Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Analyse af α-Actinin Network i Human iPSC-Afledte Kardiomyocytter ved hjælp af enkelt molekyle lokalisering mikroskopi

Published: November 3, 2020 doi: 10.3791/61605
Automatic Translation
1,2, 1,2, 3, 1,2, 1,2
1Department of Cardiac Surgery, Reference and Translation Center for Cardiac Stem Cell Therapy (RTC), Rostock University Medical Center, 2Faculty of Interdisciplinary Research, Department Life, Light & Matter, University Rostock, 3Department of Cardiology, Rostock University Medical Center

Summary

Dannelsen af et ordentligt sarkomnetværk er vigtig for modningen af iPSC-afledte kardiomyocytter. Vi præsenterer en super opløsning-baseret tilgang, der giver mulighed for kvantitativ evaluering af den strukturelle modning af stamceller afledte kardiomyocytter, for at forbedre kultur betingelser fremme hjerteudvikling.

Abstract

Modningen af iPSC-afledte kardiomyocytter er et kritisk problem for deres anvendelse i regenerativ behandling, testning af lægemidler og sygdomsmodellering. På trods af udviklingen af flere differentieringsprotokoller er genereringen af iPSC-kardiomyocytter, der ligner en voksenlignende fænotype, fortsat udfordrende. Et vigtigt aspekt af cardiomyocytes modning indebærer dannelsen af et velorganiseret sarcomere netværk for at sikre høj sammentrækningskapacitet. Her præsenterer vi en super løsningsbaseret tilgang til semi-kvantitativ analyse af α-actinin-netværket i kardiomyocytter. Ved hjælp af fotoaktiveret lokaliseringmikroskopi blev der foretaget en sammenligning af sarkomiske længde- og z-disc-tykkelse af iPSC-afledte kardiomyocytter og hjerteceller, der var isoleret fra neonatal væv. Samtidig viser vi vigtigheden af ordentlige billeddannelsesforhold for at opnå pålidelige data. Vores resultater viser, at denne metode er egnet til kvantitativt at overvåge den strukturelle modenhed af hjerteceller med høj rumlig opløsning, så detektion af selv subtile ændringer af sarcomere organisation.

Introduction

Hjerte-kar-sygdomme (CVD) såsom myokardie infarkt eller kardiomyopati fortsat den vigtigste dødsårsag i den vestlige verden1. Da det menneskelige hjerte kun har dårlig regenerativ kapacitet, er der behov for strategier til at fremme inddrivelsen fra CV'er. Dette omfatter celle udskiftning behandlingsformer til at genopbygge tabte kardiomyocytter (CM), samt udvikling af nye anti-arytmiske lægemidler til effektiv og sikker farmaceutisk intervention. Induceret pluripotent stamceller (iPSC) har vist sig at være en lovende cellekilde for den ubegrænsede generation af humane CM in vitro, egnet til regenerative behandlinger, sygdom modellering, og til udvikling af narkotika screening assays2,3,4.

Selv om mange forskellige hjerte differentiering protokoller findes, iPSC-afledte CM stadig mangler visse fænotypiske og funktionelle aspekter, der hindrer in vitro og in vivo ansøgning5,6. Udover elektrofysiologiske, metaboliske og molekylære ændringer, hjertet modning proces indebærer den strukturelle organisering af sarcomeres, som er de grundlæggende enheder, der kræves for kraft generation og celle sammentrækning7. Mens voksne CMs udviser et velorganiseret kontraktapparat, iPSC-afledte CMs ofte demonstrere disarranged sarcomere filamenter, forbundet med en reduceret sammentrækning evne og ændret sammentrækning dynamik8,9. I modsætning til modne CM, der viser uniaxial sammentrækning mønster, de desorienterede strukturer i umodne CM resulterer i en radial sammentrækning af hele cellen eller fremme udseendet af sammentrækningknudepunkter 9,10.

For at forbedre hjertemodning, flere tilgange er blevet anvendt, herunder 3D-celle kultur metoder, elektrisk og mekanisk stimulation, samt brugen af ekstracellulære matricer efterligne in vivo betingelser11,,12,13. For at vurdere disse forskellige kulturbetingelsers succes og effektivitet er der behov for teknikker til at overvåge og vurdere graden af den strukturelle modning af iPSC CM, f.eks. I modsætning til konventionel konfokal billeddannelse er opløsningen i tilfælde af fotoaktiveret lokaliseringmikroskopi (PALM) ca. 10 x højere. Denne teknik giver igen mulighed for en mere præcis analyse, opdage selv subtile ændringer af cellulære strukturer14. I betragtning af den høje opløsning af PALM-baseret billeddannelse, det overordnede mål med denne metode var den mikroskopiske evaluering af sarcomere modenhed i iPSC-afledte CMs ved præcis bestemmelse af z-Disc tykkelse og sarcomere længde. I tidligere undersøgelser har disse strukturelle træk vist sig at være egnede parametre til vurdering af hjertemodenhed15. For eksempel, syge iPSC-CM mangler fuld længde dystrophin udviser reduceret sarcomere længde og z-band bredde i forhold til vilde type celler16. Ligeledes blev længden af de enkelte sarcomeres målt for at undersøge virkningen af topografiske signaler på hjerteudvikling16. Derfor har vi anvendt denne tilgang til at evaluere den strukturelle modning af sarcomere netværket i iPSC-CM ved kvantitativt at måle sarcomere længde og z-disc tykkelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle trin i denne protokol, der involverer neonatal og voksne mus blev udført i henhold til de etiske retningslinjer for dyrepleje af Rostock University Medical Centre.

