Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Analysere det α-Actinin-nettverket i humane iPSC-avledede kardiomyocytter ved hjelp av enkeltmolekyl lokalisering mikroskopi

Published: November 3, 2020 doi: 10.3791/61605
Automatic Translation
1,2, 1,2, 3, 1,2, 1,2
1Department of Cardiac Surgery, Reference and Translation Center for Cardiac Stem Cell Therapy (RTC), Rostock University Medical Center, 2Faculty of Interdisciplinary Research, Department Life, Light & Matter, University Rostock, 3Department of Cardiology, Rostock University Medical Center

Summary

Dannelsen av et skikkelig sarcomere-nettverk er viktig for modning av iPSC-avledede kardiomyocytter. Vi presenterer en super oppløsningsbasert tilnærming som muliggjør kvantitativ evaluering av den strukturelle modningen av stamcelleavledede kardiomyocytter, for å forbedre kulturforhold som fremmer hjerteutvikling.

Abstract

Modningen av iPSC-avledede kardiomyocytter er et kritisk problem for deres anvendelse i regenerativ terapi, narkotikatesting og sykdomsmodellering. Til tross for utviklingen av flere differensieringsprotokoller, er generasjonen av iPSC kardiomyocytter som ligner en voksenlignende fenotype fortsatt utfordrende. Et viktig aspekt ved kardiomyocytter modning innebærer dannelsen av et godt organisert sarcomere-nettverk for å sikre høy sammentrekningskapasitet. Her presenterer vi en super oppløsningsbasert tilnærming for semi-kvantitativ analyse av α-actinin-nettverket i kardiomyocytter. Ved hjelp av fotoaktivert lokalisering mikroskopi en sammenligning av sarcomere lengde og z-plate tykkelse av iPSC-avledet kardiomyocytter og hjerteceller isolert fra neonatal vev ble utført. Samtidig viser vi viktigheten av riktige bildeforhold for å oppnå pålitelige data. Våre resultater viser at denne metoden er egnet til å kvantitativt overvåke den strukturelle modenheten til hjerteceller med høy romlig oppløsning, slik at påvisning av selv subtile endringer i sarcomere-organisasjonen.

Introduction

Kardiovaskulære sykdommer (CVD) som hjerteinfarkt eller kardiomyopati er fortsatt den viktigste dødsårsaken i den vestlige verden1. Som det menneskelige hjerte har bare dårlig regenerativ kapasitet, det er behov for strategier for å fremme utvinning fra CVDer. Dette inkluderer celleerstatningsterapi for å fylle opp tapte kardiomyocytter (CM), samt utvikling av nye antiarytmiske legemidler for effektiv og sikker farmasøytisk inngrep. Indusert pluripotente stamcelle (iPSC) har vist seg å være en lovende cellekilde for ubegrenset generasjon av human CM in vitro, egnet for regenerative terapier, sykdomsmodellering og for utvikling av legemiddelscreeninganalyser2,3,4.

Selv om mange forskjellige hjertediensiasjonsprotokoller finnes, mangler iPSC-avledet CM fortsatt visse fenotypiske og funksjonelle aspekter som emmer in vitro- og invivo-applikasjonen 5,,6. Ved siden av elektrofysiologiske, metabolske og molekylære endringer innebærer hjertemodningsprosessen den strukturelle organiseringen av sarkomer, som er de grunnleggende enhetene som kreves for kraftgenerering og cellesammentrekning7. Mens voksne CMs viser et godt organisert kontraktilt apparat, viser iPSC-avledede CMs ofte uarrangerte sarcomere-filamenter, forbundet med redusert sammentrekningsevne og endret sammentrekningsdynamikk8,,9. I motsetning til modne CM som viser enaksial sammentrekningsmønster, resulterer de desorienterte strukturene i umodne CM i en radial sammentrekning av hele cellen eller fremmer utseendet på sammentrekningsfokus9,10.

For å forbedre hjertemodning har flere tilnærminger blitt brukt, inkludert 3D-cellekulturmetoder, elektrisk og mekanisk stimulering, samt bruk av ekstracellulære matriser som etterligner in vivoforhold11,,12,,13. For å evaluere suksessen og effektiviteten til disse ulike kulturforholdene, er det nødvendig med teknikker for å overvåke og estimere graden av den strukturelle modningen av iPSC CM, for eksempel ved mikroskopiske teknikker. I motsetning til konvensjonell konfokal avbildning er oppløsningen ved fotoaktivert lokaliseringsmikroskopi (PALM) omtrent 10x høyere. Denne teknikken gir i sin tur en mer nøyaktig analyse, oppdage selv subtile endringer av cellulære strukturer14. Tatt i bruk den høye oppløsningen av PALM-basert bildebehandling, var det overordnede målet med denne metoden den mikroskopiske evalueringen av sarcomere modenhet i iPSC-avledede CMer ved presis bestemmelse av z-Disc tykkelse og sarcomere lengde. I tidligere studier har disse strukturelle egenskapene vist seg å være passende parametere for å vurdere hjertemodenhet15. For eksempel, syk iPSC-CM mangler full lengde dystrophin viser redusert sarcomere lengde og z-band bredde sammenlignet med vill type celler16. På samme måte ble lengden på individuelle sarkomer målt for å undersøke virkningen av topografiske signaler på hjerteutvikling16. Derfor brukte vi denne tilnærmingen til å evaluere den strukturelle modningen av sarcomere-nettverket i iPSC-CM ved kvantitativt måling av sarcomere lengde og z-platetykkelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle trinnene i denne protokollen som involverer neonatale og voksne mus ble utført i henhold til de etiske retningslinjene for dyrepleie av Rostock University Medical Centre.

