Summary
La amputación de miembros inferiores puede ocurrir incluso después de la angioplastia de vasos obstruidos en isquemia de extremidades críticas (CLI). Las células progenitoras mononucleares (MPC) reflejan la reparación vascular. El protocolo actual describe la cuantificación de los MPCs de la circulación cercana a la angioplastia, y su relación con la disfunción endotelial y la predicción de la amputación de las extremidades inferiores.
Abstract
La isquemia crítica de las extremidades (CLI) representa una etapa avanzada de la enfermedad arterial periférica. La angioplastia mejora el flujo sanguíneo a la extremidad inferior; sin embargo, algunos pacientes progresan irreversiblemente a la amputación de extremidades. El alcance del daño vascular y los mecanismos de reparación vascular son factores que afectan el resultado posterior a la angioplastia. Las células progenitoras mononucleares (MPC) son reactivas para el daño vascular y la reparación, con la capacidad de reflejar enfermedades vasculares. El protocolo actual describe la cuantificación de los MPCs obtenidos de la circulación sanguínea de los vasos cercanos al sitio de la angioplastia, así como su relación con la disfunción endotelial y su capacidad predictiva para la amputación de extremidades en los próximos 30 días después de la angioplastia en pacientes con CLI.
Introduction
Enfermedad arterial periférica (PAD) se caracteriza por una obstrucción vascular crónica y progresiva con limitación del suministro de sangre1. A escala mundial, pad de las extremidades inferiores afecta a alrededor del 10% de la población de edad avanzada, mientras que hasta el 7% de estos casos se someten a la amputación de extremidades2,3.
La isquemia de las extremidades críticas (CLI) representa la presentación más seria del PAD1. Por lo general, los pacientes experimentan dolor en reposo, úlceras o gangrena atribuible a arterias ocluidas; mientras que el pronóstico clínico es desfavorable y marcado por un 30% de riesgo de amputación y mortalidad de extremidades durante 1 año3,4,5.
La angioplastia es un procedimiento endovascular mínimamente invasivo que puede restaurar el flujo sanguíneo a la extremidad inferior en pacientes con CLI; sin embargo, algunos pacientes inevitablemente requerirán una amputación importante de las extremidades, incluso después de la terapia de angioplastia1,5. La identificación temprana de resultados desfavorables después de la angioplastia es bastante valiosa, debido a la posibilidad de la aplicación de la terapia.
Los factores de riesgo tradicionales pueden proporcionar una capacidad predictiva limitada para la amputación de extremidades principales en pacientes con CLI sometidos a angioplastia6. Los biomarcadores orientados a la fisiopatología representan métodos novedosos con aplicaciones clínicas potenciales, que pueden resultar específicamente útiles en enfermedades relacionadas con lesiones vasculares7. Hoy en día, la participación de poblaciones celulares propietarias de propiedades de reparación endotelial, en el sitio de la placa aterosclerótica, ha sido cada vez más reconocida8,9.
Las células progenitoras mononucleares (MPC) se derivan de la médula ósea y de las características estructurales y funcionales propias de las células madre con capacidades regenerativas vasculares. Debido a la capacidad de MPC para proliferar, migrar y mostrar adherencia vascular; estas células se han convertido en buenos candidatos para reflejar la reparación endotelial en respuesta a la isquemia10,11,12. Además, el continuo interés por los mecanismos que subyacen a lesiones vasculares ha motivado la exploración del papel pronóstico de los biomarcadores locales, ya que se considera que reflejan daños vasculares y reparación7,13,14.
El propósito del presente estudio es describir cómo determinar la cantidad de MPCs que circulan cerca de la obstrucción vascular en pacientes con CLI sometidos a angioplastia; y cómo evaluar la relación entre los MPCs con indicadores de disfunción endotelial y amputación de extremidades.
En comparación con el pronóstico basado en comorbilidades y rasgos vasculares intrínsecos, la cantidad de MPCs locales muestra una capacidad específica para predecir el resultado clínico con respecto a la disfunción endotelial y la amputación de extremidades. Consistentemente, algunos estudios han descrito el papel pronóstico de biomarcadores similares durante la evaluación de pacientes con PAD15,16.