1. Dyrkning og dissociation af iPSC-afledte kardiomyocytter

  1. Differentiere hiPSC-CMs i 25 dage ved hjælp af en 2D monolayer metode som beskrevet tidligere17.
  2. Forvarmet dissociation medium til 37 °C og støtte medium til stuetemperatur.
  3. Vask cellerne to gange med PBS.
  4. Der tilsættes præfladede dissociationsmedium til celler og inkuberes i 12 min. ved 37 °C og 5 % CO2.
  5. Føj støttemediet til cellerne.
    BEMÆRK: Mængden af ekstra støttemedie skal være dobbelt så stor som det dissociationsmedium, der blev brugt i trin 1.4.
  6. Forrykke cellerne ved hjælp af en 5 ml serologisk pipette.
  7. Centrifugeceller ved 200 x g i 5 min. og opsaltning af pellet i 3 ml hiPSC-CM-kulturmedium17.
  8. Frøceller i 8 godt glas bund kamre på en celletæthed på 75.000 celler / godt og kultur i 3 dage.

2. Isolering af kardiomyocyt til voksne

  1. Isolering og dyrkning af voksne kardiomyocytter fra NMRI-mus blev udført som rapporteret tidligere18.
  2. Frøceller i 8 godt glaskammer dias og kultur for en dag.

3. Isolering og dyrkning af neonatal kardiomyocytter

  1. Isolationsproceduren for neonatal kardiomyocytter, fremstillet af NMRI-mus, blev udført som beskrevet tidligere19.
  2. Frø isoleret celle i 8 godt glas kammer dias på en celletæthed på 75.000 celler / godt og kultur i 3 dage i neonatal CM kultur medium19.

4. Immunofluorescensmærkning af α-actin-netværket

BEMÆRK: For optimale resultater dyrkes celler i 8 brøndglasbundkamre. Mærkningen skal udføres én dag før billeddannelse.

  1. Prewarm 4% PFA ved 37 °C.
  2. Fastgør iPSC-CM ved at tilsætte 4% paraformaldehyd direkte i kulturmediet (1:1 fortynding) og inkubere ved 37 °C i 15 min. Den endelige koncentration af PFA for fiksering er 2%.
  3. Inkuber faste celler i 0,2% Triton-X, fortyndet i PBS, i 5 min ved stuetemperatur.
  4. Vask celler to gange med PBS, 5 min hver.
  5. Der tilsættes 1% BSA-opløsning (fortyndet i PBS) og inkuberes i 60 min ved stuetemperatur.
  6. Der klargør 150 μL primær antistofopløsning ved α fortyndes med-actininantistof 1:100 i 1% BSA, indeholdende 0,05% Triton-X. Tilføj til celler og inkubere ved stuetemperatur i 60 min.
  7. Vask celler to gange med 0,2% BSA opløsning, 5 min hver.
  8. Der klargør 150 μL sekundær antistofopløsning ved at fortynde gedeantimusen Alexa647 antistof 1:100 i 1% BSA, indeholdende 0,05% Triton-X. Tilføj til cellerne og inkubere ved stuetemperatur i 40 min.
  9. Vask celler to gange med 0,2% BSA opløsning, 5 min hver.
  10. Vask celler to gange med PBS, 5 min hver. Hold mærkede celler i mørke ved 4 °C, indtil PALM-billeddannelse.

5. Forberedelse af PALM-billedbufferen

BEMÆRK: Det er vigtigt at tilberede PALM-billedbufferen frisk for hvert eksperiment.

  1. Der tilberes 50% glukoseopløsning ved at opløse 25 g glukose i 50 ml destilleret vand.
  2. Der klargør basisbufferen med 50 mM Tris-HCl, 10 % glukose og 10 mM natriumchlorid.
    1. PH-niveauet justeres til ~8,0 ved hjælp af saltsyre.
  3. Pyranoseoxidaseopløsningen klargøres ved opløsning af 0,6 mg pyranoseoxidase i 316 μL basisbuffer.
  4. Der forbered katalaseopløsningen ved at opløse 7 mg katalase i 500 μL basisbuffer. Bland grundigt og centrifuge ved 10.000 x g i 3 min. Hold supernatanten til videre brug. Catalase opløsning kan opbevares ved 4 °C i flere dage.
  5. Der klargøres 500 μL PALM-billeddiapulffer ved blanding af 316 μL pyranoseoxidaseopløsning, 25 μL katalaseopløsning, 100 μL 50% glukoseopløsning, 50 μL cysteamin, 5 μL cyclooctatetraene og 3,5 μL β-Mercaptoethanol. Den endelige katalytiske aktivitet af pyranoseoxidase og katalase skal være henholdsvis 7,5 U, 35,00U.
    BEMÆRK: PALM-billeddiaren bufferen giver optimale billedbehandlingsforhold i 3-5 timer. Hvis blinkende evne til fluorescerende farvestof falder, forberede en ny buffer aliquot.

