Summary
Формирование правильной саркомерной сети имеет важное значение для созревания кардиомиоцитов, полученных из iPSC. Мы представляем супер резолюции на основе подхода, который позволяет для количественной оценки структурного созревания стволовых клеток, полученных кардиомиоцитов, для улучшения культурных условий содействия развитию сердца.
Abstract
Созревание кардиомиоцитов, полученных из iPSC, является важнейшей проблемой для их применения в регенеративной терапии, тестировании на наркотики и моделировании заболеваний. Несмотря на разработку нескольких протоколов дифференциации, генерация кардиомиоцитов iPSC, напоминающих взрослый фенотип, остается сложной задачей. Одним из основных аспектов созревания кардиомиоцитов является формирование хорошо организованной сети саркомеров для обеспечения высокой мощности сжатия. Здесь мы представляем супер резолюции на основе подхода для полуколиченого анализа α в кардиомиоцитов. С помощью фотоактивированной микроскопии локализации проводилось сравнение длины саркомера и толщины z-диска кардиомиоцитов, полученных из iPSC, и сердечных клеток, изолированных от неонатальной ткани. В то же время мы демонстрируем важность надлежащих условий визуализации для получения достоверных данных. Наши результаты показывают, что этот метод подходит для количественного мониторинга структурной зрелости сердечных клеток с высоким пространственным разрешением, что позволяет выявлять даже тонкие изменения саркомерной организации.
Introduction
Сердечно-сосудистые заболевания (ССЗ), такие как инфаркт миокарда или кардиомиопатия остаются основной причиной смерти в западном мире1. Поскольку человеческое сердце обладает лишь плохими регенеративными возможностями, существует необходимость в стратегиях содействия восстановлению после ССЗ. Это включает в себя заместительную терапию клеток для пополнения потерянных кардиомиоцитов (СМ), а также разработку новых антиаритмических препаратов для эффективного и безопасного фармацевтического вмешательства. Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSC) были показаны, чтобы быть перспективным источником клеток для неограниченного поколения человека CM in vitro, подходит для регенеративной терапии, моделирования заболеваний, а также для развития скрининга наркотикованализы 2,3,4.
Хотя существует много различных протоколов сердечной дифференциации, сМ, полученных iPSC, по-прежнему не имеют определенных фенотипических и функциональных аспектов, которые препятствуют in vitro и in vivo application5,,6. Помимо электрофизиологических, метаболических и молекулярных изменений, процесс созревания сердца включает в себя структурную организацию сармеров, которые являются основными единицами, необходимыми для генерации силы исокращения клеток 7. В то время как взрослые CMs демонстрируют хорошо организованный контрактильный аппарат, СМ, полученные iPSC, обычно демонстрируют несовершенные саркомерные нити, связанные с пониженной способностью сжатия и измененнойдинамикой сокращения 8,9. В отличие от зрелых CM, которые показывают одноосную модель сокращения, дезориентированные структуры в незрелых CM приводит к радиальной сокращения всей клетки или способствовать появлению сокращениякоординационных центров 9,10.
Для улучшения созревания сердца, несколько подходов были применены, в том числе методы культуры 3D клеток, электрической и механической стимуляции, а также использование внеклеточных матриц имитирующих в условиях Виво11,12,13. Для оценки успеха и эффективности этих различных культурных условий необходимы методы мониторинга и оценки степени структурного созревания iPSC CM, например, с помощью микроскопических методов. В отличие от обычных конфокальных изображений, разрешение в случае фотоактивированной микроскопии локализации (PALM) примерно в 10 раз выше. Этот метод, в свою очередь, позволяет более точный анализ, обнаруживая даже тонкие изменения клеточных структур14. Учитывая высокое разрешение изображений на основе PALM, общей целью этого метода была микроскопическая оценка зрелости саркомера в CMs, полученных iPSC, путем точного определения толщины z-Disc и длины саркомера. В предыдущих исследованиях, эти структурные особенности были показаны, чтобы быть подходящими параметрами для оценки сердечнойзрелости 15. Например, больные iPSC-CM не хватает полной длины дистрофина экспонат снижение длины саркомера и z-диапазон ширина по сравнению с дикимиклетками типа 16. Аналогичным образом, длина отдельных сармеров была измерена для исследования влияния топографических сигналов на развитие сердца16. Поэтому мы применили этот подход для оценки структурного созревания саркомерной сети в iPSC-CM путем количественного измерения длины саркомера и толщины z-диска.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все этапы этого протокола с участием неонатальных и взрослых мышей были выполнены в соответствии с этическими принципами по уходу за животными Медицинского центра Ростокского университета.
1. Культивирование и диссоциация кардиомиоцитов, полученных из iPSC
- Дифференцировать hiPSC-CMs в течение 25 дней с помощью 2D-монослойного метода, как описаноранее 17.
- Довоенная диссоциация средней до 37 градусов по Цельсию и поддерживает от средней до комнатной температуры.