Basado en resultados anteriores7, el método descrito aquí puede ser útil para una identificación temprana de la población en riesgo de resultados vasculares adversos en varios entornos clínicos, tales como isquemia coronaria y miembro inferior, accidente cerebrovascular, vasculitis, trombosis venosa y otros que implican lesiones vasculares y reparación.
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Protocol
El comité de ética de la investigación institucional del Centro Médico Nacional "20 de Noviembre" ISSSTE aprobó este protocolo prospectivo, todos los pacientes inscritos proporcionaron consentimiento informado por escrito.
1. Evaluación del bloque vascular de las extremidades inferiores, muestreo de sangre y angioplastia de globos
NOTA: La muestra de estudio utilizada para este experimento estaba compuesta por 20 pacientes diabéticos, de 68 años y 10 de cada 20 eran hombres. La mitad de la muestra eran fumadores y las co-morbilidades más frecuentes eran diabetes mellitus tipo 2, hipertensión arterial sistémica y/o dislipidemia. La muestra estaba destinada a estandarizarse para las morbilidades de edad, sexo y co.. No se pudo descartar un posible sesgo debido a la influencia clínico-demográfica en la relación entre los MPCs y la CLI.
- Evaluar la gravedad clínica de la isquemia de las extremidades de acuerdo con la clasificación13 de Rutherford (ver Tabla Suplementaria 1).
- Realice angiografía de miembros inferiores, muestreo de sangre y angioplastia de globos.
- Use anticoagulante y medicamentos anestésicos antes de la cirugía.
- Coloque una aguja de 18 G en el vaso sanguíneo en el sitio de la ingle seleccionado.
- Coloque un introductor y avance un cable guía flexible. A continuación, la guía inicial se cambia aún más para un introductor de 6 P.
- Utilice la inyección periódica de medios de contraste o CO2 bajo guía fluoroscópica para identificar la trayectoria arterial y los sitios vasculares bloqueados (Figura 1).
NOTA: Utilice medios de contraste de 40 cc, diluidos 1:1 en 0.9% solución salina, o CO2 a 10 a 20 ml por disparo a una presión de 12 psi. - Introducir dos cables guía de navegación 0.014 Fr y dos cables guía de soporte 0.014 Fr en el buque y avanzar hasta el sitio bloqueado.
NOTA: Dos cables guía fr de 0,014 fr (260 cm de largo) se utilizan para la navegación y dos cables guía fr de 0,014 fr (260 cm de largo) se utilizan para el soporte, durante un solo procedimiento. - Introducir 5 fr y 3 fr catéteres secuencialmente y recoger 10 ml de sangre del sitio más cercano a la obstrucción vascular. Mantenga muestras de sangre en el hielo.
NOTA: Los tamaños de los catéteres pueden ser 5 Fr y 3 Fr, y se cambian durante el procedimiento. - Avance un cable guía de nuevo. A continuación, introduzca un catéter de globo de angioplastia, que contiene un globo inflable situado al final del catéter. Avance el catéter del globo de angioplastia y coloque el globo justo en el lugar de la lesión. Realice la angioplastia inflando el globo contra la placa de bloqueo ubicada en la pared vascular. Verifique la restauración del flujo sanguíneo.
NOTA: Se puede colocar un stent en el área bloqueada para ayudar a mantener la arteria abierta después del procedimiento. - Introducir un catéter y avanzar hasta el sitio más cercano al bloque vascular. Recoger 10 ml de sangre a intervalos de tiempo de 30 minutos después de la angioplastia. Mantenga muestras de sangre en el hielo.
NOTA: Se recomienda la recolección de muestras de sangre antes y después de la angioplastia para evaluar aún más la influencia de la angioplastia en el número de MPCs. - Retire todos los cables bajo guía fluoroscópica.
- Proporcionar procedimientos de atención postoperatoria, incluyendo terapia anti-coagulación usando enoxaparina a 1 mg/kg subcutáneo cada 12 h, aspirina 100 mg, estatina y analgesia. Comprimir en el sitio de pinchazo vascular durante 24 h.
