Summary
Amputasjon av nedre ekstremiteter kan oppstå selv etter angioplastikk av hindret fartøy i Kritisk Lem Iskemi (CLI). Mononukleære stamceller (MPCer) reflekterer vaskulær reparasjon. Den nåværende protokollen beskriver kvantifiseringen av MPCer fra sirkulasjon nær angioplastikk, og dens forhold til endoteldysfunksjon og prediksjon av amputasjon av nedre ekstremiteter.
Abstract
Kritisk lem iskemi (CLI) representerer et avansert stadium av perifer arteriell sykdom. Angioplastikk forbedrer blodstrømmen til underbenet; Noen pasienter utvikler seg imidlertid irreversibelt til amputasjon av lemmer. Omfanget av vaskulær skade og mekanismene for vaskulær reparasjon er faktorer som påvirker utfallet etter angioplastikk. Mononukleære stamceller (MPCer) er reaktive for vaskulær skade og reparasjon, med evnen til å reflektere vaskulære sykdommer. Den nåværende protokollen beskriver kvantifisering av MPCer hentet fra blodsirkulasjon fra fartøyet nær angioplastikkstedet, samt forholdet til endoteldysfunksjon og dens prediktive evne til lemamputasjon i de neste 30 dagene etter angioplastikk hos pasienter med CLI.
Introduction
Perifer arteriell sykdom (PAD) er preget av en kronisk og progressiv vaskulær obstruksjon med begrensning av blodtilførsel1. I global skala påvirker PAD i underekstremitetene rundt 10% av den eldre befolkningen, mens opptil 7% av slike tilfeller sendes til lemamputasjon2,3.
Kritisk Limb Iskemi (CLI) representerer den mest alvorlige presentasjonen av PAD1. Pasienter opplever vanligvis smerte i ro, sår eller koldbrann som kan tilskrives okkluderte arterier; mens klinisk prognose er ugunstig og preget av en 30% risiko for lem amputasjon og dødelighet i løpet av 1 år3,4,5.
Angioplastikk er en minimal invasiv endovaskulær prosedyre som kan gjenopprette blodstrømmen til underbenet hos pasienter med CLI; Noen pasienter vil imidlertid uunngåelig kreve store lemamputasjon, selv etter angioplastisk terapi1,5. Tidlig identifisering av ugunstige resultater etter angioplastikk er ganske verdifull, på grunn av muligheten for behandlingshåndhevelse.
Tradisjonelle risikofaktorer kan gi en begrenset prediktiv evne til store lem amputasjon hos pasienter med CLI gjennomgår angioplastikk6. Patofysiologiorienterte biomarkører representerer nye metoder med potensielle kliniske anvendelser, noe som kan resultere spesielt nyttig i sykdommer relatert til vaskulær skade7. I dag har deltakelsen av cellulære populasjoner som eier endotelreparasjonsegenskaper, på stedet av aterosklerotisk plakett, blitt stadig meranerkjent 8,9.
Mononukleære stamceller (MPCer) er avledet fra benmargen og egne strukturelle og funksjonelle egenskaper ved stamceller med vaskulære regenerative evner. På grunn av MPC evne til å spre, migrere og vise vaskulær etterlevelse; disse cellene har blitt gode kandidater til å reflektere endotelreparasjon som svar påiskemi 10,11,12. I tillegg har kontinuerlig interesse for mekanismer underliggende vaskulær skade motivert til å utforske den prognostiske rollen til lokale forekommende biomarkører, siden de anses å reflektere vaskulær skade ogreparere 7,13,14.
Formålet med den nåværende studien er å beskrive hvordan man skal bestemme hvor mye MPCer som sirkulerer nær vaskulær obstruksjon hos pasienter med CLI som gjennomgår angioplastikk; og hvordan å evaluere forholdet mellom MPC med indikatorer på endoteldysfunksjon og lem amputasjon.
Sammenlignet med prognosen basert på komorbiditeter og iboende vaskulære egenskaper, viser mengden lokale MPCer spesifikk evne til å forutsi klinisk utfall angående endoteldysfunksjon og lemamputasjon. Konsekvent har noen studier beskrevet den prognostiske rollen til lignende biomarkører under evalueringen av pasienter med PAD15,16.
