Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

ניתוח רשת α-Actinin בקרדיומיוציטים אנושיים הנגזרים מ-iPSC באמצעות מיקרוסקופיה לתיאום מולקולה אחת

Published: November 3, 2020 doi: 10.3791/61605
Automatic Translation
1,2, 1,2, 3, 1,2, 1,2
1Department of Cardiac Surgery, Reference and Translation Center for Cardiac Stem Cell Therapy (RTC), Rostock University Medical Center, 2Faculty of Interdisciplinary Research, Department Life, Light & Matter, University Rostock, 3Department of Cardiology, Rostock University Medical Center

Summary

היווצרות של רשת sarcomere נכונה חשובה להתבגרות של cardiomyocytes נגזר iPSC. אנו מציגים גישה מבוססת רזולוציה סופר המאפשרת הערכה כמותית של התבגרות מבנית של תאי גזע נגזר cardiomyocytes, כדי לשפר את תנאי התרבות קידום התפתחות הלב.

Abstract

ההתבגרות של cardiomyocytes נגזר iPSC היא בעיה קריטית עבור היישום שלהם בטיפול רגנרטיבי, בדיקות סמים ומידול מחלות. למרות הפיתוח של פרוטוקולי בידול מרובים, הדור של קרדיומיוציטים iPSC הדומה לפנוטיפ כמו מבוגר נשאר מאתגר. אחד ההיבטים העיקריים של התבגרות cardiomyocytes כרוך היווצרות של רשת sarcomere מאורגן היטב כדי להבטיח קיבולת התכווצות גבוהה. כאן, אנו מציגים גישה מבוססת רזולוציה סופר לניתוח חצי כמותי של רשת α-actin ב cardiomyocytes. באמצעות מיקרוסקופית מקומיות פוטואקטיבית השוואה של אורך sarcomere ועובי z-disc של קרדיומיוציטים נגזר iPSC ותאי לב מבודדים רקמת יילודים בוצע. במקביל, אנו מדגימים את החשיבות של תנאי הדמיה נאותים להשגת נתונים אמינים. התוצאות שלנו מראות כי שיטה זו מתאימה לניטור כמותי של הבשלות המבנית של תאי לב ברזולוציה מרחבית גבוהה, המאפשרת זיהוי של שינויים עדינים אף יותר של ארגון sarcomere.

Introduction

מחלות לב וכלי דם (CVD) כגון אוטם שריר הלב או קרדיומיופתיה להישאר הגורם העיקרי למוות בעולם המערבי1. מכיוון שללב האנושי יש יכולת התחדשות ירודה בלבד, יש צורך באסטרטגיות לקידום ההתאוששות מ-CVDs. זה כולל טיפולים להחלפת תאים כדי לחדש את קרדיומיוציטים אבודים (CM), כמו גם את הפיתוח של תרופות אנטי-קצביות חדשות להתערבות יעילה ובטוחה בסמים. המושרה תאי גזע pluripotent (iPSC) הוצגו כמקור תא מבטיח לדור בלתי מוגבל של CM אנושי במבחנה, מתאים טיפולים רגנרטיביים, מידול מחלות, ופיתוח של תרופות הקרנה assays2,,3,,4.

למרות פרוטוקולים רבים ושונים של בידול לב קיימים, CM נגזר iPSC עדיין חסר היבטים פנוטיפיים ופונקציונליים מסוימים המנועים במבחנה וביישום vivo5,6. לצד שינויים אלקטרופיזיולוגיים, מטבוליים ומולקולריים, תהליך ההתבגרות הלברית כרוך בארגון המבני של סרקומרים, שהם היחידות הבסיסיות הנדרשות להדרת כוח והתכווצותתאים 7. בעוד CMs למבוגרים להפגין מערכת התכווצות מאורגן היטב, CMs נגזר iPSC בדרך כלל להפגין נרים סרקום פירוק, הקשורים יכולת התכווצות מופחתת דינמיקת התכווצותשונה 8,9. בניגוד ל-CM בוגר ההראה תבנית התכווצות חד-אקסיאלית, המבנים המבולבלים ב-CM לא בוגר גורמת להתכווצות רדיאלית של התא כולו או מקדמים את הופעתם שלנקודות מוקד התכווצות 9,10.

לשיפור התבגרות הלב, גישות מרובות הוחלו, כולל שיטות תרבות תא 3D, גירוי חשמלי ומכני, כמו גם את השימוש מטריצות חוץ תאיות מחקה בתנאי vivo11,12,13. כדי להעריך את ההצלחה והיעילות של תנאי תרבות שונים אלה, יש צורך בטכניקות כדי לפקח ולהעריך את מידת ההתבגרות המבנית של iPSC CM, למשל, על ידי טכניקות מיקרוסקופיות. בניגוד להדמיה קונבנציונלית, הרזולוציה במקרה של מיקרוסקופיה פוטואקטיבית לתיקליזציה (PALM) גבוהה בכ-10 פעמים. טכניקה זו בתורה מאפשרת ניתוח מדויק יותר, זיהוי שינויים עדינים אפילו של מבנים תאיים14. בהתחשב ברזולוציה גבוהה של הדמיה מבוססת PALM, המטרה הכוללת של שיטה זו הייתה הערכה מיקרוסקופית של בגרות sarcomere ב-iPSC נגזר CMs על ידי קביעה מדויקת של עובי z-Disc ואורך sarcomere. במחקרים קודמים, תכונות מבניות אלה הראו להיות פרמטרים מתאימים כדי להעריך את בגרות הלב15. לדוגמה, iPSC-CM מחלה חסר תצוגת דיסטרופין באורך מלא מופחת אורך sarcomere ורוחב z-band בהשוואה לתאי סוג בר16. כמו כן, אורך סרקומרים בודדים נמדד כדי לחקור את ההשפעה של רמזים טופוגרפיים על התפתחות הלב16. לפיכך, יישם גישה זו כדי להעריך את ההתבגרות המבנית של רשת sarcomere ב iPSC-CM על ידי מדידה כמותית של אורך sarcomere ועובי z-disc.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הצעדים בפרוטוקול זה מעורבים עכברים יילודים ומבוגרים בוצעו על פי ההנחיות האתיות לטיפול בבעלי חיים של המרכז הרפואי של אוניברסיטת רוסטוק.