2. Cuantificación de células progenitoras mononucleares circulantes (MPCs) (Figura 2)
- A un tubo cónico fresco de 15 ml, transfiera 6 ml de la sangre recolectada y diluya 1:1 (v/v) con PBS.
NOTA: Procesa la sangre dentro de 1 h a partir de la recolección. - Prepárese para la separación del gradiente de densidad, añadiendo 2 ml del medio de gradiente de densidad a 3 tubos de ensayo cada uno. A continuación, agregue 3 coácuotas de volumen iguales de la sangre diluida en cada tubo de ensayo.
NOTA: No exceda tres cuartas partes de la capacidad máxima del tubo de ensayo. - Centrífuga a 1.800 x g durante 30 min a 4 °C. Recoja la capa de interfaz presente como anillo con una pipeta y transfiérala a un nuevo tubo. Añadir 2 ml de PBS y girar a 1.800 x g durante 6 minutos a 4 °C. Guarde el pellet, ya que esto contendrá MPCs.
- Lave el pellet que contiene MPCs con PBS por centrifugación como se describe en el paso 2.3. Utilice PBS fresco para cada lavado y gire a 1.800 x g durante 2 minutos a 4 °C. Repita el proceso 6 veces.
- Después del último lavado, utilice 1 ml de PBS para resuspend el pellet celular. Diluir 20 μL de la suspensión celular con 20 μL de 0.4% de tripa azul, 1:1 (v/v). Utilice 10 μL de esta suspensión celular para el recuento de células utilizando hemociclo y un microscopio ligero.
- Aliquot 1 x 106 MPCs en tubos de citometría de flujo de flujo de 5 ml previamente etiquetados.
NOTA: Prepare los anticuerpos de control coincidentes con isotipo correspondientes. - Centrífuga los tubos a 1.800 x g durante 6 minutos a 4 °C. Aspirar y desechar el sobrenadante.
- Diluir anticuerpo primario en 100 μL de solución de incubación de anticuerpos [1x PBS, pH 7.4, EDTA 2 mM, BSA 0.05%] y añadir al tubo. Resuspend durante 10 s e incubar durante 20 min a 4 °C, en la oscuridad.
NOTA: Las concentraciones finales de anticuerpos primarios utilizados en el protocolo actual fueron CD45 1:50, CD34 1:20, KDR 1:50, CD184 1:20, CD133 1:50. El protocolo puede detenerse a este paso mediante la fijación de linfocitos en un 4% de paraformaldehído en PBS y el almacenamiento de muestras de hasta 24 h a 4 °C. - Centrífuga a 1.800 x g durante 2 min a 4 °C y deseche el sobrenadante. Resuspend en 500 μL de 1x PBS, pH 7.4, EDTA 2 mM.
- Realice análisis de citometría de flujo.
- Configure el fondo con anticuerpos de control coincidentes con isotipos. Luego, en la gráfica FSC/SSC, algunos linfocitos se propagan, tratando de excluir desechos celulares, granulocitos residuales y otras partículas. Dicha distribución se considera 100%.
NOTA: Los linfocitos generalmente se propagan en la región inferior izquierda de la parcela. - Utilice una puerta con inmunofenotipo común que contenga un alto número de células CD45+ y CD34+. A continuación, seleccione dos inmunofenotipos positivos utilizando gate que previamente identificó CD45+, CD34+, y añadiendo KDR (VEGFR-2)+, CD133+ o CD184+. Identifique las subpoblaciones de MPCs mediante sus marcadores de superficie celular específicos. Preséntese como el porcentaje de eventos cerrados.
- Configure el fondo con anticuerpos de control coincidentes con isotipos. Luego, en la gráfica FSC/SSC, algunos linfocitos se propagan, tratando de excluir desechos celulares, granulocitos residuales y otras partículas. Dicha distribución se considera 100%.
- Identificar las subpoblaciones principales de los MPC. En el presente estudio los inmunofenotipos analizados fueron CD45+CD34+CD133+; CD45+CD34+CD184+; CD45+CD34+CD133+CD184+; CD45+CD34+KDR+; CD45+CD34+KDR+CD133+ y CD45+CD34+KDR+CD1847,17.