1. Dyrking og dissosiasjon av iPSC-avledede kardiomyocytter

  1. Differensier hiPSC-CMs i 25 dager ved hjelp av en 2D-monolayer-metode som beskrevet tidligere17.
  2. Prewarm dissosiasjon medium til 37 °C og støtte middels til romtemperatur.
  3. Vask celler to ganger med PBS.
  4. Tilsett prewarmed dissosiasjonsmedium til celler og inkuber i 12 min ved 37 °C og 5 % CO2.
  5. Legg til støttemedium i cellene.
    MERK: Volumet av ekstra støttemedium må være dobbelt så stort volum av dissosiasjonsmediet som brukes i trinn 1.4.
  6. Løsne cellene ved hjelp av en 5 ml serologisk pipette.
  7. Sentrifugeceller ved 200 x g i 5 min og resuspend pellet i 3 ml hiPSC-CM kultur medium17.
  8. Frøceller i 8 brønnglassbunnskamre med en celletetthet på 75.000 celler / brønn og kultur i 3 dager.

2. Voksen kardiomyocyte isolasjon

  1. Isolasjon og dyrking av voksne kardiomyocytter fra NMRI-mus ble utført som rapportert tidligere18.
  2. Frøceller i 8 brønnglasskammersklie og kultur for en dag.

3. Isolasjon og dyrking av neonatale kardiomyocytter

  1. Isolasjonsprosedyre av neonatal kardiomyocytter, hentet fra NMRI-mus, ble utført som beskrevet tidligere19.
  2. Frø isolert celle i 8 brønnglasskammer lysbilde på en celle tetthet på 75.000 celler / brønn og kultur i 3 dager i neonatal CM kultur medium19.

4. Immunofluorescence merking av α-actinin nettverk

MERK: For optimale resultater er cellene dyrket i 8 brønnglassbunnskamre. Merking bør utføres en dag før avbildning.

  1. Prewarm 4% PFA ved 37 °C.
  2. Fiks iPSC-CM ved å legge til 4% paraformaldehyd direkte i kulturmediet (1:1 fortynning) og inkuber ved 37 °C i 15 min. Den endelige konsentrasjonen av PFA for fiksering er 2%.
  3. Inkuber faste celler i 0,2% Triton-X, fortynnet i PBS, i 5 min ved romtemperatur.
  4. Vask celler to ganger med PBS, 5 min hver.
  5. Tilsett 1% BSA-løsning (fortynnet i PBS) og inkuber i 60 min ved romtemperatur.
  6. Forbered 150 μL primær antistoffoppløsning ved å fortynne α-actinin antistoff 1:100 i 1% BSA, som inneholder 0,05 % Triton-X. Legg til celler og inkuber ved romtemperatur i 60 min.
  7. Vask celler to ganger med 0,2% BSA-løsning, 5 min hver.
  8. Forbered 150 μL sekundær antistoffløsning ved å fortynne geit-anti-mus Alexa647 antistoff 1:100 i 1% BSA, som inneholder 0,05% Triton-X. Legg til cellene og inkuber ved romtemperatur i 40 min.
  9. Vask celler to ganger med 0,2% BSA-løsning, 5 min hver.
  10. Vask celler to ganger med PBS, 5 min hver. Hold merkede celler i mørket ved 4 °C til PALM-avbildning.

5. Utarbeidelse av PALM-bildebufferen

MERK: Det er viktig å forberede PALM-bildebufferen for hvert eksperiment.

