Summary
De vorming van een goed sarcomerenetwerk is belangrijk voor de rijping van iPSC-afgeleide cardiomyocyten. We presenteren een super resolutie-gebaseerde aanpak die het mogelijk maakt voor de kwantitatieve evaluatie van de structurele rijping van stamcel afgeleide cardiomyocyten, ter verbetering van de cultuuromstandigheden ter bevordering van de ontwikkeling van het hart.
Abstract
De rijping van iPSC-afgeleide cardiomyocyten is een cruciaal probleem voor hun toepassing in regeneratieve therapie, drugstesten en ziektemodellering. Ondanks de ontwikkeling van meerdere differentiatieprotocollen blijft de generatie iPSC cardiomyocyten die lijken op een volwassen fenotype een uitdaging. Een belangrijk aspect van cardiomyocyten rijping omvat de vorming van een goed georganiseerd sarcomere netwerk om een hoge contractiecapaciteit te garanderen. Hier presenteren we een super resolutie-gebaseerde aanpak voor semi-kwantitatieve analyse van het α-actinin netwerk in cardiomyocyten. Met behulp van fotogeactiveerde lokalisatiemicroscopie werd een vergelijking gemaakt van de sarcomerelengte en de z-discdikte van iPSC-afgeleide cardiomyocyten en hartcellen geïsoleerd van neonatale weefsel. Tegelijkertijd tonen we het belang aan van goede beeldvormingsvoorwaarden om betrouwbare gegevens te verkrijgen. Onze resultaten tonen aan dat deze methode geschikt is om de structurele rijpheid van hartcellen met een hoge ruimtelijke resolutie kwantitatief te monitoren, waardoor zelfs subtiele veranderingen van de sarcomere organisatie kunnen worden gedetecteerd.
Introduction
Hart- en vaatziekten (CVD) zoals een hartinfarct of cardiomyopathie blijven de belangrijkste doodsoorzaak in de westerse wereld1. Aangezien het menselijk hart slechts een slechte regeneratieve capaciteit bezit, is er behoefte aan strategieën om het herstel van CVD's te bevorderen. Dit omvat celvervangende therapieën om verloren cardiomyocyten (CM) aan te vullen, evenals de ontwikkeling van nieuwe antiritmische geneesmiddelen voor efficiënte en veilige farmaceutische interventie. Geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC) zijn aangetoond dat een veelbelovende celbron voor de onbeperkte generatie van menselijke CM in vitro, geschikt voor regeneratieve therapieën, ziekte modellering, en voor de ontwikkeling van screening testen van geneesmiddelen2,3,4.
Hoewel er veel verschillende cardiale differentiatieprotocollen bestaan, ontbreekt het iPSC-afgeleide CM nog steeds aan bepaalde fenotypische en functionele aspecten die de in vitro en in vivo toepassing5,6belemmeren . Naast elektrofysiologische, metabolische en moleculaire veranderingen, omvat het hartrijpingsproces de structurele organisatie van sarcomeres, die de fundamentele eenheden zijn die nodig zijn voor krachtgeneratie en celcontractie7. Terwijl volwassen CMs een goed georganiseerd contractielapparaat vertonen, tonen door iPSC afgeleide CMs vaak ongeregelde sarcomerefilamenten aan, geassocieerd met een verminderd contractievermogen en veranderde contractiedynamiek8,9. In tegenstelling tot volwassen CM die eenaxial contractiepatroon vertonen, resulteren de gedesoriënteerde structuren in onrijpe CM in een radiale samentrekking van de hele cel of bevorderen de verschijning van contractie focal points9,10.
Voor het verbeteren van de hartrijping zijn meerdere benaderingen toegepast, waaronder 3D-celkweekmethoden, elektrische en mechanische stimulatie, evenals het gebruik van extracellulaire matrices die in vivo omstandigheden11,12,13nabootsen . Om het succes en de efficiëntie van deze verschillende cultuuromstandigheden te evalueren, zijn technieken nodig om de mate van structurele rijping van iPSC CM te monitoren en te schatten, bijvoorbeeld door middel van microscopische technieken. In tegenstelling tot conventionele confocale beeldvorming is de resolutie in het geval van fotogeactiveerde lokalisatiemicroscopie (PALM) ongeveer 10x hoger. Deze techniek op zijn beurt zorgt voor een meer nauwkeurige analyse, het detecteren van zelfs subtiele veranderingen van cellulaire structuren14. Gezien de hoge resolutie van PALM-gebaseerde beeldvorming, het algemene doel van deze methode was de microscopische evaluatie van sarcomere rijpheid in iPSC-afgeleide CMs door nauwkeurige bepaling van z-Disc dikte en sarcomere lengte. In eerdere studies is aangetoond dat deze structurele kenmerken geschikte parameters zijn om cardiale rijpheid te beoordelen15. Bijvoorbeeld, zieke iPSC-CM ontbreekt volledige lengte dystrophin vertonen verminderde sarcomere lengte en z-band breedte in vergelijking met wilde type cellen16. Ook werd de lengte van individuele sarcomeres gemeten om de impact van topografische signalen op cardiale ontwikkeling16te onderzoeken. Daarom hebben we deze aanpak toegepast om de structurele rijping van het sarcomere-netwerk in iPSC-CM te evalueren door de sarcomerelengte en z-discdikte kwantitatief te meten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle stappen in dit protocol met neonatale en volwassen muizen werden uitgevoerd volgens de ethische richtlijnen voor de dierverzorging van het Rostock Universitair Medisch Centrum.
