiyoplasti sonrası alt ekstremite amputasyonu ile 30 günlük takip sırasında. Kısaltmalar: MPC'ler, Mononükleer Progenitör Hücreler. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Dosya 1: Rutherford'un uzuv iskemisinin şiddetinin sınıflandırılması. Bu dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Damar bloğunun hassas yerinde kan toplanması teknik zorluklar gösterebilir; bu nedenle damar bloğuna yakın bir yerde kan alma işlemi gerçekleştirdik. Aynı şekilde, vasküler plaklara yakın MPC miktarı oldukça dinamik görünmektedir ve anjiyoplasti öncesi ve sonrası varyasyonlara neden olabilir. Gözlemlerimize göre, vasküler hasar ve onarımda meydana gelen çeşitli patofizyolojik süreçleri yansıtabileceğinden, MPC sayısındaki taban çizgisi ve 30 dakika sonrası anjiyoplasti değişikliklerinin değerlendirilmesi önerilir.
MPC tayini için kan örneği işleminin ilk 3 saat içinde yapılması önerilir; bu nedenle, anjiyoloji-vasküler cerrahi ekibi ve laboratuvar araştırmacıları arasında yeterli organizasyon planı ve hatta daha önceki bir simülasyon uygulaması oluşturulabilir. MPC izolasyonu dikkatlice yapılmalıdır, özellikle kan örneğini yoğunluk gradyanına ve MPC içeren peletin yıkamalarına dekante edilmelidir. Grubumuz hücreleri sitometri tüpüne aktarmak, birincil antikorlar eklemek, hücreleri bir gecede 4 °C'de sabitlemek ve depolamak için kullanılır; zaman yönetimi kolaylığı nedeniyle ve akış sitometrisi okuması ertesi gün yapılacaktır.
Dolaşımdaki MPC'lerin damar hasarı ve onarımının yararlı bir klinik biyobelirteç olarak rolü ile ilgili olarak, progenitör hücreler arasındaki immünofenotipleri standartlaştırmak için önemli çabalar bildirilmiştir17. Kapsamlı bir karakterizasyon, damar hastalıkları içindeki farklı klinik senaryolara katılan dolaşımdaki progenitör hücrelerin alt nüfuslarını içermelidir. Burada açıklanan yöntemleri kullanarak, MPC alt nüfus CD45 + CD34 + CD133+CD184+ anjiyoplasti sonrası azalmasının majör amputasyon için tahmine dayalı olduğunu gördük. Bu bulgu, vasküler yaralanma veya anjiyoplasti sırasında enflamatuar yanıtın MPC'ler için homing sinyallerini uyardığı ve lokal doku onarımını teşvik ettiği fikrini destekler18,19.
Aynı şekilde, gözlem, tahmin edici olarak MPC'lerin cd45+CD34+CD133+ ve CD45+CD34+CD133+184+ alt nüfus sayısının bildirilen etkisiyle tutarlıdır. koroner anjiyoplasti sonrası olumsuz kardiyovasküler sonuçların7Endotel progenitörlerinin daha az farklılaştırılmış fenotiplerinin hücre dışı matrise yapışabilme yeteneğinin artmasıyla açıklanabilir, çoğalmak ve vaskülojenik uyarana cevap vermekiçin 18.
Ayrıca, anjiyoplasti sonrası MPC'lerin artan sayıda CD45+CD34+KDR+ subpopülasyonunun, damar onarımına katkıda bulunduğu düşünülmesine rağmen uzuv amputasyonu ile ilişkili olduğunu gözlemledik. Bu tartışma şu nedenlerle açıklanabilir: 1) çalışma tasarımındaki varyasyonlar, diğer çalışmalar CLI ve sağlıklı kontrolleri olan hastalar arasındaki CD45+CD34+KDR+ MPC sayısını karşılaştırdığından19; 2) bölge ve anjiyoplasti ile ilgili zaman da dahil olmak üzere kan örnekleme yöntemlerindeki varyasyonlar; ve 3) arter tipi tıkanmış ve damarlanmış.