Basert på tidligere resultater7, kan metoden beskrevet her være nyttig for en tidlig identifisering av populasjon med risiko for uønskede vaskulære resultater i flere kliniske innstillinger, for eksempel nedre lem og koronar iskemi, hjerneslag, vaskulitt, venøs trombose og andre som involverer vaskulær skade og reparasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Den institusjonelle forskningsetikkkomiteen fra Centro Médico Nacional "20 de Noviembre" ISSSTE godkjente denne prospektive protokollen, alle registrerte pasienter ga skriftlig informert samtykke.
1. Evaluering av vaskulær blokk med underekstremitet, blodprøvetaking og ballongangoplastikk
MERK: Studieprøven som ble brukt til dette eksperimentet besto av 20 diabetikere, i alderen 68 år og 10 av 20 var menn. Halvparten av prøven var røykere og mest utbredte tilleggslidelser var diabetes mellitus type 2, systemisk arteriell hypertensjon og/eller dyslipidemi. Prøven var ment å være standardisert for alders-, sex- og tilleggslidelser. Mulige skjevheter på grunn av klinisk demografisk påvirkning på forholdet mellom MPCer og CLI kunne ikke utelukkes.
- Evaluer klinisk alvorlighetsgrad av lem iskemi i henhold til Rutherfordklassifisering 13 (se Supplerende tabell 1).
- Utfør angiografi i underekstremiteten, blodprøvetaking og ballongangoplastikk.
- Bruk antikoagulerende og bedøvelsesmidler før operasjonen.
- Plasser en 18 G kanyle i blodkaret på lyskestedet valgt.
- Plasser en innføringsskjerm og gå videre med en fleksibel ledevaier. Deretter blir den første guiden videre endret for en 6 Fr-introduksjons.
- Bruk periodisk injeksjon av kontrastmidler eller CO2 i fluoroskopisk veiledning for å identifisere arteriebane og vaskulære blokkerte steder (figur 1).
MERK: Bruk kontrastmedi 40 cc, fortynnet 1:1 i 0,9 % saltvann, eller CO2 ved 10 til 20 ml per skudd ved et trykk på 12 psi. - Innføre to 0.014 Fr navigasjonsføringsledninger og to 0,014 Fr støtteledninger inn i fartøyet og gå dem opp til det blokkerte området.
MERK: To 0,014 Fr føringsledninger (260 cm lange) brukes til navigasjon og to 0,014 Fr-ledninger (260 cm lange) brukes til støtte under en enkelt prosedyre. - Introdder 5 Fr og 3 Fr katetre sekvensielt og samle 10 ml blod fra nærmeste sted til vaskulær obstruksjon. Vedlikehold blodprøver på is.
MERK: Størrelsene på katetrene kan være 5 Fr og 3 Fr, og de endres under prosedyren. - Gå til en ledevaier igjen. Deretter introduserer du et angioplasty ballongkateter, som inneholder en oppblåsbar ballong som ligger på enden av kateteret. Før angioplastikk ballongkateteret og plasser ballongen rett på lesjonsstedet. Utfør angioplastikken ved å blåse ballongen mot blokkeringsplakken som ligger ved den vaskulære veggen. Kontroller restaureringen av blodstrømmen.
MERK: En stent kan plasseres i det blokkerte området for å holde arterien åpen etter inngrepet. - Introdder et kateter og gå opp til nærmeste sted til vaskulær blokk. Samle 10 ml blod ved 30 min tidsintervall etter angioplastikk. Vedlikehold blodprøver på is.
MERK: Innsamling av blodprøver før og etter angioplastikk anbefales å ytterligere evaluere påvirkningen av angioplastikken på antall MPCer. - Fjern alle ledningene under fluoroskopisk veiledning.
- Gi postoperative pleieprosedyrer, inkludert antikoagulasjonsbehandling ved hjelp av enoksaparin ved 1 mg/kg subkutan hver 12. Komprimer på stedet av vaskulær punktering under 24 timer.
2. Kvantifisering av sirkulerende mononukleære stamceller (MPCer) (figur 2)
- Til et friskt konisk rør på 15 ml overføres 6 ml av det oppsamlede blodet og fortynner 1:1 (v/v) med PBS.
MERK: Behandle blodet innen 1 time fra innsamling. - Forbered deg på separasjon av tetthetsgradering, ved å legge til 2 ml av tetthetsgradientmediet til 3 testrør hver. Deretter legger du til 3 like volum aliquots av det fortynnede blodet i hvert testrør.
MERK: Ikke overskrid tre fjerdedeler av prøverørets maksimale kapasitet. - Sentrifuge ved 1800 x g i 30 min ved 4 °C. Samle grensesnittlaget til stede som en ring ved hjelp av en pipette, og overfør til et nytt rør. Tilsett 2 ml PBS og spinn ved 1800 x g i 6 min ved 4 °C. Lagre pellet som dette vil inneholde MPCer.
- Vask pelleten som inneholder MPCer med PBS ved sentrifugering som beskrevet i trinn 2.3. Bruk fersk PBS for hver vask og spinn ved 1800 x g i 2 min ved 4 °C. Gjenta prosessen i 6 ganger.
- Etter siste vask, bruk 1 ml PBS for å gjenbruke cellepelleten. Fortynn 20 μL av cellefjæringen med 20 μL på 0,4 % trypanblå, 1:1 (v/v). Bruk 10 μL av denne cellefjæringen for celletelling ved hjelp av hemocytometer og et lett mikroskop.
- Aliquot 1 x 106 MPCer i tidligere merket 5 ml strømningscytometrirør.
MERK: Klargjør tilsvarende isotype-samsvarende kontrollantistoffer. - Sentrifuger rørene ved 1800 x g i 6 min ved 4 °C. Aspirer og kast det overnaturlige.
- Fortynn primærantistoff i 100 μL antistoffinkubasjonsoppløsning [1x PBS, pH 7,4, EDTA 2 mM, BSA 0,05%] og legg til røret. Resuspend for 10 s og inkubere i 20 min ved 4 °C, i mørket.
MERK: Endelige konsentrasjoner av primære antistoffer som brukes i den nåværende protokollen var CD45 1:50, CD34 1:20, KDR 1:50, CD184 1:20, CD133 1:50. Protokollen kan stoppes på dette trinnet ved å fikse lymfocytter i 4% paraformaldehyd i PBS og lagre prøver opp til 24 timer ved 4 °C. - Sentrifuge ved 1800 x g i 2 min ved 4 °C og kast supernatanten. Resuspend i 500 μL av 1x PBS, pH 7,4, EDTA 2 mM.
- Utfør flytcytometrianalyse.
- Sett opp bakgrunnen med isotype-matchet kontroll antistoffer. Deretter, på FSC / SSC plottet velge lymfocytter spredt, prøver å utelukke cellulære rusk, gjenværende granulocytter, og andre partikler. Slik distribusjon anses som 100%.
MERK: Lymfocytter sprer seg vanligvis i nedre venstre område av tomten. - Bruk en port med vanlig immunofenotype som inneholder høyt antall celler CD45+ og CD34+. Deretter velger du for doble positive immunofenotyper ved hjelp av port som tidligere identifiserte CD45+, CD34+, og legger til enten KDR (VEGFR-2)+, CD133+ eller CD184+. Identifiser MPCer-underpopulasjoner etter de spesifikke celleoverflatemarkørene. Rapporter som prosentandelen av inngjerdede hendelser.
- Sett opp bakgrunnen med isotype-matchet kontroll antistoffer. Deretter, på FSC / SSC plottet velge lymfocytter spredt, prøver å utelukke cellulære rusk, gjenværende granulocytter, og andre partikler. Slik distribusjon anses som 100%.
- Identifiser hovedunderpopulasjoner av MPCer. I den nåværende studien var immunofenotypene som ble analysert CD45+CD34+CD133+; CD45+CD34+CD184+; CD45+CD34+CD133+CD184+; CD45+CD34+KDR+; CD45+CD34+KDR+CD133+ og CD45+CD34+KDR+CD1847,17.
MERK: Disse celleoverflatemarkørene ble brukt til studien: CD45 (lymfocytter), CD34 (endotel- og/eller vaskulære celler), KDR (VEGFR-2) (membranmarkør for endotelceller), CD133 (endotel- og/eller vaskulære celler) og CD184 (hematopoetiske stamceller og endotelceller).
3. Relasjon av MPCer med endring av endotelfunksjon og hemodynamisk test (FMD)
- Bestem strømningsmediert dilatasjon (FMD), pre- og post-angioplastikk.
- Bruk en vaskulær lineær transduser for å måle diameteren på brachial arterien.
- Plasser mansjetten på sphygmomanometer over målestedet i underarmen og utål ved 50 mmHg over systolisk blodtrykk i 5 min og deflate.
- Bestem igjen diameteren på brachial arterien i løpet av de neste 60 s. Bruk formelen nedenfor til å beregne FMD.
MERK: Beregn graden av dilatasjon ved hjelp av ligningen (%) = (maksimal diameter etter forbigående iskemi - basal diameter) × 100 / basal diameter.
- Korreler antall MPCer med fmd-verdien med grunnlinjen og etter angioplastikkdelet til FMD.
4. Prognostisk evne til MPC for lem amputasjon
- Planlegg periodiske medisinske avtaler etter ballong angioplastikk og pasientutslipp, for å evaluere kvaliteten på blodstrømmen til underbenet.
- Evaluer klinisk alvorlighetsgrad av lem iskemi ved 2 uker etter angioplastikk. Evaluer å løse hvilesmerter, nedre iskemi og bevaring av en funksjonell fot, ifølge Rutherford klassifisering13.
- Sammenlign klinisk alvorlighetsgrad av lem iskemi, ved baseline versus oppfølging. Identifiser de tilfellene som krever større amputasjon på grunn av ugunstig utfall.
- Korreler antall MPCer med andelen pasienter som krever stor amputasjon av underbenet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Blodprøver fra blokkerte arterier, på stedet adressert for angioplastikk, ble samlet inn fra 20 diabetikere, i alderen 68 år og 10 av 20 var menn. Halvparten av utvalgspopulasjonen var røykere. Vaskulære lesjoner ble hovedsakelig scoret som Rutherford klasse VI; mens pasientene viste en høyere prevalens av type 2 Diabetes Mellitus (100 %), hypertensjon (70 %) og dyslipidemi (55 %).
En 30 dagers klinisk oppfølging etter at underekstremiteten angioplastikk ble utført. Prosentandelen av MPC-underpopulasjoner ved baseline eller dynamikk etter angioplastikk var korrelert (Spearman-analyse) med graden av endoteldysfunksjon, som evaluert av FMD; og baseline antall MPCer ble sammenlignet mellom pasienter som gjennomgikk, eller ikke, lemamputasjon etter angioplastikk (U-Mann Whitney). Studien viste at baseline MPCs underpopulasjon CD45+CD34+KDR+ negativt korrelert med FMD (Figur 3A, venstre), mens endringen av MPCs CD45+CD34+CD133+CD184+ etter angioplastikk betydelig korrelert med FMD forbedring (Figur 3B, høyre). Videre ble økt baseline antall MPCer underbefolkning CD45+CD34+KDR+ (Figur 4A, B, venstre) observert hos de pasientene som utviklet seg til lem amputasjon; samt post-angioplasty reduksjon av MPCs underbefolkning CD45+CD34+CD133+CD184+ (Figur 4A, C, høyre).
Figur 1: Angiografi og blodsamling under ekstremiteter. (A)Vaskulær bane dokumentert av kontrastmedier under fluoroskopi. (B)Vaskulær obstruksjon før angioplastikk. (C) Vaskulær obstruksjon etter angioplastikk. (D) Vaskulær kirurg bruker et kateter for å samle blod fra nærmeste sted til vaskulær obstruksjon og ateroma plakk, og Lab forsker er klar til å få blodprøven. Piler indikerer stedet for vaskulære hindringer. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Blodprøvepreparat og mononukleære stamceller (MPCer) bestemmelse. (A)Preparat for tetthetsgradering. (B)Lymfocytter ring separasjon etter blod sentrifugering. (C) Innsamling av lymfocyttfasen. Sentrifugering. Pelletsdannelse nederst på prøverøret. (F)Celle suspensjon teller. (G)Tilberedning av lymfocytter for strømningscytometri. (H)Bestemmelse av celle underpopulasjoner ved strømningscytometri. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Relasjon av MPCer med heodynamiske indikatorer. (A)Plasseringen av ultralyd for å skaffe FMD og representative resultater. (B)Forholdet mellom baseline %MPCer underpopulasjoner (venstre, CD45+CD34+KDR+; høyre, CD45+CD34+CD133+CD184+) og baseline FMD-verdier; samt forholdet mellom (C) %MPCer etter angioplastikk med FMD-forbedring etter angioplastikk. Forkortelser: MPCer, mononukleære stamceller; FMD, Flow Mediert Utvidelse. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: MPCer og prognose for amputasjon av nedre ekstremiteter etter angioplastikk. (A)Representative flyt cytometri bilder av MPCs underpopulasjoner. (B)Tilknytningen av baseline %MPCer underpopulasjoner (venstre, CD45+CD34+KDR+; høyre, CD45+CD34+CD133+CD184+), eller (C) %MPCer etter angioplastikk, med amputasjon av nedre ekstremiteter etter angioplastikk, under en 30-dagers oppfølging. Forkortelser: MPCer, mononukleære stamceller. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Supplerende fil 1: Rutherfords klassifisering av alvorlighetsgraden av lem iskemi. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Blodinnsamling på det nøyaktige stedet av vaskulær blokk kan vise tekniske problemer; Derfor utførte vi blodsamling i nærheten av vaskulær blokk. På samme måte synes mengden mpc nær vaskulær plakk å være svært dynamisk og kan oppstå variasjoner før og etter angioplastikk. Ifølge våre observasjoner anbefales det å evaluere baseline- og 30min-post-angioplastikkendringer i antall MPCer, siden de kan gjenspeile flere patofysiologiske prosesser som forekommer innen vaskulær skade og reparasjon.
Blodprøvebehandling for MPCs bestemmelse anbefales å utføres innen de første 3 h; Derfor kan tilstrekkelig organisasjonsplan, og til og med en tidligere simuleringspraksis, etableres mellom angiologi-vaskulær kirurgi team og laboratorieforskere. MPCs isolasjon bør utføres nøye, spesielt avsette blodprøven i tetthet gradient og vasker av pellet som inneholder MPC. Vår gruppe bruker til å overføre celler til cytometrirør, legge til primære antistoffer, fikse og lagre celler over natten ved 4 °C; på grunn av tidsadministrasjon bekvemmelighet, og flyt cytometri lesing ville bli utført dagen etter.
Når det gjelder rollen som sirkulerende MPCer som en nyttig klinisk biomarkør for vaskulær skade og reparasjon, har det blitt rapportert om viktige tiltak for å standardisere immunofenotyper mellom stamceller17. En omfattende karakterisering bør omfatte underpopulasjoner av sirkulerende stamceller som deltar i de ulike kliniske scenariene innen vaskulære sykdommer. Ved hjelp av metodene som er beskrevet her, fant vi at post-angioplastikk reduksjon av MPCs subpopulation CD45+CD34+CD133+CD184+ er prediktiv for stor amputasjon. Dette funnet støtter forestillingen om at inflammatorisk respons under vaskulær skade eller angioplastikk stimulerer homing signaler for MPC, fremme lokale vev reparasjon18,19.
På samme måte er observasjonen konsistent med rapportert effekt av redusert antall CD45+CD34+CD133+ og CD45+CD34+CD133+184+ underpopulasjoner av MPCer som prediktor for uønskede kardiovaskulære resultater etter koronar angioplastikk7, som kan forklares av den økte evnen til mindre differensierte fenotyper av endoteliske stamceller å følge ekstracellulær matrise, å spre seg og reagere på vaskogen stimulus18.