1. טיפוח ופירוק של קרדיומיוציטים הנגזרים מ-iPSC

  1. הבדיל hiPSC-CMs במשך 25 ימים באמצעות שיטת מונומרד דו-מיו-מיתי כמתוארקודם לכן 17.
  2. דיסוציאציה לפני המלחמה בינונית עד 37 °C ותומכת בטמפרטורת חדר בינונית עד בינונית.
  3. לשטוף תאים פעמיים עם PBS.
  4. הוסף מדיום דיסוציאציה חום מראש לתאים ותדגירה במשך 12 דקות ב- 37 °C ו- 5% CO2.
  5. הוסף אמצעי תמיכה לתאים.
    הערה: אמצעי האחסון של אמצעי האחסון שנוסף לתמיכה בינונית צריך להיות כפול מנפח אמצעי האחסון של אמצעי הדיסוציאציה המשמש בשלב 1.4.
  6. תנתקו את התאים באמצעות פיפטה סרולוגית של 5 מ"ל.
  7. צנטריפוגה תאים ב 200 x g עבור 5 דקות ולנוע מחדש את הכדור ב 3 מ"ל של hiPSC-CM תרבות בינוני17.
  8. תאי זרעים ב 8 תאים תחתון זכוכית גם בצפיפות תא של 75,000 תאים / באר ותרבות במשך 3 ימים.

2. בידוד קרדיומיוציט למבוגרים

  1. בידוד וטיפוח של קרדיומיוציטים בוגרים מעכברי NMRI בוצע כפי שדווח בעבר18.
  2. תאי זרעים ב 8 גם זכוכית תא שקופיות ותרבות ליום אחד.

3. בידוד וטיפוח של קרדיומיוציטים יילודים

  1. הליך בידוד של קרדיומיוציטים יילודים, שהושג מעכברי NMRI, בוצע כמתואר קודםלכן 19.
  2. זרע מבודד תא ב 8 גם זכוכית תא להחליק בצפיפות תא של 75,000 תאים / גם ותרבות במשך 3 ימים בתרבות CM יילודים בינוני19.

4. תיוג אימונו-α של רשת α-אקפטין

הערה: לקבלת תוצאות אופטימליות, התאים מתורתים ב-8 תאים תחתונים מזכוכית. תיוג צריך להתבצע יום אחד לפני ההדמיה.

  1. לפני המלחמה 4% PFA ב 37 °C.
  2. תקן iPSC-CM על ידי הוספת 4% paraformaldehyde ישירות למדיית התרבות (1:1 דילול) דגירה ב 37 ° C במשך 15 דקות. הריכוז הסופי של PFA עבור קיבעון הוא 2%.
  3. דגירה תאים קבועים ב 0.2% Triton-X, מדולל PBS, במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  4. לשטוף תאים פעמיים עם PBS, 5 דקות כל אחד.
  5. הוסף 1% תמיסת BSA (מדוללת ב-PBS) ומדגם במשך 60 דקות בטמפרטורת החדר.
  6. להכין 150 μL של פתרון נוגדן ראשי על ידי דילול α-actinin נוגדן 1:100 ב 1% BSA, המכיל 0.05% Triton-X. מוסיפים לתאים ומעוררים בטמפרטורת החדר במשך 60 דקות.
  7. לשטוף תאים פעמיים עם 0.2% פתרון BSA, 5 דקות כל אחד.
  8. להכין 150 μL של פתרון נוגדן משני על ידי דילול נוגדן אלקסה647 עיזים נגד עכבר 1:100 ב 1% BSA, המכיל 0.05% Triton-X. מוסיפים לתאים ותדנו בטמפרטורת החדר במשך 40 דקות.
  9. לשטוף תאים פעמיים עם 0.2% פתרון BSA, 5 דקות כל אחד.
  10. לשטוף תאים פעמיים עם PBS, 5 דקות כל אחד. שמור תאים מסומנים בחושך ב- 4 °C עד הדמיית PALM.

5. הכנת מאגר ההדמיה PALM

הערה: חשוב להכין מחדש את מאגר ההדמיה PALM עבור כל ניסוי.

  1. להכין 50% תמיסת גלוקוז על ידי המסת 25 גרם גלוקוז ב 50 מ"ל של מים מזוקקים.
  2. הכן מאגר בסיסי המכיל 50 מ'מ טריס-HCl, 10% גלוקוז ו-10 מ"מ נתרן כלורי.
    1. כוונן את רמת החומציות ל~ 8.0 באמצעות חומצה הידרוכלורית.
  3. להכין תמיסת אוקסיד אזידז pyranose על ידי המסת 0.6 מ"ג pyranose oxidase ב 316 μL של חוצץ בסיסי.
  4. להכין פתרון קטלאז על ידי המסת 7 מ"ג של קטלאז ב 500 μL של חוצץ בסיסי. מערבבים היטב וצנטריפוגה ב-10,000 x גרם למשך 3 דקות. שמור את הסופרנטנט לשימוש נוסף. פתרון Catalase ניתן לשמור ב 4 °C במשך מספר ימים.
  5. להכין 500 μL של מאגר הדמיה PALM על ידי ערבוב 316 μL של תמיסת אוקסיד אזידז פיראנוז, 25 μL של פתרון קטלאז, 100 μL של 50% תמיסת גלוקוז, 50 μL של ציסטאמין, 5 μL של cyclooctatetraene ו 3.5 μL של β-Mercaptoethanol. הפעילות הקטאליטית הסופית של אוקסידס וקטלאז פיראנוז צריכה להיות 7.5 U, 35,00U בהתאמה.
    הערה: מאגר ההדמיה PALM מספק תנאי הדמיה אופטימליים למשך 3-5 שעות. אם יכולת ההבהוב של צבע הפלורסנט פוחתת, הכינו מאגר חדש aliquot.