Çeşitli hastalıklarda damar onarımından sorumlu mekanizmalara dayanan yeni biyobelirteçlerin prognostik karakterizasyonu, çeviri araştırmalarında önemli ilgi gördü. Bu, CLI'li vakalarda anjiyoplasti sonrası uzuv amputasyonunun prognozunda, damar bloğuna yakın bir yerde lokal olarak belirlenen MPC'lerin rolünü araştırmak için bir yöntemin ilk açıklamasıdır. Bir sınırlama, anjiyoplasti sonrası daha fazla zaman noktasında MPC tayininin olmamasıdır. Bununla birlikte, bulgularımızın CLI'li hastalarda vasküler hasar, onarım ve prognostik büyük amputasyon potansiyeli sırasında MPC'lerin çevirisel rolünü karakterize ederek vasküler araştırma alanını zenginleştirdiğini görüyoruz. Özellikle, burada açıklanan yöntemin, alt eksüvtür ve koroner iskemi, inme, vaskülit ve/veya venöz tromboz gibi vasküler yaralanma ve onarım mekanizmalarını içeren klinik ortamlardaki olumsuz vasküler sonuçların tahmininde yararlı olabileceğini düşünüyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Yazarlar, 356.2015 proje kimliği için Kurumsal Program E015'in desteğine teşekkür eder.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BSA | Roche | 10735086001 | Bovine Serum Albumin (BSA) as a buffering agent, stabilizer, standard and for blending. |
| Calibration Beads | Miltenyi Biotec / MACS | #130-093-607 | MACQuant calibration beads are supplied in aqueous solution containing 0.05% sodium azide. 3.5 ml for up to 100 tests |
| CD133/1 (AC133)-PE | Milteny Biotec / MACS | #130-080-801 | Antibody conjugated to R-Phycoerythrin in PBS/EDTA buffer |
| CD184 (CXCR4)-PE-VIO770 | Miltenyi Biotec / MACS | #130-103-798 | Monoclonal, Isotype recombinant human IgG1, conjugated |
| CD309 (VEGFR-2/KDR)-APC | Miltenyi Biotec / MACS | #130-093-601 | Antibody conjugated to R-Phycoerythrin in PBS/EDTA buffer |
| CD34-FITC | Miltenyi Biotec / MACS | #130-081-001 | The monoclonal antibody clone AC136 detecs a class III epitope of the CD34 |
| CD45- VioBlue | Miltenyi Biotec / MACS | #130-092-880 | Monoclonal CD45 Antibody, human conjugated |
| Conical Tubes | Thermo SCIENTIFIC | #339651 | 15ml conical centrifuge tubes |
| Cytometry Tubes | FALCON Corning Brand | #352052 | 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube. 12x75 style. Sterile. |
| EDTA | BIO-RAD | #161-0729 | Heavy metals, (as Pb) <10ppm, Fe<0.01%, As<1ppm, Insolubles<0.005% |
| Improved Neubauer | Without brand | Without catalog number | Hemocytometer for cell counting. (range 0.1000mm, 0.0025mm2) |
| K2 EDTA Blood Collection Tubes | BD Vacutainer | #367863 | Lilac plastic vacutainer tube (K2E) 10.8mg, 6 mL. |
| Lymphoprep | Stemcell Technologies | 01-63-12-002-A | Sterile and checked on the presence of endotoxins. Density: 1.077±0.001g/mL |
| Paraformaldehyde | SIGMA-ALDRICH | #SZBF0920V | Fixation of biological samples, (powder, 95%) |
| Pipette Transfer 1,3mL | CRM Globe | PF1016, PF1015 | The transfer pipette is a tool that facilitates liquid transfer with greater accuracy. |
| Test Tubes | KIMBLE CHASE | 45060 13100 | Heat-resistant test tubes. SIZE/CAP 13 x 100 mm |
References
- Serrano-Hernando, F. J., Martín-Conejero, A. Peripheral artery disease: Pathophysiology, diagnosis and treatment. Revista Española de Cardiología. 60 (9), 969-982 (2007).