Videre observerte vi at et økt antall CD45+CD34+KDR + underpopulasjon av MPCeretter angioplastikk var relatert til lemamputasjon selv om de har blitt ansett å bidra til vaskulær reparasjon. Denne kontroversen kan forklares på grunn av: 1) variasjoner i studien design, siden andre studier har sammenlignet antall CD45+CD34+KDR+ MPC mellom pasienter med CLI og sunne kontroller19; 2) variasjoner i metodene for blodprøvetaking, inkludert stedet og tiden angående angioplastikk; og 3) typen arterie blokkert og vaskularisert.
Prognostisk karakterisering av nye biomarkører, basert på mekanismer som er ansvarlige for vaskulær reparasjon i flere sykdommer, har fått betydelig oppmerksomhet i translasjonell forskning. Dette er den første beskrivelsen av en metode for å utforske rollen som MPCer, lokalt bestemt på et sted nær vaskulær blokk, i prognosen for lemamputasjon etter angioplastikk i tilfeller med CLI. En begrensning er mangelen på MPCs bestemmelse på flere tidspunkter etter angioplastikk. Vi mener imidlertid at våre funn beriker feltet vaskulær forskning ved å karakterisere mpcs translasjonelle rolle under vaskulær skade, reparasjon og prognostisk potensial for større amputasjon hos pasienter med CLI. Spesielt anser vi at metoden som er beskrevet her kan være nyttig i prediksjon av uønskede vaskulære resultater i kliniske innstillinger som involverer en vaskulær skade og reparasjonsmekanismer, som nedre lem og koronar iskemi, hjerneslag, vaskulitt og / eller venøs trombose.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker støtten fra Institutional Program E015 for prosjekt-ID 356.2015.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BSA | Roche | 10735086001 | Bovine Serum Albumin (BSA) as a buffering agent, stabilizer, standard and for blending. |
| Calibration Beads | Miltenyi Biotec / MACS | #130-093-607 | MACQuant calibration beads are supplied in aqueous solution containing 0.05% sodium azide. 3.5 ml for up to 100 tests |
| CD133/1 (AC133)-PE | Milteny Biotec / MACS | #130-080-801 | Antibody conjugated to R-Phycoerythrin in PBS/EDTA buffer |
| CD184 (CXCR4)-PE-VIO770 | Miltenyi Biotec / MACS | #130-103-798 | Monoclonal, Isotype recombinant human IgG1, conjugated |
| CD309 (VEGFR-2/KDR)-APC | Miltenyi Biotec / MACS | #130-093-601 | Antibody conjugated to R-Phycoerythrin in PBS/EDTA buffer |
| CD34-FITC | Miltenyi Biotec / MACS | #130-081-001 | The monoclonal antibody clone AC136 detecs a class III epitope of the CD34 |
| CD45- VioBlue | Miltenyi Biotec / MACS | #130-092-880 | Monoclonal CD45 Antibody, human conjugated |
| Conical Tubes | Thermo SCIENTIFIC | #339651 | 15ml conical centrifuge tubes |
| Cytometry Tubes | FALCON Corning Brand | #352052 | 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube. 12x75 style. Sterile. |
| EDTA | BIO-RAD | #161-0729 | Heavy metals, (as Pb) <10ppm, Fe<0.01%, As<1ppm, Insolubles<0.005% |
| Improved Neubauer | Without brand | Without catalog number | Hemocytometer for cell counting. (range 0.1000mm, 0.0025mm2) |
| K2 EDTA Blood Collection Tubes | BD Vacutainer | #367863 | Lilac plastic vacutainer tube (K2E) 10.8mg, 6 mL. |
| Lymphoprep | Stemcell Technologies | 01-63-12-002-A | Sterile and checked on the presence of endotoxins. Density: 1.077±0.001g/mL |
| Paraformaldehyde | SIGMA-ALDRICH | #SZBF0920V | Fixation of biological samples, (powder, 95%) |
| Pipette Transfer 1,3mL | CRM Globe | PF1016, PF1015 | The transfer pipette is a tool that facilitates liquid transfer with greater accuracy. |
| Test Tubes | KIMBLE CHASE | 45060 13100 | Heat-resistant test tubes. SIZE/CAP 13 x 100 mm |
References
- Serrano-Hernando, F. J., Martín-Conejero, A. Peripheral artery disease: Pathophysiology, diagnosis and treatment. Revista Española de Cardiología. 60 (9), 969-982 (2007).
- Agarwal, S., et al. Burden of re-admissions among patients with critical limb ischemia. Journal of the American College of Cardiology. 69 (15), 1897-1908 (2017).
- Kolte, D., et al. Thirty-day re-admissions after endovascular or surgical therapy for critical limb ischemia: Analysis of the 2013 to 2014 nationwide re-admissions databases. Circulation. 136 (2), 167-176 (2017).
- Rowlands, T. E., Donnelly, R. Medical therapy for intermittent claudication. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 34, 314-321 (2007).
- Cronewett, J. L. Acute limb ischemia and lower extremity chronic arterial disease: Rutherford's vascular surgery (8th ed.). , Saunders Elsevier. Philadelphia, PA. (2014).
- Dick, F., et al. Surgical or endovascular revascularization in patients with critical limb ischemia: influence of diabetes mellitus on clinical outcome. Journal of Vascular Surgery. 45 (4), 751-761 (2007).
- Suárez-Cuenca, J. A., et al. Coronary circulating mononuclear progenitor cells and soluble biomarkers in the cardiovascular prognosis after coronary angioplasty. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (7), 4844-4849 (2019).
- Franz, R., et al. Use of autologous bone marrow mononuclear cell implantation therapy as a limb salvage procedure in patients with severe peripheral arterial disease. Journal of Vascular Surgery. 50 (6), 1378-1390 (2009).
- Benoit, E., O'Donnell, T. F., Patel, A. N. Safety and efficacy of autologous cell therapy in critical limb ischemia: A systematic review. Cellular Transplantation. 22 (3), 545-562 (2013).
- Hill, J. M., et al. Circulating endothelial progenitor cells, vascular function, and cardiovascular risk. New England Journal of Medicine. 348 (7), 593-600 (2003).
- Schmidt-Lucke, C., et al. Reduced number of circulating endothelial progenitor cells predicts future cardiovascular events: proof of concept for the clinical importance of endogenous vascular repair. Circulation. 111 (22), 2981-2987 (2005).
- Smadja, D. M. Early endothelial progenitor cells in bone marrow are a biomarker of cell therapy success in patients with critical limb ischemia. Cytotherapy. 14 (2), 232-239 (2012).
- Kremastinos, D. T., et al. Intracoronary cyclic-GMP and cyclic-AMP during percutaneous transluminal coronary angioplasty. International Journal of Cardiology. 53 (3), 227-232 (1996).
- Truong, Q. A., Januzzi, J. L., Szymonifka, J., Thai, W. E., Wai, B., Lavender, Z. Coronary sinus biomarker sampling compared to peripheral venous blood for predicting outcomes in patients with severe heart failure undergoing cardiac resynchronization therapy: the BIOCRT study. Heart Rhythm. 11 (12), 2167-2175 (2014).
- Ding, N., et al. Fibrosis and inflammatory markers and long-term risk of peripheral artery disease: The ARIC study. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 40 (9), 2322-2331 (2020).
- Potier, L., et al. Plasma copeptin and risk of lower-extremity amputation in Type 1 and Type 2 diabetes. Diabetes Care. 40 (12), 2290-2297 (2019).
- Schmidt-Lucke, C., et al. Quantification of circulating endothelial progenitor cells using the modified ISHAGE protocol. PLoS One. 5 (1), 13790 (2010).
- Marboeuf, P., et al. Inflammation triggers colony forming endothelial cell mobilization after angioplasty in chronic lower limb ischemia. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 6 (1), 195-197 (2008).
- Regueiro, A., et al. Mobilization of endothelial progenitor cells in acute cardiovascular events in the PROCELL study: Time-course after acute myocardial infarction and stroke. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 80, 146-155 (2015).