6. PALM billede erhvervelse

  1. Tænd for mikroskopet mindst 3 timer før brug, og bring prøven op i stuetemperatur før billeddannelse for at tillade termisk ækvilibrering. Hvis mikroskopet er udstyret med et inkubationskammer, justeres temperaturen til 30 °C.
  2. Rengør kammerets mål og bund med et passende rengøringsmiddel.
  3. Der tilsættes 300 μL PALM-billedbuffer i en brønd af mærkede celler, og kammersliden indsættes i mikroskopets sceneholder.
  4. Angiv parametrene for anskaffelse af PALM-afbildning.
    1. Vælg 1.57 N.A. 100x oliemål til erhvervelse.
    2. Vælg PALM-tilstand, og aktivér TIRF-indstillingerne.
    3. Juster antallet af rammer, der skal anskaffes. Normalt 5, 000-10, 000 rammer er tilstrækkelige til at opnå optimale resultater. Antallet af erhvervede rammer afhænger dog i høj grad af mærkningseffektiviteten og fluorescerende farvestoffets blinkende evne og kan justeres af brugeren.
    4. Indstil UV-laserkraft til 0,1 % og 647 laser til 0,2 %.
    5. Indstil gevinstniveauet til 50-100.
    6. Tænd for laserbelysningen, og vælg en målcelle. Forstærkningsniveauet kan øges, hvis signalintensiteten er for lav (afhængigt af fluorescensmærkning).
    7. Sluk for laserbelysning
  5. PALM billede erhvervelse
    1. Reducer forstærkningen til 0, og forøg lasereffekten (ex 647) til 100 %.
    2. Blege målcellen for ~ 5 s.
    3. Øge gevinst til 50 og start PALM billede erhvervelse.
      BEMÆRK: Forstærkning skal justeres for at opnå tilstrækkelig signalintensitet, mens overmættede pixel skal undgås. Hvis signalintensiteten reduceres, skal du øge forstærkningsniveauet.
  6. Eventuelt støt forbedre UV laser magt (0,1%-10%) for at øge signalintensiteten og for at fremme blinkende fluorophore.

7. Rekonstruktion af PALM-data

  1. Åbn Image J-softwaren, og importer PALM-data.
  2. Open Thunderstorm Plugin og "Kør analyse"
    1. I menuen "Kameraopsætning" skal du angive pixelstørrelse og EM-forstærkning.
      BEMÆRK: Når du bruger 100x mål og 1,6 x forstørrelsesobjektiv, er 100 nm pixelstørrelse passende. Men da pixelstørrelsen afhænger af hardwarefunktionerne i mikroskopet og kameraet, der bruges til PALM-billedbehandling, skal brugerne omhyggeligt kontrollere og tilpasse denne parameter. EM-gevinstværdier kan fås ved hjælp af metadataene.
    2. I menuen "Kør analyse" sæt parametre som følger: B-spline rækkefølge: 3, B-spline skala: 2,0, peak intensitet tærskel: stf(Wave.F1), montering radius: 3, indledende sigma: 1,6, forstørrelse: 5,0, opdatering frekvens: 50, laterale skift: 2. Bekræft ved at klikke på "Ok" knappen.
  3. Efterbehandling af rekonstrueret PALM-billede
    1. Vælg parameteren "Sigma" i menuen "Plot histogram".
    2. Brug værktøjet "Rektangel" til at vælge et investeringsafkast, bortset fra mulige artefakter og anvende investeringsafkastet på filteret. Roi-værdier vises i filterkommandofeltet.
    3. Føj" & usikkerhed <25" til roi-værdierne. En mulig filterkommando vil se sådan ud: "(sigma > 48.6821 & sigma < 1117.40) & usikkerhed <25". Anvend udvalgte sigma-værdier.
    4. I menuen"Fjern dubletter"skal du angive en afstandsgrænse på "10 nm" og anvende.
    5. I menuen "Sammenlægning" indstilles den maksimale afstand til "20", maksimumrammer pr. molekyle til "0" og maksimum off frames til "1". Anvend indstillinger.
    6. I menuen "Drift-korrektion" skal du vælgekrydskorrelationog indstille " Antal placeringer " til "5" og "Forstørrelse" til "5.0". Anvend indstillinger for driftkorrektion.
    7. Gem den endelige PALM billede og eksport post behandlede data, hvis det ønskes.

8. Analyse af sarkomere filamenter

  1. Analyse af sarkomerlængde
    1. Åbn Image J-softwaren, og importer det rekonstruerede PALM-billede.
    2. Tegn en linje mellem udvalgte sarkomstrukturer vinkelret på z-skiven for at måle den korteste afstand mellem aktininfilamenter.
    3. Vælg "Plot profil" i menuen "Analysér" og få længden mellem to toppe. Da sarkomerlængden kan variere inden for én celle, skal mindst 20 sarcomeres måles i forskellige områder af målcellen.
  2. Analyse af z-Disc tykkelse
    1. Åbn Image J-softwaren, og importer det rekonstruerede PALM-billede.
    2. Konverter det rekonstruerede PALM-billede til et 8-bit-billede.
    3. Åbn ridge detektionsplugin og indtast følgende parametre: linjebredde: 20, høj kontrast: 230, lav kontrast: 10, sigma: 0,79, lavere tærskel: 25,84, minimum linjelængde: 20.
    4. Angiv "Estimat width", "Extend line" og " Displayresults".
    5. Klik på "Ok" og brug "Middellinjebredde" fra resultattabellen til yderligere analyser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Til vurdering af graden af strukturel modning af CM, neonatal, fuldt modne voksne, og iPSC CM blev oprindeligt mærket CM med α-actinin antistof til at visualisere sarcomere netværket. Efter PALM erhvervelse, blev billeder rekonstrueret, og z-disc tykkelse blev målt ved hjælp af plugin-baseret billedbehandling software til automatisk påvisning af bredden af de enkelte filamenter. Sarcomere længde blev beregnet ved at måle afstanden mellem to tilstødende intensitet toppe, svarende til tilstødende filamenter. Figur 1 viser evalueringen af sarcomere-organisationen i iPSCs-afledt CM.