NOTA: Estos marcadores de superficie celular se utilizaron para el estudio: CD45 (linfocitos), CD34 (células endoteliales y/o vasculares), KDR (VEGFR-2) (marcador de membrana de células endoteliales), CD133 (células progenitoras endoteliales) y CD184 (células madre hematopoyéticas y células endoteliales).
3. Relación de MPCs con modificación de la función endotelial y prueba hemodinámica (FMD)
- Determinar la dilatación mediada por flujo (FMD), pre y post-angioplastia.
- Utilice un transductor lineal vascular para medir el diámetro de la arteria braquial.
- Coloque el manguito del esfigmomanómetro por encima del sitio de medición en el antebrazo e insuflar a 50 mmHg por encima de la presión arterial sistólica durante 5 minutos y desinflarse.
- Determine de nuevo el diámetro de la arteria braquial en los siguientes 60 s. Utilice la ecuación siguiente para estimar fmd.
NOTA: Calcular el grado de dilatación utilizando la ecuación (%) = (diámetro máximo después de la isquemia transitoria - diámetro basal) × 100 / diámetro basal.
- Correlacione el número de MPCs con el valor FMD de línea base y el delta posterior a la angioplastia de FMD.
4. Habilidad pronóstico de los MPCs para la amputación de extremidades
- Programe citas médicas periódicas después de la angioplastia con balón y el alta del paciente, para evaluar la calidad del flujo sanguíneo a la extremidad inferior.
- Evaluar la gravedad clínica de la isquemia de las extremidades a las 2 semanas después de la angioplastia. Evaluar la resolución del dolor de reposo, la isquemia inferior y la preservación de un pie funcional, según la clasificación13de Rutherford.
- Compare la gravedad clínica de la isquemia de las extremidades, al inicio frente al seguimiento. Identifique aquellos casos que requieran una amputación importante debido a un resultado desfavorable.
- Correlacione el número de MPCs con la proporción de pacientes que requieren una amputación importante de la extremidad inferior.
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Representative Results
Se recogieron muestras de sangre de arterias bloqueadas, en el lugar para la angioplastia, de 20 pacientes diabéticos, de 68 años y 10 de cada 20 eran hombres. La mitad de la población de muestras eran fumadores. Las lesiones vasculares se anotaron principalmente como Rutherford clase VI; mientras que los pacientes mostraron una mayor prevalencia de diabetes mellitus tipo 2 (100%), hipertensión (70%) y dislipidemia (55%).
Un seguimiento clínico de 30 días después de que se llevó a cabo la angioplastia de las extremidades inferiores. El porcentaje de subpoblaciones de MPC en la línea de base o dinámica después de la angioplastia se correlacionó (análisis de Spearman) con el grado de disfunción endotelial, evaluado por la FMD; y el número basal de MPCs se comparó entre pacientes sometidos, o no, amputación de extremidades después de la angioplastia (U-Mann Whitney). El estudio mostró que los MPCs basales subpoblación CD45+CD34+KDR+ se correlacionaron negativamente con FMD(Figura 3A, izquierda), mientras que el cambio de MPCs CD45+CD34+CD133+CD184+ después de la angioplastia se correlacionó significativamente con la mejora de fmd (Figura 3B,derecha). Además, se observó un mayor número basal de MPCs de subpoblación CD45+CD34+KDR+ (Figura 4A,B, izquierda) en aquellos pacientes que evolucionaron a la amputación de extremidades; así como la reducción posterior a la angioplastia de la subpoblación DE MPC CD45+CD34+CD133+CD184+ (Figura 4A,C,derecha).
Figura 1: Angiografía de las extremidades inferiores y recolección de sangre. (A) Trayectoria vascular evidenciada por los medios de contraste bajo fluoroscopia. (B) Obstrucción vascular antes de la angioplastia. (C) Obstrucción vascular después de la angioplastia. (D) El cirujano vascular utiliza un catéter para recoger sangre de la ubicación más cercana a la obstrucción vascular y la placa de ateroma, y el investigador del laboratorio está listo para obtener la muestra de sangre. Las flechas indican el sitio de las obstrucciones vasculares. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Preparación de muestras de sangre y determinación de células progenitoras mononucleares (MPCs). (A) Preparación del gradiente de densidad. B) Los linfocitos anillan la separación después de la centrifugación sanguínea. (C) Colección de la fase de linfocitos. (D) Centrifugación. (E) Formación de pellets en la parte inferior del tubo de ensayo. (F) Recuento de suspensión celular. (G) Preparación de linfocitos para la citometría de flujo. (H) Determinación de subpoblaciones celulares por citometría de flujo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Relación de MPCs con indicadores hemodinámicos. (A) Posición del ultrasonido para adquirir FMD y resultados representativos. (B) Relación entre subpoblacións %MPCs de línea base (izquierda, CD45+CD34+KDR+; derecha, CD45+CD34+CD133+CD184+) y valores FMD de línea base; así como la relación de (C) %MPCs después de la angioplastia con la mejora de la FMD después de la angioplastia. Abreviaturas: MPCs, Células Progenitoras Mononucleares; FMD, Dilatación mediada por flujo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: MPCs y pronóstico de amputación de miembros inferiores después de la angioplastia. (A) Imágenes representativas de citometría de flujo de subpoblaciones de MPCs. (B) La asociación de subpoblacións %MPCs basales (izquierda, CD45+CD34+KDR+; derecha, CD45+CD34+CD133+CD184+), o (C) %MPCs después de la angioplastia, con amputación de extremidades inferiores después de la angioplastia, durante un seguimiento de 30 días. Abreviaturas: MPCs, Células Progenitoras Mononucleares. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Archivo suplementario 1: Clasificación de Rutherford de la gravedad de la isquemia de las extremidades. Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
La recolección de sangre en el sitio preciso del bloque vascular puede mostrar dificultades técnicas; por lo tanto, realizamos la recolección de sangre en las proximidades al bloque vascular. Del mismo modo, la cantidad de MPCs cerca de la placa vascular parece ser altamente dinámica y puede originar variaciones antes y después de la angioplastia. De acuerdo con nuestras observaciones, se recomienda evaluar los cambios de referencia y 30min-post-angioplastia en el número de MPCs, ya que pueden reflejar varios procesos fisiológicos que ocurren dentro del daño vascular y la reparación.
Se recomienda realizar el procesamiento de muestras de sangre para la determinación de MPCs dentro de las primeras 3 h; por lo tanto, se puede establecer un plan de organización adecuado, e incluso una práctica de simulación previa, entre el equipo de angiología-cirugía vascular y los investigadores de laboratorio. El aislamiento de los MPCs debe realizarse cuidadosamente, deponiendo particularmente la muestra de sangre en gradiente de densidad y lavados del pellet que contiene MPCs. Nuestro grupo utiliza para transferir células al tubo de citometría, agregar anticuerpos primarios, fijar y almacenar células durante la noche a 4 °C; debido a la comodidad de administración del tiempo, y la lectura de citometría de flujo se realizaría el día siguiente.
En cuanto al papel de los MPCs circulantes como biomarcador clínico útil del daño vascular y la reparación, se han realizado importantes esfuerzos para estandarizar los inmunofenotipos entre las células progenitoras17. Una caracterización integral debe incluir subpoblaciones de células progenitoras circulantes que participan en los diferentes escenarios clínicos dentro de las enfermedades vasculares. Utilizando los métodos descritos aquí, encontramos que la reducción post-angioplastia de la subpoblación MPCs CD45+CD34+CD133+CD184+ es predictiva para la amputación mayor. Este hallazgo apoya la noción de que la respuesta inflamatoria durante lesiones vasculares o angioplastia estimulan las señales de localización para los MPCs, promoviendo la reparación local de tejidos18,19.
Asimismo, la observación es coherente con el efecto notificado de la reducción del número de CD45+CD34+CD133+ y CD45+CD34+CD133+184+ subpoblaciones de MPCs como predictor de resultados cardiovasculares adversos después de la angioplastia coronaria7,que puede explicarse por la mayor capacidad de fenotipos menos diferenciados de progenitores endoteliales para adherirse a la matriz extracelular, proliferar y responder a los estímulos vasculogénicos18.