1. Teelt en dissociatie van iPSC-afgeleide cardiomyocyten
- Onderscheid hiPSC-CMs gedurende 25 dagen met behulp van een 2D monolayer methode zoals eerder beschreven17.
- Prewarm dissociatiemedium tot 37 °C en steun middel tot kamertemperatuur.
- Was cellen twee keer met PBS.
- Voeg voorverwarmd dissociatiemedium toe aan cellen en broed gedurende 12 minuten bij 37 °C en 5% CO2.
- Voeg ondersteuningsmedium toe aan de cellen.
OPMERKING: Het volume van het toegevoegde ondersteuningsmedium moet twee keer zo groot zijn als het volume van het dissociatiemedium dat in stap 1.4 wordt gebruikt. - Verjagen de cellen met behulp van een 5 mL serologische pipet.
- Centrifugecellen op 200 x g gedurende 5 min en resuspend de pellet in 3 mL van hiPSC-CM cultuurmedium17.
- Zaadcellen in 8 goed glazen bodemkamers bij een celdichtheid van 75.000 cellen /goed en cultuur gedurende 3 dagen.
2. Volwassen cardiomyocyte isolement
- Isolatie en teelt van volwassen cardiomyocyten van NMRI muizen werd uitgevoerd zoals eerder gemeld18.
- Zaadcellen in 8 goed glazen kamer dia en cultuur voor een dag.
3. Isolatie en teelt van neonatale cardiomyocyten
- Isolatieprocedure van neonatale cardiomyocyten, verkregen van NMRI-muizen, werd uitgevoerd zoals eerder beschreven19.
- Zaad geïsoleerde cel in 8 goed glazen kamer dia bij een celdichtheid van 75.000 cellen / goed en cultuur voor 3 dagen in neonatale CM cultuur medium19.
4. Immunofluorescentie-etikettering van het α-actininenetwerk
LET OP: Voor optimale resultaten worden cellen gekweekt in 8 goed glazen bodemkamers. Etikettering moet een dag voor de beeldvorming worden uitgevoerd.
- Verwarm 4% PFA bij 37 °C.
- Fix iPSC-CM by adding 4% paraformaldehyde directly in the culture media (1:1 dilution) and incubate at 37 °C for 15 min. De uiteindelijke concentratie van PFA voor fixatie is 2%.
- Incubeer vaste cellen in 0,2% Triton-X, verdund in PBS, gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Was cellen twee keer met PBS, 5 min per stuk.
- Voeg 1% BSA-oplossing (verdund in PBS) en incubeer gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur.
- Bereid 150 μL primaire antilichaamoplossing voor door α-actinineantilichaam 1:100 in 1% BSA te verdunnen, met 0,05% Triton-X. Voeg toe aan cellen en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 60 minuten.
- Was cellen twee maal met 0,2% BSA-oplossing, 5 min per stuk.
- Bereid 150 μL secundaire antilichaamoplossing voor door het verdunnen van het Alexa647-antilichaam 1:100 van geit-antimuis, met 0,05% Triton-X. Voeg toe aan de cellen en uitbroeden bij kamertemperatuur gedurende 40 min.
- Was cellen twee maal met 0,2% BSA-oplossing, 5 min per stuk.
- Was cellen twee keer met PBS, 5 min per stuk. Houd gelabelde cellen in het donker op 4 °C tot PALM beeldvorming.
5. Voorbereiding van de PALM-beeldvormingsbuffer
OPMERKING: Het is van cruciaal belang om de PALM-beeldverdelende buffer voor elk experiment vers voor te bereiden.
- Bereid 50% glucoseoplossing voor door 25 g glucose op te lossen in 50 mL gedestilleerd water.
- Bereid de basisbuffer voor met 50 mM Tris-HCl, 10% glucose en 10 mM natriumchloride.
- Pas het pH-niveau aan op ~8.0 met zoutzuur.
- Bereid pyranoseoxidaseoplossing voor door 0,6 mg pyranoseoxidase op te lossen in 316 μL basisbuffer.
- Bereid catalase-oplossing voor door 7 mg catalase op te lossen in 500 μL basisbuffer. Meng grondig en centrifuge op 10.000 x g gedurende 3 min. Houd de supernatant voor verder gebruik. Catalase oplossing kan meerdere dagen op 4 °C worden gehouden.
- Bereid 500 μL PALM imaging buffer voor door 316 μL pyranoseoxidaseoplossing, 25 μL catalase-oplossing, 100 μL van 50% glucoseoplossing, 50 μL cysteamine, 5 μL cyclooctatetraeen en 3,5 μL van β-Mercaptoethanol. De uiteindelijke katalytische activiteit van pyranose oxidase en catalase moet respectievelijk 7,5 U, 35,00U zijn.
LET OP: De PALM imaging buffer biedt optimale beeldvormingsomstandigheden voor 3-5 uur. Als knipperend vermogen van de fluorescerende kleurstof afneemt, bereiden een nieuwe buffer aliquot.
6. PALM-beeldaanwinst
- Schakel de microscoop ten minste 3 uur voor gebruik in en breng het monster op kamertemperatuur voordat de beeldvorming thermische evenwicht mogelijk maakt. Als de microscoop is uitgerust met een incubatiekamer, past u de temperatuur aan op 30 °C.
- Reinig het doel en de onderkant van de schuif met behulp van een geschikt reinigingsmiddel.
