Summary
قد يحدث بتر الأطراف السفلية حتى بعد رأب الأوعية من الأوعية المعرقلة في الإقفارية الطرف الحرج (CLI). تعكس خلايا السلف أحادية النوى (MPCs) إصلاح الأوعية الدموية. يصف هذا البروتوكول القياس الكمي لثناء الغدد العاملة من الدورة الدموية بالقرب من رأب الأوعية، وعلاقته بالخلل البطاحلي والتنبؤ ببتر الأطراف السفلية.
Abstract
يمثل إقفار الأطراف الحرجة (CLI) مرحلة متقدمة من مرض الشرايين المحيطية. عملية رأب الأوعية تحسن تدفق الدم إلى الطرف السفلي; ومع ذلك، تقدم بعض المرضى بشكل لا رجعة فيه إلى بتر الأطراف. إن مدى تلف الأوعية الدموية وآليات إصلاح الأوعية الدموية هي عوامل تؤثر على نتيجة ما بعد الرأب الوعائي. خلايا السلف أحادية النوى (MPCs) هي رد فعل على تلف الأوعية الدموية وإصلاحها ، مع القدرة على عكس أمراض الأوعية الدموية. يصف هذا البروتوكول القياس الكمي لـ MPCs التي تم الحصول عليها من الدورة الدموية من الأوعية القريبة من موقع رأب الأوعية، وكذلك علاقتها بالخلل البطايني وقدرتها التنبؤية على بتر الأطراف في الأيام الثلاثين التالية بعد رأب الأوعية في المرضى الذين يعانون من CLI.
Introduction
يتميز مرض الشرايين الطرفية (PAD) بانسداد الأوعية الدموية المزمن والتقدمي مع الحد من إمدادات الدم1. على نطاق عالمي، يؤثر PAD من الأطراف السفلية على حوالي 10٪ من السكان المسنين، في حين يتم تقديم ما يصل إلى 7٪ من هذه الحالات إلى بتر الأطراف2،3.
يمثل الإقفاريات الحرجة (CLI) العرض الأكثر خطورة لـ PAD1. المرضى عادة ما تعاني من الألم في الراحة, قرحة, أو الغرغرينا التي تعزى إلى الشرايين انسداد; في حين أن التشخيص السريري غير مواتية وتتميز بـ 30٪ من خطر بتر الأطراف والوفيات خلال 1 سنة3,4,5.
رأب الأوعية هو إجراء الأوعية الدموية طفيفة التوغل التي يمكن أن تعيد تدفق الدم إلى الطرف السفلي في المرضى الذين يعانون من CLI; ومع ذلك، فإن بعض المرضى تتطلب حتما بتر الأطراف الرئيسية، حتى بعد العلاج بتر الأوعية1،5. تحديد مبكر من النتائج غير المواتية بعد رأب الأوعية أمر قيم جدا، وذلك بسبب إمكانية إنفاذ العلاج.
قد توفر عوامل الخطر التقليدية قدرة تنبؤية محدودة لبتر الأطراف الرئيسية في المرضى الذين يخضعون لعملية CLI للرأب الوعائي6. تمثل المؤشرات الحيوية الموجهة للفيزياء المرضية طرقًا جديدة ذات تطبيقات سريرية محتملة ، والتي قد تؤدي إلى فائدة خاصة في الأمراض المتعلقة بإصابة الأوعية الدموية7. في الوقت الحاضر ، ومشاركة السكان الخلوية التي تملك خصائص إصلاح البطانية ، في موقع البلاك تصلب الشرايين ، وقد اعترف بشكل متزايد8،9.
وتستمد خلايا السلف أحادية النوى (MPCs) من نخاع العظام والخصائص الهيكلية والوظيفية الخاصة من الخلايا الجذعية مع قدرات تجديد الأوعية الدموية. نظرا لقدرة لجنة السياسة النقدية على التكاثر، والهجرة وإظهار الالتزام الأوعية الدموية; وقد أصبحت هذه الخلايا مرشحين جيدين لتعكس إصلاح endothelial ردا على10،11،12. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الاهتمام المستمر بالآليات الكامنة وراء إصابة الأوعية الدموية قد حفز على استكشاف الدور التنبؤي للعلامات الحيوية المحلية التي تحدث ، حيث أنها تعتبر تعكس تلف الأوعية الدموية وإصلاح7و13و14.