6. רכישת תמונה של PALM

  1. הפעל את המיקרוסקופ לפחות 3 שעות לפני השימוש ולהביא את הדגימה לטמפרטורת החדר לפני ההדמיה כדי לאפשר שיווי משקל תרמי. אם המיקרוסקופ מצויד בתא דגירה, התאם את הטמפרטורה ל-30°C.
  2. נקה את המטרה והתחתון של החלקה התא באמצעות ממס ניקוי מתאים.
  3. הוסף 300 μL של מאגר הדמיה PALM לתוך באר אחת של תאים מסומנים והכנס את השקופית התא לתוך מחזיק הבמה של המיקרוסקופ.
  4. הגדר את הפרמטרים של רכישת תמונה PALM.
    1. בחר 1.57 N.A. 100x יעד נפט לרכישה.
    2. בחר מצב PALM והפעל את הגדרות TIRF.
    3. התאם את מספר המסגרות שיש לרכוש. בדרך כלל 5, 000-10, 000 מסגרות מספיקות כדי להשיג תוצאות אופטימליות. עם זאת, מספר המסגרות שנרכשו תלוי מאוד ביעילות התיוג וביכולת ההבהוב של צבע הפלורסנט, והמשתמש עשוי להתאים אותו.
    4. הגדר את כוח לייזר UV ל- 0.1% ו- 647 לייזר ל- 0.2%.
    5. הגדר את רמת הרווח ל- 50-100.
    6. הפעל את תאורת הלייזר ובחר תא יעד. ניתן להגדיל את רמת הרווח אם עוצמת האות נמוכה (בהתאם לתיוג פלואורסץ).)
    7. כבה את תאורת הלייזר
  5. רכישת תמונה של PALM
    1. להפחית את הרווח ל- 0 ולהגדיל את כוח הלייזר (לשעבר 647) ל- 100%.
    2. להלבין את תא היעד עבור ~ 5 s.
    3. הגדל את הרווח ל- 50 והתחיל ברכישת תמונה של PALM.
      הערה: יש לכוונן את 'רווח' כדי לקבל עוצמת אות מספקת, בעוד שיש להימנע מפיקסלים עם ערך יתר. אם עוצמת האות תפחת, הגדל את רמת הרווח.
  6. לחלופין, שפר בהתמדה את כוח הלייזר UV (0.1%-10%) כדי להגביר את עוצמת האות ולקדם את המצמוץ של הפלואורופור.

7. שחזור נתוני PALM

  1. פתח את תוכנת Image J וייבוא נתוני PALM.
  2. פתח תוסף סופתרעמים ו " הפעל ניתוח"
    1. בתפריט " הגדרתמצלמה" הזן גודל פיקסל ו- EM רווח.
      הערה: בעת שימוש ביעדי 100x ועדשת הגדלה של 1.6x, גודל פיקסל של 100 נה"מ מתאים. עם זאת, מכיוון שגודל הפיקסל תלוי בתכונות החומרה של המיקרוסקופ והמצלמה המשמשות להדמיית PALM, על המשתמשים לבדוק ולהתאים פרמטר זה בזהירות. ניתן להשיג ערכי רווח EM מהמטה-נתונים.
    2. בתפריט " הפעלניתוח" להגדיר פרמטרים כדלקמן: B-spline סדר: 3, B-סולם קו: 2.0, סף עוצמת שיא: stf (Wave.F1), רדיוס מתאים: 3, סיגמא ראשוני: 1.6, הגדלה: 5.0, תדירות עדכון: 50, משמרות לרוחב: 2 אשר על ידי לחיצה על"אישור"כפתור.
  3. ר''ר עיבוד של תמונת PALM משוחזרת
    1. בתפריט "התוויית היסטוגרמה" בחר בפרמטר "Sigma".
    2. השתמשובכלי" מלבן " לבחירת החזר השקעה, לא כולל פריטים אפשריים ולהחיל החזר השקעה על המסנן. ערכי ROI יופיעו בתיבת הפקודה של המסנן.
    3. הוסף "& אי ודאות <25" לערכי ההחזר על ההשקעה. פקודת סינון אפשרית תיראה כך: "(סיגמה > 48.6821 וסיגמא < 1117.40) ואי ודאות <25". החל ערכי סיגמא נבחרים.
    4. בתפריט "הסרת כפילויות", הזן סף מרחק של "10 נה"מ" והחיל.
    5. ב " תפריט מיזוג ",הגדר מרחקמרבי ל- "20", מסגרות מרביות לכל מולקולה ל- "0" ומקסימום מסגרות ל- "1". החל הגדרות.
    6. ב " תפריטתיקון סחף", בחר מתאם צולב והגדר "מספר סלים" ל- "5" ו - "הגדלה" ל- "5.0". החל הגדרות תיקון סחף.
    7. שמור את תמונת PALM הסופית וצא נתונים מעובדים לפוסט אם תרצה.

