Summary
적절한 sarcomere 네트워크의 형성은 iPSC 유래 심근 세포의 성숙에 중요합니다. 우리는 줄기 세포 유래 심근세포의 구조적 성숙의 정량적 평가를 허용하고, 심장 발달을 촉진하는 배양 조건을 개선할 수 있는 슈퍼 분해능 기반 접근법을 제시한다.
Abstract
iPSC 유래 심근세포의 성숙은 재생 치료, 약물 검사 및 질병 모델링에 있는 그들의 신청에 대한 중요한 문제점입니다. 다중 분화 프로토콜의 발달에도 불구하고 성인과 같은 표현형을 닮은 iPSC 심근세포의 생성은 여전히 도전적입니다. 심근 세포 성숙의 한 가지 주요 측면은 높은 수축 용량을 보장하기 위해 잘 조직 된 sarcomere 네트워크의 형성을 포함한다. 여기에서는 심근세포에서 α 액티닌 네트워크의 반정량 분석을 위한 슈퍼 분해능 기반 접근 방식을 제시합니다. 광활성화 국소화 현미경을 사용하여 신생아 조직으로부터 분리된 iPSC 유래 심근세포 및 심장 세포의 사코프레 길이 및 z-디스크 두께의 비교가 수행되었다. 동시에 신뢰할 수 있는 데이터를 얻기 위해 적절한 이미징 조건의 중요성을 입증합니다. 우리의 결과는 이 방법이 높은 공간 해상도로 심장 세포의 구조적 성숙도를 정량적으로 모니터링하는 데 적합하다는 것을 보여 주어 sarcomere 조직의 미묘한 변화를 감지할 수 있습니다.
Introduction
심근 경색 또는 심근병증과 같은 심혈관 질환(CVD)은 서구 세계1에서주요 사망 원인으로 남아 있다. 인간의 심장은 가난한 재생 능력을 가지고 있기 때문에, CVD에서 회복을 촉진하기위한 전략에 대한 필요가있다. 여기에는 분실된 심근세포(CM)를 보충하기 위한 세포 대체 요법뿐만 아니라 효율적이고 안전한 제약 개입을 위한 새로운 부정맥 약물의 개발이 포함됩니다. 유도만능 줄기세포(iPSC)는 생체외에서 인간 CM의 무제한 생성을 위한 유망한 세포공급원으로 나타났으며, 재생 요법, 질병 모델링, 약물 스크리닝 어세서2,,3,,4의개발에 적합하게 된다.
많은 다른 심장 분화 프로토콜이 존재하지만, iPSC 유래 CM은 여전히 시험관 내 및 생체 내 응용 프로그램5,,6을방해하는 특정 표현성 및 기능적 측면이 부족하다. 전기 생리학, 대사 및 분자 변화 외에도 심장 성숙 과정은 힘 생성 및 세포수축7에필요한 기본 단위인 sarcomeres의 구조 적 조직을 포함한다. 성인 CM은 잘 조직된 수축 장치를 전시하는 동안, iPSC 유래 CM은 일반적으로 수축 능력 감소 및 변경된 수축 역학과 관련된 분리된 사코레 필라멘트를 입증한다8,,9. 단축 수축 패턴을 보이는 성숙한 CM과는 달리, 미숙한 CM의 방향감각 구조는 전체 세포의 방사형 수축을 초래하거나 수축 초점점9,,10의출현을 촉진한다.
심장 성숙을 개선하기 위해 3D 세포 배양 방법, 전기 및 기계적 자극뿐만 아니라 생체 조건에서 모방된 세포외 행렬의사용(11,,12,13)을포함한 여러접근법이적용되었다. 이러한 다양한 배양 조건의 성공과 효율성을 평가하기 위해서는 미세한 기술로 iPSC CM의 구조적 성숙 정도를 모니터링하고 추정하기 위한 기술이 필요합니다. 기존의 공초점 영상과는 달리, 광활성화 국소화 현미경검사(PALM)의 경우 해상도는 약 10배 더 높다. 이 기술은 차례로 세포 구조물의 미묘한 변경을 검출하는 더 정확한 분석을 가능하게합니다(14). PALM 기반 이미징의 고해상도를 고려할 때, 이 방법의 전반적인 목표는 z-Disc 두께 및 사코메 길이의 정확한 측정에 의한 iPSC 유래 CM에서 sarcomere 성숙도의 현미경 평가였습니다. 이전 연구에서, 이러한 구조적 특징은 심장 성숙도를 평가하기 에 적합한 매개 변수로 표시되었습니다(15. 예를 들어, 병에 걸린 iPSC-CM전체 길이 디스트로핀이 부족한 경우 야생형세포(16)와비교했을 때 사코름 길이및 z대역 폭이 감소한다. 마찬가지로, 개별 사파레의 길이는 심장 발달에 지형 단서의 충격을 조사하기 위하여 측정되었다16. 따라서, 우리는 정량적으로 sarcomere 길이와 z 디스크 두께를 측정하여 iPSC-CM에서 sarcomere 네트워크의 구조적 성숙을 평가하기 위해이 접근 방식을 적용했다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
신생아와 성인 마우스를 관련시키는 이 프로토콜에 있는 모든 단계는 로스톡 대학 의료 센터의 동물 배려를 위한 윤리적인 지침에 따라 수행되었습니다.
1. iPSC 유래 심근세포의 재배 및 해리
- 이전에설명된 바와 같이 2D 단층 방법을 사용하여 25일 동안 hiPSC-CM을 차별화한다.
- 37°C에 미리 떼어내며 중온에서 실온을 지원합니다.
- PBS로 셀을 두 번 씻으시면 됩니다.
- 세포에 미리 예온된 해리 배지를 추가하고 37°C및 5% CO2에서12분 동안 배양한다.
- 셀에 지지 매체를 추가합니다.
참고: 추가된 지지 매체의 부피는 1.4단계에서 사용되는 해리 매체의 두 배여야 합니다. - 5mL 세로지학적 파이펫을 사용하여 세포를 빼내게 한다.
- 원심분리기 세포는 200 x g에서 5분 동안 및 hiPSC-CM 배양 배지17의3mL에서 펠릿을 재연한다.
- 종자 세포 8 잘 유리 바닥 챔버의 세포 밀도에서 75,000 세포 /잘 및 배양 3 일 동안.
2. 성인 심근세포 격리
- NMRI 마우스로부터 의 성인 심근세포의 격리 및 재배는 이전에 보고된 바와 같이수행되었다 18.
- 종자 세포 8 잘 유리 챔버 슬라이드 및 문화에서 하루 동안.
3. 신생아 심근세포의 격리 및 재배
- NMRI 마우스로부터 수득된 신생아 심근세포의 격리 절차는 이전에 설명된 바와 같이수행되었다 19.
- 종자 분리세포는 신생아 CM 배양배지에서 3일간 75,000세포/웰 및 배양의 세포 밀도로 8개의 유리 챔버슬라이드를한다.
4. α 액티닌 네트워크의 면역 형광 라벨
참고: 최적의 결과를 위해, 세포는 8 잘 유리 바닥 챔버에서 배양된다. 라벨링은 이미징 을 하기 하루 전에 수행해야 합니다.
- 37 °C에서 사전 웜 4 % PFA.
- 배양 매체에 직접 4% 파라포름알데히드를 추가하여 iPSC-CM을 수정(1:1 희석) 15분 동안 37°C에서 배양한다. 고정을 위한 PFA의 최종 농도는 2%입니다.
- PBS에서 희석된 0.2% 트리톤-X에서 고정 셀을 실내 온도에서 5분 동안 배양합니다.
- PBS로 두 번, 각각 5 분 세척.
- 1% BSA 용액(PBS에서 희석)을 추가하고 실온에서 60분 동안 배양합니다.
- 0.05% Triton-X를 함유한 1%BSA에서 α 액틴 항체 1:100을 희석하여 1차 항체 용액의 150 μL을 준비한다. 셀에 추가하고 60 분 동안 실온에서 배양하십시오.
- 0.2% BSA 용액으로 두 번 세척할 수 있으며, 각각 5분.
- 염소 항마우스 Alexa647 항체를 1%BSA에서 1:100으로 희석하여 이차 항체 용액의 150 μL을 준비하여 0.05% Triton-X를 함유한다. 셀에 추가하고 40 분 동안 실온에서 배양하십시오.
- 0.2% BSA 용액으로 두 번 세척할 수 있으며, 각각 5분.
- PBS로 두 번, 각각 5 분 세척. PALM 이미징이 될 때까지 4°C에서 어두운 상태로 표지된 세포를 유지합니다.
5. PALM 이미징 버퍼 의 준비
참고: 각 실험에 대해 PALM 이미징 버퍼를 신선하게 준비하는 것이 중요합니다.
- 증류수 50mL에 25g의 포도당을 용해하여 50% 포도당 용액을 준비하십시오.
- 50m Tris-HCl, 10% 포도당 및 10mM 염화나트륨을 함유한 기본 버퍼를 준비하십시오.
- 염산을 사용하여 pH 레벨을 ~8.0으로 조정합니다.
- 기본 완충제의 316 μL에서 0.6 mg 의 피라노스 산화를 용해하여 피라노스 산화제 용액을 준비하십시오.
- 기본 버퍼 500 μL에 7 mg의 카탈라아제를 용해하여 카탈라제 용액을 준비하십시오. 10,000 x g에서 3분 간 철저하게 혼합하고 원심분리기를 섞습니다. 추가 사용을 위해 상체를 유지합니다. 카탈라제 용액은 며칠 동안 4 °C에서 보관 할 수 있습니다.
- 316 μL의 피라노스 산화용액, 카탈라제 용액 25μL, 50% 포도당 용액의 100 μL, 시스팀진 50μL, 사이클로오텐 5μL, β 메카포에탄솔 3.5 μL을 혼합하여 PALM 이미징 버퍼 500 μL을 준비하십시오. 피라노스 산화제와 카탈라제의 최종 촉매 활성은 각각 7.5 U, 35,00U가 되어야 합니다.
참고: PALM 이미징 버퍼는 3-5h에 최적의 이미징 조건을 제공합니다. 형광염의 깜박임 기능이 감소하면 새 버퍼 알리쿼트를 준비하십시오.
6. 팜 이미지 수집
- 사용 전에 현미경을 최소 3시간 켜고 열 평형을 허용하기 위해 이미징 전에 샘플을 실온으로 가져옵니다. 현미경이 인큐베이션 챔버를 장착한 경우 온도를 30°C로 조정합니다.
- 적절한 세척 용매를 사용하여 챔버 슬라이드의 목표와 바닥을 청소하십시오.
- 300 μL의 PALM 이미징 버퍼를 라벨이 부착된 셀의 한 웰에 넣고 챔버 슬라이드를 현미경의 스테이지 홀더에 삽입합니다.
- PALM 이미지 수집 매개 변수를 설정합니다.
- 인수시 1.57 N.A. 100배 의 석유 목표를 선택합니다.
- PALM 모드를 선택하고 TIRF 설정을 활성화합니다.
- 획득할 프레임 수를 조정합니다. 일반적으로 5, 000-10, 000 프레임은 최적의 결과를 얻기에 충분합니다. 그러나, 획득된 프레임의 수는 형광염의 라벨링 효율 및 깜박임 능력에 따라 크게 좌우되며 사용자가 조정할 수 있다.
- UV 레이저 전력을 0.1% 및 647 레이저로 0.2%로 설정합니다.
- 게인 레벨을 50-100으로 설정합니다.
- 레이저 조명을 켜고 대상 셀을 선택합니다. 신호 강도가 낮으면 게인 수준을 높일 수 있습니다(형광 라벨링에 따라 다름).
- 레이저 조명 끄기
- 팜 이미지 수집
- 게인을 0으로 줄이고 레이저 전력(ex 647)을 100%로 늘립니다.
- ~5s에 대한 대상 셀을 표백합니다.
- 이득을 50으로 늘리고 PALM 이미지 수집을 시작합니다.
참고: 과포화 픽셀을 피해야 하는 동안 충분한 신호 강도를 얻으려면 게인을 조정해야 합니다. 신호 강도가 감소하면 게인 레벨을 늘립니다.
- 선택적으로, 꾸준히 UV 레이저 전력을 향상 (0.1%-10%) 신호 강도를 높이고 불소조의 깜박임을 촉진합니다.
7. 팜 데이터 재구성
- 이미지 J 소프트웨어를 열고 PALM 데이터를 가져옵니다.
- 오픈 뇌우 플러그인 및"실행 분석"
- "카메라설정"메뉴에서픽셀 크기와 EM 게인을 입력합니다.
참고: 100x 목표와 1.6배배율 렌즈를 사용하는 경우 100nm 픽셀 크기가 적절합니다. 그러나 픽셀 크기는 PALM 이미징에 사용되는 현미경 및 카메라의 하드웨어 기능에 따라 달라지므로 사용자는 이 매개 변수를 주의 깊게 확인하고 조정해야 합니다. EM 게인 값은 메타데이터에서 얻을 수 있습니다. - "실행분석 메뉴"와같이 매개 변수를 설정 : B-스플래라인 순서 : 3, B-스플래라인 배율 : 2.0, 피크 강도 임계 값 : stf (Wave.F1), 피팅 반경 : 3, 초기 시그마 : 1.6, 배율 : 5.0, 업데이트 주파수 : 50, 측면 교대 : 2. 확인 "확인"
- "카메라설정"메뉴에서픽셀 크기와 EM 게인을 입력합니다.
- 재구성된 PALM 이미지의 사후 처리
- "플롯히스토그램"메뉴에서"시그마"매개 변수를 선택합니다.
- "사각형"도구를 사용하여 가능한 아티팩트를 제외한 ROI를 선택하고 필터에 ROI를 적용합니다. ROI 값은 필터 명령 상자에 나타납니다.
- ROI값에 "&불확실성 &25"를추가합니다. 가능한 필터 명령은 다음과 같습니다 : "(시그마 & 48.6821 & 시그마 & 1117.40) & 불확실성 & lt;25". 선택한 시그마 값을 적용합니다.
- "중복제거" 메뉴, "10 nm"의 거리 임계 값을 입력하고 적용합니다.
- "병합메뉴"에서최대 거리를 "20"로 설정하고 분자당 최대 프레임을 "0"으로 설정하고 최대 오프 프레임에서 "1"로 설정합니다. 설정을 적용합니다.
- "드리프트 보정 메뉴"에서교차 상관 관계를 선택하고 "5"와"배율"에서"5.0"으로"쓰레기통 수"를설정합니다. 드리프트 보정 설정을 적용합니다.
- 원하는 경우 최종 PALM 이미지를 저장하고 사후 처리 된 데이터를 내보냅니다.
8. 사마레 필라멘트의 분석
- 사컴레 길이 분석
- 이미지 J 소프트웨어를 열고 재구성된 PALM 이미지를 가져옵니다.
- z 디스크에 수직으로 선택한 사카필리 구조물 사이에 선을 그려 액티나 필라멘트 사이의 가장 짧은 거리를 측정합니다.
- """분석"메뉴에서"플롯 프로파일"을선택하고 두 피크 사이의 길이를 획득합니다. sarcomere 길이는 1개의 세포 안에 변화할 수 있기 때문에, 최소 20sarcomeres는 표적 세포의 다른 지역에서 측정되어야 합니다.
- z 디스크 두께 분석
- 이미지 J 소프트웨어를 열고 재구성된 PALM 이미지를 가져옵니다.
- 재구성된 PALM 이미지를 8비트 모드 이미지로 변환합니다.
- 능선 감지 플러그인을 열고 다음 매개 변수를 입력 : 라인 폭 : 20, 높은 대비 : 230, 낮은 대비 : 10, 시그마 : 0.79, 낮은 임계 값 : 25.84, 최소 라인 길이 : 20.
- "예상 폭","확장 선"및"표시 결과"를 설정합니다.
- 추가 분석을 위해 결과 표에서"확인"및 사용"평균 선 너비"를 사용합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
CM의 구조적 성숙 정도를 추정하기 위해 신생아, 완전 성숙한 성인 및 iPSC CM은 처음에 α 액틴 항체로 CM을 표시하여 사코메르 네트워크를 시각화했다. PALM 수집 후 이미지를 재구성하고 개별 필라멘트의 폭을 자동으로 감지하기 위해 플러그인 기반 이미지 처리 소프트웨어를 사용하여 z 디스크 두께를 측정했습니다. Sarcomere 길이는 인접한 필라멘트에 해당하는 두 개의 인접한 강도 피크 사이의 거리를 측정하여 계산되었습니다. 도 1은 iPSC 유래 CM에서 사컴레 조직의 평가를 나타낸다.
도 2A에제시된 바와 같이, iPSC-CM 및 신생아 세포는 불규칙하고 분리된 사코레 구조를 가진 유사한 α-액티닌 패턴을 나타내는 것으로 나타났다. 마찬가지로, 정량적 평가는 α 액티닌 필라멘트의 길이와 두께가 거의 동일하다는 것을 보여주었으며 이는 iPSC CM의 조기 발달 상태를 나타낸다. 보다 정밀하게, 평균 사코머 길이는 약 1.83 μm (성인 대 iPSC CM 대 신생아 CM: 1.91 ± 0.02 1.83 ± 0.049 μm 대. 1.82±0.03 μm, n=20 셀), z-디스크 두께는 약 74nm(성인 대 iPSC CM vs. 신생아 CM: 71.30 ± 1.64 vs. 73.95 ± 0.86 nm vs. 74.08 ± 0.12 nm,n=20셀)이었다. 대조적으로, 성인 성숙한 CM은 약간 증가 된 sarcomere 길이와 감소 z-디스크 두께와 일반 sarcomere 네트워크를 보였다.
종래의 공초점 영상및 PALM의 비교는 사코름길이(도 2C)의유의한 차이를 입증하지 못했다(공초점 대 손바닥: 1.75 ± 0.02 vs. 1.70 ± 0.02, n=10 세포). 그러나, iPSC-CM이 PALM이미징(도 2C)을실시했을 때 심오한 감소 z-디스크 두께가 검출되었다(공초점 대 손바닥: 224.71 ± 4.31 vs. 73.91 ± 1.31, n=10 세포). 대표적인 이미지는 PALM가 적용되었을 때 해상도의 게인을 강조 표시하며, 해당 강도플롯(그림 2D,E)에의해 지원됩니다. 전체 폭은 최대 최대 최대 의 전체 폭으로 계산된 것으로 나타났습니다 α 액티닌 구조는 표준 공초점 현미경검사법(그림 2E)에비해 PALM 이미지에서 ~3배 더 얇습니다.
PALM와 같은 단일 분자 국소화 현미경 검사는 회절 한계보다 훨씬 낮은 세포 내 구조를 검출할 수 있습니다. 최대 공간 해상도를 보장하기 위해 단일 분자 국소화를 정밀하게 감지하려면 적절한 이미징 조건이 필요합니다. 사용된 이미징 버퍼 시스템은 형광 염료의 광물리적 특성에 영향을 미치므로 최종 PALM 이미지의 전반적인 해상도 및 정확도에 큰 영향을 미치기 때문에 이 수집 프로세스에 매우 중요합니다. 이미징이 나오기 하루 전에 준비된 고품질 완충액과 버퍼 간의 비교는 필라멘트두께(그림 3A,B)의심오한 차이를 드러냈다. 낮은 품질의 버퍼로 획득한 Sarcomere 구조는 최적의 이미징 조건에 비해 두껍게보입니다(그림 3A). 실제로, 정량적 평가는 z-Disc 두께가 ~65%(고품질 대 저품질: 73.87 ± 1.02 nm 대 113.9 ± 1.33nm, n=155 필라멘트)(그림3B)에의해 증가한 것으로 나타났다. 이러한 데이터 정확도의 부족은 국소화 이벤트당 검출된 광자(높음 대 낮은 버퍼 품질: 29689 광자/이벤트 vs 16422 광자/이벤트)(그림 3C)의깜박임 특성감소로 인한 것이다. 또한, 악화된 이미징 조건(고품질 대 저품질: 14.25 ± 5.85 nm vs. 19.56 ± 6.7nm)에서 국소화 정밀도가 감소하여 재구성된 PALM이미지(그림 3C)의전체 해상도를 낮춥니다.
또한, 시료 드리프트는 예를 들어 열 불안정으로 인한 형광 분자의 정확한 국소화에 영향을 미치고 도 3D에제시된 바와 같이 흐릿한 이미지를 초래한다. 최적의 PALM 이미징은 명확하고 잘 정의된 강도 피크를 제공하지만 과도한 샘플 드리프트는 불규칙한 강도 패턴을 생성하여 인접한 두 필라멘트 사이의 거리를 정확하게 결정하기가 어렵습니다. 이러한 데이터는 단일 분자 국소화 현미경 검사법의 정밀하게 제어된 이미징 조건의 중요성을 강조하며, 수집 과정에서 미묘한 변화가 있어 이미지 품질과 데이터 정확도가 크게 저하될 수 있습니다.
그림 1: iPSC 유래 CM에서 사컴레 조직의 평가.
sarcomere 네트워크는 α 액티닌 항체로 형광으로 표시되었고 PALM 이미지 수집이 뒤따랐습니다. 후속 재구성은 정량 분석에 사용된 최종 PALM 이미지로 이어집니다. 개별 사커필레의 길이는 인접한 사커필레 필라멘트(1-5)에 대응하는 두 강도 피크 사이의 거리를 측정하여 결정하였다. Z-디스크 두께는 플러그인 기반 이미지 처리 도구에 의해 자동으로 계산되었습니다. 배율 막대 10 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: iPSC, 성인 및 신생아 심장 조직에서 파생된 CM의 z 디스크 두께 및 사카레 길이의 정량적 비교.
(A)iPSC 및 신생아 CM의 α 액티닌 네트워크의 재구성 된 PALM 이미지(B)정량적 평가는 모든 신생아및 사코머 길이에서 높은 유사성을 공유하는 것으로 나타났습니다 (성인 대 iPSC CM 대 신생아 CM: 1.91 ± 0.02 1.83 ± 0.82 μm vs. 1.82μm 및 1.820±.03 μm 의 개인 두께 iPSC CM vs. 신생아 CM: 71.30 ± 1.64 vs. 73.95 ± 0.86 nm vs. 74.08 ± 0.12 nm), iPSC CM.(C) 종래의 공초점 영상 및 팜 기반 데이터 수집 간의 사르코머 길이 및 z-Disc 두께비교를 나타낸다.C 사코레 길이는 피크-피크 거리를 측정하여 결정되었기 때문에 데이터 정확도에 대한 해상도 증가의 영향은 덜 두드러졌습니다(공초점 대 PALM: 1.75 ± 0.02 vs. 1.70 ± 0.02). 반면, 손바닥을 적용했을 때 z-디스크 두께가 현저히 낮았다(공초점 대 손바닥: 224.71 ± 4.31 vs. 73.91 ± 1.31). (D)공초점 및 PALM 이미징에 의해 얻어진 iPSC-CM의 대표적인 현미경 이미지. (E)(D)에 도시된 레드 라인에 대응하는 형광 강도 플롯. Values represent full width at half maximum of fluorescence intensity, indicating a profound increase of resolution in PALM images. 데이터는 평균 ± SEM, n=10-20 셀, 셀 당 20 sarcomeres를 평가한 평균으로 제시되었다. 통계적 유의성은 t학생 t-Test.p&0.005, 스케일 바 10 μm을 사용하여 결정되었습니다.
그림 3: 버퍼 품질과 샘플 드리프트가 데이터 정확도 및 안정성에 미치는 영향입니다.
(A)상이한 이미징 조건하에서 획득한 iPSC 유래 CM의 대표적인 PALM 이미지. Sarcomere 필라멘트는 낮은 품질의 버퍼로 이미지된 샘플에서 두껍게 나타납니다. 빨간색 선은 사컴레 길이의 대표적인 측정을 나타내고 녹색 필라멘트 구조는 z-Disc 분석에 포함되었습니다. (B)정량적 평가는 저품질 버퍼(high 대) 사이의 z-Disc 두께에서 상당한 차이를 확인하였다. 낮은 완충 품질: 73.87 ± 1.02 nm 대 113.9 ± 1.34 nm)(C)이미지 정확도의 차이는 불소의 깜박임 능력을 감소시켜 분자당 검출된 광자 수(높은 대 낮은 버퍼 품질: 29689 광자/이벤트 대 16422)를 감소시켰다. 동시에, 국소화 정밀도가 감소하여 전체 해상도(고완충율 대비 낮은 완충도 품질: 14.25 ± 5.85 vs. 19.56 ± 6.7)(D)마찬가지로 과도한 샘플 드리프트는 이미지 품질을 저하시킬 수 있다. 시료 드리프트없이 적절한 이미지 수집은 α 액티닌 필라멘트의 잘 정의 된 강도 피크를 초래하지만, 증가 된 샘플 드리프트는 비정기적 인 강도 패턴을 유발하여 sarcomere 길이의 정확한 분석에 강하게 영향을 미칩니다. 데이터는 SEM에 ± 155필라멘트를 분석한 것으로 나타났습니다. 통계적 유의성은 t학생 t-Test.를 사용하여 결정되었습니다. 10μm 의 Please click here to view a larger version of this figure. 척도 표시줄.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
시험관 내 기능성 iPSC 유래 CM의 생성은 재생 치료, 질병 모델링 및 약물 선별 플랫폼의 개발에 중요합니다. 그러나, 이러한 CM의 불충분 한 성숙은 심장 혈관 연구에서 주요장애물이다 20. 이와 관련하여 iPSC 유래 CM의 구조적 성숙 상태를 모니터링할 수 있는 고해상도 이미징 기술이 필요합니다. 동시에, 슈퍼 분해능 현미경 검사는 최근 티틴 및,트로포닌(10,10,21,22)에대해 입증된 바와 같이 적절한 사커메르 형성에 필요한 특정 단백질의 기능을 정확하게 분석하는 귀중한 도구가 될 수 있다.
현재 프로토콜에서는 α 액틴 사코메르 네트워크를 분석하여 iPSC CM의 구조적 성숙도를 정량적으로 평가하는 PALM 기반 접근법을 제시합니다.
기존의 광 현미경 검사법과 비교하여 PALM는 ~20-50 nm23의해상도로 세포 구조를 시각화할 수 있습니다. 따라서, 고전적인 광 현미경 접근법에 의해 거의 또는 검출할 수 없는 심장 사프로펠 네트워크의 미묘한 변화를 감지할 수 있습니다. 손바닥을 적용, 우리는 iPSC및 신생아 CM(도 2)에서~ 1.84 μm의 평균 사코머 길이를 측정했다. 이는 개별 사커머의 크기가 ~1.7-2.0 μm24,25,26임을보여주는 여러 이전 보고서와 일치한다. 사커길이에 비해, 그 크기가 빛 현미경 검사법의 고전적인 해상도 한계보다 훨씬 낮기 때문에 z 선의 두께에 대한 정확한 추정은 더 복잡합니다. 전자 현미경 검사를 사용하여, 이전 연구는 z-디스크 두께가 iPSC CM에서 50에서 80 nm범위, ~73 nm의 우리의 PALM 기반 검출과 유사하다는 것을 밝혔다(도 2).
표준 공초점 현미경 검사법과 비교하면 PALM이 적용되었을 때 해상도가 급격한 증가했습니다. 우리는 PALM 이미징(그림 2)에따라 3 배 낮은 z 디스크 두께를 발견했습니다. 그러나, 사컴레 길이에 대해 유의한 차이를 측정하지 못했다. 이 매개 변수는 강도 플롯의 피크-피크-피크 거리를 감지하여 측정되므로 해상도증가의 효과가 덜 두드러집니다.
이 높은 공간 해상도를 달성하기 위해 PALM는 사용자가 신중하게 해결해야 하는 잘 정의된 이미징 조건이 필요합니다. 단일 분자의 정확한 국소화를 위해, 형광은 특별한 광물리학적 특성을 가지고, 깜박이는27에게불린 형광과 어두운 상태 사이 급속한 전환을 가능하게 하는 필요합니다. 앞서 설명한 바와 같이, 형광의 선택은 이미지품질(28)에강하게 영향을 미칠 수 있다. 심오한 깜박임 능력은 단일 분자 국소화 현미경검사법 29,,30,31에가장 우수하고 널리 사용되는 염료 중 하나인 Alexa 647에 대해 설명되었다., 그러나 수많은 PALM 형광을 사용할 수 있기 때문에 사용자는 샘플 라벨링27,,28측면에서 높은 유연성을 갖게됩니다.
적합한 형광제의 선택 외에도 이미징 버퍼 시스템은 형광염의 광물리적 특성을 지시하기 때문에 PALM 이미징의 또 다른 중요한 점입니다. 피라노스 산화제를 혈당 산화제보다 우수하여 pH 안정성이 향상됨에 따라,32,33에걸쳐 불소소가 깜박이지 않고 장기간 이미징할 수 있도록 하는 산소 산화제를적용했다. 그러나 이미징 버퍼의 수명이 몇 시간으로 제한되기 때문에 높은 재현성을 보장하기 위해 각 실험에 대해 신선하게 준비해야 합니다. 우리의 결과는 낮은 품질의 버퍼와 PALM 이미징 다음 데이터 정확도의 극적인 감소를 보여 주며, 깜박임 기능 장애및 현지화 정밀도감소(그림 3A-C)로이어집니다.
더욱이, 이미징 시스템의 열 안정성은 증가된 견본 드리프트를 피하기 위하여 필수적입니다. 계산 해석에 의해 적당한 드리프트를 교정할 수 있지만 과도한 샘플 움직임은 검출된 형광의 잘못 계산된 현지화로 이어집니다. 이것은 PALM 화상 진찰을 시작하기 전에 가열 챔버와 각 견본의 충분한 열 평형을 가진 현미경및 충분한 열 평형을 사용하여 방지될 수 있습니다. 또한, 항체 단편 또는 나노체의 사용뿐만 아니라 밀도 및 효율을 라벨링하는 것은 이미징 조건34,,35,,36을최적화하는 것으로 간주되어야 한다.
대형 세포 구조의 획득 과정은 이미징 매개 변수(시야, 형광 프로브, 이미징 버퍼 등)에 따라 10-30분 정도 걸릴 수 있다. 이 긴 취득 시간은 살아있는 세포 화상 진찰에 적게 적당한 만드는 PALM의 결백입니다. 일반적으로 5.000-10.000 프레임은 국소화정밀도가 높은 깜박임 이벤트의 적절한 수를 달성하기 위해 캡처됩니다. 또한 이미징 깊이는 일반적으로 수백 나노미터로 제한되어 두꺼운 샘플을 조사하기가 어렵습니다. 그러나 z 방향의 향상된 해상도는 3D PALM설정(37)으로얻을 수 있다.
우리는 사코메르 길이 및 z-디스크 두께를 포함하여 iPSC CM의 α 액티닌 네트워크를 특성화하기 위해 두 가지 매개 변수를 선택했습니다. 추가 기능을 수집하여 필라멘트 방향과 같은 사컴레 스캐폴드를 보다 포괄적으로 볼 수 있습니다. 마찬가지로, 3D PALM는 네트워크 내의 현재 노드 및 분기를 추정하여 전체 sarcomere 구조를 정량적으로 분석하는 데 도움이 될 수 있습니다.
PALM은 sarcomere 구조의 매우 상세한 분석을 가능하게하지만,이 방법은 심장 성숙도를 평가하는 또 다른 중요한 기능인 세포 수축과 같은 기능적 매개 변수의 획득을 허용하지 않습니다. 이전 보고서는 sarcomere 구조의 현미경 기반 평가가 기능적데이터(38,,39)를얻기 위해 비디오 분석과 결합될 수 있음을 보여주었다. 그러나, 저자는 기존의 형광 현미경을 사용했기 때문에 SARcomere 구조에 대한 데이터를 얻은 것은 PALM와 비교하면 덜 정확하다. 또한 당사의 접근 방식은 PALM 데이터를 이전 타임랩스 기록과 상호 연관시킬 수 있으므로 수축 측정을 획득할 수 있습니다.
요약하자면, 본 프로토콜은 CM에서 sarcomere 네트워크의 구조적 성숙을 정량적으로 평가하는 방법을 제공한다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 연구는 EU 구조 기금 (ESF/14-BM-A55-0024/18)에 의해 지원되었다. 또한, H.L.은 로스토크 대학 의료 센터(889001 및 889003)와 요제프와 케테 클린츠 재단(T319/29737/2017)의 FORUN 프로그램에 의해 지원됩니다. C.I.L.은 로스토크 대학 의료 센터의 임상 과학자 프로그램에 의해 지원됩니다. R.D는 DFG(DA1296/6-1), DAMP 재단, 독일 심장 재단(F/01/12) 및 BMBF(VIP+ 00240)에 의해 지원됩니다.
우리는 iPSC 세포 배양및 심장 분화에 그녀의 기술 지원에 대한 마들렌 Bartsch 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| human iPSC cell line | Takara | Y00325 | |
| µ-Slide 8 Well Glass Bottom | ibidi | 80827 | |
| 0.5ml eppendorf tube | Eppendorf | 30121023 | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A906 | |
| Cardiomyocyte Dissociation Kit | Stem Cell Technologies | 05025 | |
| Catalase | Sigma Aldrich | C40-1G | |
| Cyclooctatetraene | Sigma Aldrich | 138924-1G | |
| Cysteamine | Sigma Aldrich | 30070-10g | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline without Ca2+ and Mg2+ | Thermo Fisher | 14190169 | |
| F(ab')2-Goat anti-Mouse IgG Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher | A-21237 | |
| Fiji image processing software (Image J) | |||
| Glucose | Carl Roth | X997.2 | |
| Hydrochloric acid | Sigma Aldrich | H1758 | |
| LSM 780 ELYRA PS.1 system | Zeiss | ||
| Paraformaldehyde | Merck | 8187150100 | |
| Pyranose oxidase | Sigma Aldrich | P4234-250UN | |
| sarcomeric α-actinin antibody [EA-53] | Abcam | ab9465 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S7653 | |
| sterile water | Carl Roth | 3255.1 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
| Trizma base | Sigma Aldrich | T1503 | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | 63689 |
References
- McAloon, C. J., et al. The changing face of cardiovascular disease 2000-2012: An analysis of the world health organisation global health estimates data. International Journal of Cardiology. 224, 256-264 (2016).
- Kussauer, S., David, R., Lemcke, H. hiPSCs Derived Cardiac Cells for Drug and Toxicity Screening and Disease Modeling: What Micro- Electrode-Array Analyses Can Tell Us. Cells. 8 (11), 1331 (2019).
- Ylä-Herttuala, S. iPSC-Derived Cardiomyocytes Taken to Rescue Infarcted Heart Muscle in Coronary Heart Disease Patients. Molecular Therapy. 26 (9), 2077 (2018).
- Kadota, S., Shiba, Y. Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocyte Transplantation for Heart Disease Treatment. Current Cardiology Reports. 21 (8), 73 (2019).
- Jiang, Y., Park, P., Hong, S. M., Ban, K. Maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells: Current strategies and limitations. Molecules and Cells. 41 (7), 613-621 (2018).
- Feric, N. T., Radisic, M. Maturing human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes in human engineered cardiac tissues. Advanced Drug Delivery Reviews. 96, 110-134 (2016).
- Ali, H., Braga, L., Giacca, M. Cardiac regeneration and remodelling of the cardiomyocyte cytoarchitecture. The FEBS Journal. 287 (3), 417-438 (2020).
- Yang, X., Pabon, L., Murry, C. E. Engineering adolescence: maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circulation Research. 114 (3), 511-523 (2014).
- Bedada, F. B., Wheelwright, M., Metzger, J. M. Maturation status of sarcomere structure and function in human iPSC-derived cardiac myocytes. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1863 (7), 1829-1838 (2016).
- Dai, Y., et al. Troponin destabilization impairs sarcomere-cytoskeleton interactions in iPSC-derived cardiomyocytes from dilated cardiomyopathy patients. Scientific Reports. 10 (1), 1-15 (2020).
- Huang, C. Y., et al. Enhancement of human iPSC-derived cardiomyocyte maturation by chemical conditioning in a 3D environment. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 138, 1-11 (2020).
- Ronaldson-Bouchard, K., et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).
- Lee, S., et al. Contractile force generation by 3D hiPSC-derived cardiac tissues is enhanced by rapid establishment of cellular interconnection in matrix with muscle-mimicking stiffness. Biomaterials. 131, 111-120 (2017).
- Baddeley, D., Bewersdorf, J. Biological Insight from Super-Resolution Microscopy: What We Can Learn from Localization-Based Images. Annual Review of Biochemistry. 87 (1), 965-989 (2018).
- Ovesný, M., Křížek, P., Borkovec, J., Švindrych, Z., Hagen, G. M. ThunderSTORM: A comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging. Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).
- Mahadev, K., Wu, X., Donnelly, S., Ouedraogo, R., Eckhart, A. D., Goldstein, B. J. Adiponectin inhibits vascular endothelial growth factor-induced migration of human coronary artery endothelial cells. Cardiovascular Research. 78 (2), 376-384 (2008).
- Lemcke, H., Skorska, A., Lang, C. I., Johann, L., David, R. Quantitative evaluation of the sarcomere network of human hiPSC-derived cardiomyocytes using single-molecule localization microscopy. International Journal of Molecular Sciences. 21 (8), 2819 (2020).
- Ackers-Johnson, M., et al. A simplified, langendorff-Free method for concomitant isolation of viable cardiac myocytes and nonmyocytes from the adult mouse heart. Circulation Research. 119 (8), 909-920 (2016).
- Lemcke, H., et al. Applying 3D-FRAP microscopy to analyse gap junction-dependent shuttling of small antisense RNAs between cardiomyocytes. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 98, 117-127 (2016).
- Karbassi, E., et al. Cardiomyocyte maturation: advances in knowledge and implications for regenerative medicine. Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).
- Krysiak, J., et al. Protein phosphatase 5 regulates titin phosphorylation and function at a sarcomere-associated mechanosensor complex in cardiomyocytes. Nature Communications. 9 (1), 1-14 (2018).
- Zaunbrecher, R. J., et al. Cronos Titin Is Expressed in Human Cardiomyocytes and Necessary for Normal Sarcomere Function. Circulation. 140 (20), 1647-1660 (2019).
- Fornasiero, E. F., Opazo, F. Super-resolution imaging for cell biologists. BioEssays. Fornasiero, E. F., Opazo, F. , Wiley Online Library. (2015).
- Jeziorowska, D., et al. Differential Sarcomere and Electrophysiological Maturation of Human iPSC-Derived Cardiac Myocytes in Monolayer vs. Aggregation-Based Differentiation Protocols. International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), 1173 (2017).
- Kroll, K., et al. Electro-mechanical conditioning of human iPSC-derived cardiomyocytes for translational research. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 130, 212-222 (2017).
- Zuppinger, C., et al. Characterization of cytoskeleton features and maturation status of cultured human iPSC-derived cardiomyocytes. European Journal of Histochemistry. 61 (2), 145-153 (2017).
- Jradi, F. M., Lavis, L. D. Chemistry of Photosensitive Fluorophores for Single-Molecule Localization Microscopy. ACS Chemical Biology. 14 (6), 1077-1090 (2019).
- Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nature Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).
- Lampe, A., Haucke, V., Sigrist, S. J., Heilemann, M., Schmoranzer, J. Multi-colour direct STORM with red emitting carbocyanines. Biology of the Cell. 104 (4), 229-237 (2012).
- Chamma, I., Levet, F., Sibarita, J. B., Sainlos, M., Thoumine, O. Nanoscale organization of synaptic adhesion proteins revealed by single-molecule localization microscopy. Neurophotonics. 3 (4), 041810 (2016).
- Ma, H., Fu, R., Xu, J., Liu, Y. A simple and cost-effective setup for super-resolution localization microscopy. Scientific Reports. 7 (1), 1-9 (2017).
- Olivier, N., Keller, D., Gönczy, P., Manley, S. Resolution Doubling in 3D-STORM Imaging through Improved Buffers. PLoS One. 8 (7), 0069004 (2013).
- Swoboda, M., et al. Enzymatic oxygen scavenging for photostability without ph drop in single-molecule experiments. ACS Nano. 6 (7), 6364-6369 (2012).
- Mikhaylova, M., et al. Resolving bundled microtubules using anti-tubulin nanobodies. Nature Communications. 6 (1), 1-7 (2015).
- Venkataramani, V., et al. Enhanced labeling density and whole-cell 3D dSTORM imaging by repetitive labeling of target proteins. Scientific Reports. 8 (1), 1-7 (2018).
- Erdélyi, M., et al. Origin and compensation of imaging artefacts in localization-based super-resolution microscopy. Methods. 88, 122-132 (2015).
- McGorty, R., Schnitzbauer, J., Zhang, W., Huang, B. Correction of depth-dependent aberrations in 3D single-molecule localization and super-resolution microscopy. Optics Letters. 39 (2), 275 (2014).
- Ribeiro, M. C., et al. A cardiomyocyte show of force: A fluorescent alpha-actinin reporter line sheds light on human cardiomyocyte contractility versus substrate stiffness. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 141, 54-64 (2020).
- Pioner, J. M., et al. Isolation and mechanical measurements of myofibrils from human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cell Reports. 6 (6), 885-896 (2016).