Som vist i figur 2Aviste det sig, at iPSC-CM- og neonatalceller udviste et lignende α- actininmønster med uregelmæssige, opløste sarkomstrukturer. På samme måde viste en kvantitativ vurdering, at længden og tykkelsen af α-actinin-filamenter var næsten identiske, hvilket indikerer en for tidlig udviklingstilstand for iPSC CM. Mere præcist var den gennemsnitlige sarcomere længde omkring 1,83 μm (voksen vs iPSC CM vs neonatal CM: 1,91 ± 0,02 1,83 ± 0,049 μm vs 1,82±0,03 μm, n=20 celler), mens z-Disc tykkelse var ca 74 nm (voksen vs iPSC CM vs neonatal CM: 71,30 ± 1,64 vs 73,95 ± 0,86 nm vs 74,08 ± 0,12 nm, n = 20 celler) (Figur 2B). I modsætning hertil viste voksen moden CM en regelmæssig sarcomere netværk med lidt øget sarcomere længde og reduceret z-Disc tykkelse.

Sammenligning af konventionel konfokal billeddannelse og PALM viste ingen signifikant forskel i sarcomere længde (Figur 2C) (konfokal vs PALM: 1,75 ± 0,02 vs 1,70 ± 0,02, n = 10 celler). Der blev dog fundet en dyb reduceret z-Disc-tykkelse, da iPSC-CM blev udsat for PALM-billeddannelse (Figur 2C) (konfokal vs. PALM: 224,71 ± 4,31 vs. 73,91 ± 1,31, n=10 celler). Repræsentative billeder fremhæver forstærkningen i opløsning, når PALM blev anvendt, understøttet af tilsvarende intensitetsområder (Figur 2D,E). Beregnet fuld bredde ved halv maksimal fluorescens intensitet viste, at α-actinin strukturer er ~ 3-fold tyndere i PALM billeder, hvis sammenlignet med standard konfokal mikroskopi (Figur 2E).

Enkelt molekyle lokalisering mikroskopi, ligesom PALM, gør det muligt at detektion af intracellulære strukturer langt under diffraktion grænse. For at sikre maksimal rumlig opløsning kræves der passende billeddannelsesforhold til præcis detektion af lokalisering af et enkelt molekyle. Den anvendte billeddannelse buffer system er afgørende for denne erhvervelse proces, da det påvirker de fotofysiske egenskaber af fluorescerende farvestof og dermed har en betydelig indvirkning på den samlede opløsning og nøjagtighed af den endelige PALM billede. Sammenligning mellem buffer og buffer af høj kvalitet, der blev udarbejdet en dag før billeddannelse, afslørede en stor forskel i glødetrådtykkelsen (Figur 3A,B). Sarkomere strukturer erhvervet med lav kvalitet buffer synes at være tykkere i forhold til optimale billeddannelse betingelser (Figur 3A). Faktisk viste kvantitativ evaluering, at z-Disc tykkelse blev øget med ~ 65% (høj kvalitet vs lav kvalitet: 73,87 ± 1,02 nm vs 113,9 ± 1,33 nm, n = 155 filamenter) (Figur 3B). Denne mangel på data nøjagtighed skyldes reduceret blinkende egenskaber af fluorophore, der resulterer i mindre fundne fotoner pr lokalisering begivenhed (høj vs lav buffer kvalitet: 29689 fotoner / begivenhed vs 16422 fotoner / begivenheder) (Figur 3C). Desuden er lokalisering præcision faldet under forringede billeddannelse betingelser (høj kvalitet vs lav kvalitet: 14,25 ± 5,85 nm vs 19,56 ± 6,7 nm), hvilket sænker den samlede opløsning af det rekonstruerede PALM billede (Figur 3C).

Desuden kan prøvedrift, fx forårsaget af termisk ustabilitet, påvirke præcis lokalisering af fluorescerende molekyler og resulterer i slørede billeder, som vist i figur 3D. Mens optimal PALM billeddannelse giver klare og veldefinerede intensitet toppe, overdreven prøve drift producerer en uregelmæssig intensitet mønster, der gør det vanskeligt præcist at bestemme afstanden mellem to tilstødende filamenter. Disse data fremhæver vigtigheden af stramt kontrollerede billeddannelsesforhold i mikroskopi med et enkelt molekyles lokalisering, da selv subtile ændringer under anskaffelsesprocessen dramatisk kan forringe billedkvaliteten og datanøjagtigheden.