الغرض من هذه الدراسة هو وصف كيفية تحديد كمية ال MPCs التي تنتشر بالقرب من انسداد الأوعية الدموية في المرضى الذين يعانون من CLI يخضع لعملية رأب الأوعية; وكيفية تقييم العلاقة بين اللجان MPCs مع مؤشرات الخلل البطانية وبتر الأطراف.
بالمقارنة مع التكهن على أساس الأمراض المصاحبة وميزات الأوعية الدموية الجوهرية، فإن كمية ال MPCs المحلية تظهر قدرة محددة على التنبؤ بالنتائج السريرية فيما يتعلق بالخلل البطانية وبتر الأطراف. باستمرار، وقد وصفت بعض الدراسات دور التكهن من المؤشرات الحيوية مماثلة أثناء تقييم المرضى الذين يعانون من PAD15،16.
استناداً إلى النتائج السابقة7، قد تكون الطريقة الموصوفة هنا مفيدة لتحديد مبكر للسكان المعرضين لخطر النتائج الوعائية الضارة في العديد من البيئات السريرية ، مثل الأمعاء السفلية والأوعية الدموية والسكتة الدماغية والتهاب الأوعية الدموية والجلطات الوريدية وغيرها التي تنطوي على إصابة الأوعية الدموية وإصلاحها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وافقت لجنة أخلاقيات البحوث المؤسسية من Centro Médico Nacional "20 de Noviembre" ISSSTE على هذا البروتوكول المحتمل ، وقدم جميع المرضى المسجلين موافقة خطية مستنيرة.
1- تقييم كتلة الأوعية الدموية في الأطراف السفلية، وأخذ عينات الدم، والبلاستيس الوعائي بالون
ملاحظة: عينة الدراسة المستخدمة في هذه التجربة تتألف من 20 مريضا بالسكري، الذين تتراوح أعمارهم بين 68 سنة و 10 من أصل 20 كانوا من الذكور. وكان نصف العينة من المدخنين وكانت معظم الاعتلالات المشتركة السائدة هي مرض السكري من النوع 2، وارتفاع ضغط الدم الشرياني الجهازي و/أو ديسليبيديميا. وكان القصد من هذه العينة أن تكون موحدة بالنسبة للأمراض العمرية والجنس والمراضة المشتركة. التحيز المحتمل بسبب التأثير السريري الديموغرافي على العلاقة بين MPCs وCLI لا يمكن استبعاده.
- تقييم شدة سريرية من الإقفاريات الطرف وفقا لتصنيف رذرفورد13 (انظر الجدول التكميلي 1).
- إجراء تصوير الأوعية السفلية للأطراف، وأخذ عينات الدم، والورم بالون.
- استخدام مضادات التخثر والأدوية المخدرة قبل الجراحة.
- ضع إبرة 18 G في الوعاء الدموي في موقع الفخذ المحدد.
- وضع مقدم وتقدم سلك دليل مرنة. ثم، يتم تغيير الدليل الأولي لمزيد من المقدم 6 Fr.
- استخدام الحقن الدوري من وسائل الإعلام التباين أو CO2 تحت دليل الفلورسكوب لتحديد مسار الشريان والأوعية الدموية المواقع المسدودة (الشكل 1).
ملاحظة: استخدام وسائط التباين 40 سم مكعب، المخفف 1:1 في 0.9٪ ملحي، أو CO2 في 10 إلى 20 مل لكل طلقة في ضغط من 12 psi. - إدخال اثنين من 0.014 الأسلاك دليل الملاحة Fr واثنين من 0.014 أسلاك دليل دعم الأب في السفينة وتقدم لهم حتى الموقع المحظورة.
ملاحظة: يتم استخدام اثنين من الأسلاك دليل 0.014 Fr (260 سم طويلة) للملاحة واثنين من 0.014 Fr أسلاك دليل (260 سم طويلة) وتستخدم لدعم، خلال إجراء واحد. - إدخال 5 Fr و 3 Fr القسطرة بالتتابع وجمع 10 مل من الدم من أقرب موقع لعرقلة الأوعية الدموية. الحفاظ على عينات الدم على الجليد.
ملاحظة: قد تكون أحجام القسطرة 5 Fr و 3 Fr، ويتم تغييرها أثناء الإجراء. - تقدم سلك دليل مرة أخرى. ثم، إدخال قسطرة بالون رأب الأوعية، الذي يحتوي على بالون قابل للنفخ يقع في نهاية القسطرة. تقدم قسطرة بالون رأب الأوعية ووضع الحق في البالون في موقع الآفة. قم بإجراء عملية رأب الأوعية عن طريق نفخ البالون ضد لوحة الحجب الموجودة في جدار الأوعية الدموية. تحقق من استعادة تدفق الدم.
ملاحظة: قد توضع الدعامة في المنطقة المحجوبة للمساعدة في إبقاء الشريان مفتوحًا بعد الإجراء. - إدخال قسطرة والتقدم حتى أقرب موقع إلى كتلة الأوعية الدموية. جمع 10 مل من الدم في 30 دقيقة الفاصل الزمني بعد رأب الأوعية. الحفاظ على عينات الدم على الجليد.
ملاحظة: يوصى بجمع عينات الدم قبل وبعد رأب الأوعية لتقييم تأثير رأب الأوعية على عدد الـMPCs. - إزالة جميع الأسلاك تحت التوجيه الفلوري.
- توفير إجراءات الرعاية بعد العملية الجراحية، بما في ذلك العلاج المضاد للتخثر باستخدام اليناكسابارين في 1 ملغ/ كغ تحت الجلد كل 12 ساعة، والأسبرين 100 ملغ، الستاتين، والتخويل. ضغط في موقع ثقب الأوعية الدموية خلال 24 ساعة.
2. القياس الكمي ل الخلايا أحادية النوى السلف (MPCs) (الشكل 2)
- إلى أنبوب مخروطي جديد 15 مل، نقل 6 مل من الدم الذي تم جمعه وتمييع 1:1 (v/v) مع برنامج تلفزيوني.
ملاحظة: معالجة الدم في غضون 1 ساعة من جمع. - الاستعداد لفصل التدرج الكثافة، عن طريق إضافة 2 مل من متوسطة التدرج الكثافة إلى 3 أنابيب الاختبار لكل منهما. ثم، إضافة 3 aliquots حجم متساو من الدم المخفف في كل أنبوب الاختبار.
ملاحظة: لا تتجاوز ثلاثة أرباع قدرة أنبوب الاختبار القصوى. - أجهزة الطرد المركزي عند 1,800 x ز لمدة 30 دقيقة عند 4 درجة مئوية. جمع طبقة واجهة الحاضر كخاتم باستخدام ماصة، ونقلها إلى أنبوب جديد. إضافة 2 مل من برنامج تلفزيوني وتدور في 1800 س ز لمدة 6 دقائق في 4 درجة مئوية. حفظ بيليه لأن هذا سوف تحتوي على MPCs.
- اغسل الكريه التي تحتوي على الـ MPCs مع PBS بواسطة الطرد المركزي كما هو موضح في الخطوة 2.3. استخدام برنامج تلفزيوني جديد لكل غسل وتدور في 1800 س ز لمدة 2 دقيقة في 4 °C. كرر العملية لمدة 6 مرات.
- بعد الغسيل الأخير، استخدم 1 مل من برنامج تلفزيوني لإعادة تعليق بيليه الخلية. تمييع 20 ميكرولتر من تعليق الخلية مع 20 ميكرولتر من 0.4٪ trypan الأزرق، 1:1 (v/v). استخدم 10 ميكرولتر من هذا التعليق الخلوي لعد الخلايا باستخدام مقياس الهيموسيت والمجهر الخفيف.
- Aliquot 1 × 106 MPCs في أنابيب 5 ml تدفق سابقا.
ملاحظة: إعداد الأجسام المضادة المطابقة لـ isotype. - أجهزة الطرد المركزي الأنابيب في 1800 س ز لمدة 6 دقائق في 4 درجة مئوية. التعرق وتجاهل المابير.
- تخفيف الأجسام المضادة الأولية في 100 ميكرولتر من محلول حضانة الأجسام المضادة [1X PBS، pH 7.4، EDTA 2 mM، BSA 0.05٪] وإضافة إلى الأنبوب. Resuspend لمدة 10 ق واحتضان لمدة 20 دقيقة في 4 درجة مئوية، في الظلام.
ملاحظة: كانت التركيزات النهائية للأجسام المضادة الأولية المستخدمة في هذا البروتوكول CD45 1:50، CD34 1:20، KDR 1:50، CD184 1:20، CD133 1:50. ويمكن وقف البروتوكول في هذه الخطوة عن طريق تحديد الخلايا الليمفاوية في 4٪ شبهformaldehyde في برنامج تلفزيوني وتخزين عينات تصل إلى 24 ح في 4 درجة مئوية. - أجهزة الطرد المركزي في 1800 × ز لمدة 2 دقيقة في 4 درجة مئوية والتخلص من الفائق. Resuspend في 500 ميكرولتر من 1X PBS، وhH 7.4، EDTA 2 mM.
- إجراء تحليل تدفق قياس الثغرات.
- إعداد الخلفية مع الأجسام المضادة التحكم المتطابقة مع الأيزوتايب. ثم، في مؤامرة FSC / SSC حدد الخلايا الليمفاوية تنتشر، في محاولة لاستبعاد الحطام الخلوي، الحبيبات المتبقية، والجسيمات الأخرى. ويعتبر هذا التوزيع 100٪.
ملاحظة: تنتشر الخلايا الليمفاوية عادة في المنطقة اليسرى السفلى من المؤامرة. - استخدام بوابة مع النمط المناعي المشترك الذي يحتوي على عدد كبير من الخلايا CD45+ وD34+. ثم، حدد للنوعات المناعية الإيجابية المزدوجة باستخدام البوابة التي تم تحديدها سابقا CD45+، CD34+، وإضافة إما KDR (VEGFR -2)+، CD133+ أو CD184+. تحديد الأسطح الفرعية لـ MPCs بواسطة علامات سطح الخلايا المحددة الخاصة بها. تقرير كنسبة مئوية من الأحداث المسورة.
- إعداد الخلفية مع الأجسام المضادة التحكم المتطابقة مع الأيزوتايب. ثم، في مؤامرة FSC / SSC حدد الخلايا الليمفاوية تنتشر، في محاولة لاستبعاد الحطام الخلوي، الحبيبات المتبقية، والجسيمات الأخرى. ويعتبر هذا التوزيع 100٪.
- تحديد السكان الفرعيين الرئيسيين للبلدان المُمَكِّلة. في هذه الدراسة كانت النماذج المناعية التي تم تحليلها CD45+CD34+CD133+; CD45+CD34+CD184+؛ CD45+CD34+CD133+CD184+؛ CD45+CD34+KDR+؛ CD45+CD34+KDR+CD133+ وDD45+CD34+KDR+CD1847،17.
ملاحظة: تم استخدام علامات سطح الخلية هذه للدراسة: CD45 (الخلايا اللمفاوية)، CD34 (الخلايا البطانية و /أو الأوعية الدموية)، KDR (VEGFR-2) (علامة غشاء الخلايا البطانية)، CD133 (خلايا السلف البطانية) وCD184 (الخلايا الجذعية الدموية والخلايا البطانية).
3- علاقة المراكز الميكرفة مع تعديل الوظيفة البطانية واختبار الديناميكا الدموية (FMD)
- تحديد تمدد بالتدفق (FMD)، قبل وما بعد رأب الأوعية.
- استخدم محول خطي في الأوعية الدموية لقياس قطر الشريان العضدي.
- ضع الكفة من مقياس ضغط الدم فوق موقع القياس في الساعد و insufflate في 50 مم زئبق فوق ضغط الدم الانقباضي لمدة 5 دقائق وفرغ.
- تحديد مرة أخرى قطر الشريان العضدي في غضون 60 ثانية المقبلة. استخدم المعادلة أدناه لتقدير الـ إف إم إند.
ملاحظة: حساب درجة توسيع نطاق استخدام المعادلة (٪ = (أقصى قطر بعد نقص التروية عابرة - قطر القاعدي) × 100 / قطر القاعدي.
- ربط عدد الـ MPCs بقيمة الـ FMD الأساسية ودلتا ما بعد رأب الأوعية من الـ FMD.
4- القدرة التنبؤية للبلدان غير الممَرَكَة على بتر الأطراف
- جدولة مواعيد طبية دورية بعد رأب الأوعية بالون والتفريغ المريض, لتقييم نوعية تدفق الدم إلى الطرف السفلي.
- تقييم الخطورة السريرية لاقفارية الأطراف في 2 أسابيع بعد رأب الأوعية. تقييم حل آلام الراحة، انخفاض نقص التروية، والحفاظ على القدم الوظيفية، وفقا لتصنيف روثرفورد13.
- قارن الشدة السريرية لاقفوية الأطراف، في خط الأساس مقابل المتابعة. تحديد الحالات التي تتطلب بتر كبير بسبب نتائج غير مواتية.
- ربط عدد الـMPCs مع نسبة المرضى الذين يحتاجون إلى بتر كبير في الطرف السفلي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وتم جمع عينات دم من الشرايين المسدودة، في الموقع الذي تم تناوله من أجل رأب الأوعية، من 20 مريضاً بالسكري، يبلغ عمرهم 68 عاماً، و10 من أصل 20 من الذكور. وكان نصف عينة السكان من المدخنين. وكانت الآفات الوعائية أساسا كما سجل روثرفورد الدرجة السادسة; في حين أظهر المرضى ارتفاع معدل انتشار مرض السكري من النوع 2 (100٪)، وارتفاع ضغط الدم (70٪) وعسر الدم (55٪).
30 يوما من المتابعة السريرية بعد أن أجريت عملية رأب الأوعية في الأطراف السفلية. نسبة السكان الفرعية لجنة السياسة النقدية في خط الأساس أو ديناميات بعد رأب الأوعية كانت مرتبطة (تحليل سبيرمان) مع درجة الخلل البطانية، كما تم تقييمها من قبل مرض الوفيات النفاسية; وتمت مقارنة العدد الأساسي لـ MPCs بين المرضى الذين يخضعون، أو لا يخضعون، لبتر الأطراف بعد رأب الأوعية (U-Mann Whitney). وأظهرت الدراسة أن السكان الفرعية MPCs الأساسية CD45+CD34+KDR+ يرتبط سلبا مع الوفيات الواماضية(الشكل 3A، اليسار) ، في حين أن تغيير MPCs CD45+CD34+CD133+CD184+ + بعد رأب الأوعية يرتبط بشكل كبير مع تحسن FMD(الشكل 3B، والحق). وعلاوة على ذلك، لوحظت زيادة في عدد خط الأساس من السكان الفرعية للبلدان المم بي سي CD45+CD34+KDR+ (الشكل 4A, B, اليسار) في المرضى الذين تطوروا إلى بتر الأطراف; فضلا عن الحد بعد قسطرة من MPCs سوبكيشن CD45+CD34+CD133+CD184+ (الشكل 4A, C, حق).
الشكل 1: تصوير الأوعية السفلية للأطراف السفلية وجمع الدم. (أ)مسار الأوعية الدموية التي تشهد عليها وسائل الإعلام على النقيض من ذلك تحت المنظار الفلوري. (ب) انسداد الأوعية الدموية قبل رأب الأوعية. (ج)انسداد الأوعية الدموية بعد رأب الأوعية. (د)يستخدم جراح الأوعية الدموية قسطرة لجمع الدم من أقرب مكان إلى انسداد الأوعية الدموية ولوحة تصلب الشرايين، والباحث مختبر مستعد للحصول على عينة الدم. الأسهم تشير إلى موقع العوائق الوعائية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: إعداد عينة الدم وتحديد الخلايا السلف أحادية النوى. (A)إعداد التدرج الكثافة. (B) الخلايا الليمفاوية حلقة الفصل بعد الطرد المركزي في الدم. (ج) جمع المرحلة اللمفاوية. (D) الطرد المركزي. (E) تشكيل بيليه في الجزء السفلي من أنبوب الاختبار. (F)عدد تعليق الخلية. (G) إعداد الخلايا الليمفاوية لتدفق الخلايا. (H) تحديد الخلايا الفرعية حسب عملية استئصال الخلايا. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: علاقة البلدان الجزرية المتعددة المدى بالمؤشرات الديناميكية الدموية. (أ) موقف الموجات فوق الصوتية للحصول على الـ FMD والنتائج التمثيلية. (B) العلاقة بين الاكتظاظ الفرعي ٪MPCs (يسار، CD45+CD34+KDR+؛ يمين، CD45+CD34+CD133+CD184+) وقيم الـ FMD الأساسية؛ فضلا عن العلاقة بين (C) ٪ MPCs بعد رأب الأوعية مع تحسن الـ FMD بعد رأب الأوعية. اختصر: MPCs, خلايا السلف أحادية النوى; FMD، تمدد بوساطة التدفق. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: الـ MPCs والتكهن ببتر الأطراف السفلية بعد رأب الأوعية. (A) ممثل تدفق الصور العملية الخلايا من القسام MPCs الفرعية. (B)اقتران التجمّع الفرعي ٪MPCs (يسار، CD45+CD34+KDR+؛ يمين، CD45+CD34+CD133+CD184+) ، أو (C) ٪ MPCs بعد رأب الأوعية ، مع بتر الأطراف السفلية بعد رأب الأوعية ، خلال متابعة لمدة 30 يومًا. اختصار: MPCs، خلايا السلف أحادية النوى. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الملف التكميلي 1: تصنيف روثرفورد لشدة الإقفاريات الطرفية. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
قد تظهر عملية جمع الدم في الموقع الدقيق الكتلة الوعائية صعوبات تقنية؛ لذلك، قمنا بجمع الدم في القرب من كتلة الأوعية الدموية. وبالمثل، فإن كمية الـMPCs القريبة من اللويحات الوعائية تبدو ديناميكية للغاية وقد تنشأ اختلافات قبل وبعد رأب الأوعية. وفقا لملاحظاتنا، فمن المستحسن لتقييم خط الأساس و 30min-بعد تغيير الأوعية الدموية في عدد من MPCs، لأنها قد تعكس العديد من العمليات الفسيولوجية المرضية التي تحدث في الأضرار الوعائية وإصلاحها.
يوصى بإجراء معالجة عينات الدم لتحديد الـ MPCs في غضون الـ 3 ساعات الأولى؛ لذلك، قد يتم إنشاء خطة تنظيم كافية، وحتى ممارسة المحاكاة السابقة، بين فريق جراحة الأوعية الدموية والباحثين في المختبر. وينبغي أن يتم عزل MPCs بعناية، لا سيما خلع عينة الدم في تدرج كثافة وغسلات من بيليه تحتوي على MPCs. لدينا مجموعة استخدام لنقل الخلايا إلى أنبوب الخلايا، إضافة الأجسام المضادة الأولية، إصلاح، وتخزين الخلايا بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية. بسبب الوقت الإدارة الراحة، وتدفق القراءة cytometry سيتم تنفيذها في اليوم التالي.
وفيما يتعلق بدور تعميم المركبات العضوية المُمَرَكَة كعلامة بيولوجية سريرية مفيدة لتلف الأوعية الدموية وإصلاحها، فقد تم الإبلاغ عن جهود هامة لتوحيد الأنماط المناعية بين الخلايا السلف17. وينبغي أن يشمل التوصيف الشامل السكّان الفرعية للخلايا السلف المتداولة المشاركة في السيناريوهات السريرية المختلفة ضمن أمراض الأوعية الدموية. باستخدام الطرق المذكورة هنا، وجدنا أن الحد بعد قسطرة من MPCs الفرعية CD45+CD34+CD133+CD184+ هو التنبؤية لبتر الكبرى. هذه النتيجة تدعم فكرة أن الاستجابة الالتهابية أثناء الإصابة الوعائية أو رأب الأوعية تحفز إشارات التوجيه لMPCs ، وتعزيز إصلاح الأنسجة المحلية18،19.
وبالمثل، الملاحظة متسقة مع التأثير المبلغ عنه من عدد مخفض من CD45+CD34+CD133+ و CD45+CD34 + CD133+184+ السكان الفرعية من MPCs كمنبئ للنتائج القلبية الوعائية السلبية بعد قسطرة التاجية7، والتي يمكن تفسيرها بزيادة قدرة أقل تميزا من الأنماط الظاهرية من progenitors endothelial على الالتزام مصفوفة خارج الخلية ، لتكاثر والاستجابة للحافز الأوعية الدموية18.
وعلاوة على ذلك، لاحظنا أن عددا متزايدا من CD45+CD34+KDR+ السكان الفرعية من MPCs بعد رأب الأوعية كان متصلا بتر الأطراف على الرغم من أنها قد اعتبرت للمساهمة في إصلاح الأوعية الدموية. ويمكن تفسير هذا الجدل بسبب: 1) الاختلافات في تصميم الدراسة, منذ دراسات أخرى قد قارنت عدد CD45+CD34+KDR+ MPCs بين المرضى الذين يعانون من CLI والضوابط الصحية19; 2) الاختلافات في أساليب لأخذ عينات الدم، بما في ذلك الموقع والوقت فيما يتعلق بالرأب الوعائي؛ و 3) نوع من انسداد الشريان والأوعية الدموية.
وقد حظي التوصيف التكهني للعلامات الحيوية الجديدة، استناداً إلى الآليات المسؤولة عن إصلاح الأوعية الدموية في العديد من الأمراض، باهتمام كبير في البحوث الانتقالية. هذا هو الوصف الأول لطريقة لاستكشاف دور الـ MPCs، الذي يتم تحديده محليًا في موقع قريب من كتلة الأوعية الدموية، في تشخيص بتر الأطراف بعد رأب الأوعية في الحالات التي تجرى فيها CLI. أحد القيود هو عدم وجود تحديد MPCs في نقاط زمنية أكثر بعد رأب الأوعية. ومع ذلك، فإننا نعتقد أن النتائج التي توصلنا إليها إثراء مجال البحوث الأوعية الدموية من خلال توصيف الدور الترجمي لMPCs خلال تلف الأوعية الدموية، والإصلاح، واحتمال التكهن للبتر الكبرى في المرضى الذين يعانون من CLI. على وجه الخصوص، نحن نعتبر أن الطريقة المذكورة هنا قد تكون مفيدة في التنبؤ بالنتائج الوعائية السلبية في البيئات السريرية التي تنطوي على إصابة الأوعية الدموية وآليات الإصلاح، مثل الأطراف السفلية والإقفار التاجي، والسكتة الدماغية، والتهاب الأوعية الدموية، و / أو تجلط الدم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
يشكر المؤلفون دعم البرنامج المؤسسي E015 للمشروع ID 356.2015.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BSA | Roche | 10735086001 | Bovine Serum Albumin (BSA) as a buffering agent, stabilizer, standard and for blending. |
| Calibration Beads | Miltenyi Biotec / MACS | #130-093-607 | MACQuant calibration beads are supplied in aqueous solution containing 0.05% sodium azide. 3.5 ml for up to 100 tests |
| CD133/1 (AC133)-PE | Milteny Biotec / MACS | #130-080-801 | Antibody conjugated to R-Phycoerythrin in PBS/EDTA buffer |
| CD184 (CXCR4)-PE-VIO770 | Miltenyi Biotec / MACS | #130-103-798 | Monoclonal, Isotype recombinant human IgG1, conjugated |
| CD309 (VEGFR-2/KDR)-APC | Miltenyi Biotec / MACS | #130-093-601 | Antibody conjugated to R-Phycoerythrin in PBS/EDTA buffer |
| CD34-FITC | Miltenyi Biotec / MACS | #130-081-001 | The monoclonal antibody clone AC136 detecs a class III epitope of the CD34 |
| CD45- VioBlue | Miltenyi Biotec / MACS | #130-092-880 | Monoclonal CD45 Antibody, human conjugated |
| Conical Tubes | Thermo SCIENTIFIC | #339651 | 15ml conical centrifuge tubes |
| Cytometry Tubes | FALCON Corning Brand | #352052 | 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube. 12x75 style. Sterile. |
| EDTA | BIO-RAD | #161-0729 | Heavy metals, (as Pb) <10ppm, Fe<0.01%, As<1ppm, Insolubles<0.005% |
| Improved Neubauer | Without brand | Without catalog number | Hemocytometer for cell counting. (range 0.1000mm, 0.0025mm2) |
| K2 EDTA Blood Collection Tubes | BD Vacutainer | #367863 | Lilac plastic vacutainer tube (K2E) 10.8mg, 6 mL. |
| Lymphoprep | Stemcell Technologies | 01-63-12-002-A | Sterile and checked on the presence of endotoxins. Density: 1.077±0.001g/mL |
| Paraformaldehyde | SIGMA-ALDRICH | #SZBF0920V | Fixation of biological samples, (powder, 95%) |
| Pipette Transfer 1,3mL | CRM Globe | PF1016, PF1015 | The transfer pipette is a tool that facilitates liquid transfer with greater accuracy. |
| Test Tubes | KIMBLE CHASE | 45060 13100 | Heat-resistant test tubes. SIZE/CAP 13 x 100 mm |
References
- Serrano-Hernando, F. J., Martín-Conejero, A. Peripheral artery disease: Pathophysiology, diagnosis and treatment. Revista Española de Cardiología. 60 (9), 969-982 (2007).
- Agarwal, S., et al. Burden of re-admissions among patients with critical limb ischemia. Journal of the American College of Cardiology. 69 (15), 1897-1908 (2017).
- Kolte, D., et al. Thirty-day re-admissions after endovascular or surgical therapy for critical limb ischemia: Analysis of the 2013 to 2014 nationwide re-admissions databases. Circulation. 136 (2), 167-176 (2017).
- Rowlands, T. E., Donnelly, R. Medical therapy for intermittent claudication. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 34, 314-321 (2007).
- Cronewett, J. L. Acute limb ischemia and lower extremity chronic arterial disease: Rutherford's vascular surgery (8th ed.). , Saunders Elsevier. Philadelphia, PA. (2014).
- Dick, F., et al. Surgical or endovascular revascularization in patients with critical limb ischemia: influence of diabetes mellitus on clinical outcome. Journal of Vascular Surgery. 45 (4), 751-761 (2007).
- Suárez-Cuenca, J. A., et al. Coronary circulating mononuclear progenitor cells and soluble biomarkers in the cardiovascular prognosis after coronary angioplasty. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (7), 4844-4849 (2019).
- Franz, R., et al. Use of autologous bone marrow mononuclear cell implantation therapy as a limb salvage procedure in patients with severe peripheral arterial disease. Journal of Vascular Surgery. 50 (6), 1378-1390 (2009).
- Benoit, E., O'Donnell, T. F., Patel, A. N. Safety and efficacy of autologous cell therapy in critical limb ischemia: A systematic review. Cellular Transplantation. 22 (3), 545-562 (2013).
- Hill, J. M., et al. Circulating endothelial progenitor cells, vascular function, and cardiovascular risk. New England Journal of Medicine. 348 (7), 593-600 (2003).
- Schmidt-Lucke, C., et al. Reduced number of circulating endothelial progenitor cells predicts future cardiovascular events: proof of concept for the clinical importance of endogenous vascular repair. Circulation. 111 (22), 2981-2987 (2005).
- Smadja, D. M. Early endothelial progenitor cells in bone marrow are a biomarker of cell therapy success in patients with critical limb ischemia. Cytotherapy. 14 (2), 232-239 (2012).
- Kremastinos, D. T., et al. Intracoronary cyclic-GMP and cyclic-AMP during percutaneous transluminal coronary angioplasty. International Journal of Cardiology. 53 (3), 227-232 (1996).
- Truong, Q. A., Januzzi, J. L., Szymonifka, J., Thai, W. E., Wai, B., Lavender, Z. Coronary sinus biomarker sampling compared to peripheral venous blood for predicting outcomes in patients with severe heart failure undergoing cardiac resynchronization therapy: the BIOCRT study. Heart Rhythm. 11 (12), 2167-2175 (2014).
- Ding, N., et al. Fibrosis and inflammatory markers and long-term risk of peripheral artery disease: The ARIC study. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 40 (9), 2322-2331 (2020).
- Potier, L., et al. Plasma copeptin and risk of lower-extremity amputation in Type 1 and Type 2 diabetes. Diabetes Care. 40 (12), 2290-2297 (2019).
- Schmidt-Lucke, C., et al. Quantification of circulating endothelial progenitor cells using the modified ISHAGE protocol. PLoS One. 5 (1), 13790 (2010).
- Marboeuf, P., et al. Inflammation triggers colony forming endothelial cell mobilization after angioplasty in chronic lower limb ischemia. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 6 (1), 195-197 (2008).
- Regueiro, A., et al. Mobilization of endothelial progenitor cells in acute cardiovascular events in the PROCELL study: Time-course after acute myocardial infarction and stroke. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 80, 146-155 (2015).