- Agarwal, S., et al. Burden of re-admissions among patients with critical limb ischemia. Journal of the American College of Cardiology. 69 (15), 1897-1908 (2017).
- Kolte, D., et al. Thirty-day re-admissions after endovascular or surgical therapy for critical limb ischemia: Analysis of the 2013 to 2014 nationwide re-admissions databases. Circulation. 136 (2), 167-176 (2017).
- Rowlands, T. E., Donnelly, R. Medical therapy for intermittent claudication. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 34, 314-321 (2007).
- Cronewett, J. L. Acute limb ischemia and lower extremity chronic arterial disease: Rutherford's vascular surgery (8th ed.). , Saunders Elsevier. Philadelphia, PA. (2014).
- Dick, F., et al. Surgical or endovascular revascularization in patients with critical limb ischemia: influence of diabetes mellitus on clinical outcome. Journal of Vascular Surgery. 45 (4), 751-761 (2007).
- Suárez-Cuenca, J. A., et al. Coronary circulating mononuclear progenitor cells and soluble biomarkers in the cardiovascular prognosis after coronary angioplasty. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (7), 4844-4849 (2019).
- Franz, R., et al. Use of autologous bone marrow mononuclear cell implantation therapy as a limb salvage procedure in patients with severe peripheral arterial disease. Journal of Vascular Surgery. 50 (6), 1378-1390 (2009).
- Benoit, E., O'Donnell, T. F., Patel, A. N. Safety and efficacy of autologous cell therapy in critical limb ischemia: A systematic review. Cellular Transplantation. 22 (3), 545-562 (2013).
- Hill, J. M., et al. Circulating endothelial progenitor cells, vascular function, and cardiovascular risk. New England Journal of Medicine. 348 (7), 593-600 (2003).
- Schmidt-Lucke, C., et al. Reduced number of circulating endothelial progenitor cells predicts future cardiovascular events: proof of concept for the clinical importance of endogenous vascular repair. Circulation. 111 (22), 2981-2987 (2005).
- Smadja, D. M. Early endothelial progenitor cells in bone marrow are a biomarker of cell therapy success in patients with critical limb ischemia. Cytotherapy. 14 (2), 232-239 (2012).
- Kremastinos, D. T., et al. Intracoronary cyclic-GMP and cyclic-AMP during percutaneous transluminal coronary angioplasty. International Journal of Cardiology. 53 (3), 227-232 (1996).
- Truong, Q. A., Januzzi, J. L., Szymonifka, J., Thai, W. E., Wai, B., Lavender, Z. Coronary sinus biomarker sampling compared to peripheral venous blood for predicting outcomes in patients with severe heart failure undergoing cardiac resynchronization therapy: the BIOCRT study. Heart Rhythm. 11 (12), 2167-2175 (2014).
- Ding, N., et al. Fibrosis and inflammatory markers and long-term risk of peripheral artery disease: The ARIC study. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 40 (9), 2322-2331 (2020).
- Potier, L., et al. Plasma copeptin and risk of lower-extremity amputation in Type 1 and Type 2 diabetes. Diabetes Care. 40 (12), 2290-2297 (2019).
- Schmidt-Lucke, C., et al. Quantification of circulating endothelial progenitor cells using the modified ISHAGE protocol. PLoS One. 5 (1), 13790 (2010).
- Marboeuf, P., et al. Inflammation triggers colony forming endothelial cell mobilization after angioplasty in chronic lower limb ischemia. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 6 (1), 195-197 (2008).
- Regueiro, A., et al. Mobilization of endothelial progenitor cells in acute cardiovascular events in the PROCELL study: Time-course after acute myocardial infarction and stroke. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 80, 146-155 (2015).