Figure 1
Figur 1: Evaluering af sarcomere-organisationen i iCSCs-afledt CM.
Den sarcomere netværket blev fluorescerende mærket med en α-actinin antistof, efterfulgt af PALM image erhvervelse. Efterfølgende genopbygning fører til den endelige PALM billede, der blev brugt til kvantitativ analyse. Længden af de enkelte sarcomeres blev bestemt ved at måle afstanden mellem to intensitet toppe svarende til tilstødende sarcomere filamenter (1-5). Z-Disc tykkelse blev automatisk beregnet af en plugin-baseret billedbehandling værktøj. Skala bar 10 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Kvantitativ sammenligning af z-skive tykkelse og sarcomere længde i CM stammer fra iPSCs, voksen, og neonatal hjertevæv.
aA) Rekonstruerede PALM-billeder af iPSC-netværkets og neonatalCM-netværketsα-aktinin-netværk viste, at al neonatal og har stor lighed i sarkomerlængde (voksen vs. iPSC CM vs. neonatal CM: 1,91 ± 0,02 1,83 ± 0,049 μm vs. 1,82±0,03 μm) og tykkelsen af de enkelte filamenter (voksen vs. iPSC CM vs. neonatal CM: 71,30 ± 1,64 vs. 73,95 ± 0,86 nm vs. 74,08 ± 0,12 nm), hvilket indikerer for tidlig fænotype i IPSC CM. (C) Sammenligning af sarkomeretlængde og z-Skivetykkelse mellem konventionel konfokal i og PALMmaging-baseret dataindsamling. Da sarkomedylængden blev bestemt ved at måle top-til-top-afstanden, var virkningen af den øgede opløsning på datanøjabilitet mindre udtalt (konfokal vs. PALM: 1,75 ± 0,02 vs. 1,70 ± 0,02). I modsætning hertil blev en betydeligt lavere z-Disc tykkelse opdaget, når PALM blev anvendt (konfokale vs PALM: 224,71 ± 4,31 vs 73,91 ± 1,31). d)Repræsentative mikroskopiske billeder af iPSC-CM fremstillet ved konfokal og PALM-billeddannelse. (E) Fluorescensintensitetsområder svarende til den røde linje, der er vist i litra D). Værdier repræsenterer fuld bredde ved halvt maksimal fluorescensintensitet, hvilket indikerer en dyb stigning i opløsningen i PALM-billeder. Data præsenteres som middelværdi ± SEM, n=10-20 celler, 20 sarcomeres pr. celle blev evalueret. Statistisk signifikans blev bestemt ved hjælp af studerende t-Test. ** p<0.005, Scale bar 10 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Stødeffekt af bufferkvalitet og stikprøvedrift på datanøjagtighed og pålidelighed.
a)Repræsentative PALM-billeder af iPSC-afledt CM, der er anskaffet under forskellige billedbehandlingsforhold. Sarkomere filamenter synes tykkere i prøver, der er blevet afbildet med buffer af lav kvalitet. Røde linjer indikerer repræsentativ måling af sarkomlængde, mens grønne glødetrådstrukturer blev inkluderet i z-Disc-analysen. (B) Kvantitativ evaluering bekræftede en signifikant forskel i z-Disc tykkelse mellem lav- og høj kvalitet buffer (høj vs lav buffer kvalitet: 73,87 ± 1,02 nm vs. 113,9 ± 1,34 nm)(C)Denne forskel i billednøjabilitet var baseret på en reduceret blinkende evne til fluorophore, hvilket førte til et reduceret antal fundne fotoner pr. molekyle (høj vs. lav bufferkvalitet: 29689 fotoner/hændelse vs. 16422 fotoner/hændelser). Samtidig faldt lokaliseringspræcisionen, hvilket igen sænkede den samlede opløsning (høj vs. lav bufferkvalitet: 14,25 ± 5,85 vs. 19,56 ± 6,7) (D) Ligeledes kan overdreven prøvedrift forringe billedkvaliteten. Mens korrekt billedopkøb uden prøvedrift resulterer i veldefinerede intensitetstoppe af α-actinin-filamenter, fremkalder øget prøvedrift et uregelmæssigt intensitetsmønster, som i høj grad påvirker den nøjagtige analyse af sarkomlængden. Data præsenteres som middelværdi ± SEM. 155 filamenter blev analyseret. Statistisk signifikans blev bestemt ved hjælp af studerende t-Test. ****p<0.0001. Skala bar 10μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Generering af funktionelt iPSC-afledt CM in vitro er vigtigt for regenerative behandlinger, sygdomsmodellering og udvikling af lægemiddelscreeningsplatforme. Utilstrækkelig modenhed af disse cm er imidlertid en væsentlig hindring for hjerte-kar-forskning20. I den forbindelse er der behov for billeddannelsesteknikker med høj opløsning, som gør det muligt at overvåge den strukturelle modningstilstand for iPSC-afledt cm. Samtidig kan superopløsningsmikroskopi være et værdifuldt redskab til præcist at analysere funktionen af specifikke proteiner, der kræves for korrekt sarkomdannelse, som for nylig blev påvist for titin og troponin10,21,22.

I den nuværende protokol præsenterer vi en PALM-baseret tilgang til kvantitativt at evaluere den strukturelle modning af iPSC CM ved at analysere α-actin sarcomere netværk.