- Voeg 300 μL PALM imaging buffer toe aan één put van gelabelde cellen en steek de kamerglijbaan in de stadiumhouder van de microscoop.
- Stel de parameters voor de aankoop van DE PALM-afbeelding in.
- Selecteer 1,57 N.A. 100x oliedoelstelling voor overname.
- Selecteer de PALM-modus en activeer de TIRF-instellingen.
- Pas het aantal frames aan dat moet worden aangeschaft. Meestal zijn 5.000-10.000 frames voldoende om optimale resultaten te behalen. Het aantal verworven frames hangt echter sterk af van de etiketteringsefficiëntie en de knippercapaciteit van de fluorescerende kleurstof en kan door de gebruiker worden aangepast.
- Stel UV-laservermogen in op 0,1% en 647 laser op 0,2%.
- Stel het versterkingsniveau in op 50-100.
- Schakel de laserverlichting in en selecteer een doelcel. Het versterkingsniveau kan worden verhoogd als de signaalintensiteit te laag is (afhankelijk van fluorescentielabeling).
- De laserverlichting uitschakelen
- PALM-beeldverwerving
- Verlaag de winst tot 0 en verhoog het laservermogen (ex 647) tot 100%.
- Bleek de doelcel voor ~ 5 s.
- Verhoog de winst tot 50 en start palm-beeldacquisitie.
OPMERKING: Versterking moet worden aangepast om voldoende signaalintensiteit te krijgen, terwijl oververzadigde pixels moeten worden vermeden. Als de signaalintensiteit vermindert, verhoogt u het versterkingsniveau.
- Optioneel u de UV-laserkracht gestaag verbeteren (0,1%-10%) om de signaalintensiteit te verhogen en het knipperen van de fluorofofor te bevorderen.
7. Reconstructie van PALM-gegevens
- Open de Image J-software en importeer PALM-gegevens.
- Open Thunderstorm Plugin en "Run analyse"
- Voer in het menu' Camera-instelling" pixelgrootte en EM-versterking in.
OPMERKING: Bij gebruik van 100x doelstellingen en 1,6x vergroting lens, 100 nm pixelgrootte is geschikt. Aangezien de pixelgrootte echter afhankelijk is van de hardwarekenmerken van de microscoop en de camera die worden gebruikt voor PALM-beeldvorming, moeten gebruikers deze parameter zorgvuldig controleren en aanpassen. EM gain waarden kunnen worden verkregen uit de metadata. - In de "Run analysis menu" stel parameters als volgt: B-spline volgorde: 3, B-spline schaal: 2.0, piek intensiteit drempel: stf (Wave.F1), montage radius: 3, initial sigma: 1.6, vergroting: 5.0, update frequentie: 50, laterale verschuivingen: 2. Bevestigen door te klikken op de "Ok" knop.
- Voer in het menu' Camera-instelling" pixelgrootte en EM-versterking in.
- Nabewerking van gereconstrueerde PALM-afbeelding
- Selecteer in het menu" Plot histogram" de parameter "Sigma".
- Gebruik het gereedschapRechthoekom een ROI te selecteren, met uitzondering van mogelijke artefacten en roi toe te passen op het filter. ROI-waarden worden weergegeven in het opdrachtvak filter.
- Voeg "& onzekerheid <25" toe aan de ROI-waarden. Een mogelijke filteropdracht ziet er als volgt uit: "(sigma > 48.6821 & sigma < 1117.40) & uncertainty <25". Geselecteerde sigmawaarden toepassen.
- Voer in het menu'Duplicaten verwijderen' een afstandsdrempelvan "10 nm" in en breng een aanvraag in.
- Stel in hetmenu " Samenvoegen" de maximale afstand in op "20", maximale frames per molecuul op "0" en maximaal uit frames op "1". Instellingen toepassen.
- Selecteer in hetmenu " Driftcorrectie" kruiscorrelatie en stel "Aantal bakken" in op "5" en "Vergroting" op "5.0". Plaats instellingen voor driftcorrectie.
- Sla de uiteindelijke PALM-afbeelding op en exporteer desverwerkte gegevens indien gewenst.
8. Analyse van sarcomere filamenten
- Analyse van sarcomere lengte
- Open Image J-software en importeer de gereconstrueerde PALM-afbeelding.
- Teken een lijn tussen geselecteerde sarcomerestructuren loodrecht op de z-disc om de kortste afstand tussen actininefilamenten te meten.
- Selecteer "Plot profiel" in het menu "Analyseren" en verkrijg de lengte tussen twee pieken. Aangezien de sarcomerelengte binnen één cel kan variëren, moeten minimaal 20 sarcomeren worden gemeten in verschillende gebieden van de doelcel.
- Analyse van de dikte van de Z-Disc
- Open Image J-software en importeer de gereconstrueerde PALM-afbeelding.
- Zet de gereconstrueerde PALM-afbeelding om in een afbeelding in de 8-bits modus.
- Open de nokdetectie-plugin en voer de volgende parameters in: lijnbreedte: 20, hoog contrast: 230, laag contrast: 10, sigma: 0,79, ondergrens: 25,84, minimale lijnlengte: 20.
- Stel "Schattingsbreedte", "Uitschuiflijn" en "Weergaveresultaten" in.
- Klik op' Ok'en gebruik 'Gemiddelde lijnbreedte'van de resultatentabel voor verdere analyses.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Voor het schatten van de mate van structurele rijping van CM, neonatale, volledig volwassen volwassen, en iPSC CM werden in eerste instantie gelabeld de CM met α-actinine antilichaam om het sarcomere netwerk te visualiseren. Na palm-acquisitie werden beelden gereconstrueerd en werd de dikte van de Z-disc gemeten met behulp van op plugin gebaseerde beeldverwerkingssoftware voor de automatische detectie van de breedte van individuele filamenten. Sarcomere lengte werd berekend door het meten van de afstand tussen twee aangrenzende intensiteit pieken, overeenkomend met naburige filamenten. Figuur 1 toont de evaluatie van de sarcomere organisatie in iPSCs-afgeleide CM.
Zoals gepresenteerd in figuur 2A,iPSC-CM en neonatale cellen bleken een soortgelijke α- actinine patroon vertonen met onregelmatige, ongestrepte sarcomere structuren. Evenzo toonde de kwantitatieve beoordeling aan dat de lengte en dikte van α- actinefilamenten vrijwel identiek waren, hetgeen wijst op een voortijdige ontwikkelingstoestand van iPSC CM. Om precies te zijn was de gemiddelde sarcomerelengte ongeveer 1,83 μm (volwassene vs. iPSC CM vs. neonatale CM: 1,91 ± 0,02 1,83 ± 0,049 μm vs. 1,82±0,03 μm, n=20 cellen), terwijl de dikte van de Z-Disc ongeveer 74 nm was (volwassene vs. iPSC CM vs. neonatale CM: 71,30 ± 1,64 vs. 73,95 ± 0,86 nm vs. 74,08 ± 0,12 nm, n=20 cellen) (figuur 2B). In tegenstelling, volwassen volwassen CM toonde een regelmatige sarcomere netwerk met een licht verhoogde sarcomere lengte en verminderde z-Disc dikte.
Vergelijking van conventionele confocale beeldvorming en PALM toonde geen significant verschil van sarcomere lengte(figuur 2C) (confocale vs PALM: 1,75 ± 0,02 vs. 1,70 ± 0,02, n = 10 cellen). Echter, een diep verminderde z-Disc dikte werd gedetecteerd toen iPSC-CM werden onderworpen aan PALM imaging (Figuur 2C) (confocale vs PALM: 224.71 ± 4.31 vs. 73.91 ± 1.31, n = 10 cellen). Representatieve afbeeldingen benadrukken de winst in resolutie toen PALM werd toegepast, ondersteund door overeenkomstige intensiteitspercelen(figuur 2D,E). Berekende volledige breedte bij de helft van de fluorescentie intensiteit bleek dat α-actinine structuren zijn ~ 3-voudig dunner in PALM beelden in vergelijking met standaard confocale microscopie (Figuur 2E).
Single molecule lokalisatie microscopie, zoals PALM, maakt de detectie van intracellulaire structuren ver onder de diffractie limiet. Om een maximale ruimtelijke resolutie te garanderen, zijn passende beeldomstandigheden vereist voor nauwkeurige detectie van lokalisatie van één molecuul. Het gebruikte imaging buffersysteem is van cruciaal belang voor dit acquisitieproces omdat het de fotofysische eigenschappen van de fluorescerende kleurstof beïnvloedt en dus een aanzienlijke impact heeft op de algehele resolutie en nauwkeurigheid van het uiteindelijke PALM-beeld. Vergelijking tussen hoge kwaliteit buffer en buffer bereid een dag voor beeldvorming bleek een groot verschil in filament dikte (Figuur 3A,B). Sarcomere structuren verworven met lage kwaliteit buffer lijken dikker in vergelijking met optimale beeldvormingsomstandigheden (Figuur 3A). Uit de kwantitatieve evaluatie bleek namelijk dat de dikte van de Z-Disc met ~65% werd verhoogd (hoge kwaliteit versus lage kwaliteit: 73,87 ± 1,02 nm vs. 113,9 ± 1,33 nm, n=155 filamenten) (Figuur 3B). Dit gebrek aan gegevensnauwkeurigheid is te wijten aan verminderde knipperende eigenschappen van de fluorofofoër die resulteert in minder gedetecteerde fotonen per lokalisatiegebeurtenis (hoge vs. lage bufferkwaliteit: 29689 fotonen/gebeurtenis vs. 16422 fotonen/gebeurtenissen) (Figuur 3C). Bovendien wordt de lokalisatieprecisie verminderd onder verslechterde beeldvormingsomstandigheden (hoge kwaliteit versus lage kwaliteit: 14,25 ± 5,85 nm vs. 19,56 ± 6,7 nm), wat de algehele resolutie van het gereconstrueerde PALM-beeld(figuur 3C)verlaagt.
Bovendien kan monsterdrift, bijvoorbeeld veroorzaakt door thermische instabiliteit, de precieze lokalisatie van fluorescerende moleculen beïnvloeden en resulteert in wazige beelden, zoals weergegeven in figuur 3D. Terwijl optimale PALM-beeldvorming duidelijke en goed gedefinieerde intensiteitspieken geeft, produceert overmatige monsterdrift een onregelmatig intensiteitspatroon dat het moeilijk maakt om de afstand tussen twee aangrenzende filamenten nauwkeurig te bepalen. Deze gegevens benadrukken het belang van strak gecontroleerde beeldvormingsomstandigheden in single molecule lokalisatiemicroscopie, omdat zelfs subtiele veranderingen tijdens het acquisitieproces de beeldkwaliteit en gegevensnauwkeurigheid drastisch kunnen verminderen.
Figuur 1: Evaluatie van de sarcomere organisatie in iPSCs-afgeleide CM.
Het sarcomere netwerk werd fluorescerend gelabeld met een α-actinine antilichaam, gevolgd door PALM image acquisition. Latere reconstructie leidt tot de uiteindelijke PALM beeld dat werd gebruikt voor kwantitatieve analyse. De lengte van individuele sarcomeres werd bepaald door de afstand tussen twee intensiteitspieken te meten die overeenkomen met naburige sarcomerefilamenten (1-5). De dikte van de Z-Disc werd automatisch berekend door een op een plugin gebaseerde afbeeldingsverwerkingstool. Schaalbalk 10 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Kwantitatieve vergelijking van z-disc dikte en sarcomere lengte in CM afgeleid van iPSCs, volwassen en neonatale hartweefsel.
(A) Gereconstrueerde PALM-beelden van het α-actinin-netwerk van iPSC en neonatale CM. (B) Uit kwantitatieve beoordeling is gebleken dat alle neonatale en delen een hoge gelijkenis in sarcomere lengte (volwassene vs. iPSC CM vs. neonatale CM: 1,91 ± 0,02 1,83 ± 0,049 μm vs. 1,82±0,03 μm) en dikte van individuele filamenten (volwassene vs. iPSC CM vs. neonatale CM: 71,30 ± 1,64 vs. 73,95 ± 0,86 nm vs. 74,08 ± 0,12 nm), wat het voortijdige fenotype iPSC CM. (C) Vergelijking van sarcomerelengte en z-Disc dikte tussen conventionele confocale imaging en PALM-gebaseerde gegevens aangeeft. Aangezien de sarcomerelengte werd bepaald door de piek-tot-piekafstand te meten, was de impact van een verhoogde resolutie op de nauwkeurigheid van gegevens minder uitgesproken (confocale vs. PALM: 1,75 ± 0,02 vs. 1,70 ± 0,02). Daarentegen werd een aanzienlijk lagere z-Disc dikte gedetecteerd toen PALM werd toegepast (confocale vs PALM: 224,71 ± 4,31 vs. 73,91 ± 1,31). (D) Representatieve microscopische beelden van iPSC-CM verkregen door confocale en PALM-beeldvorming. (E) Fluorescentieintensiteitspercelen die overeenkomen met de rode lijn in de onder D) vermelde rode lijn. Waarden vertegenwoordigen de volledige breedte bij de helft van de fluorescentieintensiteit, wat wijst op een diepgaande toename van de resolutie in PALM-afbeeldingen. Gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SEM, n=10-20 cellen, 20 sarcomeres per cel werden geëvalueerd. Statistische significantie werd bepaald met behulp van studenten t-Test. ** p<0.005, Schaalbalk 10 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Impact van bufferkwaliteit en monsterdrift op de nauwkeurigheid en betrouwbaarheid van gegevens.
aA) Representatieve PALM-beelden van iPSC-afgeleide CM die onder verschillende beeldvormingsvoorwaarden zijn verkregen. Sarcomere filamenten lijken dikker in monsters die zijn afgebeeld met buffer van lage kwaliteit. Rode lijnen geven representatieve meting van sarcomere lengte, terwijl groene filament structuren werden opgenomen in z-Disc analyse. (B) Kwantitatieve evaluatie bevestigde een significant verschil in z-Disc dikte tussen lage- en hoogwaardige buffer (hoge vs. lage bufferkwaliteit: 73,87 ± 1,02 nm vs. 113,9 ± 1,34 nm) (C) Dit verschil in beeldnauwkeurigheid was gebaseerd op een verminderd knipperend vermogen van de fluorofophore, wat leidde tot een verminderd aantal gedetecteerde fotonen per molecuul (hoge vs. lage bufferkwaliteit: 29689 fotonen/gebeurtenis vs. 16422 fotonen/gebeurtenissen). Tegelijkertijd daalde de lokalisatieprecisie, waardoor de algehele resolutie daalde (hoge versus lage bufferkwaliteit: 14,25 ± 5,85 vs. 19,56 ± 6,7) (D)Ook overmatige monsterdrift kan de beeldkwaliteit aantasten. Terwijl een goede beeldverwerving zonder monsterdrift resulteert in goed gedefinieerde intensiteitspieken van α-actininefilamenten, veroorzaakt verhoogde monsterdrift een onregelmatig intensiteitspatroon, dat een sterke invloed heeft op de nauwkeurige analyse van de sarcomerelengte. De gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SEM. 155 filamenten werden geanalyseerd. Statistische significantie werd bepaald met behulp van studenten t-Test. ****p<0,0001. Schaalbalk 10μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De generatie van functionele iPSC-afgeleide CM in vitro is belangrijk voor regeneratieve therapieën, ziektemodellering en de ontwikkeling van drugscreeningplatforms. Echter, onvoldoende rijpheid van deze CM is een groot obstakel in cardiovasculair onderzoek20. In dit verband zijn beeldvormingstechnieken met hoge resolutie nodig die het mogelijk maken de structurele rijpingstoestand van iPSC-afgeleide CM te monitoren. Tegelijkertijd kan microscopie met superresolutie een waardevol hulpmiddel zijn om de functie van specifieke eiwitten nauwkeurig te analyseren, die nodig is voor een goede sarcomerevorming zoals onlangs is aangetoond voor titine en troponine10,21,22.
In het huidige protocol presenteren we een PALM-gebaseerde aanpak om de structurele rijping van iPSC CM kwantitatief te evalueren door het α-actinin sarcomere netwerk te analyseren.
In vergelijking met de conventionele lichtmicroscopie maakt PALM visualisatie van cellulaire structuren mogelijk met een resolutie van ~20-50 nm23. Zo maakt het het mogelijk om zelfs subtiele veranderingen van het hartsarcomerenetwerk te detecteren die nauwelijks of zelfs niet detecteerbaar zijn door klassieke lichtmicroscopiebenaderingen. Met PALM hebben we een gemiddelde sarcomerelengte van ~1,84 μm gemeten in iPSC en neonatale CM (figuur 2). Dit is in overeenstemming met een aantal eerdere rapporten waaruit blijkt dat de grootte van individuele sarcomeres ~1,7-2,0 μm24,25,26is. In vergelijking met sarcomere lengte, nauwkeurige schatting van de dikte van z-lijnen is ingewikkelder als de grootte is ver onder de klassieke resolutie limiet van licht microscopie. Met behulp van elektronenmicroscopie, eerdere studies bleek dat z-Disc dikte varieert van 50 tot 80 nm in iPSC CM, die vergelijkbaar is met onze PALM-gebaseerde detectie van ~ 73 nm (Figuur 2).
Vergelijking met standaard confocale microscopie toonde de dramatische toename van de resolutie toen PALM werd toegepast. We vonden een 3-voudige lagere z-Disc dikte, na PALM imaging(Figuur 2). Er werd echter geen significant verschil gemeten voor de sarcomerelengte. Aangezien deze parameter wordt gemeten door het detecteren van de piek-tot-piek afstand van intensiteit percelen, het effect van verhoogde resolutie is minder uitgesproken.
Om deze hoge ruimtelijke resolutie te bereiken, vereist PALM goed gedefinieerde beeldvormingsvoorwaarden die zorgvuldig door de gebruiker moeten worden aangepakt. Voor een nauwkeurige lokalisatie van enkele moleculen zijn fluoroforen nodig die speciale fotofysische eigenschappen bezitten, waardoor snel kan worden schakelen tussen fluorescerende en donkere toestand, genaamd knipperend27. Zoals eerder aangetoond, kan de selectie van fluoroforen de beeldkwaliteit sterk beïnvloeden28. Een diepgaande knipperende vermogen werd beschreven voor Alexa 647, een van de beste en veel gebruikte kleurstoffen voor enkele molecuul lokalisatie microscopie29,30,31. Aangezien er echter talrijke PALM-fluoroforen beschikbaar zijn , zullen de gebruikers een grote flexibiliteit hebben op het gebied van de steekproefetikettering27,28.
Naast de selectie van geschikte fluorofoër, de imaging buffer systeem is een ander kritiek punt in PALM imaging als het dicteert de fotofysische eigenschappen van de fluorescerende kleurstof. We hebben pyranoseoxidase toegepast als een zuurstofaasiesysteem dat superieur is aan glucoseoxidase omdat het een verhoogde pH-stabiliteit biedt, waardoor langetermijnbeeldvorming mogelijk is zonder een significante afname van fluorofolaat die in de loop van de tijdknippert 32,33. Maar aangezien de levensduur van de beeldverdeler buffer beperkt is tot enkele uren, moet het voor elk experiment vers worden voorbereid om een hoge reproduceerbaarheid te garanderen. Onze resultaten tonen een dramatische afname van de gegevensnauwkeurigheid na PALM-beeldvorming met een lage kwaliteit buffer, wat leidt tot verminderde knipperen vermogen en verminderde lokalisatie precisie(Figuur 3A-C).
Bovendien is thermische stabiliteit van het beeldvormingssysteem verplicht om verhoogde monsterdrift te voorkomen. Terwijl matige drift kan worden gecorrigeerd door computationele analyse, overmatige monsterbeweging leidt tot verkeerd berekende lokalisatie van gedetecteerde fluoroforen en vermindert de beeldkwaliteit en de nauwkeurigheid van gegevens. Dit kan worden voorkomen door microscopen met verwarmingskamers en voldoende thermische evenwicht van het respectieve monster te gebruiken voordat met PALM-beeldvorming wordt begonnen. Daarnaast moeten etiketteringsdichtheid en -efficiëntie en het gebruik van antilichaamfragmenten of nanolichamen worden overwogen om de beeldomstandigheden34,35,,36te optimaliseren .
Het verwervingsproces van grote cellulaire structuren kan 10-30 minuten duren, afhankelijk van de beeldvormingsparameters (gezichtsveld, tl-sonde, beeldbuffer enz.). Deze lange acquisitietijd is een nadeel van PALM, waardoor het minder geschikt is voor live celbeeldvorming. Doorgaans worden 5.000-10.000 frames vastgelegd om een voldoende aantal knipperende gebeurtenissen met een hoge lokalisatieprecisie te bereiken. Ook is de beelddiepte meestal beperkt tot enkele honderden nanometer, waardoor het moeilijk is om dikkere monsters te onderzoeken. Echter, verbeterde resolutie in z-richting kan worden verkregen met een 3D PALM setup37.
We hebben twee parameters geselecteerd om het α-actinine netwerk van iPSC CM te karakteriseren, inclusief sarcomere lengte en z-Disc dikte. Extra functies kunnen worden verzameld om een meer uitgebreide weergave op de sarcomere steiger te krijgen, zoals filament oriëntatie. Ook 3D PALM kan helpen om kwantitatief analyseren van de hele sarcomere structuur door schatting van de huidige knooppunten en takken binnen het netwerk.
Hoewel PALM een zeer gedetailleerde analyse van de sarcomerestructuur mogelijk maakt, staat deze methode niet toe dat functionele parameters zoals cellulaire contractiliteit worden overgenomen, wat een ander belangrijk kenmerk is om cardiale volwassenheid te evalueren. Uit eerdere rapporten is gebleken dat een microscopiegebaseerde beoordeling van de sarcomerestructuur kan worden gecombineerd met video-analyse om functionele gegevens te verkrijgen38,39. Echter, aangezien de auteurs hebben gebruikt conventionele fluorescentie microscopie verkregen gegevens over de sarcomere structuur zijn minder nauwkeurig in vergelijking met PALM. Onze aanpak biedt ook de mogelijkheid om PALM-gegevens te correleren met eerdere time lapse-opnames en maakt het dus mogelijk om contractiemetingen te verkrijgen.
Samengevat biedt dit protocol een methode om de structurele rijping van het sarcomere-netwerk in CM kwantitatief te evalueren. Met behulp van deze op superresolutie gebaseerde benadering kunnen strategieën worden vastgesteld op een verbeterde cardiale ontwikkeling van iPSC-afgeleide CM om een volwassener fenotype te verkrijgen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenconflict.
Acknowledgments
Deze studie werd ondersteund door het Structuurfonds van de EU (ESF/14-BM-A55-0024/18). Daarnaast wordt H.L. ondersteund door het FORUN Programma van het Rostock Universitair Medisch Centrum (889001 en 889003) en de Josef and Käthe Klinz Foundation (T319/29737/2017). C.I.L. wordt ondersteund door het Clinician Scientist Program van het Rostock University Medical Center. R.D wordt ondersteund door de DFG (DA1296/6-1), de DAMP foundation, de Duitse Hartstichting (F/01/12) en de BMBF (VIP+ 00240).
Wij danken Madeleine Bartsch voor haar technische ondersteuning in de iPSC celcultuur en hartdifferentiatie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| human iPSC cell line | Takara | Y00325 | |
| µ-Slide 8 Well Glass Bottom | ibidi | 80827 | |
| 0.5ml eppendorf tube | Eppendorf | 30121023 | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A906 | |
| Cardiomyocyte Dissociation Kit | Stem Cell Technologies | 05025 | |
| Catalase | Sigma Aldrich | C40-1G | |
| Cyclooctatetraene | Sigma Aldrich | 138924-1G | |
| Cysteamine | Sigma Aldrich | 30070-10g | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline without Ca2+ and Mg2+ | Thermo Fisher | 14190169 | |
| F(ab')2-Goat anti-Mouse IgG Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher | A-21237 | |
| Fiji image processing software (Image J) | |||
| Glucose | Carl Roth | X997.2 | |
| Hydrochloric acid | Sigma Aldrich | H1758 | |
| LSM 780 ELYRA PS.1 system | Zeiss | ||
| Paraformaldehyde | Merck | 8187150100 | |
| Pyranose oxidase | Sigma Aldrich | P4234-250UN | |
| sarcomeric α-actinin antibody [EA-53] | Abcam | ab9465 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S7653 | |
| sterile water | Carl Roth | 3255.1 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
| Trizma base | Sigma Aldrich | T1503 | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | 63689 |
References
- McAloon, C. J., et al. The changing face of cardiovascular disease 2000-2012: An analysis of the world health organisation global health estimates data. International Journal of Cardiology. 224, 256-264 (2016).
- Kussauer, S., David, R., Lemcke, H. hiPSCs Derived Cardiac Cells for Drug and Toxicity Screening and Disease Modeling: What Micro- Electrode-Array Analyses Can Tell Us. Cells. 8 (11), 1331 (2019).
- Ylä-Herttuala, S. iPSC-Derived Cardiomyocytes Taken to Rescue Infarcted Heart Muscle in Coronary Heart Disease Patients. Molecular Therapy. 26 (9), 2077 (2018).
- Kadota, S., Shiba, Y. Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocyte Transplantation for Heart Disease Treatment. Current Cardiology Reports. 21 (8), 73 (2019).
- Jiang, Y., Park, P., Hong, S. M., Ban, K. Maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells: Current strategies and limitations. Molecules and Cells. 41 (7), 613-621 (2018).
- Feric, N. T., Radisic, M. Maturing human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes in human engineered cardiac tissues. Advanced Drug Delivery Reviews. 96, 110-134 (2016).
- Ali, H., Braga, L., Giacca, M. Cardiac regeneration and remodelling of the cardiomyocyte cytoarchitecture. The FEBS Journal. 287 (3), 417-438 (2020).
- Yang, X., Pabon, L., Murry, C. E. Engineering adolescence: maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circulation Research. 114 (3), 511-523 (2014).
- Bedada, F. B., Wheelwright, M., Metzger, J. M. Maturation status of sarcomere structure and function in human iPSC-derived cardiac myocytes. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1863 (7), 1829-1838 (2016).
- Dai, Y., et al. Troponin destabilization impairs sarcomere-cytoskeleton interactions in iPSC-derived cardiomyocytes from dilated cardiomyopathy patients. Scientific Reports. 10 (1), 1-15 (2020).
- Huang, C. Y., et al. Enhancement of human iPSC-derived cardiomyocyte maturation by chemical conditioning in a 3D environment. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 138, 1-11 (2020).
- Ronaldson-Bouchard, K., et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).
- Lee, S., et al. Contractile force generation by 3D hiPSC-derived cardiac tissues is enhanced by rapid establishment of cellular interconnection in matrix with muscle-mimicking stiffness. Biomaterials. 131, 111-120 (2017).
- Baddeley, D., Bewersdorf, J. Biological Insight from Super-Resolution Microscopy: What We Can Learn from Localization-Based Images. Annual Review of Biochemistry. 87 (1), 965-989 (2018).
- Ovesný, M., Křížek, P., Borkovec, J., Švindrych, Z., Hagen, G. M. ThunderSTORM: A comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging. Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).
- Mahadev, K., Wu, X., Donnelly, S., Ouedraogo, R., Eckhart, A. D., Goldstein, B. J. Adiponectin inhibits vascular endothelial growth factor-induced migration of human coronary artery endothelial cells. Cardiovascular Research. 78 (2), 376-384 (2008).
- Lemcke, H., Skorska, A., Lang, C. I., Johann, L., David, R. Quantitative evaluation of the sarcomere network of human hiPSC-derived cardiomyocytes using single-molecule localization microscopy. International Journal of Molecular Sciences. 21 (8), 2819 (2020).
- Ackers-Johnson, M., et al. A simplified, langendorff-Free method for concomitant isolation of viable cardiac myocytes and nonmyocytes from the adult mouse heart. Circulation Research. 119 (8), 909-920 (2016).
- Lemcke, H., et al. Applying 3D-FRAP microscopy to analyse gap junction-dependent shuttling of small antisense RNAs between cardiomyocytes. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 98, 117-127 (2016).
- Karbassi, E., et al. Cardiomyocyte maturation: advances in knowledge and implications for regenerative medicine. Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).
- Krysiak, J., et al. Protein phosphatase 5 regulates titin phosphorylation and function at a sarcomere-associated mechanosensor complex in cardiomyocytes. Nature Communications. 9 (1), 1-14 (2018).
- Zaunbrecher, R. J., et al. Cronos Titin Is Expressed in Human Cardiomyocytes and Necessary for Normal Sarcomere Function. Circulation. 140 (20), 1647-1660 (2019).
- Fornasiero, E. F., Opazo, F. Super-resolution imaging for cell biologists. BioEssays. Fornasiero, E. F., Opazo, F. , Wiley Online Library. (2015).
- Jeziorowska, D., et al. Differential Sarcomere and Electrophysiological Maturation of Human iPSC-Derived Cardiac Myocytes in Monolayer vs. Aggregation-Based Differentiation Protocols. International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), 1173 (2017).
- Kroll, K., et al. Electro-mechanical conditioning of human iPSC-derived cardiomyocytes for translational research. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 130, 212-222 (2017).
- Zuppinger, C., et al. Characterization of cytoskeleton features and maturation status of cultured human iPSC-derived cardiomyocytes. European Journal of Histochemistry. 61 (2), 145-153 (2017).
- Jradi, F. M., Lavis, L. D. Chemistry of Photosensitive Fluorophores for Single-Molecule Localization Microscopy. ACS Chemical Biology. 14 (6), 1077-1090 (2019).
- Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nature Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).
- Lampe, A., Haucke, V., Sigrist, S. J., Heilemann, M., Schmoranzer, J. Multi-colour direct STORM with red emitting carbocyanines. Biology of the Cell. 104 (4), 229-237 (2012).
- Chamma, I., Levet, F., Sibarita, J. B., Sainlos, M., Thoumine, O. Nanoscale organization of synaptic adhesion proteins revealed by single-molecule localization microscopy. Neurophotonics. 3 (4), 041810 (2016).
- Ma, H., Fu, R., Xu, J., Liu, Y. A simple and cost-effective setup for super-resolution localization microscopy. Scientific Reports. 7 (1), 1-9 (2017).
- Olivier, N., Keller, D., Gönczy, P., Manley, S. Resolution Doubling in 3D-STORM Imaging through Improved Buffers. PLoS One. 8 (7), 0069004 (2013).
- Swoboda, M., et al. Enzymatic oxygen scavenging for photostability without ph drop in single-molecule experiments. ACS Nano. 6 (7), 6364-6369 (2012).
- Mikhaylova, M., et al. Resolving bundled microtubules using anti-tubulin nanobodies. Nature Communications. 6 (1), 1-7 (2015).
- Venkataramani, V., et al. Enhanced labeling density and whole-cell 3D dSTORM imaging by repetitive labeling of target proteins. Scientific Reports. 8 (1), 1-7 (2018).
- Erdélyi, M., et al. Origin and compensation of imaging artefacts in localization-based super-resolution microscopy. Methods. 88, 122-132 (2015).
- McGorty, R., Schnitzbauer, J., Zhang, W., Huang, B. Correction of depth-dependent aberrations in 3D single-molecule localization and super-resolution microscopy. Optics Letters. 39 (2), 275 (2014).
- Ribeiro, M. C., et al. A cardiomyocyte show of force: A fluorescent alpha-actinin reporter line sheds light on human cardiomyocyte contractility versus substrate stiffness. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 141, 54-64 (2020).
- Pioner, J. M., et al. Isolation and mechanical measurements of myofibrils from human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cell Reports. 6 (6), 885-896 (2016).