- Вымойте клетки дважды с ПОМОЩЬю PBS.
- Добавить довоенную диссоциацию среды к клеткам и инкубировать в течение 12 мин при 37 градусов по Цельсию и 5% CO2.
- Добавьте средства поддержки к клеткам.
ПРИМЕЧАНИЕ: Объем добавленной среды поддержки должен быть в два раза больше объема средств диссоциации, используемых в шаге 1.4. - Выбить клетки с помощью 5 мл серологической пипетки.
- Центрифуги клетки на 200 х г в течение 5 мин и повторно гранулы в 3 мл hiPSC-CM культурысреды 17.
- Семенные клетки в 8 хорошо стеклянных нижних камер при плотности клеток 75000 клеток / хорошо и культуры в течение 3 дней.
2. Взрослая изоляция кардиомиоцитов
- Изоляция и культивирование взрослых кардиомиоцитов у мышей ЯМРИ было выполнено, как сообщалосьранее 18.
- Семенные клетки в 8 хорошо стеклянные камеры слайд и культуры в течение одного дня.
3. Изоляция и культивирование неонатальных кардиомиоцитов
- Процедура изоляции неонатальных кардиомиоцитов, полученных от мышей ЯМРИ, была выполнена, как описаноранее 19.
- Семя изолированной клетки в 8 хорошо стеклянная камера слайд при плотности клеток 75000 клеток / хорошо и культуры в течение 3 дней в неонатальной культуры CMсреды 19.
4. Иммунофлуоресценция маркировки α-актинин сети
ПРИМЕЧАНИЕ: Для достижения оптимальных результатов клетки культурит в 8 хорошо стеклянных нижних камерах. Маркировка должна быть выполнена за день до изображения.
- Довоенная 4% PFA при 37 градусов по Цельсию.
- Исправьте iPSC-CM, добавив 4% параформальдегид непосредственно в культурные средства массовой информации (1:1 разбавления) и инкубировать при 37 градусов по Цельсию в течение 15 минут. Окончательная концентрация ПФА для фиксации составляет 2%.
- Инкубация фиксированных клеток в 0,2% Triton-X, разбавленных в PBS, в течение 5 минут при комнатной температуре.
- Вымойте клетки дважды с PBS, 5 минут каждый.
- Добавьте 1% раствор BSA (разбавленный в PBS) и инкубировать в течение 60 минут при комнатной температуре.
- Приготовьте 150 МЛ первичного раствора антител, разбавляя α-актинин антитела 1:100 в 1% BSA, содержащий 0,05% Triton-X. Добавить в клетки и инкубировать при комнатной температуре в течение 60 мин.
- Вымойте клетки дважды с 0,2% BSA решение, 5 мин каждый.
- Приготовьте 150 МКЛ вторичного раствора антител путем разбавления козьего антимышки Alexa647 антитела 1:100 в 1% BSA, содержащий 0,05% Triton-X. Добавить в клетки и инкубировать при комнатной температуре в течение 40 мин.
- Вымойте клетки дважды с 0,2% BSA решение, 5 мин каждый.
- Вымойте клетки дважды с PBS, 5 минут каждый. Храните помеченные клетки в темноте при 4 градусах Цельсия до изображения PALM.
5. Подготовка буфера изображений PALM
ПРИМЕЧАНИЕ: Очень важно только что подготовить буфер изображения PALM для каждого эксперимента.
- Приготовьте 50% раствор глюкозы, растворив 25 г глюкозы в 50 мл дистиллированной воды.
- Приготовьте базовый буфер, содержащий 50 мМ Трис-HCl, 10% глюкозы и 10 мн хлорида натрия.
- Отрегулируйте уровень рН до 8,0 евро с использованием соляной кислоты.
- Подготовка пиранозы oxidase раствор путем растворения 0,6 мг пиранозы оксидазы в 316 йл основного буфера.
- Приготовьте раствор каталазы, растворив 7 мг каталазы в 500 МКЛ базового буфера. Тщательно перемешать и центрифугу при 10 000 х г в течение 3 мин. Держите супернатант для дальнейшего использования. Каталазный раствор можно хранить при 4 градусах Цельсия в течение нескольких дней.
- Подготовь 500 МКЛ буфера визуализации PALM, смешивая 316 МКЛ раствора оксидазы пиранозы, 25 МКЛ раствора каталазы, 100 МКЛ 50% раствора глюкозы, 50 МКЛ цистимина, 5 МКЛ циклооктатетраена и 3,5 мл β-Мерктоэтола. Окончательная каталитическая активность оксидазы и каталазы должна быть 7,5 U, 35,00U соответственно.
ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер изображения PALM обеспечивает оптимальные условия визуализации для 3-5 ч. Если способность мигать флуоресцентным красителем уменьшается, подготовьте новую буферную алициту.
6. Приобретение изображений PALM
- Включите микроскоп по крайней мере за 3 часа до использования и доввейте образец до комнатной температуры перед визуализацией, чтобы обеспечить теплоубийку. Если микроскоп оборудован инкубационой камерой, отрегулируйте температуру до 30 градусов по Цельсию.
- Очистите цель и дно камерного слайда с помощью соответствующего растворителя очистки.
- Добавьте 300 МКЛ буфера изображения PALM в один колодец помеченных клеток и вставьте камерный слайд в держатель сцены микроскопа.
- Установите параметры приобретения изображений PALM.
- Выберите 1.57 N.A. 100x нефтяную цель для приобретения.
- Выберите режим PALM и активируйте настройки TIRF.
- Отрегулируйте количество кадров, которые необходимо приобрести. Обычно 5 000-10 000 кадров достаточно для получения оптимальных результатов. Однако количество приобретенных кадров сильно зависит от эффективности маркировки и возможности мигания флуоресцентного красителя и может быть скорректировано пользователем.
- Установите УФ-лазерную мощность до 0,1% и 647 лазера до 0,2%.
- Установите уровень усиления до 50-100.
- Включите лазерное освещение и выберите целевую ячейку. Уровень усиления может быть увеличен, если интенсивность сигнала является низкой (в зависимости от маркировки флуоресценции).
- Выключите лазерное освещение
- Приобретение изображений PALM
- Уменьшите прирост до 0 и увеличьте мощность лазера (ex 647) до 100%.
- Отбелить целевую ячейку на 5 с.
- Увеличьте прибыль до 50 и начните приобретение изображений PALM.
ПРИМЕЧАНИЕ: Прибыль должна быть скорректирована, чтобы получить достаточную интенсивность сигнала в то время как перенасыщенные пиксели следует избегать. Если интенсивность сигнала снижается, увеличьте уровень усиления.
- Дополнительно, неуклонно увеличивать мощность УФ-лазера (0.1%-10%) для увеличения интенсивности сигнала и содействия мигание флюорофора.
7. Реконструкция данных PALM
- Откройте программное обеспечение Image J и импортируем данные PALM.
- Открыть Гроза Plugin и "Выбежать анализ"
- В меню«Настройка камеры»вводят размер пикселей и прирост EM.
ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании 100x целей и 1,6x увеличение объектива, 100 нм размер пикселей является целесообразным. Однако, поскольку размер пикселей зависит от аппаратных особенностей микроскопа и камеры, используемой для визуализации PALM, пользователям необходимо тщательно проверить и адаптировать этот параметр. Значения прироста EM можно получить из метаданных. - В«Меню анализа бега»установлены параметры следующим образом: B-spline order: 3, B-spline scale: 2.0, порог пиковой интенсивности: stf (Wave.F1), радиус установки: 3, начальная сигма: 1.6, увеличение: 5.0, частота обновления: 50, боковой сдвиг: 2. Подтвердите, нажав кнопку«Ok».
- В меню«Настройка камеры»вводят размер пикселей и прирост EM.
- Почтовая обработка реконструированного изображения PALM
- В меню«Сюжетнаягистограмма» выберитепараметр «Сигма».
- Используйте инструмент«Rectangle»,чтобы выбрать рентабельность инвестиций, исключая возможные артефакты и применить рентабельность инвестиций к фильтру. Значения рентабельности инвестиций будут отображаться в командной коробке фильтра.
- Добавьтек значениям рентабельности инвестиций «и неопределенность и lt;25». Возможная команда фильтра будет выглядеть так: "(сигма и 48.6821 и сигма и lt; 1117.40) и неопределенность и lt;25". Примените выбранные значения сигмы.
- В меню"Удалить дубликаты"введите порог расстояния "10 нм" и примените.
- В"Слиянии меню",установить максимальное расстояние до "20", максимальные кадры на молекулу до "0" и максимум от кадров до "1". Применить настройки.
- В"Меню коррекции дрейфа"выберите поперечнуюкорреляциюи установите "Количество ячеек" до "5" и"Увеличение"до "5,0". Применить настройки коррекции дрейфа.
- Сохранить окончательное изображение PALM и экспортировать пост обработанные данные при желании.
8. Анализ саркомерных нитей
- Анализ длины саркомера
- Открытое программное обеспечение Image J и импорт реконструированного изображения PALM.
- Нарисуйте линию между выбранными структурами саркомера перпендикулярно z-диску для измерения кратчайшего расстояния между актининовыми мишенями.
- Выберите«Профиль участка»в меню«Анализ»и приобретете длину между двумя пиками. Поскольку длина саркомера может варьироваться в пределах одной ячейки, минимум 20 сармеров должны быть измерены в различных областях целевой ячейки.
- Анализ толщины z-disc
- Открытое программное обеспечение Image J и импорт реконструированного изображения PALM.
- Преобразование реконструированного изображения PALM в 8-битное изображение режима.
- Откройте плагин обнаружения хребта и введите следующие параметры: ширина линии: 20, высокий контраст: 230, низкий контраст: 10, сигма: 0,79, нижний порог: 25,84, минимальная длина линии: 20.
- Установить "Оценка ширины","Расширить линию"и "Отображение результатов".
- Нажмите«Ok»и используйте«Средняя ширина линии»из таблицы результатов для дальнейшего анализа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Для оценки степени структурного созревания СМ, неонатальный, полностью зрелый взрослый, и iPSC CM были первоначально помечены CM с α-актинин антитела для визуализации саркомерной сети. После приобретения PALM изображения были реконструированы, а толщина z-диска была измерена с помощью программного обеспечения для обработки изображений на основе плагина для автоматического обнаружения ширины отдельных нитей. Длина саркомера была рассчитана путем измерения расстояния между двумя смежными пиками интенсивности, соответствующих соседним нитью. На рисунке 1 показана оценка организации саркомера в сМ, полученной из iPSCs.
Как по представлено на рисунке 2A, iPSC-CM и неонатальные клетки были найдены, чтобы показать аналогичную α-актинин шаблон с нерегулярными, дисгаррангированные структуры саркомера. Аналогичным образом, количественная оценка показала, что длина и толщина α-актининных нитей были почти идентичны, что указывает на преждевременное состояние развития IPSC CM. Точнее, средняя длина саркомера составила около 1,83 мкм (взрослый против iPSC CM против неонатального СМ: 1,91 ± 0,02 1,83 ± 0,049 мкм против 1,82±0,03 мкм, n-20 клеток), в то время как толщина z-Disc составила приблизительно 74 нм (взрослый против iPSC CM против неонатального СМ: 71,30 ± 1,64 против 73,95 ± 0,86 нм против 74,08 ± 0,12 нм, n'20клеток) ( Рисунок 2B). В отличие от этого, взрослый зрелый CM показал регулярную сеть саркомеров со слегка увеличенной длиной саркомера и уменьшенной толщиной z-Disc.
Сравнение обычных конфокальных изображений и PALM не показало существенной разницы длины саркомера(рисунок 2C)(конфокальный против PALM: 1,75 ± 0,02 против 1,70 ± 0,02, n'10 клеток). Тем не менее, глубокое снижение толщины z-Disc было обнаружено, когда iPSC-CM подверглись PALM изображения (Рисунок 2C) (конфокальный против PALM: 224,71 ± 4,31 против 73,91 ± 1,31, n'10 клеток). Репрезентативные изображения подчеркивают увеличение разрешения при применении PALM, поддерживаемое соответствующими участками интенсивности(рисунок 2D,E). Рассчитанная полная ширина при половине максимальной интенсивности флуоресценции показала, что α-актининовые структуры в 3 раза тоньше на изображениях PALM по сравнению со стандартной конфокальной микроскопией(рисунок 2E).
Микроскопия локализации одной молекулы, как и PALM, позволяет обнаруживать внутриклеточные структуры значительно ниже предела дифракции. Для обеспечения максимального пространственного разрешения необходимы соответствующие условия визуализации для точного обнаружения локализации одной молекулы. Используемая буферная система изображения имеет решающее значение для этого процесса приобретения, поскольку она влияет на фотофизические свойства флуоресцентного красителя и, таким образом, оказывает значительное влияние на общее разрешение и точность окончательного изображения PALM. Сравнение между высококачественным буфером и буфером, подготовленным за день до того, как изображение выявило глубокую разницу в толщиненити (рисунок 3A,B). Sarcomere структур, приобретенных с низким качеством буфера, как представляется, толще по сравнению с оптимальными условиями изображения(рисунок 3A). Действительно, количественная оценка показала, что толщина z-Disc была увеличена на 65% (высокое качество по сравнению с низким качеством: 73,87 ± 1,02 нм против 113,9 ± 1,33 нм, n-155 нити)(рисунок 3B). Это отсутствие точности данных связано с сокращением мигающих свойств флюорофора, что приводит к менее обнаруженных фотонов на событие локализации (высокий против низкого качества буфера: 29689 фотонов / событие против 16422 фотонов / событий) (Рисунок 3C). Кроме того, точность локализации снижается при ухудшихся условиях визуализации (высокое качество против низкого качества: 14,25 ± 5,85 нм против 19,56 ± 6,7 нм), что снижает общее разрешение реконструированного изображения PALM(рисунок 3C).
Кроме того, дрейф образца, например, вызванный тепловой нестабильностью, может повлиять на точную локализацию флуоресцентных молекул и приводит к размытым изображениям, представленным на рисунке 3D. В то время как оптимальная визуализация PALM дает четкие и четко определенные пики интенсивности, чрезмерный дрейф выборки производит нерегулярную схему интенсивности, что затрудняет точное определение расстояния между двумя смежными нитью. Эти данные подчеркивают важность жестко контролируемых условий визуализации в микроскопии локализации одной молекулы, поскольку даже незначительные изменения в процессе приобретения могут значительно снизить качество изображения и точность данных.
Рисунок 1: Оценка организации саркомера в СМ, полученной из iPSCs.
Саркомерная сеть была флуоресцентно помечена α анти-актинина, за которым последовало приобретение изображения PALM. Последующая реконструкция приводит к окончательному изображению PALM, которое было использовано для количественного анализа. Длина отдельных саркомеров определялась путем измерения расстояния между двумя пиками интенсивности, соответствующими соседним саркомерам (1-5). Толщина диска автоматически вычисляется с помощью инструмента обработки изображений на основе плагина. Масштабная планка 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть более широкую версию этой цифры.
Рисунок 2: Количественное сравнение толщины z-диска и длины саркомера в CM, полученных из iPSCs, взрослых и неонатальной ткани сердца.
(A)Реконструированные изображения PALM α сети iPSC и неонатальной CM.(B)Количественная оценка показала, что все неонатальные и имеют высокое сходство в длине саркомера (взрослый против iPSC CM против неонатального CM: 1,91 ± 0,02 1,83 ± 0,049 мкм против 1,82±0,03 мкм) и толщина отдельных нитей (взрослый против iPSC против CM. неонатальный CM: 71,30 ± 1,64 против 73,95 ± 0,86 нм против 74,08 ± 0,12 нм), что указывает на преждевременный фенотип iPSC CM. (C) Сравнение длины саркомера и толщины z-Disc между обычной конфокальной визуализацией и приобретением данных на основе PALM. Поскольку длина саркомера определялась путем измерения расстояния от пика до пика, влияние увеличенного разрешения на точность данных было менее выраженным (конфокальный против PALM: 1,75 ± 0,02 против 1,70 ± 0,02). В отличие от этого, при применении PALM была обнаружена значительно более низкая толщина z-disc (конфокаль против PALM: 224,71 ± 4,31 против 73,91 ± 1,31). (D)Репрезентативные микроскопические изображения iPSC-CM, полученные с помощью конфокальных и PALM изображений. (E)Участки интенсивности флуоресценции, соответствующие красной линии, показанной в (D). Значения представляют полную ширину при половине максимальной интенсивности флуоресценции, что свидетельствует о значительном увеличении разрешения на изображениях PALM. Данные представлены как среднее ± SEM, n'10-20 ячеек, 20 саркомеров на ячейку были оценены. Статистическая значимость tбыла определена с помощью студентов t-Test. s p'lt;0.005, Шкала бар 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Влияние качества буфера и дрейфа выборки на точность и надежность данных.
(A)Представитель PALM изображения iPSC полученных CM приобретенных в различных условиях изображения. Sarcomere нити появляются толще в образцах, которые были изображены с буфером низкого качества. Красные линии указывают на репрезентативное измерение длины саркомера, в то время как зеленые структуры нити были включены в анализ z-Disc. (B)Количественная оценка подтвердила существенную разницу в толщине z-Disc между низко- и высококачественным буфером (высокое против низкого качества буфера: 73.87 ± 1.02 nm против. 113.9 ± 1.34nm)( C ) Эта разница в точности изображения была основана на уменьшенной способности мигать флюорофора, что привело к снижению количества обнаруженных фотонов на молекулу (высокое против низкого качества буфера: 29689 фотонов/событий против 16422 фотонов/событий). В то же время снизилась точность локализации, что, в свою очередь, снизило общее разрешение (высокое против низкого качества буфера: 14,25 ± 5,85 против 19,56 ± 6,7) (D)Аналогичным образом, чрезмерный дрейф выборки может ухудшить качество изображения. В то время как правильное получение изображения без дрейфа выборки приводит к четко определенным пикам интенсивности α-актининных нитей, увеличение дрейфа выборки провоцирует нерегулярную структуру интенсивности, что сильно влияет на точный анализ длины саркомера. Данные представлены как среднее ± SEM. было проанализировано 155 нитей. Статистическая значимость tбыла определена с помощью студентов t-Test. Масштабная планка 10 м. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть более широкую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Поколение функциональных сМ в пробирке, полученных из iPSC, имеет важное значение для регенеративной терапии, моделирования заболеваний и разработки платформ скрининга лекарственных средств. Тем не менее, недостаточная зрелость этих СМ является основным препятствием в сердечно-сосудистыхисследований 20. В этой связи необходимы методы визуализации с высоким разрешением, позволяющие контролировать структурное состояние созревания СМ, полученного из iPSC. В то же время, микроскопия супер разрешения может быть ценным инструментом для точного анализа функции конкретных белков, необходимых для правильного формирования саркомера, как недавно продемонстрировано для титинаи тропонина 10,,21,22.
В текущем протоколе мы представляем palm-подход к количественной оценке структурного созревания iPSC CM путем анализа α саркомерной сети.
По сравнению с обычной световой микроскопией, PALM позволяет визуализировать клеточные структуры с разрешением 20-50 нм23. Таким образом, он позволяет обнаруживать даже тонкие изменения сердечной саркомерной сети, которые едва или даже не обнаруживаются классическими подходами световой микроскопии. Применяя PALM, мы измерили среднюю длину саркомера в размере 1,84 мкм в iPSC и неонатальном СМ(рисунок 2). Это соответствует нескольким предыдущим отчетам, показывающим, что размер отдельных саркомеров составляет1,7-2,0 мкм 24,25,26. По сравнению с длиной саркомера точная оценка толщины z-линий сложнее, так как ее размер намного ниже классического предела разрешения световой микроскопии. Используя электронную микроскопию, предыдущие исследования показали, что толщина z-Disc колеблется от 50 до 80 нм в iPSC CM, что похоже на наше обнаружение на основе PALM 73 нм(рисунок 2).
Сравнение со стандартной конфокальные микроскопии продемонстрировали резкое увеличение разрешения при применении PALM. Мы обнаружили, в 3 раза ниже z-Disc толщиной, после ИЗОБРАЖЕНИЯ PALM (Рисунок 2). Тем не менее, не было измерено существенной разницы по длине саркомера. Поскольку этот параметр измеряется путем обнаружения пикового до пикового расстояния участков интенсивности, эффект увеличения разрешения менее выражен.
Для достижения такого высокого пространственного разрешения PALM требует четко определенных условий визуализации, которые должны быть тщательно рассмотрены пользователем. Для точной локализации отдельных молекул необходимы флюорофоры, обладающие особыми фотофизическими свойствами, позволяющие быстро переключаться между флуоресцентным и темным состоянием, называемыммигающим 27. Как было продемонстрировано ранее, выбор фторфоров может сильно повлиять на качество изображения28. Глубокий мигающий потенциал был описан для Alexa 647, один из лучших и широко используемых красителей для одной молекулы локализациимикроскопии 29,30,31. Однако, поскольку многочисленные флюорофоры PALM доступны, пользователи будут иметь высокую гибкость сточки зрения маркировки образца 27,28.
Помимо выбора подходящего флюорофора, буферная система визуализации является еще одним критическим моментом в визуализации PALM, поскольку она диктует фотофизические свойства флуоресцентного красителя. Мы применили оксидазы пиранозы в качестве системы очистки кислорода, которая превосходит оксидазы глюкозы, поскольку она обеспечивает повышенную стабильность рН, следовательно, позволяя долгосрочной визуализации без значительного снижения фторфора мигает стечением времени 32,33. Тем не менее, поскольку срок службы буфера изображений ограничен несколькими часами, он должен быть свежеприготовлен к каждому эксперименту, чтобы обеспечить высокую воспроизводимость. Наши результаты демонстрируют резкое снижение точности данных после изображения PALM с низкое качество буфера, что приводит к нарушению способности мигать и снижение точностилокализации (рисунок 3A-C).
Кроме того, тепловая устойчивость системы визуализации является обязательным, чтобы избежать увеличения дрейфа образца. В то время как умеренный дрейф может быть исправлен с помощью вычислительного анализа, чрезмерное движение выборки приводит к неправильной локализации обнаруженных фторфоров и снижает качество изображения и точность данных. Этого можно предотвратить с помощью микроскопов с нагревательных камер и достаточной тепловой эквилибрации соответствующего образца перед началом визуализации PALM. Кроме того, для оптимизации условийвизуализации 34,35,,36 следует учитывать плотность и эффективностьмаркировки,а также использование фрагментов антител илинанояд.
Процесс приобретения крупных клеточных структур может занять 10-30 мин, в зависимости от параметров изображения (поле зрения, флуоресцентный зонд, буфер изображения и т.д.). Это долгое время приобретения является недостатком PALM, что делает его менее подходящим для живой визуализации клеток. Как правило, 5.000-10.000 кадров захвачены для достижения достаточного количества мигающих событий с высокой точностью локализации. Кроме того, глубина изображения, как правило, ограничивается несколькими сотнями нанометров, что затрудняет исследование более толстых образцов. Тем не менее, расширенное разрешение в z-направлении может быть получено с 3D PALM установки37.
Мы выбрали два параметра для характеристики α iPSC CM, включая длину саркомера и толщину z-disc. Дополнительные функции могут быть собраны, чтобы получить более полное представление о саркомер эшафот, таких как нить ориентации. Аналогичным образом, 3D PALM может помочь количественно проанализировать всю структуру саркомера путем оценки нынешних узлов и ветвей в сети.
Хотя PALM позволяет очень подробный анализ структуры саркомера, этот метод не позволяет приобретение функциональных параметров, таких как клеточной контрактности, которая является еще одной важной особенностью для оценки сердечной зрелости. Бывшие отчеты показали, что микроскопия на основе оценки саркомерной структуры может быть объединена с видео-анализом для полученияфункциональных данных 38,39. Однако, поскольку авторы использовали обычные флуоресценции микроскопии полученные данные о структуре саркомера являются менее точными по сравнению с PALM. Наш подход также предоставляет возможность соотносить данные PALM с предыдущими записями промежуток времени и, следовательно, позволяет приобретение измерений сокращения.
Таким образом, этот протокол предоставляет метод количественной оценки структурного созревания сети саркомеров в CM. Используя этот подход, основанный на супер разрешении, стратегии могут быть направлены на улучшение сердечного развития СМ, полученного iPSC, чтобы получить более взрослый фенотип.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствие конфликта интересов.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано структурным фондом ЕС (ESF/14-BM-A55-0024/18). Кроме того, H.L. поддерживается программой FORUN Медицинского центра Ростокского университета (889001 и 889003) и Фондом Джозефа и Кёте Клинца (T319/29737/2017). C.I.L. поддерживается программой ученых-клиницистов Медицинского центра Ростокского университета. R.D поддерживается DFG (DA1296/6-1), фондом DAMP, Немецким фондом сердца (F/01/12) и BMBF (VIP-00240).
Мы благодарим Мадлен Барч за ее техническую поддержку в культуре клеток iPSC и сердечную дифференциацию.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| human iPSC cell line | Takara | Y00325 | |
| µ-Slide 8 Well Glass Bottom | ibidi | 80827 | |
| 0.5ml eppendorf tube | Eppendorf | 30121023 | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A906 | |
| Cardiomyocyte Dissociation Kit | Stem Cell Technologies | 05025 | |
| Catalase | Sigma Aldrich | C40-1G | |
| Cyclooctatetraene | Sigma Aldrich | 138924-1G | |
| Cysteamine | Sigma Aldrich | 30070-10g | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline without Ca2+ and Mg2+ | Thermo Fisher | 14190169 | |
| F(ab')2-Goat anti-Mouse IgG Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher | A-21237 | |
| Fiji image processing software (Image J) | |||
| Glucose | Carl Roth | X997.2 | |
| Hydrochloric acid | Sigma Aldrich | H1758 | |
| LSM 780 ELYRA PS.1 system | Zeiss | ||
| Paraformaldehyde | Merck | 8187150100 | |
| Pyranose oxidase | Sigma Aldrich | P4234-250UN | |
| sarcomeric α-actinin antibody [EA-53] | Abcam | ab9465 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S7653 | |
| sterile water | Carl Roth | 3255.1 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
| Trizma base | Sigma Aldrich | T1503 | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | 63689 |
References
- McAloon, C. J., et al. The changing face of cardiovascular disease 2000-2012: An analysis of the world health organisation global health estimates data. International Journal of Cardiology. 224, 256-264 (2016).
- Kussauer, S., David, R., Lemcke, H. hiPSCs Derived Cardiac Cells for Drug and Toxicity Screening and Disease Modeling: What Micro- Electrode-Array Analyses Can Tell Us. Cells. 8 (11), 1331 (2019).
- Ylä-Herttuala, S. iPSC-Derived Cardiomyocytes Taken to Rescue Infarcted Heart Muscle in Coronary Heart Disease Patients. Molecular Therapy. 26 (9), 2077 (2018).
- Kadota, S., Shiba, Y. Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocyte Transplantation for Heart Disease Treatment. Current Cardiology Reports. 21 (8), 73 (2019).
- Jiang, Y., Park, P., Hong, S. M., Ban, K. Maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells: Current strategies and limitations. Molecules and Cells. 41 (7), 613-621 (2018).
- Feric, N. T., Radisic, M. Maturing human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes in human engineered cardiac tissues. Advanced Drug Delivery Reviews. 96, 110-134 (2016).
- Ali, H., Braga, L., Giacca, M. Cardiac regeneration and remodelling of the cardiomyocyte cytoarchitecture. The FEBS Journal. 287 (3), 417-438 (2020).
- Yang, X., Pabon, L., Murry, C. E. Engineering adolescence: maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circulation Research. 114 (3), 511-523 (2014).
- Bedada, F. B., Wheelwright, M., Metzger, J. M. Maturation status of sarcomere structure and function in human iPSC-derived cardiac myocytes. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1863 (7), 1829-1838 (2016).
- Dai, Y., et al. Troponin destabilization impairs sarcomere-cytoskeleton interactions in iPSC-derived cardiomyocytes from dilated cardiomyopathy patients. Scientific Reports. 10 (1), 1-15 (2020).
- Huang, C. Y., et al. Enhancement of human iPSC-derived cardiomyocyte maturation by chemical conditioning in a 3D environment. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 138, 1-11 (2020).
- Ronaldson-Bouchard, K., et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).
- Lee, S., et al. Contractile force generation by 3D hiPSC-derived cardiac tissues is enhanced by rapid establishment of cellular interconnection in matrix with muscle-mimicking stiffness. Biomaterials. 131, 111-120 (2017).
- Baddeley, D., Bewersdorf, J. Biological Insight from Super-Resolution Microscopy: What We Can Learn from Localization-Based Images. Annual Review of Biochemistry. 87 (1), 965-989 (2018).
- Ovesný, M., Křížek, P., Borkovec, J., Švindrych, Z., Hagen, G. M. ThunderSTORM: A comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging. Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).
- Mahadev, K., Wu, X., Donnelly, S., Ouedraogo, R., Eckhart, A. D., Goldstein, B. J. Adiponectin inhibits vascular endothelial growth factor-induced migration of human coronary artery endothelial cells. Cardiovascular Research. 78 (2), 376-384 (2008).
- Lemcke, H., Skorska, A., Lang, C. I., Johann, L., David, R. Quantitative evaluation of the sarcomere network of human hiPSC-derived cardiomyocytes using single-molecule localization microscopy. International Journal of Molecular Sciences. 21 (8), 2819 (2020).
- Ackers-Johnson, M., et al. A simplified, langendorff-Free method for concomitant isolation of viable cardiac myocytes and nonmyocytes from the adult mouse heart. Circulation Research. 119 (8), 909-920 (2016).
- Lemcke, H., et al. Applying 3D-FRAP microscopy to analyse gap junction-dependent shuttling of small antisense RNAs between cardiomyocytes. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 98, 117-127 (2016).
- Karbassi, E., et al. Cardiomyocyte maturation: advances in knowledge and implications for regenerative medicine. Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).
- Krysiak, J., et al. Protein phosphatase 5 regulates titin phosphorylation and function at a sarcomere-associated mechanosensor complex in cardiomyocytes. Nature Communications. 9 (1), 1-14 (2018).
- Zaunbrecher, R. J., et al. Cronos Titin Is Expressed in Human Cardiomyocytes and Necessary for Normal Sarcomere Function. Circulation. 140 (20), 1647-1660 (2019).
- Fornasiero, E. F., Opazo, F. Super-resolution imaging for cell biologists. BioEssays. Fornasiero, E. F., Opazo, F. , Wiley Online Library. (2015).
- Jeziorowska, D., et al. Differential Sarcomere and Electrophysiological Maturation of Human iPSC-Derived Cardiac Myocytes in Monolayer vs. Aggregation-Based Differentiation Protocols. International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), 1173 (2017).
- Kroll, K., et al. Electro-mechanical conditioning of human iPSC-derived cardiomyocytes for translational research. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 130, 212-222 (2017).
- Zuppinger, C., et al. Characterization of cytoskeleton features and maturation status of cultured human iPSC-derived cardiomyocytes. European Journal of Histochemistry. 61 (2), 145-153 (2017).
- Jradi, F. M., Lavis, L. D. Chemistry of Photosensitive Fluorophores for Single-Molecule Localization Microscopy. ACS Chemical Biology. 14 (6), 1077-1090 (2019).
- Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nature Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).
- Lampe, A., Haucke, V., Sigrist, S. J., Heilemann, M., Schmoranzer, J. Multi-colour direct STORM with red emitting carbocyanines. Biology of the Cell. 104 (4), 229-237 (2012).
- Chamma, I., Levet, F., Sibarita, J. B., Sainlos, M., Thoumine, O. Nanoscale organization of synaptic adhesion proteins revealed by single-molecule localization microscopy. Neurophotonics. 3 (4), 041810 (2016).
- Ma, H., Fu, R., Xu, J., Liu, Y. A simple and cost-effective setup for super-resolution localization microscopy. Scientific Reports. 7 (1), 1-9 (2017).
- Olivier, N., Keller, D., Gönczy, P., Manley, S. Resolution Doubling in 3D-STORM Imaging through Improved Buffers. PLoS One. 8 (7), 0069004 (2013).
- Swoboda, M., et al. Enzymatic oxygen scavenging for photostability without ph drop in single-molecule experiments. ACS Nano. 6 (7), 6364-6369 (2012).
- Mikhaylova, M., et al. Resolving bundled microtubules using anti-tubulin nanobodies. Nature Communications. 6 (1), 1-7 (2015).
- Venkataramani, V., et al. Enhanced labeling density and whole-cell 3D dSTORM imaging by repetitive labeling of target proteins. Scientific Reports. 8 (1), 1-7 (2018).
- Erdélyi, M., et al. Origin and compensation of imaging artefacts in localization-based super-resolution microscopy. Methods. 88, 122-132 (2015).
- McGorty, R., Schnitzbauer, J., Zhang, W., Huang, B. Correction of depth-dependent aberrations in 3D single-molecule localization and super-resolution microscopy. Optics Letters. 39 (2), 275 (2014).
- Ribeiro, M. C., et al. A cardiomyocyte show of force: A fluorescent alpha-actinin reporter line sheds light on human cardiomyocyte contractility versus substrate stiffness. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 141, 54-64 (2020).
- Pioner, J. M., et al. Isolation and mechanical measurements of myofibrils from human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cell Reports. 6 (6), 885-896 (2016).