Sammenlignet med den konventionelle lysmikroskopi muliggør PALM visualisering af cellulære strukturer med en opløsning på ~20-50 nm23. Således, det giver detektering selv subtile ændringer af hjertet sarcomere netværk, der er knap eller ikke engang påvises ved klassisk lys mikroskopi tilgange. Påføring af PALM har vi målt en gennemsnitlig sarkomlængde på ~1,84 μm i iPSC og neonatal CM (Figur 2). Dette er i overensstemmelse med flere tidligere rapporter, der viser, at størrelsen af de enkelte sarcomeres er ~ 1,7-2,0 μm24,25,26. Sammenlignet med sarkomiske længde, præcis vurdering af tykkelsen af z-linjer er mere kompliceret, da dens størrelse er langt under den klassiske opløsning grænse for lys mikroskopi. Ved hjælp af elektronmikroskopi viste tidligere undersøgelser, at z-Disc-tykkelsen varierer fra 50 til 80 nm i iPSC CM, hvilket svarer til vores PALM-baserede detektion på ~73 nm (Figur 2).

Sammenligning med standard konfokal mikroskopi viste den dramatiske stigning i opløsning, når PALM blev anvendt. Vi fandt en 3-fold lavere z-Disc tykkelse, efter PALM imaging(Figur 2). Der blev dog ikke målt nogen signifikant forskel for sarkomerlængden. Da denne parameter måles ved at detektere den top-til-top afstand af intensitetsområder, er effekten af øget opløsning mindre udtalt.

For at opnå denne høje rumlige opløsning kræver PALM veldefinerede billeddannelsesforhold, der skal behandles omhyggeligt af brugeren. For en nøjagtig lokalisering af enkelte molekyler, fluorophores er nødvendige, der besidder særlige fotofysiske egenskaber, så hurtig skift mellem fluorescerende og mørk tilstand, kaldetblinkende 27. Som tidligere påvist, kan udvælgelsen af fluorophores stærkt påvirke billedkvaliteten28. En dyb blinkende evne blev beskrevet for Alexa 647, en af de bedste og udbredte farvestoffer til enkelt molekyle lokalisering mikroskopi29,30,31. Da der imidlertid findes mange PALM-fluorfofjeringer, vil brugerne have stor fleksibilitet med hensyn til stikprøvemærkning27,28.

Udover udvælgelse af passende fluorophore, billeddannelse buffer system er et andet kritisk punkt i PALM billeddannelse, da det dikterer de fotofysiske egenskaber af fluorescerende farvestof. Vi har anvendt pyranose oxidase som en ilt skyllevæske system, der er overlegen i forhold til glukose oxidase, da det giver en øget pH-stabilitet, dermed, så langsigtet billeddannelse uden et betydeligt fald i fluorophore blinker over tid32,33. Men da billedbufferens levetid er begrænset til flere timer, skal den være frisklavet til hvert eksperiment for at sikre høj reproducerbarhed. Vores resultater viser et dramatisk fald i datanøjagtigheden efter PALM-billedbehandling med buffer af lav kvalitet, hvilket fører til nedsat blinkende kapacitet og reduceret lokaliseringspræcision (Figur 3A-C).

Desuden er den termiske stabilitet i billedbehandlingssystemet obligatorisk for at undgå øget prøvedrift. Mens moderat drift kan korrigeres ved beregningsanalyse, fører overdreven prøvebevægelse til fejlberegnet lokalisering af det fundne fluorophores og reducerer billedkvaliteten og datanøjabiliteten. Dette kan forebygges ved hjælp af mikroskoper med varmekamre og tilstrækkelig termisk ækvilibrering af den respektive prøve, før du starter PALM imaging. Desuden bør mærkningstæthed og -effektivitet samt anvendelse af antistoffragmenter eller nanostoffer overvejes for at optimere billeddannelsesforhold34,35,36.

Anskaffelsesprocessen af store cellulære strukturer kan tage 10-30 min, afhængigt af billeddannelse parametre (synsfelt, fluorescerende sonde, billeddiagnostiske buffer osv.). Denne lange erhvervelse tid er en ulempe ved PALM, som gør det mindre hensigtsmæssigt for levende celle billeddannelse. Typisk opfanges 5.000-10.000 billeder for at opnå et tilstrækkeligt antal blinkende hændelser med høj lokaliseringspræcision. Også billeddiaddybden er normalt begrænset til få hundrede nanometer, hvilket gør det vanskeligt at undersøge tykkere prøver. Forbedret opløsning i z-retning kan dog opnås med en 3D PALM setup37.

Vi har valgt to parametre til at karakterisere α-actinin netværk af iPSC CM, herunder sarcomere længde og z-Disc tykkelse. Yderligere funktioner kunne indsamles for at få et mere omfattende overblik over sarcomere stilladset, såsom glødetråd orientering. Ligeledes kan 3D PALM bidrage til kvantitativt at analysere hele sarcomere struktur ved estimering af nuværende oder og grene inden for netværket.

Selvom PALM muliggør en meget detaljeret analyse af sarkomeret struktur, denne metode ikke tillader erhvervelse af funktionelle parametre som cellulære kontraktilitet, som er en anden vigtig funktion til at evaluere hjertemodenhed. Tidligere rapporter har vist , at mikroskopibaseret vurdering af sarkomstrukturen kan kombineres med videoanalyse for at opnå funktionelle data38,39. Men da forfatterne har brugt konventionel fluorescens mikroskopi opnået data om sarcomere struktur er mindre præcise, hvis sammenlignet med PALM. Vores tilgang giver også mulighed for at korrelere PALM data med tidligere tid bortfalder optagelser og derfor giver mulighed for erhvervelse af sammentrækning målinger.

Sammenfattende giver denne protokol en metode til kvantitativt at evaluere den strukturelle modning af sarcomere-netværket i CM. Ved hjælp af denne super opløsning-baserede tilgang, kan strategier etableres rettet mod en forbedret hjerteudvikling af iPSC-afledt CM for at opnå en mere voksen-lignende fænotype.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.

Acknowledgments

Denne undersøgelse blev støttet af EU's strukturfond (ESF/14-BM-A55-0024/18). Derudover støttes H.L. af FORUN-programmet for Rostock University Medical Centre (889001 og 889003) og Josef og Käthe Klinz Foundation (T319/29737/2017). C.I.L. er støttet af Clinician Scientist Program af Rostock University Medical Center. R.D støttes af DFG (DA1296/6-1), DAMP Foundation, German Heart Foundation (F/01/12) og BMBF (VIP+ 00240).

Vi takker Madeleine Bartsch for hendes tekniske support i iPSC cellekultur og hjertedifferentiering.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
human iPSC cell line Takara Y00325
µ-Slide 8 Well Glass Bottom ibidi 80827
0.5ml eppendorf tube Eppendorf 30121023
Bovine serum albumin Sigma Aldrich A906
Cardiomyocyte Dissociation Kit Stem Cell Technologies 05025
Catalase Sigma Aldrich C40-1G
Cyclooctatetraene Sigma Aldrich 138924-1G
Cysteamine Sigma Aldrich 30070-10g
Dulbecco's phosphate-buffered saline without Ca2+ and Mg2+ Thermo Fisher 14190169
F(ab')2-Goat anti-Mouse IgG Alexa Fluor 647 Thermo Fisher A-21237
Fiji image processing software (Image J)
Glucose Carl Roth X997.2
Hydrochloric acid Sigma Aldrich H1758
LSM 780 ELYRA PS.1 system Zeiss
Paraformaldehyde Merck 8187150100
Pyranose oxidase Sigma Aldrich P4234-250UN
sarcomeric α-actinin antibody [EA-53] Abcam ab9465
Sodium chloride Sigma Aldrich S7653
sterile water Carl Roth 3255.1
Triton X-100 Sigma Aldrich X100
Trizma base Sigma Aldrich T1503
β-Mercaptoethanol Sigma Aldrich 63689

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McAloon, C. J., et al. The changing face of cardiovascular disease 2000-2012: An analysis of the world health organisation global health estimates data. International Journal of Cardiology. 224, 256-264 (2016).
  2. Kussauer, S., David, R., Lemcke, H. hiPSCs Derived Cardiac Cells for Drug and Toxicity Screening and Disease Modeling: What Micro- Electrode-Array Analyses Can Tell Us. Cells. 8 (11), 1331 (2019).
  3. Ylä-Herttuala, S. iPSC-Derived Cardiomyocytes Taken to Rescue Infarcted Heart Muscle in Coronary Heart Disease Patients. Molecular Therapy. 26 (9), 2077 (2018).
  4. Kadota, S., Shiba, Y. Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocyte Transplantation for Heart Disease Treatment. Current Cardiology Reports. 21 (8), 73 (2019).
  5. Jiang, Y., Park, P., Hong, S. M., Ban, K. Maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells: Current strategies and limitations. Molecules and Cells. 41 (7), 613-621 (2018).
  6. Feric, N. T., Radisic, M. Maturing human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes in human engineered cardiac tissues. Advanced Drug Delivery Reviews. 96, 110-134 (2016).
  7. Ali, H., Braga, L., Giacca, M. Cardiac regeneration and remodelling of the cardiomyocyte cytoarchitecture. The FEBS Journal. 287 (3), 417-438 (2020).
  8. Yang, X., Pabon, L., Murry, C. E. Engineering adolescence: maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circulation Research. 114 (3), 511-523 (2014).
  9. Bedada, F. B., Wheelwright, M., Metzger, J. M. Maturation status of sarcomere structure and function in human iPSC-derived cardiac myocytes. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1863 (7), 1829-1838 (2016).
  10. Dai, Y., et al. Troponin destabilization impairs sarcomere-cytoskeleton interactions in iPSC-derived cardiomyocytes from dilated cardiomyopathy patients. Scientific Reports. 10 (1), 1-15 (2020).
  11. Huang, C. Y., et al. Enhancement of human iPSC-derived cardiomyocyte maturation by chemical conditioning in a 3D environment. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 138, 1-11 (2020).
  12. Ronaldson-Bouchard, K., et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).
  13. Lee, S., et al. Contractile force generation by 3D hiPSC-derived cardiac tissues is enhanced by rapid establishment of cellular interconnection in matrix with muscle-mimicking stiffness. Biomaterials. 131, 111-120 (2017).
  14. Baddeley, D., Bewersdorf, J. Biological Insight from Super-Resolution Microscopy: What We Can Learn from Localization-Based Images. Annual Review of Biochemistry. 87 (1), 965-989 (2018).
  15. Ovesný, M., Křížek, P., Borkovec, J., Švindrych, Z., Hagen, G. M. ThunderSTORM: A comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging. Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).
  16. Mahadev, K., Wu, X., Donnelly, S., Ouedraogo, R., Eckhart, A. D., Goldstein, B. J. Adiponectin inhibits vascular endothelial growth factor-induced migration of human coronary artery endothelial cells. Cardiovascular Research. 78 (2), 376-384 (2008).
  17. Lemcke, H., Skorska, A., Lang, C. I., Johann, L., David, R. Quantitative evaluation of the sarcomere network of human hiPSC-derived cardiomyocytes using single-molecule localization microscopy. International Journal of Molecular Sciences. 21 (8), 2819 (2020).
  18. Ackers-Johnson, M., et al. A simplified, langendorff-Free method for concomitant isolation of viable cardiac myocytes and nonmyocytes from the adult mouse heart. Circulation Research. 119 (8), 909-920 (2016).
  19. Lemcke, H., et al. Applying 3D-FRAP microscopy to analyse gap junction-dependent shuttling of small antisense RNAs between cardiomyocytes. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 98, 117-127 (2016).
  20. Karbassi, E., et al. Cardiomyocyte maturation: advances in knowledge and implications for regenerative medicine. Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).
  21. Krysiak, J., et al. Protein phosphatase 5 regulates titin phosphorylation and function at a sarcomere-associated mechanosensor complex in cardiomyocytes. Nature Communications. 9 (1), 1-14 (2018).
  22. Zaunbrecher, R. J., et al. Cronos Titin Is Expressed in Human Cardiomyocytes and Necessary for Normal Sarcomere Function. Circulation. 140 (20), 1647-1660 (2019).
  23. Fornasiero, E. F., Opazo, F. Super-resolution imaging for cell biologists. BioEssays. Fornasiero, E. F., Opazo, F. , Wiley Online Library. (2015).
  24. Jeziorowska, D., et al. Differential Sarcomere and Electrophysiological Maturation of Human iPSC-Derived Cardiac Myocytes in Monolayer vs. Aggregation-Based Differentiation Protocols. International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), 1173 (2017).
  25. Kroll, K., et al. Electro-mechanical conditioning of human iPSC-derived cardiomyocytes for translational research. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 130, 212-222 (2017).
  26. Zuppinger, C., et al. Characterization of cytoskeleton features and maturation status of cultured human iPSC-derived cardiomyocytes. European Journal of Histochemistry. 61 (2), 145-153 (2017).
  27. Jradi, F. M., Lavis, L. D. Chemistry of Photosensitive Fluorophores for Single-Molecule Localization Microscopy. ACS Chemical Biology. 14 (6), 1077-1090 (2019).
  28. Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nature Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).
  29. Lampe, A., Haucke, V., Sigrist, S. J., Heilemann, M., Schmoranzer, J. Multi-colour direct STORM with red emitting carbocyanines. Biology of the Cell. 104 (4), 229-237 (2012).
  30. Chamma, I., Levet, F., Sibarita, J. B., Sainlos, M., Thoumine, O. Nanoscale organization of synaptic adhesion proteins revealed by single-molecule localization microscopy. Neurophotonics. 3 (4), 041810 (2016).
  31. Ma, H., Fu, R., Xu, J., Liu, Y. A simple and cost-effective setup for super-resolution localization microscopy. Scientific Reports. 7 (1), 1-9 (2017).
  32. Olivier, N., Keller, D., Gönczy, P., Manley, S. Resolution Doubling in 3D-STORM Imaging through Improved Buffers. PLoS One. 8 (7), 0069004 (2013).
  33. Swoboda, M., et al. Enzymatic oxygen scavenging for photostability without ph drop in single-molecule experiments. ACS Nano. 6 (7), 6364-6369 (2012).
  34. Mikhaylova, M., et al. Resolving bundled microtubules using anti-tubulin nanobodies. Nature Communications. 6 (1), 1-7 (2015).
  35. Venkataramani, V., et al. Enhanced labeling density and whole-cell 3D dSTORM imaging by repetitive labeling of target proteins. Scientific Reports. 8 (1), 1-7 (2018).
  36. Erdélyi, M., et al. Origin and compensation of imaging artefacts in localization-based super-resolution microscopy. Methods. 88, 122-132 (2015).
  37. McGorty, R., Schnitzbauer, J., Zhang, W., Huang, B. Correction of depth-dependent aberrations in 3D single-molecule localization and super-resolution microscopy. Optics Letters. 39 (2), 275 (2014).
  38. Ribeiro, M. C., et al. A cardiomyocyte show of force: A fluorescent alpha-actinin reporter line sheds light on human cardiomyocyte contractility versus substrate stiffness. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 141, 54-64 (2020).
  39. Pioner, J. M., et al. Isolation and mechanical measurements of myofibrils from human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cell Reports. 6 (6), 885-896 (2016).

Tags

Biologi human induceret pluripotente stamceller cardiomyocyte super opløsning modning sarcomere netværk fotoaktiveret lokalisering mikroskopi
Analyse af α-Actinin Network i Human iPSC-Afledte Kardiomyocytter ved hjælp af enkelt molekyle lokalisering mikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Johann, L., Chabanovska, O., Lang,… More

Johann, L., Chabanovska, O., Lang, C. I., David, R., Lemcke, H. Analyzing the α-Actinin Network in Human iPSC-Derived Cardiomyocytes Using Single Molecule Localization Microscopy. J. Vis. Exp. (165), e61605, doi:10.3791/61605 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter