Summary
A amputação de membros inferiores pode ocorrer mesmo após a angioplastia de vasos obstruídos em Isquemia de Membros Críticos (CLI). Células Progenitoras Mononucleares (MPCs) refletem o reparo vascular. O presente protocolo descreve a quantificação de CMS de circulação próxima à angioplastia, e sua relação com disfunção endotelial e previsão de amputação de membros inferiores.
Abstract
Isquemia de membros críticos (CLI) representa um estágio avançado da doença arterial periférica. A angioplastia melhora o fluxo sanguíneo para o membro inferior; no entanto, alguns pacientes irreversivelmente progredir para amputação de membros. A extensão dos danos vasculares e os mecanismos de reparação vascular são fatores que afetam o desfecho pós-angioplastia. As Células Progenitoras Mononucleares (MPCs) são reativas a danos vasculares e reparos, com a capacidade de refletir doenças vasculares. O presente protocolo descreve a quantificação de CMS obtidos a partir da circulação sanguínea de um vaso próximo ao local da angioplastia, bem como sua relação com a disfunção endotelial e sua capacidade preditiva para amputação de membros nos próximos 30 dias após a angioplastia em pacientes com CLI.
Introduction
A Doença Arterial Periférica (PAD) é caracterizada por obstrução vascular crônica e progressiva com limitação do fornecimento de sangue1. Em escala global, o PAD dos membros inferiores afeta cerca de 10% da população idosa, enquanto até 7% desses casos são submetidos à amputação de membros2,3.
Isquemia de Membros Críticos (CLI) representa a apresentação mais séria do PAD1. Os pacientes geralmente sentem dor em repouso, úlceras ou gangrena atribuíveis a artérias ocluídas; enquanto o prognóstico clínico é desfavorável e marcado por um risco de 30% de amputação e mortalidade dos membros durante 1 ano3,4,5.
A angioplastia é um procedimento endovascular minimamente invasivo que pode restaurar o fluxo sanguíneo para o membro inferior em pacientes com CLI; no entanto, alguns pacientes inevitavelmente exigirão amputação de membros principais, mesmo após a terapia de angioplastia1,5. A identificação precoce de desfechos desfavoráveis após a angioplastia é bastante valiosa, devido à possibilidade de aplicação da terapia.
Fatores de risco tradicionais podem fornecer uma capacidade preditiva limitada para amputação de membros principais em pacientes com CLI submetido à angioplastia6. Biomarcadores orientados à fisiopatologia representam novos métodos com aplicações clínicas potenciais, o que pode resultar especificamente útil em doenças relacionadas à lesão vascular7. Atualmente, a participação de populações celulares proprietárias de propriedades de reparo endotelial, no local da placa aterosclerótica, tem sido cada vez mais reconhecida8,9.
As Células Progenitoras Mononucleares (MPCs) são derivadas da medula óssea e possuem características estruturais e funcionais de células-tronco com habilidades regenerativas vasculares. Devido à capacidade do MPC de proliferar, migrar e mostrar adesão vascular; essas células tornaram-se bons candidatos para refletir o reparo endotelial em resposta à isquemia10,11,12. Além disso, o interesse contínuo por mecanismos subjacentes à lesão vascular tem motivado a exploração do papel prognóstico dos biomarcadores locais, uma vez que são considerados para refletir danos vasculares e reparar7,13,14.
O objetivo do presente estudo é descrever como determinar a quantidade de MPCs que circulam perto da obstrução vascular em pacientes com CLI submetidos à angioplastia; e como avaliar a relação entre ASCs com indicadores de disfunção endotelial e amputação de membros.
Em comparação com o prognóstico baseado em comorbidades e características vasculares intrínsecas, a quantidade de MPCs locais mostram capacidade específica de prever o desfecho clínico em relação à disfunção endotelial e amputação de membros. Consistentemente, alguns estudos descreveram o papel prognóstico de biomarcadores semelhantes durante a avaliação de pacientes com PAD15,16.
Com base em resultados anteriores7, o método descrito aqui pode ser útil para uma identificação precoce da população em risco de desfechos vasculares adversos em diversos ambientes clínicos, como isquemia de membros inferiores e coronárias, acidente vascular cerebral, vasculite, trombose venosa e outros envolvendo lesão vascular e reparação.
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Protocol
O comitê de ética em pesquisa institucional do Centro Médico Nacional "20 de Noviembre" issste aprovou este protocolo prospectivo, todos os pacientes inscritos forneceram consentimento por escrito informado.
1. Avaliação de bloco vascular de membro inferior, amostragem de sangue e angioplastia de balão
NOTA: A amostra utilizada para este experimento foi composta por 20 pacientes diabéticos, com idade entre 68 anos e 10 em 20 homens. Metade da amostra era de fumantes e as co-morbidades mais prevalentes eram diabetes mellitus tipo 2, hipertensão arterial sistêmica e/ou dislipidemia. A amostra destinava-se a ser padronizada para idade, sexo e co-morbidades. O possível viés devido à influência clínico-demográfica na relação entre OSCs e CLI não pôde ser descartado.
- Avaliar a gravidade clínica da isquemia dos membros de acordo com a classificação de Rutherford13 (ver Tabela Suplementar 1).
- Realizar angiografia de membros inferiores, amostragem de sangue e angioplastia de balão.
- Use anticoagulantes e medicamentos anestésicos antes da cirurgia.
- Coloque uma agulha de 18 G no vaso sanguíneo no local da virilha selecionado.
- Coloque um introdutor e avance um fio guia flexível. Em seguida, o guia inicial é ainda mais alterado para um introdutor de 6 Fr.
- Use injeção periódica de mídia de contraste ou CO2 sob guia fluoroscópica para identificar trajetória arterial e locais bloqueados vasculares(Figura 1).
NOTA: Use mídia de contraste de 40 cc, diluída 1:1 em 0,9% salina, ou CO2 a 10 a 20 mL por tiro a uma pressão de 12 psi. - Introduza dois fios guia de navegação 0,014 Fr e dois fios de guia de suporte de 0,014 Fr na embarcação e avance-os até o local bloqueado.
NOTA: Dois fios-guia de 0,014 Fr (260 cm de comprimento) são utilizados para navegação e dois fios-guia de 0,014 Fr (260 cm de comprimento) são utilizados para suporte, durante um único procedimento. - Introduza 5 cateteres Fr e 3 Fr sequencialmente e colete 10 mL de sangue do local mais próximo à obstrução vascular. Mantenha amostras de sangue no gelo.
NOTA: Os tamanhos dos cateteres podem ser de 5 Fr e 3 Fr, e são alterados durante o procedimento. - Avance um fio guia novamente. Em seguida, introduza um cateter de balão de angioplastia, que contém um balão inflável localizado no final do cateter. Avance o cateter do balão da angioplastia e coloque o balão bem no local da lesão. Realize a angioplastia inflando o balão contra a placa de bloqueio localizada na parede vascular. Verifique a restauração do fluxo sanguíneo.
NOTA: Um stent pode ser colocado na área bloqueada para ajudar a manter a artéria aberta após o procedimento. - Introduza um cateter e avance até o local mais próximo do bloco vascular. Coletar 10 mL de sangue a 30 minutos de intervalo após angioplastia. Mantenha amostras de sangue no gelo.
NOTA: Recomenda-se a coleta de amostras de sangue antes e depois da angioplastia para avaliar melhor a influência da angioplastia no número de MPCs. - Remova todos os fios sob orientação fluoroscópica.
- Fornecer procedimentos de assistência pós-operatória, incluindo terapia anticoagulação usando enoxaparina a 1 mg/kg subcutâneo a cada 12 h, aspirina 100 mgs, estatina e analgesia. Compresse no local da punção vascular durante 24 h.
2. Quantificação das células progenitoras mononucleares circulantes (MPCs) (Figura 2)
- Para um tubo cônico fresco de 15 mL, transfira 6 mL do sangue coletado e diluir 1:1 (v/v) com PBS.
NOTA: Processe o sangue dentro de 1h da coleta. - Prepare-se para a separação do gradiente de densidade, adicionando 2 mL do gradiente de densidade médio a 3 tubos de ensaio cada. Em seguida, adicione 3 alíquotas de volume iguais do sangue diluído em cada tubo de ensaio.
NOTA: Não exceda três quartos da capacidade máxima do tubo de ensaio. - Centrifugar a 1.800 x g por 30 min a 4 °C. Colete a camada de interface presente como um anel usando uma pipeta e transfira para um novo tubo. Adicione 2 mL de PBS e gire a 1.800 x g por 6 min a 4 °C. Guarde a pelota, pois isso conterá MPCs.
- Lave a pelota contendo MPCs com PBS por centrifugação conforme descrito na etapa 2.3. Use PBS fresco para cada lavagem e gire a 1.800 x g por 2 min a 4 °C. Repita o processo por 6 vezes.
- Após a última lavagem, use 1 mL de PBS para resuspensar a pelota da célula. Diluir 20 μL da suspensão celular com 20 μL de 0,4% de tripano azul, 1:1 (v/v). Use 10 μL desta suspensão celular para contagem de células usando hemótmetro e um microscópio leve.
- Aliquot 1 x 106 MPCs em tubos de citometria de fluxo de 5 mL previamente rotulados.
NOTA: Prepare os anticorpos de controle correspondentes ao isótipo correspondentes. - Centrifugar os tubos a 1.800 x g por 6 min a 4 °C. Aspire e descarte o supernaspe.
- Diluir o anticorpo primário em 100 μL de solução de incubação de anticorpos [1x PBS, pH 7.4, EDTA 2 mM, BSA 0,05%] e adicionar ao tubo. Resuspend para 10 s e incubar por 20 min a 4 °C, no escuro.
NOTA: As concentrações finais dos anticorpos primários utilizados no presente protocolo foram CD45 1:50, CD34 1:20, KDR 1:50, CD184 1:20, CD133 1:50. O protocolo pode ser interrompido nesta etapa, fixando linfócitos em 4% de paraformaldeído na PBS e armazenando amostras até 24h a 4 °C. - Centrifugar a 1.800 x g por 2 min a 4 °C e descartar o supernaspe. Resuspend em 500 μL de 1x PBS, pH 7.4, EDTA 2 mM.
- Realize a análise da citometria de fluxo.
- Configure o fundo com anticorpos de controle compatível com isótipo. Em seguida, no gráfico FSC/SSC, os linfócitos selecionados se espalham, tentando excluir detritos celulares, granulócitos residuais e outras partículas. Essa distribuição é considerada 100%.
NOTA: Os linfócitos geralmente se espalham na região inferior esquerda do enredo. - Use um portão com imunofenótipo comum contendo alto número de células CD45+ e CD34+. Em seguida, selecione para imunofenótipos duplos positivos usando o portão que anteriormente identificou CD45+, CD34+, e adicionando KDR (VEGFR-2)+, CD133+ ou CD184+. Identifique as subpopulações dos MPCs por seus marcadores de superfície celular específicos. Informe-se como a porcentagem de eventos fechados.
- Configure o fundo com anticorpos de controle compatível com isótipo. Em seguida, no gráfico FSC/SSC, os linfócitos selecionados se espalham, tentando excluir detritos celulares, granulócitos residuais e outras partículas. Essa distribuição é considerada 100%.
- Identificar as principais subpopulações de MPCs. No presente estudo, os imunofenótipos analisados foram CD45+CD34+CD133+; CD45+CD34+CD184+; CD45+CD34+CD133+CD184+; CD45+CD34+KDR+; CD45+CD34+KDR+CD133+ e CD45+CD34+KDR+CD1847,17.
NOTA: Estes marcadores de superfície celular foram utilizados para o estudo: CD45 (linfócitos), CD34 (células endoteliais e/ou vasculares), KDR (VEGFR-2) (marcador de membrana de células endoteliais), CD133 (células progenitoras endoteliais) e CD184 (células-tronco hematopoiéticas e células endoteliais).
3. Relação dos MPCs com modificação da função endotelial e teste hemodinâmico (FMD)
- Determine a dilatação mediada por fluxo (FMD), pré e pós-angioplastia.
- Use um transdutor linear vascular para medir o diâmetro da artéria braquial.
- Coloque a braçadeira do esfigmomanômetro acima do local de medição no antebraço e insuflê a 50 mmHg acima da pressão arterial sistólica por 5 min e desintoque.
- Determine novamente o diâmetro da artéria braquial nos próximos 60 s. Use a equação abaixo para estimar a Febre Aftosa.
NOTA: Calcular o grau de dilatação utilizando a equação (%) = (diâmetro máximo após isquemia transitória - diâmetro basal) × 100 / diâmetro basal.
- Correlacionar o número de MPCs com o valor de FMD de linha de base e delta pós-angioplastia de FMD.
4. Capacidade prognóstica de MPCs para amputação de membros
- Agende consultas médicas periódicas após angioplastia de balão e alta do paciente, para avaliar a qualidade do fluxo sanguíneo para o membro inferior.
- Avalie a gravidade clínica da isquemia dos membros às 2 semanas após a angioplastia. Avaliar a resolução da dor de repouso, isquemia mais baixa e preservação de um pé funcional, de acordo com a classificação Rutherford13.
- Compare a gravidade clínica da isquemia dos membros, na linha de base versus acompanhamento. Identificar esses casos que requerem amputação maior devido ao desfecho desfavorável.
- Correlacionar o número de CMIs com a proporção de pacientes que necessitam de amputação maior do membro inferior.
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Representative Results
Amostras de sangue de artérias bloqueadas, no local abordado para angioplastia, foram coletadas de 20 pacientes diabéticos, com idade entre 68 anos e 10 em 20 homens. Metade da população amostral era fumante. As lesões vasculares foram pontuadas principalmente como Rutherford classe VI; enquanto os pacientes apresentaram maior prevalência de Diabetes Mellitus tipo 2 (100%), hipertensão (70%) e dislipidemia (55%).
Um acompanhamento clínico de 30 dias após a angioplastia dos membros inferiores foi realizada. O percentual de subpopulações de MPC na linha de base ou dinâmica após a angioplastia foram correlacionados (análise de Spearman) com o grau de disfunção endotelial, conforme avaliado pela FEBRE AF; e o número de MPCs na linha de base foi comparado entre pacientes submetidos, ou não, amputação de membros após angioplastia (U-Mann Whitney). O estudo mostrou que a subpopulação de MPCs de base CD45+CD34+KDR+ correlacionada negativamente com a FEBRE AF(Figura 3A, esquerda), enquanto a mudança dos MPCs CD45+CD34+CD133+CD184+ após a angioplastia correlacionada significativamente com a melhora da FEBRE AF(Figura 3B, à direita). Além disso, observou-se aumento do número de base de MPCs subpopulação CD45+CD34+KDR+ (Figura 4A,B, esquerda) nos pacientes que evoluíram para amputação de membros; bem como a redução pós-angioplastia da subpopulação de MPCs CD45+CD34+CD133+CD184+ (Figura 4A,C, à direita).
Figura 1: Angiografia de membros inferiores e coleta de sangue. (A) Trajetória vascular evidenciada por meios de contraste sob fluoroscopia. (B) Obstrução vascular antes da angioplastia. (C) Obstrução vascular após angioplastia. (D) Cirurgião vascular usa um cateter para coletar sangue do local mais próximo da obstrução vascular e placa de atheroma, e o pesquisador do Laboratório está pronto para obter a amostra de sangue. Setas indicam o local de obstruções vasculares. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Preparação da amostra de sangue e determinação de células progenitoras mononucleares (MPCs). (A) Preparação de gradiente de densidade. (B) Separação do anel de linfócitos após centrifugação sanguínea. (C) Coleta da fase linfócito. (D)Centrifugação. (E) Formação de pelotas na parte inferior do tubo de ensaio. (F) Contagem de suspensão celular. (G) Preparação de linfócitos para citometria de fluxo. (H) Determinação das subpopulações celulares por citometria de fluxo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Relação dos MPCs com indicadores hemodinâmicos. (A) Posição do ultrassom para aquisição de Febre Aftosa e resultados representativos. (B) Relação entre subpopulações de %MPCs de linha de base (esquerda, CD45+CD34+KDR+; direita, CD45+CD34+CD133+CD184+) e valores de FMD de linha de base; bem como a relação de (C) %MPCs após angioplastia com melhora da Febre Aftosa após angioplastia. Abreviaturas: MPCs, Células Progenitoras Mononucleares; Febre Aftosa, Dilação Mediada por Fluxo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: MPCs e prognóstico de amputação de membros inferiores após angioplastia. (A) Imagens representativas de citometria de fluxo das subpopulações de MPCs. (B) Associação de subpopulações %MPCs de linha de base (esquerda, CD45+CD34+KDR+; direita, CD45+CD34+CD133+CD184+), ou (C) %MPCs após angioplastia, com amputação de membros inferiores após angioplastia, durante um seguimento de 30 dias. Abreviaturas: MPCs, Células Progenitoras Mononucleares. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Arquivo suplementar 1: Classificação de Rutherford de gravidade da isquemia de membros. Clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
A coleta de sangue no local exato do bloco vascular pode apresentar dificuldades técnicas; por isso, realizamos coleta de sangue nas proximidades do bloco vascular. Da mesma forma, a quantidade de MPCs próximos à placa vascular parece ser altamente dinâmica e pode originar variações antes e depois da angioplastia. De acordo com nossas observações, recomenda-se avaliar as alterações de linha de base e 30min pós-angioplastia no número de MPCs, uma vez que podem refletir diversos processos fisiofisiológicos que ocorrem dentro de danos vasculares e reparos.
Recomenda-se que o processamento da amostragem sanguínea para a determinação dos CCM seja realizado nas primeiras 3h; portanto, um plano de organização adequado e até mesmo uma prática de simulação prévia, pode ser estabelecido entre a equipe de cirurgia angiologia-vascular e pesquisadores de laboratório. O isolamento dos MPCs deve ser cuidadosamente realizado, particularmente depondo a amostra de sangue em gradiente de densidade e lavagens da pelota contendo MPCs. Nosso grupo usa para transferir células para o tubo de citometria, adicionar anticorpos primários, fixar e armazenar células durante a noite a 4 °C; devido à conveniência da administração do tempo, e a leitura da citometria de fluxo seria realizada no dia seguinte.
Quanto ao papel dos MPCs circulantes como biomarcador clínico útil de danos vasculares e reparação, importantes esforços têm sido relatados para padronizar os imunofenótipos entre as células progenitoras17. Uma caracterização abrangente deve incluir subpopulações de células progenitoras circulantes que participam dos diferentes cenários clínicos dentro de doenças vasculares. Usando os métodos aqui descritos, descobrimos que a redução pós-angioplastia da subpopulação de MPCs CD45+CD34+CD133+CD184+ é preditiva para grande amputação. Este achado sustenta a noção de que a resposta inflamatória durante lesões vasculares ou angioplastia estimulam sinais de localização para os MPCs, promovendo a reparação de tecidos locais18,19.
Da mesma forma, a observação é consistente com o efeito relatado do número reduzido de CD45+CD34+CD133+ e CD45+CD34+CD133+184+ subpopulações de MPCs como preditor de desfechos cardiovasculares adversos após angioplastia coronariana7, o que pode ser explicado pelo aumento da capacidade de fenótipos menos diferenciados de progenitores endotelial. para proliferar e responder ao estímulo vasculogênico18.
Além disso, observou-se que um número aumentado de CD45+CD34+KDR+ subpopulação de PCM após angioplastia foi relacionada com amputação de membros, embora tenham sido considerados para contribuir para a reparação vascular. Essa controvérsia pode ser explicada devido a: 1) variações no desenho do estudo, uma vez que outros estudos compararam o número de CD45+CD34+KDR+ MPCs entre pacientes com CLI e controles saudáveis19; 2) variações nos métodos de amostragem de sangue, incluindo o local e o tempo relativo à angioplastia; e 3) o tipo de artéria bloqueada e vascularizada.
A caracterização prognóstica de novos biomarcadores, a partir de mecanismos responsáveis pela reparação vascular em diversas doenças, tem recebido atenção significativa na pesquisa translacional. Esta é a primeira descrição de um método para explorar o papel dos MPCs, determinado localmente em um local próximo ao bloco vascular, no prognóstico de amputação de membros após angioplastia em casos com CLI. Uma limitação é a falta de determinação dos CMIs em mais pontos de tempo após a angioplastia. No entanto, acreditamos que nossos achados enriquecem o campo da pesquisa vascular caracterizando o papel translacional dos MPCs durante danos vasculares, reparação e potencial prognóstico para grande amputação em pacientes com CLI. Particularmente, consideramos que o método aqui descrito pode ser útil na previsão de desfechos vasculares adversos em ambientes clínicos envolvendo lesões vasculares e mecanismos de reparação, como isquemia de membros inferiores e coronárias, derrame, vasculite e/ou trombose venosa.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Os autores agradecem o apoio do Programa Institucional E015 pelo projeto ID 356.2015.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BSA | Roche | 10735086001 | Bovine Serum Albumin (BSA) as a buffering agent, stabilizer, standard and for blending. |
| Calibration Beads | Miltenyi Biotec / MACS | #130-093-607 | MACQuant calibration beads are supplied in aqueous solution containing 0.05% sodium azide. 3.5 ml for up to 100 tests |
| CD133/1 (AC133)-PE | Milteny Biotec / MACS | #130-080-801 | Antibody conjugated to R-Phycoerythrin in PBS/EDTA buffer |
| CD184 (CXCR4)-PE-VIO770 | Miltenyi Biotec / MACS | #130-103-798 | Monoclonal, Isotype recombinant human IgG1, conjugated |
| CD309 (VEGFR-2/KDR)-APC | Miltenyi Biotec / MACS | #130-093-601 | Antibody conjugated to R-Phycoerythrin in PBS/EDTA buffer |
| CD34-FITC | Miltenyi Biotec / MACS | #130-081-001 | The monoclonal antibody clone AC136 detecs a class III epitope of the CD34 |
| CD45- VioBlue | Miltenyi Biotec / MACS | #130-092-880 | Monoclonal CD45 Antibody, human conjugated |
| Conical Tubes | Thermo SCIENTIFIC | #339651 | 15ml conical centrifuge tubes |
| Cytometry Tubes | FALCON Corning Brand | #352052 | 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube. 12x75 style. Sterile. |
| EDTA | BIO-RAD | #161-0729 | Heavy metals, (as Pb) <10ppm, Fe<0.01%, As<1ppm, Insolubles<0.005% |
| Improved Neubauer | Without brand | Without catalog number | Hemocytometer for cell counting. (range 0.1000mm, 0.0025mm2) |
| K2 EDTA Blood Collection Tubes | BD Vacutainer | #367863 | Lilac plastic vacutainer tube (K2E) 10.8mg, 6 mL. |
| Lymphoprep | Stemcell Technologies | 01-63-12-002-A | Sterile and checked on the presence of endotoxins. Density: 1.077±0.001g/mL |
| Paraformaldehyde | SIGMA-ALDRICH | #SZBF0920V | Fixation of biological samples, (powder, 95%) |
| Pipette Transfer 1,3mL | CRM Globe | PF1016, PF1015 | The transfer pipette is a tool that facilitates liquid transfer with greater accuracy. |
| Test Tubes | KIMBLE CHASE | 45060 13100 | Heat-resistant test tubes. SIZE/CAP 13 x 100 mm |
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