8. ניתוח של נרים סרקום

  1. ניתוח אורך סרקומר
    1. פתח את תוכנת Image J וייבוא תמונת PALM המושחזרת.
    2. צייר קו בין מבני סרקומר נבחרים בניצב לדיסק z כדי למדוד את המרחק הקצר ביותר בין נכי actinin.
    3. בחר "התוויהפרופיל " בתפריט "נתח" ולרכוש את האורך בין שתי פסגות. כמו אורך sarcomere עשוי להשתנות בתוך תא אחד, מינימום של 20 סרקומרים יש למדוד באזורים שונים של תא היעד.
  2. ניתוח עובי Z-Disc
    1. פתח את תוכנת Image J וייבוא תמונת PALM המושחזרת.
    2. המר את תמונת PALM המושחזרת לתמונה במצב של 8 סיביות.
    3. פתח את תוסף זיהוי הרכס והזן את הפרמטרים הבאים: רוחב קו: 20, ניגודיות גבוהה: 230, ניגודיות נמוכה: 10, סיגמה: 0.79, סף נמוך יותר: 25.84, אורך קו מינימלי: 20.
    4. הגדר "הערכת רוחב", "הרחב קו" ו "הצגת תוצאות".
    5. לחץעל" אישור " והשתמש "רוחב קוממוצע " מטבלת התוצאות לניתוחים נוספים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

להערכת מידת ההתבגרות המבנית של CM, יילודים, מבוגר בוגר לחלוטין, ו- iPSC CM סומנו בתחילה CM עם נוגדן α-actinin כדי לדמיין את רשת sarcomere. לאחר רכישת PALM, התמונות שוחזרו, ועובי z-disc נמדד באמצעות תוכנת עיבוד תמונה מבוססת תוסף לזיהוי אוטומטי של רוחב של ניביים בודדים. אורך Sarcomere חושב על ידי מדידת המרחק בין שתי פסגות עוצמה סמוכות, המקבילה לניבים שכנים. איור 1 מציג את ההערכה של הארגון sarcomere ב- CM הנגזר מ- iPSCs.

כפי שהוצג באיור 2A, iPSC-CM ותאי יילוד נמצאו להפגין דפוס דומה α- actinin עם מבנים סרקומר לא סדיר, לא מסודר. כמו כן, הערכה כמותית הוכיחה כי האורך והעובי של α- סיבי actinin היו כמעט זהים אשר מצביע על מצב התפתחותי מוקדם של iPSC CM. ליתר דיוק, אורך sarcomere הממוצע היה על 1.83 μm (מבוגר לעומת. iPSC CM לעומת ס"מ יילודים: 1.91 ± 0.02 1.83 ± 0.049 μm לעומת 1.82±0.03 μm, n = 20 תאים), בעוד עובי z-Disc היה כ 74 nm (מבוגר לעומת. iPSC CM לעומת ס"מ יילודים: 71.30 ± 1.64 לעומת 73.95 ± 0.86 נק', לעומת 74.08 ± 0.12 נק', n = 20 תאים)(איור 2B). לעומת זאת, CM בוגר בוגר הראה רשת sarcomere רגיל עם אורך sarcomere מעט גדל ועובי z-Disc מופחת.

השוואה של הדמיה קונבנציונלית confocal וPALM הפגינו שום הבדל משמעותי של אורך sarcomere (איור 2C) (confocal לעומת PALM: 1.75 ± 0.02 לעומת 1.70 ± 0.02, n = 10 תאים). עם זאת, עובי z-Disc מופחת עמוק זוהה כאשר iPSC-CM היו נתונים הדמיית PALM (איור 2C) (confocal לעומת PALM: 224.71 ± 4.31 לעומת 73.91 ± 1.31, n = 10 תאים). תמונות מייצגות מדגישות את הרווח ברזולוציה כאשר PALM הוחלה, נתמכת על ידי חלקות עוצמה מתאימות (איור 2D,E). רוחב מלא מחושב בחצי מרבי של עוצמת פלואורסציט גילה כי α-actin מבנים הם ~ 3-פי רזה בתמונות PALM אם בהשוואה למיקרוסקופית confocalסטנדרטי (איור 2E).

מיקרוסקופית מולקולה אחת, כמו PALM, מאפשרת זיהוי של מבנים תאיים הרבה מתחת למגבלת ההתפלה. כדי להבטיח רזולוציה מרחבית מרבית, תנאי הדמיה מתאימים נדרשים לזיהוי מדויק של התאמה מקומית של מולקולות בודדות. מערכת מאגר ההדמיה בשימוש היא קריטית עבור תהליך רכישה זה כפי שהוא משפיע על המאפיינים הפוטופיזיים של צבע פלורסנט, ולכן, יש השפעה משמעותית על הרזולוציה הכוללת ודיוק של תמונת PALM הסופית. השוואה בין חיץ באיכות גבוהה לבין חוצץ שהוכן יום אחד לפני ההדמיה חשפה הבדל עמוק בעובי נימה (איור 3א', ב'). מבני Sarcomere שנרכשו עם מאגר באיכות נמוכה נראים עבים יותר בהשוואה לתנאי הדמיה אופטימליים(איור 3א). ואכן, הערכה כמותית הראתה כי עובי z-Disc גדל בכ-65% (איכות גבוהה לעומת איכות נמוכה: 73.87 ± 1.02 נה"מ לעומת 113.9 ± 1.33 נה"מ, n =155 נ"מ)(איור 3B). חוסר דיוק נתונים זה נובע ממאפיינים מהבהבים מופחתים של הפלואורופור, התוצאה היא פחות פוטונים שזוהו לכל אירוע התאמה מקומית (איכות מאגר גבוהה לעומת נמוכה: 29689 פוטונים/אירוע לעומת 16422 פוטונים/אירועים) (איור 3C). יתר על כן, דיוק הלוקליזציה יורד בתנאי הדמיה מידרדרים (איכות גבוהה לעומת איכות נמוכה: 14.25 ± 5.85 נק', לעומת 19.56 ± 6.7 נק'), מה שמפחית את הרזולוציה הכוללת של תמונת PALM המושחזרת (איור 3C).

בנוסף, סחיפה לדוגמה, למשל, הנגרמת על ידי חוסר יציבות תרמית, יכולה להשפיע על התאמה מדויקת של מולקולות פלורסנט ותוצאות בתמונות מטושטשות, כפי שמוצג באיור תלת-מידי. בעוד הדמיית PALM אופטימלית מעניקה פסגות עוצמה ברורות ומוגדרות היטב, סחיפה מדגם מוגזמת מייצרת תבנית עוצמה לא סדירה שמקשה לקבוע במדויק את המרחק בין שני נימה סמוכים. נתונים אלה מדגישים את החשיבות של תנאי הדמיה מבוקרים היטב במיקרוסקופ התאמה מולקולה אחת כמו אפילו שינויים עדינים במהלך תהליך הרכישה יכול להקטין באופן דרמטי את איכות התמונה ודיוק נתונים.

Figure 1
איור 1: הערכת ארגון sarcomere ב- CM הנגזר מ- IPSCs.
רשת sarcomere סומנה באופן פלורסנטי עם α-אקדמין, ואחריו רכישת תמונה PALM. השחזור הבא מוביל לתדמית PALM הסופית ששימשה לניתוח כמותי. אורכם של סרקומרים בודדים נקבע על ידי מדידת המרחק בין שתי פסגות בעוצמה התואמות לניני סרקום שכנים (1-5). עובי Z-Disc חושב באופן אוטומטי על-ידי כלי עיבוד תמונה מבוסס תוסף. סרגל קנה מידה 10 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של דמות זו.

Figure 2
איור 2: השוואה כמותית של עובי z-disc ואורך sarcomere ב- CM נגזר iPSCs, מבוגר, רקמת לב ילודים.
(א)תמונות PALM משוחזרות של רשת α-actin של iPSC ו- CM יילודים.(ב)הערכה כמותית גילתה כי כל יילודים ולשתף דמיון גבוה באורך sarcomere (מבוגר לעומת. iPSC CM לעומת ס"מ יילודים: 1.91 ± 0.02 1.83 ± 0.049 μm לעומת 1.82±0.03 μm) ועובי של סיבים בודדים (מבוגר לעומת iPSC CM לעומת. ס"מ יילודים: 71.30 ± 1.64 לעומת 73.95 ± 0.86 נק', לעומת 74.08 ± 0.12 נק') המציין את הפנוטיפ המוקדם של iPSC CM. (C) השוואה של אורך סרקומר ועובי z-Disc בין הדמיה קונבנציונלית confocal ורכישת נתונים מבוססת PALM. ככל שאורך sarcomere נקבע על ידי מדידת מרחק השיא לשיא, ההשפעה של רזולוציה מוגברת על דיוק נתונים היה פחות בולט (confocal לעומת PALM: 1.75 ± 0.02 לעומת 1.70 ± 0.02). לעומת זאת, עובי Z-Disc נמוך משמעותית זוהה כאשר PALM הוחל (confocal לעומת PALM: 224.71 ± 4.31 לעומת 73.91 ± 1.31). (D)תמונות מיקרוסקופיות מייצגות של iPSC-CM שהושגו על ידי הדמיית CONFOCAL ו-PALM. (ה)מתווה עוצמת פלואורסנצס המתאים לקו האדום המוצג ב( D). הערכים מייצגים רוחב מלא בחצי מרבי של עוצמת פלואורסציט, מה שמצביע על עלייה עמוקה ברזולוציה בתמונות PALM. הנתונים מוצגים כנתונים ± SEM, n = 10-20 תאים, 20 סרקומרים לכל תא הוערכו. משמעות סטטיסטית נקבעה באמצעות תלמידים t-Test. **p<0.005, סרגל קנה מידה 10 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של דמות זו.

Figure 3
איור 3: ההשפעה של איכות מאגר והסחף לדוגמה על דיוק ואמינות נתונים.
(A) תמונות PALM מייצגות של CM הנגזר מ-iPSC שנרכשו בתנאי הדמיה שונים. נכי Sarcomere נראים עבים יותר בדגימות שתמונה עם חוצץ באיכות נמוכה. קווים אדומים מצביעים על מדידה מייצגת של אורך sarcomere, בעוד מבני נימה ירוקים נכללו בניתוח z-Disc. (ב)הערכה כמותית אישרה הבדל משמעותי בעובי z-Disc בין מאגר באיכות נמוכה לבין מאגר באיכות גבוהה (איכות מאגר גבוהה לעומת נמוכה: 73.87 ± 1.02 דפים לעומת. 113.9 ± 1.34 צפון ל"ס(ג)הבדל זה ברמת דיוק התמונה התבסס על יכולת מצמוץ מופחתת של הפלואורופור, מה שהוביל למספר מופחת של פוטונים שזוהו לכל מולקולה (איכות מאגר גבוהה לעומת נמוכה: 29689 פוטונים/אירוע לעומת 16422 פוטונים/אירועים). במקביל, דיוק ההתיקות למיקום נמוך אשר בתורו הוריד את הרזולוציה הכוללת (גבוהה לעומת איכות מאגר נמוכה: 14.25 ± 5.85 לעומת 19.56 ± 6.7) (D)כמו כן, סחיפה מדגם מוגזם עלול לפגוע באיכות התמונה. בעוד רכישת תמונה נכונה ללא סחיפה מדגם תוצאות פסגות עוצמה מוגדרות היטב של α-actin נקבים, סחיפה מדגם מוגברת מעוררת דפוס עוצמה לא סדירה, אשר משפיע מאוד ניתוח מדויק של אורך sarcomere. הנתונים מוצגים כנתונים ± SEM. 155 ננוח. משמעות סטטיסטית נקבעה באמצעות תלמידים t-Test.****p<0.0001. סרגל קנה מידה 10μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הדור של CM פונקציונלי נגזר iPSC במבחנה חשוב עבור טיפולים רגנרטיביים, מידול מחלות ופיתוח של פלטפורמות סינון סמים. עם זאת, בגרות לא מספיקה של CM אלה הוא מכשול מרכזי במחקר לב וכלידם 20. בהקשר זה, דרושות טכניקות הדמיה ברזולוציה גבוהה המאפשרות ניטור של מצב ההתבגרות המבנית של CM הנגזר מ-iPSC. במקביל, מיקרוסקופית סופר רזולוציה יכול להיות כלי רב ערך לנתח במדויק את הפונקציה של חלבונים ספציפיים, נדרש היווצרות sarcomere נכונה כפי שהוכח לאחרונה עבור טיטין וטרופונין10,,21,22.

בפרוטוקול הנוכחי, אנו מציגים גישה מבוססת PALM כדי להעריך באופן כמותי את ההתבגרות המבנית של iPSC CM על ידי ניתוח α-actinin sarcomere.

בהשוואה למיקרוסקופ אור קונבנציונלי, PALM מאפשר הדמיה של מבנים סלולריים עם רזולוציה של ~ 20-50 נג'ר23. לכן, הוא מאפשר זיהוי שינויים עדינים אפילו של רשת sarcomere הלב כי הם בקושי או אפילו לא ניתן לזהות על ידי גישות מיקרוסקופיות אור קלאסי. החלת PALM, מדדנו אורך sarcomere ממוצע של ~ 1.84 μm ב iPSC ו- CM יילודים (איור 2). זה בקנה אחד עם מספר דוחות קודמים המראים כי הגודל של סרקומרים בודדים הוא ~ 1.7-2.0 μm24,25,26. בהשוואה לאורכו sarcomere, הערכה מדויקת של עובי z-קווים היא מסובכת יותר כמו גודלו הוא הרבה מתחת למגבלת הרזולוציה הקלאסית של מיקרוסקופ אור. באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים, מחקרים קודמים גילו כי עובי z-Disc נע בין 50 ל-80 נה"מ ב- iPSC CM, הדומה לזיהוי מבוסס PALM שלנו של כ-73 נה"מ (איור 2).

השוואה עם מיקרוסקופית confocal סטנדרטית הדגימה את העלייה הדרמטית ברזולוציה כאשר PALM הוחל. מצאנו 3-פי עובי Z-Disc נמוך, בעקבות הדמיית PALM (איור 2). עם זאת, לא נמדד הבדל משמעותי באורך הסרקומר. מאחר שפרמטר זה נמדד על-ידי זיהוי מרחק השיא לשיא של קווי עוצמה, ההשפעה של רזולוציה מוגברת בולטת פחות.

כדי להשיג רזולוציה מרחבית גבוהה זו, PALM דורש תנאי הדמיה מוגדרים היטב כי יש לטפל בזהירות על ידי המשתמש. עבור התאמה מדויקת של מולקולות בודדות, פלואורופורים נדרשים בעלי תכונות פוטופיזיות מיוחדות, המאפשרות מעבר מהיר בין פלורסנט למצבכהה, הנקרא מהבהב 27. כפי שהוכח בעבר, הבחירה של פלואורופורים יכול להשפיע מאוד על איכות התמונה28. יכולת מצמוץ עמוקה תוארה עבור אלקסה 647, אחד הצבעים הטובים ביותר בשימוש נרחב עבור מיקרוסקופית מולקולהאחת 29,30,31. עם זאת, מאז fluorophores PALM רבים זמינים, למשתמשים תהיה גמישות גבוהה במונחים של תיוג מדגם27,28.

מלבד הבחירה של פלואורופור מתאים, מערכת מאגר ההדמיה היא נקודה קריטית נוספת בהדמיית PALM כפי שהוא מכתיב את המאפיינים הפוטופיזיים של צבע פלורסנט. יש לנו להחיל oxidase pyranose כמערכת נבלות חמצן כי הוא מעולה אוקסידס גלוקוז כפי שהוא מספק יציבות pH מוגברת, ומכאן, המאפשר הדמיה לטווח ארוך ללא ירידה משמעותית של פלואורופור ממצמץלאורך זמן 32,,33. עם זאת, מכיוון שאורך החיים של מאגר ההדמיה מוגבל למספר שעות, יש להכין אותו מחדש לכל ניסוי כדי להבטיח שכפול גבוה. התוצאות שלנו מדגימות ירידה דרמטית של דיוק הנתונים בעקבות הדמיית PALM עם מאגר באיכות נמוכה, המוביל ליכולת מצמוץ לקויה ודיוק התאמה מקומית מופחתת (איור 3A-C).

יתר על כן, יציבות תרמית של מערכת ההדמיה היא חובה כדי למנוע סחיפה מדגם מוגברת. בעוד סחיפה מתונה יכולה להיות מתוקנת על ידי ניתוח חישובי, תנועת מדגם מוגזמת מובילה למיקום שגוי של פלואורופורים שזוהו ומפחיתה את איכות התמונה ואת דיוק הנתונים. ניתן למנוע זאת באמצעות מיקרוסקופים עם תאי חימום ושוויון תרמי מספיק של המדגם המתאים לפני הפעלת הדמיית PALM. בנוסף, תיוג צפיפות ויעילות, כמו גם השימוש של שברי נוגדנים או nanobodies יש לשקול כדי לייעל את תנאיהדמיה 34,35,36.

תהליך הרכישה של מבנים סלולריים גדולים עשוי להימשך 10-30 דקות, בהתאם לפרמטרים הדמיה (שדה תצוגה, בדיקה פלורסנט, מאגר הדמיה וכו '). זמן רכישה ארוך זה הוא חיסרון של PALM מה שהופך אותו פחות מתאים עבור הדמיית תא חי. בדרך כלל, מסגרות 5.000-10.000 נלכדות כדי להשיג מספר מספיק של אירועים מהבהבים עם דיוק התאמה מקומית גבוהה. כמו כן, עומק ההדמיה מוגבל בדרך כלל לכמה מאות ננומטר, מה שמקשה על חקירת דגימות עבות יותר. עם זאת, ניתן להשיג רזולוציה משופרת בכיוון z עם הגדרת 37 PALM3D.

בחרנו שני פרמטרים כדי לאפיין את α-actinin של iPSC CM, כולל אורך sarcomere ועובי z-Disc. תכונות נוספות ניתן לאסוף כדי לקבל תצוגה מקיפה יותר על הפיגומים sarcomere, כגון כיוון נימה. כמו כן, 3D PALM יכול לעזור לנתח כמותית את כל מבנה sarcomere על ידי הערכת צמתים וענפים הנוכחיים בתוך הרשת.

למרות PALM מאפשר ניתוח מפורט מאוד של מבנה sarcomere, שיטה זו אינה מאפשרת רכישת פרמטרים פונקציונליים כמו כיווץ סלולרי, שהוא תכונה חשובה נוספת כדי להעריך את בגרות הלב. דיווחים קודמים הראו כי הערכה מבוססת מיקרוסקופ של מבנה sarcomere ניתן לשלב עם ניתוח וידאו כדי לקבל נתוניםפונקציונליים 38,39. עם זאת, מאז המחברים השתמשו מיקרוסקופ פלואורסצינציונלי השיג נתונים על מבנה sarcomere הם פחות מדויקים בהשוואה PALM. הגישה שלנו גם מספקת את האפשרות לתאם נתוני PALM עם הקלטות זמן קודמות לשגות ולכן מאפשרת רכישת מדידות התכווצות.

לסיכום, פרוטוקול זה מספק שיטה להערכה כמותית של ההתבגרות המבנית של רשת sarcomere ב CM. באמצעות גישה זו מבוססת רזולוציה סופר, אסטרטגיות יכולות להיות מבוססות מיקוד פיתוח לב משופר של CM נגזר iPSC כדי להשיג פנוטיפ יותר למבוגרים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים לא מצהירים על ניגוד עניינים.

Acknowledgments

מחקר זה נתמך על ידי הקרן המבנית של האיחוד האירופי (ESF/14-BM-A55-0024/18). בנוסף, H.L. נתמכת על ידי תוכנית FORUN של המרכז הרפואי של אוניברסיטת רוסטוק (889001 ו 889003) וקרן יוזף וקתה קלינץ (T319/29737/2017). C.I.L. נתמך על ידי תוכנית המדען הקליני של המרכז הרפואי של אוניברסיטת רוסטוק. R.D נתמכת על ידי ה-DFG (DA1296/6-1), קרן DAMP, קרן הלב הגרמנית (F/01/12) וה-BMBF (VIP+ 00240).

אנו מודים מדלן Bartsch על התמיכה הטכנית שלה בתרבות תאי iPSC ובידול לב.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
human iPSC cell line Takara Y00325
µ-Slide 8 Well Glass Bottom ibidi 80827
0.5ml eppendorf tube Eppendorf 30121023
Bovine serum albumin Sigma Aldrich A906
Cardiomyocyte Dissociation Kit Stem Cell Technologies 05025
Catalase Sigma Aldrich C40-1G
Cyclooctatetraene Sigma Aldrich 138924-1G
Cysteamine Sigma Aldrich 30070-10g
Dulbecco's phosphate-buffered saline without Ca2+ and Mg2+ Thermo Fisher 14190169
F(ab')2-Goat anti-Mouse IgG Alexa Fluor 647 Thermo Fisher A-21237
Fiji image processing software (Image J)
Glucose Carl Roth X997.2
Hydrochloric acid Sigma Aldrich H1758
LSM 780 ELYRA PS.1 system Zeiss
Paraformaldehyde Merck 8187150100
Pyranose oxidase Sigma Aldrich P4234-250UN
sarcomeric α-actinin antibody [EA-53] Abcam ab9465
Sodium chloride Sigma Aldrich S7653
sterile water Carl Roth 3255.1
Triton X-100 Sigma Aldrich X100
Trizma base Sigma Aldrich T1503
β-Mercaptoethanol Sigma Aldrich 63689

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McAloon, C. J., et al. The changing face of cardiovascular disease 2000-2012: An analysis of the world health organisation global health estimates data. International Journal of Cardiology. 224, 256-264 (2016).
  2. Kussauer, S., David, R., Lemcke, H. hiPSCs Derived Cardiac Cells for Drug and Toxicity Screening and Disease Modeling: What Micro- Electrode-Array Analyses Can Tell Us. Cells. 8 (11), 1331 (2019).
  3. Ylä-Herttuala, S. iPSC-Derived Cardiomyocytes Taken to Rescue Infarcted Heart Muscle in Coronary Heart Disease Patients. Molecular Therapy. 26 (9), 2077 (2018).
  4. Kadota, S., Shiba, Y. Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocyte Transplantation for Heart Disease Treatment. Current Cardiology Reports. 21 (8), 73 (2019).
  5. Jiang, Y., Park, P., Hong, S. M., Ban, K. Maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells: Current strategies and limitations. Molecules and Cells. 41 (7), 613-621 (2018).
  6. Feric, N. T., Radisic, M. Maturing human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes in human engineered cardiac tissues. Advanced Drug Delivery Reviews. 96, 110-134 (2016).
  7. Ali, H., Braga, L., Giacca, M. Cardiac regeneration and remodelling of the cardiomyocyte cytoarchitecture. The FEBS Journal. 287 (3), 417-438 (2020).
  8. Yang, X., Pabon, L., Murry, C. E. Engineering adolescence: maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circulation Research. 114 (3), 511-523 (2014).
  9. Bedada, F. B., Wheelwright, M., Metzger, J. M. Maturation status of sarcomere structure and function in human iPSC-derived cardiac myocytes. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1863 (7), 1829-1838 (2016).
  10. Dai, Y., et al. Troponin destabilization impairs sarcomere-cytoskeleton interactions in iPSC-derived cardiomyocytes from dilated cardiomyopathy patients. Scientific Reports. 10 (1), 1-15 (2020).
  11. Huang, C. Y., et al. Enhancement of human iPSC-derived cardiomyocyte maturation by chemical conditioning in a 3D environment. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 138, 1-11 (2020).
  12. Ronaldson-Bouchard, K., et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).
  13. Lee, S., et al. Contractile force generation by 3D hiPSC-derived cardiac tissues is enhanced by rapid establishment of cellular interconnection in matrix with muscle-mimicking stiffness. Biomaterials. 131, 111-120 (2017).
  14. Baddeley, D., Bewersdorf, J. Biological Insight from Super-Resolution Microscopy: What We Can Learn from Localization-Based Images. Annual Review of Biochemistry. 87 (1), 965-989 (2018).
  15. Ovesný, M., Křížek, P., Borkovec, J., Švindrych, Z., Hagen, G. M. ThunderSTORM: A comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging. Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).
  16. Mahadev, K., Wu, X., Donnelly, S., Ouedraogo, R., Eckhart, A. D., Goldstein, B. J. Adiponectin inhibits vascular endothelial growth factor-induced migration of human coronary artery endothelial cells. Cardiovascular Research. 78 (2), 376-384 (2008).
  17. Lemcke, H., Skorska, A., Lang, C. I., Johann, L., David, R. Quantitative evaluation of the sarcomere network of human hiPSC-derived cardiomyocytes using single-molecule localization microscopy. International Journal of Molecular Sciences. 21 (8), 2819 (2020).
  18. Ackers-Johnson, M., et al. A simplified, langendorff-Free method for concomitant isolation of viable cardiac myocytes and nonmyocytes from the adult mouse heart. Circulation Research. 119 (8), 909-920 (2016).
  19. Lemcke, H., et al. Applying 3D-FRAP microscopy to analyse gap junction-dependent shuttling of small antisense RNAs between cardiomyocytes. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 98, 117-127 (2016).
  20. Karbassi, E., et al. Cardiomyocyte maturation: advances in knowledge and implications for regenerative medicine. Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).
  21. Krysiak, J., et al. Protein phosphatase 5 regulates titin phosphorylation and function at a sarcomere-associated mechanosensor complex in cardiomyocytes. Nature Communications. 9 (1), 1-14 (2018).
  22. Zaunbrecher, R. J., et al. Cronos Titin Is Expressed in Human Cardiomyocytes and Necessary for Normal Sarcomere Function. Circulation. 140 (20), 1647-1660 (2019).
  23. Fornasiero, E. F., Opazo, F. Super-resolution imaging for cell biologists. BioEssays. Fornasiero, E. F., Opazo, F. , Wiley Online Library. (2015).
  24. Jeziorowska, D., et al. Differential Sarcomere and Electrophysiological Maturation of Human iPSC-Derived Cardiac Myocytes in Monolayer vs. Aggregation-Based Differentiation Protocols. International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), 1173 (2017).
  25. Kroll, K., et al. Electro-mechanical conditioning of human iPSC-derived cardiomyocytes for translational research. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 130, 212-222 (2017).
  26. Zuppinger, C., et al. Characterization of cytoskeleton features and maturation status of cultured human iPSC-derived cardiomyocytes. European Journal of Histochemistry. 61 (2), 145-153 (2017).
  27. Jradi, F. M., Lavis, L. D. Chemistry of Photosensitive Fluorophores for Single-Molecule Localization Microscopy. ACS Chemical Biology. 14 (6), 1077-1090 (2019).
  28. Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nature Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).
  29. Lampe, A., Haucke, V., Sigrist, S. J., Heilemann, M., Schmoranzer, J. Multi-colour direct STORM with red emitting carbocyanines. Biology of the Cell. 104 (4), 229-237 (2012).
  30. Chamma, I., Levet, F., Sibarita, J. B., Sainlos, M., Thoumine, O. Nanoscale organization of synaptic adhesion proteins revealed by single-molecule localization microscopy. Neurophotonics. 3 (4), 041810 (2016).
  31. Ma, H., Fu, R., Xu, J., Liu, Y. A simple and cost-effective setup for super-resolution localization microscopy. Scientific Reports. 7 (1), 1-9 (2017).
  32. Olivier, N., Keller, D., Gönczy, P., Manley, S. Resolution Doubling in 3D-STORM Imaging through Improved Buffers. PLoS One. 8 (7), 0069004 (2013).
  33. Swoboda, M., et al. Enzymatic oxygen scavenging for photostability without ph drop in single-molecule experiments. ACS Nano. 6 (7), 6364-6369 (2012).
  34. Mikhaylova, M., et al. Resolving bundled microtubules using anti-tubulin nanobodies. Nature Communications. 6 (1), 1-7 (2015).
  35. Venkataramani, V., et al. Enhanced labeling density and whole-cell 3D dSTORM imaging by repetitive labeling of target proteins. Scientific Reports. 8 (1), 1-7 (2018).
  36. Erdélyi, M., et al. Origin and compensation of imaging artefacts in localization-based super-resolution microscopy. Methods. 88, 122-132 (2015).
  37. McGorty, R., Schnitzbauer, J., Zhang, W., Huang, B. Correction of depth-dependent aberrations in 3D single-molecule localization and super-resolution microscopy. Optics Letters. 39 (2), 275 (2014).
  38. Ribeiro, M. C., et al. A cardiomyocyte show of force: A fluorescent alpha-actinin reporter line sheds light on human cardiomyocyte contractility versus substrate stiffness. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 141, 54-64 (2020).
  39. Pioner, J. M., et al. Isolation and mechanical measurements of myofibrils from human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cell Reports. 6 (6), 885-896 (2016).

Tags

ביולוגיה גיליון 165 תאי גזע פלורופוטנטיים המושרה על ידי בני אדם קרדיומיוציט רזולוציית על התבגרות רשת סרקום מיקרוסקופית פוטואקטיביזציה למיקום
ניתוח רשת α-Actinin בקרדיומיוציטים אנושיים הנגזרים מ-iPSC באמצעות מיקרוסקופיה לתיאום מולקולה אחת
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Johann, L., Chabanovska, O., Lang,… More

Johann, L., Chabanovska, O., Lang, C. I., David, R., Lemcke, H. Analyzing the α-Actinin Network in Human iPSC-Derived Cardiomyocytes Using Single Molecule Localization Microscopy. J. Vis. Exp. (165), e61605, doi:10.3791/61605 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter