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Biology

Analyse des α-Actinin-Netzwerks in humanen iPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten mittels Einzelmolekül-Lokalisierungsmikroskopie

Published: November 3, 2020 doi: 10.3791/61605
Automatic Translation
1,2, 1,2, 3, 1,2, 1,2
1Department of Cardiac Surgery, Reference and Translation Center for Cardiac Stem Cell Therapy (RTC), Rostock University Medical Center, 2Faculty of Interdisciplinary Research, Department Life, Light & Matter, University Rostock, 3Department of Cardiology, Rostock University Medical Center

Summary

Die Bildung eines richtigen Sarcomere-Netzwerks ist wichtig für die Reifung von iPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten. Wir präsentieren einen super Auflösungs-basierten Ansatz, der die quantitative Bewertung der strukturellen Reifung von Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten ermöglicht, um die Kulturbedingungen zu verbessern, die die Herzentwicklung fördern.

Abstract

Die Reifung von iPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten ist ein kritisches Thema für ihre Anwendung in der regenerativen Therapie, Medikamententests und Krankheitsmodellierung. Trotz der Entwicklung mehrerer Differenzierungsprotokolle bleibt die Erzeugung von iPSC-Kardiomyozyten, die einem erwachsenen Phänotyp ähneln, eine Herausforderung. Ein wichtiger Aspekt der Kardiomyozytenreifung ist die Bildung eines gut organisierten Sarcomere-Netzwerks, um eine hohe Kontraktionskapazität zu gewährleisten. Hier stellen wir einen super auflösungsbasierten Ansatz für die semiquantitative Analyse des α-Actinin-Netzwerks in Kardiomyozyten vor. Mit hilfe der photoaktivierten Lokalisationsmikroskopie wurde ein Vergleich der Sarkomelänge und der Z-Scheibendicke von iPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten und herzisolierten Herzzellen aus neonatalem Gewebe durchgeführt. Gleichzeitig zeigen wir, wie wichtig geeignete Bildgebungsbedingungen sind, um zuverlässige Daten zu erhalten. Unsere Ergebnisse zeigen, dass diese Methode geeignet ist, die strukturelle Reife von Herzzellen mit hoher räumlicher Auflösung quantitativ zu überwachen, was den Nachweis selbst subtiler Veränderungen der Sarcomere-Organisation ermöglicht.

Introduction

Herz-Kreislauf-Erkrankungen (CVD) wie Myokardinfarkt oder Kardiomyopathie bleiben die Haupttodesursache in der westlichen Welt1. Da das menschliche Herz nur über schlechte Regenerationsfähigkeit verfügt, bedarf es Strategien, um die Erholung von CVDs zu fördern. Dazu gehören Zellersatztherapien zur Auffüllung verlorener Kardiomyozyten (CM) sowie die Entwicklung neuer antiarrhythmischer Medikamente für eine effiziente und sichere pharmazeutische Intervention. Induzierte pluripotente Stammzelle (iPSC) haben sich als vielversprechende Zellquelle für die unbegrenzte Generierung von humanem CM in vitro erwiesen, geeignet für regenerative Therapien, Krankheitsmodellierung, und für die Entwicklung von Arzneimittel-Screening-Assays2,3,4.

Obwohl es viele verschiedene kardiale Differenzierungsprotokolle gibt, fehlt es iPSC-abgeleitetem CM noch immer an bestimmten phänotypischen und funktionellen Aspekten, die die In-vitro- und In-vivo-Anwendung behindern5,6. Neben elektrophysiologischen, metabolischen und molekularen Veränderungen beinhaltet der Herzreifungsprozess die strukturelle Organisation von Sarkomen, die die grundlegenden Einheiten sind, die für die Kraftgenerierung und Zellkontraktion erforderlich sind7. Während erwachsene CMs ein gut organisiertes kontraktiles Gerät aufweisen, zeigen iPSC-abgeleitete CMs häufig disarrangierte Sarcomere-Filamente, die mit einer reduzierten Kontraktionsfähigkeit und veränderten Kontraktionsdynamik8,9verbunden sind. Im Gegensatz zu reifen CM, die uniaxiale Kontraktionsmuster zeigen, führen die desorientierten Strukturen in unreifen CM zu einer radialen Kontraktion der ganzen Zelle oder fördern das Auftreten von Kontraktionsschwerpunkten9,10.

Zur Verbesserung der Herzreife wurden mehrere Ansätze angewendet, einschließlich 3D-Zellkulturmethoden, elektrische und mechanische Stimulation sowie die Verwendung extrazellulärer Matrizen, die in vivo Bedingungen11,12,13imitieren. Um den Erfolg und die Effizienz dieser verschiedenen Kulturbedingungen zu bewerten, sind Techniken erforderlich, um den Grad der strukturellen Reifung von iPSC CM zu überwachen und abzuschätzen, z. B. durch mikroskopische Techniken. Im Gegensatz zur herkömmlichen konfokalen Bildgebung ist die Auflösung bei der photoaktivierten Lokalisationsmikroskopie (PALM) etwa 10-fach höher. Diese Technik wiederum ermöglicht eine genauere Analyse, die auch subtile Veränderungen der zellulären Strukturen erkennt14. Unter Berücksichtigung der hohen Auflösung der PALM-basierten Bildgebung war das übergeordnete Ziel dieser Methode die mikroskopische Bewertung der Sarkomereife in iPSC-abgeleiteten CMs durch präzise Bestimmung der Z-Scheibendicke und Sarcomere-Länge. In früheren Studien haben sich diese strukturellen Merkmale als geeignete Parameter zur Beurteilung der Herzreife erwiesen15. Zum Beispiel, kranke iPSC-CM fehlt volle Länge Dystrophin zeigen reduzierte Sarcomere Länge und Z-Bandbreite Breite im Vergleich zu Wild-Typ-Zellen16. Ebenso wurde die Länge der einzelnen Sarkome gemessen, um die Auswirkungen topografischer Hinweise auf die Herzentwicklung zu untersuchen16. Daher haben wir diesen Ansatz angewandt, um die strukturelle Reifung des Sarcomere-Netzwerks in iPSC-CM zu bewerten, indem wir die Sarcomere-Länge und die Z-Scheibendicke quantitativ messen.

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Protocol

Alle Schritte in diesem Protokoll mit neonatalen und erwachsenen Mäusen wurden nach den ethischen Richtlinien für die Tierpflege des Universitätsklinikums Rostock durchgeführt.

1. Kultivierung und Dissoziation von iPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten

  1. Differenzieren Sie hiPSC-CMs 25 Tage lang mit einer 2D-Monolayer-Methode, wie zuvorbeschrieben 17.
  2. Vorwärmedissoziation Medium bis 37 °C und unterstützen mittlere raumtemperatur.
  3. Waschen Sie Zellen zweimal mit PBS.
  4. Vorgewärmtes Dissoziationsmedium zu zellen hinzufügen und 12 min bei 37 °C und 5%CO2brüten.
  5. Fügen Sie den Zellen ein Unterstützungsmedium hinzu.
    HINWEIS: Das Volumen des hinzugefügten Unterstützungsmediums muss doppelt so groß sein wie das Volumen des Dissoziationsmediums, das in Schritt 1.4 verwendet wird.
  6. Lösen Sie die Zellen mit einer 5 ml serologischen Pipette.
  7. Zentrifugenzellen bei 200 x g für 5 min und das Pellet in 3 ml hiPSC-CM Kulturmedium17wieder aufsetzen.
  8. Samenzellen in 8 Brunnenglasbodenkammern mit einer Zelldichte von 75.000 Zellen/Well und Kultur für 3 Tage.

2. Erwachsenen-Kardiomyozyten-Isolierung

  1. Isolation und Kultivierung von erwachsenen Kardiomyozyten von NMRI-Mäusen wurde durchgeführt, wie zuvor berichtet18.
  2. Samenzellen in 8 Brunnenglaskammer rutsche und Kultur für einen Tag.

3. Isolierung und Kultivierung von neonatalen Kardiomyozyten

  1. Isolationsverfahren von neonatalen Kardiomyozyten, die von NMRI-Mäusen erhalten wurden, wurde wie zuvorbeschrieben 19durchgeführt.
  2. Samen isolierte Zelle in 8 Gutglaskammer gleiten bei einer Zelldichte von 75.000 Zellen/ Well und Kultur für 3 Tage in neonatalen CM Kulturmedium19.

4. Immunofluoreszenzkennzeichnung des α-Actinin-Netzes

HINWEIS: Für optimale Ergebnisse werden Zellen in 8 Brunnenglasbodenkammern kultiviert. Die Etikettierung sollte einen Tag vor der Bildgebung erfolgen.

  1. Vorwärme 4% PFA bei 37 °C.
  2. Fix iPSC-CM durch Zugabe von 4% Paraformaldehyd direkt in die Kulturmedien (1:1 Verdünnung) und inkubieren bei 37 °C für 15 min. Die endgültige Konzentration von PFA für die Fixierung beträgt 2%.
  3. Inkubieren Sie feste Zellen in 0,2% Triton-X, in PBS verdünnt, für 5 min bei Raumtemperatur.
  4. Waschen Sie Zellen zweimal mit PBS, jeweils 5 min.
  5. 1% BSA-Lösung hinzufügen (in PBS verdünnt) und 60 min bei Raumtemperatur brüten.
  6. Bereiten Sie 150 l primäre Antikörperlösung vor, indem Sie α-Actinin-Antikörper 1:100 in 1% BSA verdünnen, der 0,05% Triton-X enthält. Zu den Zellen hinzufügen und bei Raumtemperatur 60 min brüten.
  7. Waschen Sie Zellen zweimal mit 0,2% BSA-Lösung, jeweils 5 min.
  8. Bereiten Sie 150 l Sekundärantikörperlösung vor, indem Sie den Ziegen-Anti-Maus-Antikörper Alexa647 1:100 in 1% BSA verdünnen, der 0,05% Triton-X enthält. Zu den Zellen geben und bei Raumtemperatur 40 min brüten.
  9. Waschen Sie Zellen zweimal mit 0,2% BSA-Lösung, jeweils 5 min.
  10. Waschen Sie Zellen zweimal mit PBS, jeweils 5 min. Beschriftete Zellen bei 4 °C bei 4 °C bis zur PALM-Bildgebung im Dunkeln halten.

5. Vorbereitung des PALM-Bildgebungspuffers

HINWEIS: Es ist wichtig, den PALM-Bildgebungspuffer für jedes Experiment neu vorzubereiten.

  1. Bereiten Sie 50% Glukoselösung vor, indem Sie 25 g Glukose in 50 ml destilliertem Wasser auflösen.
  2. Bereiten Sie einen Basispuffer mit 50 mM Tris-HCl, 10% Glukose und 10 mM Natriumchlorid vor.
    1. Stellen Sie den pH-Wert mit Salzsäure auf 8,0 an.
  3. Bereiten Sie die Pyranoseoxidase-Lösung vor, indem Sie 0,6 mg Pyranoseoxidase in 316 l Grundpuffer auflösen.
  4. Bereiten Sie die Kataalaselösung vor, indem Sie 7 mg Katanasain in 500 l Grundpuffer auflösen. Gründlich mischen und zentrifugieren bei 10.000 x g für 3 min. Halten Sie den Überstand für die weitere Verwendung. Die Katasselösung kann mehrere Tage bei 4 °C aufbewahrt werden.
  5. Bereiten Sie 500 l PALM-Bildgebungspuffer vor, indem Sie 316 L Pyranoseoxidase-Lösung, 25 l Kataalaselösung, 100 l 50% Glukoselösung, 50 l Cysteamin, 5 l Cyclooctatetraen und 3,5 l β-Mercaptoethanol mischen. Die letzte katalytische Aktivität von Pyranoseoxidase und Kataalase muss 7,5 U bzw. 35,00 U betragen.
    HINWEIS: Der PALM-Bildgebungspuffer bietet optimale Bildbedingungen für 3-5 h. Wenn die Blinkfähigkeit des Fluoreszenzfarbstoffs abnimmt, bereiten Sie einen neuen Puffer aliquot vor.

6. PALM Bildaufnahme

  1. Schalten Sie das Mikroskop vor Gebrauch mindestens 3 h ein und bringen Sie die Probe vor der Bildgebung auf Raumtemperatur, um eine thermische Gleichgewichtslösung zu ermöglichen. Wenn das Mikroskop mit einer Inkubationskammer ausgestattet ist, stellen Sie die Temperatur auf 30 °C ein.
  2. Reinigen Sie das Objektiv und den Boden des Kammerschlittens mit einem geeigneten Reinigungslösungsmittel.
  3. Fügen Sie 300 L PALM-Bildgebungspuffer in einen Brunnen beschrifteter Zellen ein und legen Sie das Kammerschlitten in den Bühnenhalter des Mikroskops ein.
  4. Legen Sie die PALM-Bildaufnahmeparameter fest.
    1. Wählen Sie 1.57 N.A. 100x Ölziel für den Erwerb.
    2. Wählen Sie den PALM-Modus und aktivieren Sie die TIRF-Einstellungen.
    3. Passen Sie die Anzahl der zu erwerbenden Frames an. Normalerweise reichen 5 000-10 000 Rahmen aus, um optimale Ergebnisse zu erzielen. Die Anzahl der erworbenen Rahmen hängt jedoch stark von der Etikettierungseffizienz und der Blinkfähigkeit des Fluoreszenzfarbstoffs ab und kann vom Benutzer angepasst werden.
    4. Stellen Sie die UV-Laserleistung auf 0,1% und 647 Laser auf 0,2% ein.
    5. Legen Sie die Verstärkungsstufe auf 50-100 fest.
    6. Schalten Sie die Laserbeleuchtung ein und wählen Sie eine Zielzelle aus. Der Verstärkungsgrad kann erhöht werden, wenn die Signalintensität zu niedrig ist (abhängig von der Fluoreszenzkennzeichnung).
    7. Laserbeleuchtung ausschalten
  5. PALM Bildaufnahme
    1. Reduzieren Sie den Gewinn auf 0 und erhöhen Sie die Laserleistung (ex 647) auf 100%.
    2. Bleichen Sie die Zielzelle für 5 s.
    3. Erhöhen Sie den Gewinn auf 50 und starten Sie die PALM-Bildaufnahme.
      HINWEIS: Gain muss angepasst werden, um eine ausreichende Signalintensität zu erhalten, während übersättigte Pixel vermieden werden sollten. Wenn die Signalintensität abnimmt, erhöhen Sie den Verstärkungsgrad.
  6. Optional die UV-Laserleistung stetig steigern (0,1%-10%) die Signalintensität zu erhöhen und das Blinken des Fluorophors zu fördern.

7. Rekonstruktion der PALM-Daten

  1. Öffnen Sie die Image J-Software und importieren Sie PALM-Daten.
  2. Open Thunderstorm Plugin und "Run analysis"
    1. Geben Sie im Menü"Kamera-Setup" Pixelgröße und EM-Verstärkung ein.
      HINWEIS: Bei Verwendung von 100x Objektiven und 1,6-facher Vergrößerungslinse ist eine Pixelgröße von 100 nm geeignet. Da die Pixelgröße jedoch von den Hardware-Features des Mikroskops und der Kamera abhängt, die für die PALM-Bildgebung verwendet werden, müssen Benutzer diesen Parameter sorgfältig überprüfen und anpassen. EM-Verstärkungswerte können aus den Metadaten abgerufen werden.
    2. Im Menü"Laufzeitanalyse" parametern wie folgt einstellen: B-Spline-Reihenfolge: 3, B-Spline-Skala: 2,0, Spitzenintensitätsschwelle: stf(Wave.F1), Anpassungsradius: 3, Anfangssigma: 1,6, Vergrößerung: 5,0, Aktualisierungsfrequenz: 50, Seitenverschiebungen: 2. Bestätigen Sie, indem Sie auf die Schaltfläche "Ok" klicken.
  3. Nachbearbeitung des rekonstruierten PALM-Bildes
    1. Wählen Sie im Menü "Plot histogram" den Parameter "Sigma" aus.
    2. Verwenden Sie das Werkzeug "Rechteck", um einen ROI auszuwählen, ohne mögliche Artefakte, und wenden Sie den ROI auf den Filter an. ROI-Werte werden im Filterbefehlsfeld angezeigt.
    3. Fügen Sie den ROI-Werten "& uncertainty <25" hinzu. Ein möglicher Filterbefehl sieht wie folgt aus: "(sigma > 48.6821 & sigma < 1117.40) & uncertainty <25". Wenden Sie ausgewählte Sigma-Werte an.
    4. Geben Sie im Menü "Duplikateentfernen " einen Abstandsschwellenwert von "10 nm" ein und wenden Sie ihn an.
    5. Im"Merging-Menü" legen Sie den maximalen Abstand auf "20", maximale Frames pro Molekül auf "0" und maximale Off-Frames auf "1" fest. Wenden Sie Einstellungen an.
    6. Wählen Sie im "Drift-Korrekturmenü" Kreuzkorrelation aus und setzen Sie "Anzahl der Abschnitte" auf "5" und "Vergrößerung" auf "5.0". Wenden Sie Driftkorrektureinstellungen an.
    7. Speichern Sie das endgültige PALM-Bild und exportieren Sie die nachgestellten Daten, falls gewünscht.

8. Analyse von Sarcomere-Filamenten

  1. Analyse der Sarcomere-Länge
    1. Öffnen Sie die Image J-Software und importieren Sie das rekonstruierte PALM-Image.
    2. Zeichnen Sie eine Linie zwischen ausgewählten Sarcomere-Strukturen senkrecht zur Z-Scheibe, um den kürzesten Abstand zwischen Denakin-Filamenten zu messen.
    3. Wählen Sie "Plotprofil" im Menü "Analysieren" und erfassen Sie die Länge zwischen zwei Spitzen. Da die Sarkome-Länge innerhalb einer Zelle variieren kann, sollten mindestens 20 Sarkome in verschiedenen Bereichen der Zielzelle gemessen werden.
  2. Analyse der Z-Scheibendicke
    1. Öffnen Sie die Image J-Software und importieren Sie das rekonstruierte PALM-Image.
    2. Konvertieren Sie das rekonstruierte PALM-Bild in ein 8-Bit-Modusbild.
    3. Öffnen Sie das Graterkennungs-Plugin und geben Sie die folgenden Parameter ein: Linienbreite: 20, hoher Kontrast: 230, niedriger Kontrast: 10, Sigma: 0,79, unterer Schwellenwert: 25,84, minimale Linienlänge: 20.
    4. Legen Sie "Estimate width", "Extend line" und " Displayresults" fest.
    5. Klicken Sie auf "Ok" und verwenden Sie "Mittlere Linienbreite" aus der Ergebnistabelle für weitere Analysen.

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Representative Results

Zur Schätzung des Grades der strukturellen Reifung von CM wurden neonatale, vollreife Erwachsene und iPSC CM zunächst als CM mit α-Actinin-Antikörper nazierend, um das Sarcomere-Netzwerk zu visualisieren. Nach der PALM-Erfassung wurden Bilder rekonstruiert und die Z-Scheibendicke mit einer Plugin-basierten Bildverarbeitungssoftware zur automatischen Erfassung der Breite einzelner Filamente gemessen. Die Sarcomere-Länge wurde berechnet, indem der Abstand zwischen zwei benachbarten Intensitätsspitzen gemessen wurde, der benachbarten Filamenten entspricht. Abbildung 1 zeigt die Auswertung der Sarcomere-Organisation in iPSCs-abgeleitetem CM.

Wie in Abbildung 2Adargestellt, zeigten iPSC-CM und neonatale Zellen ein ähnliches α-Aktinin-Muster mit unregelmäßigen, disarrangierten Sarcomere-Strukturen. Ebenso ergab die quantitative Bewertung, dass Länge und Dicke von α-Actinin-Filamenten nahezu identisch waren, was auf einen vorzeitigen Entwicklungszustand von iPSC CM hindeutet. Genauer gesagt betrug die durchschnittliche Sarkome-Länge etwa 1,83 m (Erwachsene vs. iPSC CM vs. neonatale CM: 1,91 ± 0,02 1,83 ± 0,049 m vs. 1,82±0,03 m, n=20 Zellen), während die Z-Scheibendicke etwa 74 nm betrug (Adult vs. iPSC CM vs. neonatale CM: 71,30 ± 1,64 vs. 73,95 ± 0,86 nm vs. 74,08 ± 0,12 nm, n=20 Zellen) (Abbildung 2B). Im Gegensatz dazu zeigte erwachsene reife CM ein regelmäßiges Sarcomere-Netzwerk mit leicht erhöhter Sarcomere-Länge und reduzierter Z-Disc-Dicke.

Der Vergleich der konventionellen konfokalen Bildgebung und PALM zeigte keinen signifikanten Unterschied der Sarkomelänge (Abbildung 2C) (konfokale vs. PALM: 1,75 ± 0,02 vs. 1,70 ± 0,02, n=10 Zellen). Bei der BILD-Bildgebung von iPSC-CM(Abbildung 2C) wurde jedoch eine deutlich reduzierte Z-Scheibendicke festgestellt (konfokale vs. PALM: 224,71 ± 4,31 vs. 73,91 ± 1,31, n=10 Zellen). Repräsentative Bilder heben die Auflösungssteigerung bei der Anwendung von PALM hervor, unterstützt durch entsprechende Intensitätsdiagramme(Abbildung 2D,E). Berechnete volle Breite bei der halben maximalen Fluoreszenzintensität ergab, dass α-Actinin-Strukturen in PALM-Bildern im Vergleich zur Standard-Konfokalmikroskopie um das 3-fache dünner sind(Abbildung 2E).

Die Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie, wie PALM, ermöglicht den Nachweis intrazellulärer Strukturen weit unterhalb der Beugungsgrenze. Um eine maximale räumliche Auflösung zu gewährleisten, sind geeignete bildgebende Bedingungen für den präzisen Nachweis der Lokalisierung einzelner Moleküle erforderlich. Das verwendete bildgebende Puffersystem ist für diesen Erfassungsprozess von entscheidender Bedeutung, da es die photophysikalischen Eigenschaften des Fluoreszenzfarbstoffs beeinflusst und somit einen erheblichen Einfluss auf die Gesamtauflösung und Genauigkeit des endgültigen PALM-Bildes hat. Der Vergleich zwischen hochwertigem Puffer und Puffer, der einen Tag vor der Bildgebung erstellt wurde, ergab einen tiefen Unterschied in der Filamentdicke (Abbildung 3A,B). Sarcomere-Strukturen, die mit einem Puffer niedriger Qualität erworben wurden, scheinen im Vergleich zu optimalen Bildbedingungen dicker zu sein (Abbildung 3A). Tatsächlich zeigte die quantitative Bewertung, dass die Z-Scheibendicke um 65 % erhöht wurde (hohe Qualität vs. niedrige Qualität: 73,87 ± 1,02 nm vs. 113,9 ± 1,33 nm, n=155 Filamente) (Abbildung 3B). Dieser Mangel an Datengenauigkeit ist auf reduzierte Blinkeigenschaften des Fluorophors zurückzuführen, was zu weniger erkannten Photonen pro Lokalisierungsereignis führt (hohe vs. niedrige Pufferqualität: 29689 Photonen/Ereignis vs. 16422 Photonen/Ereignisse) (Abbildung 3C). Darüber hinaus wird die Lokalisierungsgenauigkeit unter verschlechterten Bildgebungsbedingungen verringert (hohe Qualität vs. niedrige Qualität: 14,25 ± 5,85 nm vs. 19,56 ± 6,7 nm), was die Gesamtauflösung des rekonstruierten PALM-Bildes senkt (Abbildung 3C).

Darüber hinaus kann die Probendrift, z. B. durch thermische Instabilität, die genaue Lokalisierung fluoreszierender Moleküle beeinflussen und zu verschwommenen Bildern führen, wie in Abbildung 3Ddargestellt. Während eine optimale PALM-Bildgebung klare und klar definierte Intensitätsspitzen liefert, erzeugt übermäßige Probendrift ein unregelmäßiges Intensitätsmuster, das es schwierig macht, den Abstand zwischen zwei benachbarten Filamenten genau zu bestimmen. Diese Daten unterstreichen die Bedeutung streng kontrollierter bildgebender Bedingungen in der Einzelmolekül-Lokalisierungsmikroskopie, da selbst subtile Veränderungen während des Erfassungsprozesses die Bildqualität und Datengenauigkeit drastisch verringern können.

Figure 1
Abbildung 1: Bewertung der Sarcomere-Organisation in iPSCs-abgeleitetem CM.
Das Sarcomere-Netzwerk wurde fluoreszierend mit einem α-Actinin-Antikörper gekennzeichnet, gefolgt von der PALM-Bildaufnahme. Die nachfolgende Rekonstruktion führt zum endgültigen PALM-Bild, das für die quantitative Analyse verwendet wurde. Die Länge der einzelnen Sarkome wurde durch Messung des Abstands zwischen zwei Intensitätsspitzen bestimmt, die benachbarten Sarcomere-Filamenten (1-5) entsprechen. Die Z-Disc-Dicke wurde automatisch durch ein Plugin-basiertes Bildverarbeitungstool berechnet. Maßstab bar 10 'm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Quantitativer Vergleich der Z-Scheibendicke und Sarkomelänge in CM, abgeleitet von iPSCs, Erwachsenen- und neonatalen Herzgewebe.
(A) Rekonstruierte PALM-Bilder des α-Actinin-Netzwerks von iPSC und neonatalem CM. (B) Quantitative Beurteilung ergab, dass alle neonatalen und aufweisenden hochwertigen Ähnlichkeiten in der Sarkome-Länge (Erwachsene vs. iPSC CM vs. neonatale CM: 1,91 ± 0,02 1,83 ± 0,049 m vs. 1,82±0,03 m) und dicke einzelne Filamente (Erwachsene vs. iPSC CM vs. neonatale CM: 71,30 ± 1,64 vs. 73,95 ± 0,86 nm vs. 74,08 ± 0,12 nm), was auf den vorzeitigen Phänotyp von iPSC CM hindeutet. (C) Vergleich der Sarkomelänge und der Z-Scheibendicke zwischen konventioneller konfokaler Bildgebung und PALM-basierter Datenerfassung. Da die Sarkomelänge durch Messung der Peak-to-Peak-Entfernung bestimmt wurde, war der Einfluss einer erhöhten Auflösung auf die Datengenauigkeit weniger ausgeprägt (konfokale vs. PALM: 1,75 ± 0,02 vs. 1,70 ± 0,02). Im Gegensatz dazu wurde bei der Anwendung von PALM eine deutlich geringere Z-Scheibendicke festgestellt (konfokale vs. PALM: 224,71 ± 4,31 gegenüber 73,91 ± 1,31). (D) Repräsentative mikroskopische Bilder von iPSC-CM, die durch konfokale und PALM-Bildgebung gewonnen werden. (E) Fluoreszenzintensitätsdiagramme, die der roten Linie entsprechen, die in (D) dargestellt ist. Die Werte stellen die volle Breite bei der Hälfte der Fluoreszenzintensität dar, was auf eine tiefgreifende Erhöhung der Auflösung in PALM-Bildern hindeutet. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM, n=10-20 Zellen dargestellt, 20 Sarkome pro Zelle wurden ausgewertet. Die statistische Signifikanz wurde anhand von Studenten t-Test bestimmt. **p<0.005, Scale bar 10 'm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Auswirkungen der Pufferqualität und der Stichprobendrift auf die Datengenauigkeit und -zuverlässigkeit.
(A) Repräsentative PALM-Bilder von iPSC-abgeleitetem CM, die unter verschiedenen bildgebenden Bedingungen aufgenommen wurden. Sarcomere Filamente erscheinen dicker in Proben, die mit Puffer von geringer Qualität abgebildet wurden. Rote Linien zeigen eine repräsentative Messung der Sarkomelänge an, während grüne Filamentstrukturen in die Z-Disc-Analyse einbezogen wurden. (B) Quantitative Auswertung bestätigte einen signifikanten Unterschied in der Z-Scheibendicke zwischen niedrig- und qualitativ hochwertigem Puffer (hoch vs. geringe Pufferqualität: 73,87 ± 1,02 nm vs. 113,9 ± 1,34 nm) (C) Dieser Unterschied in der Bildgenauigkeit beruhte auf einer reduzierten Blinkfähigkeit des Fluorophors, was zu einer reduzierten Anzahl von nachgewiesenen Photonen pro Molekül führte (hohe vs. niedrige Pufferqualität: 29689 Photonen/Ereignis vs. 16422 Photonen/Ereignisse). Gleichzeitig verringerte sich die Lokalisierungsgenauigkeit, was wiederum die Gesamtauflösung verringerte (hohe vs. niedrige Pufferqualität: 14,25 ± 5,85 vs. 19,56 ± 6,7) (D) Ebenso kann übermäßige Probendrift die Bildqualität beeinträchtigen. Während eine korrekte Bildaufnahme ohne Probendrift zu genau definierten Intensitätsspitzen von α-Actinin-Filamenten führt, provoziert eine erhöhte Probendrift ein unregelmäßiges Intensitätsmuster, das die genaue Analyse der Sarcomere-Länge stark beeinflusst. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM dargestellt. 155 Filamente wurden analysiert. Die statistische Signifikanz wurde anhand von Schülern t-Test bestimmt. ****p<0.0001. Maßstab bar 10'm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Discussion

Die Generierung funktioneller iPSC-abgeleiteter CM in vitro ist wichtig für regenerative Therapien, Die Krankheitsmodellierung und die Entwicklung von Arzneimittel-Screening-Plattformen. Jedoch, unzureichende Reife dieser CM ist ein großes Hindernis in der kardiovaskulären Forschung20. In diesem Zusammenhang sind hochauflösende Bildgebungstechniken erforderlich, die die Überwachung des strukturellen Reifungszustands von iPSC-abgeleitetem CM ermöglichen. Gleichzeitig kann die Superauflösungsmikroskopie ein wertvolles Werkzeug sein, um die Funktion bestimmter Proteine genau zu analysieren, die für eine richtige Sarkomebildung erforderlich sind, wie kürzlich für Titin und Troponin10,21,22gezeigt wurde.

Im aktuellen Protokoll stellen wir einen PALM-basierten Ansatz zur quantitativen Bewertung der strukturellen Reifung von iPSC CM vor, indem wir das α-Actinin-Sarcomere-Netzwerk analysieren.

Im Vergleich zur herkömmlichen Lichtmikroskopie ermöglicht PALM die Visualisierung zellulärer Strukturen mit einer Auflösung von 20-50 nm23. So ermöglicht es auch subtile Veränderungen des Herzsarcomere-Netzwerks, die durch klassische Lichtmikroskopie-Ansätze kaum oder gar nachweisbar sind. Bei Anwendung von PALM haben wir eine durchschnittliche Sarkome-Länge von 1,84 m in iPSC und neonatalem CM gemessen (Abbildung 2). Dies steht im Einklang mit mehreren früheren Berichten, aus denen hervorgeht, dass die Größe der einzelnen Sarkome 1,7-2,0 m24,25,26beträgt. Im Vergleich zur Sarcomere-Länge ist eine genaue Abschätzung der Dicke von Z-Linien komplizierter, da ihre Größe weit unter der klassischen Auflösungsgrenze der Lichtmikroskopie liegt. Mit Hilfe der Elektronenmikroskopie ergaben frühere Studien, dass die Z-Scheibendicke in iPSC CM zwischen 50 und 80 nm liegt, was unserem PALM-basierten Nachweis von 73 nm(Abbildung 2) ähnelt.

Der Vergleich mit der standardkonfokalen Mikroskopie zeigte die dramatische Zunahme der Auflösung bei der Anwendung von PALM. Wir fanden eine 3-fach niedrigere Z-Disc Dicke, nach PALM-Bildgebung (Abbildung 2). Für die Sarcomere-Länge wurde jedoch kein signifikanter Unterschied gemessen. Da dieser Parameter durch DieErkennung des Peak-to-Peak-Abstands von Intensitätsdiagrammen gemessen wird, ist der Effekt einer erhöhten Auflösung weniger ausgeprägt.

Um diese hohe räumliche Auflösung zu erreichen, benötigt PALM gut definierte Bildbedingungen, die vom Benutzer sorgfältig behandelt werden müssen. Für eine genaue Lokalisierung einzelner Moleküle werden Fluorophore benötigt, die besondere photophysikalische Eigenschaften besitzen und ein schnelles Umschalten zwischen fluoreszierendem und dunklem Zustand ermöglichen, das sogenannte Blinken27. Wie bereits gezeigt, kann die Auswahl von Fluorophoren die Bildqualität stark beeinflussen28. Eine profunde Blinkfähigkeit wurde für Alexa 647 beschrieben, eine der besten und am weitesten verbreiteten Farbstoffe für die Einzelmolekül-Lokalisierungsmikroskopie29,30,31. Da jedoch zahlreiche PALM-Fluorophore zur Verfügung stehen, haben die Anwender eine hohe Flexibilität in Bezug auf die Probenkennzeichnung27,28.

Neben der Auswahl geeigneter Fluorophore ist das bildgebende Puffersystem ein weiterer kritischer Punkt in der PALM-Bildgebung, da es die photophysikalischen Eigenschaften des Fluoreszenzfarbstoffs diktiert. Wir haben Pyranoseoxidase als Sauerstofffängersystem angewendet, das der Glukoseoxidase überlegen ist, da es eine erhöhte pH-Stabilität bietet, was eine langfristige Bildgebung ohne eine signifikante Abnahme des Fluorophors ermöglicht, das im Laufe der Zeit32,33blinkt. Da jedoch die Lebensdauer des Bildgebungspuffers auf mehrere Stunden begrenzt ist, muss er für jedes Experiment frisch vorbereitet werden, um eine hohe Reproduzierbarkeit zu gewährleisten. Unsere Ergebnisse zeigen eine drastische Abnahme der Datengenauigkeit nach PALM-Bildgebung mit niedrigem Puffer, was zu einer beeinträchtigten Blinkfähigkeit und einer verringerten Lokalisierungsgenauigkeit führt (Abbildung 3A-C).

Darüber hinaus ist die thermische Stabilität des Bildgebungssystems obligatorisch, um eine erhöhte Probendrift zu vermeiden. Während moderate Drift durch Rechenanalyse korrigiert werden kann, führt übermäßige Probenbewegung zu einer falsch berechneten Lokalisierung erkannter Fluorophore und reduziert die Bildqualität und Datengenauigkeit. Dies kann durch den Einsatz von Mikroskopen mit Heizkammern und einer ausreichenden thermischen Auswägung der jeweiligen Probe vor Beginn der PALM-Bildgebung verhindert werden. Darüber hinaus sollten Die Kennzeichnungsdichte und -effizienz sowie die Verwendung von Antikörperfragmenten oder Nanokörpern in Betracht gezogen werden, um die bildgebenden Bedingungen34,35,36zu optimieren.

Der Erfassungsprozess großer zellulärer Strukturen kann je nach Bildparametern (Sichtfeld, Fluoreszenzsonde, Bildgebungspuffer usw.) 10-30 min dauern. Diese lange Erfassungszeit ist ein Nachteil von PALM, was es weniger geeignet für die Live-Zell-Bildgebung macht. In der Regel werden 5.000-10.000 Frames erfasst, um eine ausreichende Anzahl von blinkenden Ereignissen mit hoher Lokalisierungsgenauigkeit zu erreichen. Außerdem ist die Bildtiefe in der Regel auf wenige hundert Nanometer begrenzt, was die Untersuchung dickerer Proben erschwert. Eine verbesserte Auflösung in Z-Richtung kann jedoch mit einem 3D PALM Setup37erreicht werden.

Wir haben zwei Parameter ausgewählt, um das α-Actinin-Netzwerk von iPSC CM zu charakterisieren, einschließlich Sarcomere-Länge und Z-Disc-Dicke. Zusätzliche Funktionen könnten gesammelt werden, um einen umfassenderen Blick auf das Sarcomere-Gerüst zu erhalten, wie z. B. die Filamentausrichtung. Ebenso kann 3D PALM helfen, die gesamte Sarcomere-Struktur quantitativ zu analysieren, indem man die vorhandenen Knoten und Zweige innerhalb des Netzwerks schätzt.

Obwohl PALM eine sehr detaillierte Analyse der Sarkome-Struktur ermöglicht, erlaubt diese Methode nicht die Erfassung von funktionellen Parametern wie Zellkontraktilität, was ein weiteres wichtiges Merkmal zur Beurteilung der Herzreife ist. Frühere Berichte haben gezeigt, dass die mikroskopische Bewertung der Sarkomestruktur mit einer Videoanalyse kombiniert werden kann, um funktionelle Daten zu erhalten38,39. Da die Autoren jedoch die herkömmliche Fluoreszenzmikroskopie verwendet haben, sind die erhaltenen Daten über die Sarkomestruktur im Vergleich zu PALM weniger genau. Unser Ansatz bietet auch die Möglichkeit, PALM-Daten mit früheren Zeitrafferaufzeichnungen zu korrelieren und ermöglicht somit die Erfassung von Kontraktionsmessungen.

Zusammenfassend bietet dieses Protokoll eine Methode zur quantitativen Bewertung der strukturellen Reifung des Sarcomere-Netzwerks in CM. Mit diesem Super-Resolution-basierten Ansatz können Strategien entwickelt werden, die auf eine verbesserte kardiale Entwicklung von iPSC-abgeleitetem CM abzielen, um einen erwachseneren Phänotyp zu erhalten.

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Disclosures

Die Autoren erklären keinen Interessenkonflikt.

Acknowledgments

Diese Studie wurde vom EU-Strukturfonds (ESF/14-BM-A55-0024/18) unterstützt. Darüber hinaus wird H.L. durch das FORUN-Programm des Universitätsklinikums Rostock (889001 und 889003) und die Josef und Käthe Klinz Stiftung (T319/29737/2017) unterstützt. C.I.L. wird vom Clinician Scientist Program des Universitätsklinikums Rostock unterstützt. Gefördert wird die R.D. von der DFG (DA1296/6-1), der DAMP-Stiftung, der Deutschen Herzstiftung (F/01/12) und dem BMBF (VIP+ 00240).

Wir danken Madeleine Bartsch für ihre technische Unterstützung bei der iPSC-Zellkultur und der Herzdifferenzierung.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
human iPSC cell line Takara Y00325
µ-Slide 8 Well Glass Bottom ibidi 80827
0.5ml eppendorf tube Eppendorf 30121023
Bovine serum albumin Sigma Aldrich A906
Cardiomyocyte Dissociation Kit Stem Cell Technologies 05025
Catalase Sigma Aldrich C40-1G
Cyclooctatetraene Sigma Aldrich 138924-1G
Cysteamine Sigma Aldrich 30070-10g
Dulbecco's phosphate-buffered saline without Ca2+ and Mg2+ Thermo Fisher 14190169
F(ab')2-Goat anti-Mouse IgG Alexa Fluor 647 Thermo Fisher A-21237
Fiji image processing software (Image J)
Glucose Carl Roth X997.2
Hydrochloric acid Sigma Aldrich H1758
LSM 780 ELYRA PS.1 system Zeiss
Paraformaldehyde Merck 8187150100
Pyranose oxidase Sigma Aldrich P4234-250UN
sarcomeric α-actinin antibody [EA-53] Abcam ab9465
Sodium chloride Sigma Aldrich S7653
sterile water Carl Roth 3255.1
Triton X-100 Sigma Aldrich X100
Trizma base Sigma Aldrich T1503
β-Mercaptoethanol Sigma Aldrich 63689

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Biologie Ausgabe 165 humaninduzierte pluripotente Stammzellen Kardiomyozyten Superauflösung Reifung Sarcomere-Netzwerk photoaktivierte Lokalisationsmikroskopie
Analyse des α-Actinin-Netzwerks in humanen iPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten mittels Einzelmolekül-Lokalisierungsmikroskopie
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Johann, L., Chabanovska, O., Lang, C. I., David, R., Lemcke, H. Analyzing the α-Actinin Network in Human iPSC-Derived Cardiomyocytes Using Single Molecule Localization Microscopy. J. Vis. Exp. (165), e61605, doi:10.3791/61605 (2020).

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