Además, observamos que un mayor número de CD45+CD34+KDR+ subpoblación de MPCs después de la angioplastia estaba relacionado con la amputación de extremidades, aunque se ha considerado que contribuyen a la reparación vascular. Esta controversia puede explicarse debido a: 1) variaciones en el diseño del estudio, ya que otros estudios han comparado el número de CD45+CD34+KDR+ MPCs entre pacientes con CLI y controles saludables19; 2) variaciones en los métodos para el muestreo de sangre, incluyendo el sitio y el tiempo con respecto a la angioplastia; y 3) el tipo de arteria bloqueada y vascularizada.
La caracterización pronóstico de nuevos biomarcadores, basada en mecanismos responsables de la reparación vascular en varias enfermedades, ha recibido una atención significativa en la investigación traslacional. Esta es la primera descripción de un método para explorar el papel de los MPCs, determinado localmente en un sitio cercano al bloque vascular, en el pronóstico de la amputación de extremidades después de la angioplastia en casos con CLI. Una limitación es la falta de determinación de los MPCs en más momentos después de la angioplastia. Sin embargo, creemos que nuestros hallazgos enriquecen el campo de la investigación vascular al caracterizar el papel traslacional de los MPCs durante el daño vascular, la reparación y el potencial pronóstico de amputación mayor en pacientes con CLI. Particularmente, consideramos que el método descrito aquí puede ser útil en la predicción de resultados vasculares adversos en entornos clínicos que implican una lesión vascular y mecanismos de reparación, tales como isquemia coronaria y miembro inferior, accidente cerebrovascular, vasculitis, y / o trombosis venosa.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores agradecen el apoyo del Programa Institucional E015 para el proyecto ID 356.2015.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BSA | Roche | 10735086001 | Bovine Serum Albumin (BSA) as a buffering agent, stabilizer, standard and for blending. |
| Calibration Beads | Miltenyi Biotec / MACS | #130-093-607 | MACQuant calibration beads are supplied in aqueous solution containing 0.05% sodium azide. 3.5 ml for up to 100 tests |
| CD133/1 (AC133)-PE | Milteny Biotec / MACS | #130-080-801 | Antibody conjugated to R-Phycoerythrin in PBS/EDTA buffer |
| CD184 (CXCR4)-PE-VIO770 | Miltenyi Biotec / MACS | #130-103-798 | Monoclonal, Isotype recombinant human IgG1, conjugated |
| CD309 (VEGFR-2/KDR)-APC | Miltenyi Biotec / MACS | #130-093-601 | Antibody conjugated to R-Phycoerythrin in PBS/EDTA buffer |
| CD34-FITC | Miltenyi Biotec / MACS | #130-081-001 | The monoclonal antibody clone AC136 detecs a class III epitope of the CD34 |
| CD45- VioBlue | Miltenyi Biotec / MACS | #130-092-880 | Monoclonal CD45 Antibody, human conjugated |
| Conical Tubes | Thermo SCIENTIFIC | #339651 | 15ml conical centrifuge tubes |
| Cytometry Tubes | FALCON Corning Brand | #352052 | 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube. 12x75 style. Sterile. |
| EDTA | BIO-RAD | #161-0729 | Heavy metals, (as Pb) <10ppm, Fe<0.01%, As<1ppm, Insolubles<0.005% |
| Improved Neubauer | Without brand | Without catalog number | Hemocytometer for cell counting. (range 0.1000mm, 0.0025mm2) |
| K2 EDTA Blood Collection Tubes | BD Vacutainer | #367863 | Lilac plastic vacutainer tube (K2E) 10.8mg, 6 mL. |
| Lymphoprep | Stemcell Technologies | 01-63-12-002-A | Sterile and checked on the presence of endotoxins. Density: 1.077±0.001g/mL |
| Paraformaldehyde | SIGMA-ALDRICH | #SZBF0920V | Fixation of biological samples, (powder, 95%) |
| Pipette Transfer 1,3mL | CRM Globe | PF1016, PF1015 | The transfer pipette is a tool that facilitates liquid transfer with greater accuracy. |
| Test Tubes | KIMBLE CHASE | 45060 13100 | Heat-resistant test tubes. SIZE/CAP 13 x 100 mm |
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