  1. Forbered 50% glukoseoppløsning ved å oppløse 25 g glukose i 50 ml destillert vann.
  2. Forbered grunnleggende buffer som inneholder 50 mM Tris-HCl, 10% glukose og 10 mM natriumklorid.
    1. Juster pH-nivået til ~8,0 ved hjelp av saltsyre.
  3. Forbered pyranoseoksidaseoppløsning ved å oppløse 0,6 mg pyranoseoksidase i 316 μL grunnleggende buffer.
  4. Forbered katalaseoppløsningen ved å oppløse 7 mg katalase i 500 μL grunnleggende buffer. Bland godt og sentrifuge ved 10.000 x g i 3 min. Hold supernatanten for videre bruk. Katalaseoppløsningen kan oppbevares ved 4 °C i flere dager.
  5. Forbered 500 μL av PALM-bildebuffer ved å blande 316 μL pyranoseoksidaseoppløsning, 25 μL katalaseoppløsning, 100 μL med 50 % glukoseoppløsning, 50 μL cysteamin, 5 μL cyklooctatetraen og 3,5 μL β-Mercapettohanol. Den endelige katalytiske aktiviteten til pyranoseoksidase og katalase må være henholdsvis 7,5 U, 35 00U.
    MERK: PALM-bildebufferen gir optimale bildeforhold i 3-5 timer. Hvis blinkende evne til fluorescerende fargestoff reduseres, forberede en ny buffer aliquot.

6. PALM bilde oppkjøp

  1. Slå på mikroskopet minst 3 timer før bruk og ta prøven til romtemperatur før avbildning for å tillate termisk likevekt. Hvis mikroskopet er utstyrt med et inkubasjonskammer, juster temperaturen til 30 °C.
  2. Rengjør objektivet og bunnen av kammersklien ved hjelp av et passende rengjøringsmiddel.
  3. Tilsett 300 μL PALM-bildebuffer i en brønn med merkede celler og sett kammeret gli inn i faseholderen på mikroskopet.
  4. Angi parameterne for palm-bildeanskaffelse.
    1. Velg 1,57 N.A. 100x oljemål for oppkjøp.
    2. Velg PALM-modus og aktiver TIRF-innstillingene.
    3. Juster antall rammer som skal anskaffes. Vanligvis er 5, 000-10, 000 rammer tilstrekkelig for å oppnå optimale resultater. Antall ervervede rammer avhenger imidlertid sterkt av merkeeffektiviteten og den blinkende evnen til det fluorescerende fargestoffet og kan justeres av brukeren.
    4. Sett UV lasereffekt til 0,1% og 647 laser til 0,2%.
    5. Sett forsterkingsnivået til 50-100.
    6. Slå på laserbelysningen og velg en målcelle. Forsterkningenivået kan økes hvis signalintensiteten er til lav (avhengig av fluorescensmerking).
    7. Slå av laserbelysningen
  5. PALM bilde oppkjøp
    1. Reduser forsterk gevinsten til 0 og øk lasereffekten (ex. 647) til 100 %.
    2. Bleke målcellen for ~5 s.
    3. Øk gevinsten til 50 og start PALM bilde oppkjøp.
      MERK: Forsterkninger må justeres for å få tilstrekkelig signalintensitet, mens overmettettede piksler bør unngås. Hvis signalintensiteten reduseres, øker du forsterkninger.
  6. Eventuelt, jevnt forbedre UV lasereffekt (0,1%-10%) for å øke signalintensiteten og for å fremme blinking av fluorofor.

7. Rekonstruksjon av PALM-data

  1. Åpne Image J-programvaren og importer PALM-data.
  2. Åpne Tordenvær Plugin og"Kjør analyse"
    1. I menyen "Kameraoppsett"angir du pikselstørrelse og EM-forsterkning.
      MERK: Når du bruker 100x mål og 1,6x forstørrelseslinse, er 100 nm pikselstørrelse egnet. Men siden pikselstørrelsen avhenger av maskinvarefunksjonene i mikroskopet og kameraet som brukes til PALM-bildebehandling, må brukerne nøye sjekke og tilpasse denne parameteren. EM-gevinstverdier kan hentes fra metadataene.
    2. I"Kjør analysemenyen" angi parametere som følger: B-spline rekkefølge: 3, B-spline skala: 2.0, peak intensitet terskel: stf (Wave.F1), montering radius: 3, første sigma: 1.6, forstørrelse: 5.0, oppdateringsfrekvens: 50, laterale skift: 2. Bekreft ved å klikke på "Ok" knapp.
  3. Etterbehandling av rekonstruert PALM bilde
    1. I menyen"Plot histogram"velger du parameteren "Sigma".
    2. Bruk verktøyet"Rektangel"til å velge en avkastning, unntatt mulige artefakter og bruke avkastning på filteret. ROI-verdier vises i filterkommandoboksen.
    3. Legg til" & usikkerhet <25"i avkastningsverdiene. En mulig filterkommando vil se slik ut: "(sigma > 48.6821 & sigma < 1117.40) & usikkerhet <25". Bruk valgte sigmaverdier.
    4. I menyen"Fjern duplikater"skriver du inn en avstandsterskel på "10 nm" og gjelder.
    5. I"Sammenslåingsmenyen", sett maksimal avstand til "20", maksimale rammer per molekyl til "0" og maksimalt av rammer til "1". Bruk innstillinger.
    6. I menyen "Driftkorrigering"velger du krysskorrelasjon og setter "Antall hyller"til "5" og "Forstørrelse"til "5.0". Bruk innstillinger for driftkorrigering.
    7. Lagre det endelige PALM-bildet og eksporter innleggs behandlede data hvis ønskelig.

8. Analyse av sarcomere filamenter

  1. Analyse av sarcomere lengde
    1. Åpne Image J-programvaren og importer det rekonstruerte PALM-bildet.
    2. Tegn en linje mellom valgte sarkomerestrukturer vinkelrett på z-platen for å måle den korteste avstanden mellom aktininfilamenter.
    3. Velg "Plot profil" i"Analyser"-menyen og få lengden mellom to topper. Siden sarkomerlengden kan variere innenfor en celle, bør minst 20 sarkomer måles i ulike områder av målcellen.
  2. Analyse av z-Disc tykkelse
    1. Åpne Image J-programvaren og importer det rekonstruerte PALM-bildet.
    2. Konverter det rekonstruerte PALM-bildet til et 8-biters modusbilde.
    3. Åpne ridge detection plugin og skriv inn følgende parametere: linjebredde: 20, høy kontrast: 230, lav kontrast: 10, sigma: 0,79, nedre terskel: 25,84, minimum linjelengde: 20.
    4. Sett "Estimatbredde", "Utvidlinje " og "Displayresultater".
    5. Klikk "Ok" og bruk "Gjennomsnittlig linjebredde" fra resultattabellen for videre analyser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For å estimere graden av strukturell modning av CM ble neonatal, fullt moden voksen og iPSC CM opprinnelig merket CM med α-actinin antistoff for å visualisere sarkomerenettverket. Etter PALM-oppkjøpet ble bildene rekonstruert, og z-platetykkelsen ble målt ved hjelp av plugin-basert bildebehandlingsprogramvare for automatisk deteksjon av bredden på individuelle filamenter. Sarcomere lengde ble beregnet ved å måle avstanden mellom to tilstøtende intensitet topper, tilsvarende nærliggende filamenter. Figur 1 viser evalueringen av sarcomere-organisasjonen i iPSCs-avledet CM.

Som presentert i figur 2A,iPSC-CM og neonatal celler ble funnet å vise en lignende α- actinin mønster med uregelmessige, uarrangerte sarkomer strukturer. På samme måte viste kvantitativ vurdering at lengden og tykkelsen på α-actininfilamenter var nesten identiske, noe som indikerer en for tidlig utviklingstilstand for iPSC CM. Mer presist var den gjennomsnittlige sarkomerlengden ca. 1,83 μm (voksen vs. iPSC CM vs. neonatal CM: 1,91 ± 0,02 1,83 ± 0,049 μm vs. 1,82±0,03 μm, n = 20 celler), mens z-Disc tykkelse var ca 74 nm (voksen vs. iPSC CM vs. neonatal CM: 71,30 ± 1,64 vs. 73,95 ± 0,86 nm vs. 74,08 ± 0,12 nm, n = 20 celler) (Figur 2B). I motsetning viste voksen moden CM et vanlig sarcomere nettverk med litt økt sarcomere lengde og redusert z-Disc tykkelse.

Sammenligning av konvensjonell konfokal avbildning og PALM viste ingen signifikant forskjell på sarkomerlengde (figur 2C) (konfokal vs. PALM: 1,75 ± 0,02 vs. 1,70 ± 0,02, n = 10 celler). Det ble imidlertid oppdaget en dyp redusert z-Disc-tykkelse da iPSC-CM ble utsatt for PALM-bildebehandling (figur 2C) (konfokal vs. PALM: 224,71 ± 4,31 vs. 73,91 ± 1,31, n = 10 celler). Representative bilder fremhever gevinsten i oppløsning når PALM ble brukt, støttet av tilsvarende intensitetsplott (figur 2D, E). Beregnet full bredde ved halv maksimal fluorescensintensitet viste at α-actinin strukturer er ~ 3 ganger tynnere i PALM bilder hvis sammenlignet med standard konfokal mikroskopi (figur 2E).

Enkeltmolekyl lokalisering mikroskopi, som PALM, muliggjør påvisning av intracellulære strukturer langt under diffraksjon grensen. For å sikre maksimal romlig oppløsning er passende bildeforhold nødvendig for nøyaktig påvisning av enkeltmolekyl lokalisering. Det brukte bildebuffersystemet er avgjørende for denne oppkjøpsprosessen, da det påvirker de fotofysiske egenskapene til det fluorescerende fargestoffet, og har dermed en betydelig innvirkning på den generelle oppløsningen og nøyaktigheten til det endelige PALM-bildet. Sammenligning mellom buffer og buffer av høy kvalitet utarbeidet en dag før bildebehandling viste en dyp forskjell i filamenttykkelse (figur 3A, B). Sarcomere strukturer ervervet med lav kvalitet buffer synes å være tykkere sammenlignet med optimale bildeforhold (Figur 3A). Faktisk viste kvantitativ evaluering at z-Disc tykkelse ble økt med ~ 65% (høy kvalitet vs. lav kvalitet: 73,87 ± 1,02 nm vs. 113,9 ± 1,33 nm, n = 155 filamenter) (Figur 3B). Denne mangelen på datanøyaktighet skyldes reduserte blinkende egenskaper for fluoroforen som resulterer i mindre oppdagede fotoner per lokaliseringshendelse (høy vs. lav bufferkvalitet: 29689 fotoner / hendelse vs. 16422 fotoner / hendelser) (figur 3C). Videre reduseres lokaliseringspresisjonen under forverrede bildeforhold (høy kvalitet vs. lav kvalitet: 14,25 ± 5,85 nm vs. 19,56 ± 6,7 nm), noe som senker den totale oppløsningen på det rekonstruerte PALM-bildet (figur 3C).

I tillegg kan prøvedrift, for eksempel forårsaket av termisk ustabilitet, påvirke nøyaktig lokalisering av fluorescerende molekyler og resulterer i uklare bilder, som presentert i figur 3D. Mens optimal PALM-bildebehandling gir klare og veldefinerte intensitetstopper, gir overdreven prøvedrift et uregelmessig intensitetsmønster som gjør det vanskelig å nøyaktig bestemme avstanden mellom to tilstøtende filamenter. Disse dataene understreker viktigheten av tett kontrollerte bildeforhold i enkeltmolekyl lokalisering mikroskopi som selv subtile endringer under oppkjøpet prosessen kan dramatisk redusere bildekvalitet og data nøyaktighet.

Figure 1
Figur 1: Evaluering av sarcomere-organisasjonen i iPSCs-avledet CM.
Sarcomere-nettverket ble fluorescerende merket med et α-actinin antistoff, etterfulgt av PALM-bildeoppkjøp. Påfølgende rekonstruksjon fører til det endelige PALM-bildet som ble brukt til kvantitativ analyse. Lengden på individuelle sarkomer ble bestemt ved å måle avstanden mellom to intensitetstopper tilsvarende nærliggende sarkomere filamenter (1-5). Z-Disc tykkelse ble automatisk beregnet av en plugin-basert bildebehandling verktøy. Skala bar 10 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Kvantitativ sammenligning av z-platetykkelse og sarkomerlengde i CM avledet fra iPSCer, voksent og neonatal hjertevev.
(A)Rekonstruerte PALM bilder av α-actinin nettverk av iPSC og neonatal CM. (B) Kvantitativ vurdering viste at alle neonatal og dele høy likhet i sarcomere lengde (voksen vs. iPSC CM vs. neonatal CM: 1,91 ± 0,02 1,83 ± 0,049 μm vs. 1,82±0,03 μm) og tykkelsen på individuelle filamenter (voksen vs. iPSC CM vs. neonatal CM: 71,30 ± 1,64 vs. 73,95 ± 0,86 nm vs. 74,08 ± 0,12 nm), noe som indikerer for tidlig fenotype av iPSC CM. (C) Sammenligning av sarcomere lengde og z-Disc tykkelse mellom konvensjonell confocal imaging og PALM-basert datainnsamling. Etter hvert som sarkomenes lengde ble bestemt ved å måle topp-til-topp-avstanden, var virkningen av økt oppløsning på datanøyaktighet mindre uttalt (konfokal vs. PALM: 1,75 ± 0,02 vs. 1,70 ± 0,02). I motsetning ble det påvist en betydelig lavere z-Disc tykkelse da PALM ble påført (confocal vs. PALM: 224.71 ± 4.31 vs. 73.91 ± 1.31). (D)Representative mikroskopiske bilder av iPSC-CM oppnådd ved konfokal og PALM-avbildning. (E) Fluorescensintensitetsplott tilsvarende den røde linjen som vises i (D). Verdier representerer full bredde ved halv maksimal fluorescensintensitet, noe som indikerer en dyp økning av oppløsning i PALM-bilder. Data presenteres som gjennomsnitt ± SEM, n= 10-20 celler, 20 sarkomer per celle ble evaluert. Statistisk signifikans ble bestemt ved hjelp av studenter t-Test.**p<0.005, Scale bar 10 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Virkningen av bufferkvalitet og prøvedrift på datanøyaktighet og pålitelighet.
(A)Representative PALM-bilder av iPSC-avledet CM ervervet under forskjellige bildeforhold. Sarcomere filamenter vises tykkere i prøver som har blitt avbildet med buffer av lav kvalitet. Røde linjer indikerer representativ måling av sarcomere lengde, mens grønne filamentstrukturer ble inkludert i z-Disc analyse. (B)Kvantitativ evaluering bekreftet en betydelig forskjell i z-Disc tykkelse mellom lav- og høy kvalitet buffer (høy vs. lav bufferkvalitet: 73,87 ± 1,02 nm vs. 113,9 ± 1,34 nm) (C) Denne forskjellen i bildenøyaktighet var basert på en redusert blinkende evne til fluorofor, noe som førte til redusert antall oppdagede fotoner per molekyl (høy vs. lav bufferkvalitet: 29689 fotoner / hendelse vs. 16422 fotoner / hendelser). Samtidig reduserte lokaliseringspresisjonen som igjen senket den totale oppløsningen (høy vs. lav bufferkvalitet: 14,25 ± 5,85 vs. 19,56 ± 6,7) (D) På samme måte kan overdreven prøvedrift svekke bildekvaliteten. Mens riktig bildeoppkjøp uten prøvedrift resulterer i veldefinerte intensitetstopper på α-actinin filamenter, provoserer økt prøvedrift et uregelmessig intensitetsmønster, noe som sterkt påvirker nøyaktig analyse av sarkomerlengde. Data presenteres som ± SEM. 155 filamenter ble analysert. Statistisk signifikans ble bestemt ved hjelp av studenter t-Test.****p<0.0001. Skala bar 10μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Genereringen av funksjonell iPSC-avledet CM in vitro er viktig for regenerative terapier, sykdomsmodellering og utvikling av legemiddelscreeningplattformer. Imidlertid er utilstrekkelig modenhet av disse CM et stort hinder i kardiovaskulær forskning20. I denne forbindelse er det nødvendig med høyoppløselige bildeteknikker som muliggjør overvåking av den strukturelle modningstilstanden til iPSC-avledet CM. Samtidig kan superoppløsning mikroskopi være et verdifullt verktøy for å nøyaktig analysere funksjonen til spesifikke proteiner, som kreves for riktig sarcomere formasjon som nylig demonstrert for titin og troponin10,21,22.

I den nåværende protokollen presenterer vi en PALM-basert tilnærming for kvantitativt å evaluere den strukturelle modningen av iPSC CM ved å analysere α-actinin sarcomere-nettverket.

Sammenlignet med den konvensjonelle lysmikroskopien muliggjør PALM visualisering av cellulære strukturer med en oppløsning på ~ 20-50 nm23. Dermed gjør det det mulig å oppdage selv subtile endringer i hjerteserkomene nettverket som knapt eller ikke engang kan oppdages ved klassiske lysmikroskopitilnærminger. Påføring av PALM, har vi målt en gjennomsnittlig sarcomere lengde på ~ 1,84 μm i iPSC og neonatal CM (figur 2). Dette er i tråd med flere tidligere rapporter som viser at størrelsen på individuelle sarcomeres er ~ 1,7-2,0 μm24,25,26. Sammenlignet med sarcomere lengde, presis estimering av tykkelsen på z-linjer er mer komplisert som størrelsen er langt under den klassiske oppløsning grensen for lys mikroskopi. Ved hjelp av elektronmikroskopi viste tidligere studier at z-Disc tykkelse varierer fra 50 til 80 nm i iPSC CM, som ligner på vår PALM-baserte påvisning av ~ 73 nm (figur 2).

Sammenligning med standard konfokal mikroskopi viste den dramatiske økningen i oppløsning når PALM ble brukt. Vi fant en 3-ganger lavere z-Disc tykkelse, etter PALM imaging (Figur 2). Det ble imidlertid ikke målt noen signifikant forskjell for sarkomtidslengden. Siden denne parameteren måles ved å oppdage topp-til-topp-intensitetsplottene, er effekten av økt oppløsning mindre uttalt.

For å oppnå denne høye romlige oppløsningen krever PALM veldefinerte bildeforhold som må tas nøye opp av brukeren. For en nøyaktig lokalisering av enkeltmolekyler er det nødvendig med fluoroforer som har spesielle fotofysiske egenskaper, noe som muliggjør rask veksling mellom fluorescerende og mørk tilstand, kaltblinkende 27. Som tidligere demonstrert kan valg av fluoroforer sterkt påvirke bildekvaliteten28. En dyp blinkende evne ble beskrevet for Alexa 647, en av de beste og mye brukte fargestoffer for enkelt molekyl lokalisering mikroskopi29,30,31. Men siden mange PALM fluoroforer er tilgjengelige, vil brukerne ha høy fleksibilitet når det gjelder prøvemerking27,,28.

Foruten valg av egnet fluorofor, er bildebuffersystemet et annet kritisk punkt i PALM-avbildning da det dikterer de fotofysiske egenskapene til det fluorescerende fargestoffet. Vi har brukt pyranoseoksidase som et oksygenrensersystem som er bedre enn glukoseoksidase, da det gir økt pH-stabilitet, og dermed tillater langsiktig avbildning uten en betydelig reduksjon av fluorofor blinker over tid32,33. Likevel, siden levetiden til bildebufferen er begrenset til flere timer, må den være nyberedt for hvert eksperiment for å sikre høy reproduserbarhet. Resultatene våre viser en dramatisk reduksjon av datanøyaktigheten etter PALM-avbildning med buffer av lav kvalitet, noe som fører til nedsatt blinkende evne og redusert lokaliseringspresisjon (figur 3A-C).

Videre er termisk stabilitet i bildesystemet obligatorisk for å unngå økt prøvedrift. Mens moderat drift kan korrigeres ved beregningsanalyse, fører overdreven prøvebevegelse til feilberegnet lokalisering av oppdagede fluoroforer og reduserer bildekvalitet og datanøyaktighet. Dette kan forebygges ved hjelp av mikroskoper med varmekamre og tilstrekkelig termisk likevekt av den respektive prøven før du starter PALM-avbildning. I tillegg bør merking tetthet og effektivitet samt bruk av antistofffragmenter eller nanolegemer vurderes for å optimalisere bildeforhold34,,35,,36.

Anskaffelsesprosessen av store cellulære strukturer kan ta 10-30 min, avhengig av bildeparametrene (synsfelt, fluorescerende sonde, bildebuffer etc.). Denne lange oppkjøpstiden er en ulempe med PALM som gjør det mindre hensiktsmessig for levende celleavbildning. Vanligvis fanges 5.000-10.000 rammer for å oppnå et tilstrekkelig antall blinkende hendelser med høy lokaliseringspresisjon. Bildedybden er også vanligvis begrenset til få hundre nanometer, noe som gjør det vanskelig å undersøke tykkere prøver. Forbedret oppløsning i z-retning kan imidlertid oppnås med et 3D PALM-oppsett37.

Vi har valgt to parametere for å α-actinin nettverk av iPSC CM, inkludert sarcomere lengde og z-Disc tykkelse. Ytterligere funksjoner kan samles inn for å få en mer omfattende visning på sarcomere stillas, for eksempel filament orientering. På samme måte kan 3D PALM bidra til å kvantitativt analysere hele sarkomerstrukturen ved estimering av nåværende noder og grener i nettverket.

Selv om PALM muliggjør en svært detaljert analyse av sarkomerstrukturen, tillater denne metoden ikke oppkjøpet av funksjonelle parametere som cellulær kontraktilitet, noe som er en annen viktig funksjon for å evaluere hjertemodenhet. Tidligere rapporter har vist at mikroskopibasert vurdering av sarkomerstruktur kan kombineres med videoanalyse for å få funksjonelle data38,39. Men siden forfatterne har brukt konvensjonell fluorescens mikroskopi innhentet data om sarcomere strukturen er mindre nøyaktig hvis sammenlignet med PALM. Vår tilnærming gir også mulighet til å korrelere PALM-data med tidligere tidsforløpsopptak og tillater derfor oppkjøp av sammentrekningsmålinger.

Oppsummert gir denne protokollen en metode for å kvantitativt evaluere den strukturelle modningen av sarcomere-nettverket i CM. Ved hjelp av denne superoppløsningsbaserte tilnærmingen kan strategier etableres rettet mot en forbedret hjerteutvikling av iPSC-avledet CM for å oppnå en mer voksenlignende fenotype.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.

Acknowledgments

Denne studien ble støttet av EUs strukturfond (ESF/14-BM-A55-0024/18). I tillegg støttes H.L. av FORUN-programmet ved Rostock University Medical Centre (889001 og 889003) og Josef og Käthe Klinz Foundation (T319/29737/2017). C.I.L. støttes av Clinician Scientist Program ved Rostock University Medical Center. R.D støttes av DFG (DA1296/6-1), DAMP foundation, German Heart Foundation (F/01/12) og BMBF (VIP+ 00240).

Vi takker Madeleine Bartsch for hennes tekniske støtte i iPSC cellekultur og hjertediensiasjon.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
human iPSC cell line Takara Y00325
µ-Slide 8 Well Glass Bottom ibidi 80827
0.5ml eppendorf tube Eppendorf 30121023
Bovine serum albumin Sigma Aldrich A906
Cardiomyocyte Dissociation Kit Stem Cell Technologies 05025
Catalase Sigma Aldrich C40-1G
Cyclooctatetraene Sigma Aldrich 138924-1G
Cysteamine Sigma Aldrich 30070-10g
Dulbecco's phosphate-buffered saline without Ca2+ and Mg2+ Thermo Fisher 14190169
F(ab')2-Goat anti-Mouse IgG Alexa Fluor 647 Thermo Fisher A-21237
Fiji image processing software (Image J)
Glucose Carl Roth X997.2
Hydrochloric acid Sigma Aldrich H1758
LSM 780 ELYRA PS.1 system Zeiss
Paraformaldehyde Merck 8187150100
Pyranose oxidase Sigma Aldrich P4234-250UN
sarcomeric α-actinin antibody [EA-53] Abcam ab9465
Sodium chloride Sigma Aldrich S7653
sterile water Carl Roth 3255.1
Triton X-100 Sigma Aldrich X100
Trizma base Sigma Aldrich T1503
β-Mercaptoethanol Sigma Aldrich 63689

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McAloon, C. J., et al. The changing face of cardiovascular disease 2000-2012: An analysis of the world health organisation global health estimates data. International Journal of Cardiology. 224, 256-264 (2016).
  2. Kussauer, S., David, R., Lemcke, H. hiPSCs Derived Cardiac Cells for Drug and Toxicity Screening and Disease Modeling: What Micro- Electrode-Array Analyses Can Tell Us. Cells. 8 (11), 1331 (2019).
  3. Ylä-Herttuala, S. iPSC-Derived Cardiomyocytes Taken to Rescue Infarcted Heart Muscle in Coronary Heart Disease Patients. Molecular Therapy. 26 (9), 2077 (2018).
  4. Kadota, S., Shiba, Y. Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocyte Transplantation for Heart Disease Treatment. Current Cardiology Reports. 21 (8), 73 (2019).
  5. Jiang, Y., Park, P., Hong, S. M., Ban, K. Maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells: Current strategies and limitations. Molecules and Cells. 41 (7), 613-621 (2018).
  6. Feric, N. T., Radisic, M. Maturing human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes in human engineered cardiac tissues. Advanced Drug Delivery Reviews. 96, 110-134 (2016).
  7. Ali, H., Braga, L., Giacca, M. Cardiac regeneration and remodelling of the cardiomyocyte cytoarchitecture. The FEBS Journal. 287 (3), 417-438 (2020).
  8. Yang, X., Pabon, L., Murry, C. E. Engineering adolescence: maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circulation Research. 114 (3), 511-523 (2014).
  9. Bedada, F. B., Wheelwright, M., Metzger, J. M. Maturation status of sarcomere structure and function in human iPSC-derived cardiac myocytes. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1863 (7), 1829-1838 (2016).
  10. Dai, Y., et al. Troponin destabilization impairs sarcomere-cytoskeleton interactions in iPSC-derived cardiomyocytes from dilated cardiomyopathy patients. Scientific Reports. 10 (1), 1-15 (2020).
  11. Huang, C. Y., et al. Enhancement of human iPSC-derived cardiomyocyte maturation by chemical conditioning in a 3D environment. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 138, 1-11 (2020).
  12. Ronaldson-Bouchard, K., et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).
  13. Lee, S., et al. Contractile force generation by 3D hiPSC-derived cardiac tissues is enhanced by rapid establishment of cellular interconnection in matrix with muscle-mimicking stiffness. Biomaterials. 131, 111-120 (2017).
  14. Baddeley, D., Bewersdorf, J. Biological Insight from Super-Resolution Microscopy: What We Can Learn from Localization-Based Images. Annual Review of Biochemistry. 87 (1), 965-989 (2018).
  15. Ovesný, M., Křížek, P., Borkovec, J., Švindrych, Z., Hagen, G. M. ThunderSTORM: A comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging. Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).
  16. Mahadev, K., Wu, X., Donnelly, S., Ouedraogo, R., Eckhart, A. D., Goldstein, B. J. Adiponectin inhibits vascular endothelial growth factor-induced migration of human coronary artery endothelial cells. Cardiovascular Research. 78 (2), 376-384 (2008).
  17. Lemcke, H., Skorska, A., Lang, C. I., Johann, L., David, R. Quantitative evaluation of the sarcomere network of human hiPSC-derived cardiomyocytes using single-molecule localization microscopy. International Journal of Molecular Sciences. 21 (8), 2819 (2020).
  18. Ackers-Johnson, M., et al. A simplified, langendorff-Free method for concomitant isolation of viable cardiac myocytes and nonmyocytes from the adult mouse heart. Circulation Research. 119 (8), 909-920 (2016).
  19. Lemcke, H., et al. Applying 3D-FRAP microscopy to analyse gap junction-dependent shuttling of small antisense RNAs between cardiomyocytes. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 98, 117-127 (2016).
  20. Karbassi, E., et al. Cardiomyocyte maturation: advances in knowledge and implications for regenerative medicine. Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).
  21. Krysiak, J., et al. Protein phosphatase 5 regulates titin phosphorylation and function at a sarcomere-associated mechanosensor complex in cardiomyocytes. Nature Communications. 9 (1), 1-14 (2018).
  22. Zaunbrecher, R. J., et al. Cronos Titin Is Expressed in Human Cardiomyocytes and Necessary for Normal Sarcomere Function. Circulation. 140 (20), 1647-1660 (2019).
  23. Fornasiero, E. F., Opazo, F. Super-resolution imaging for cell biologists. BioEssays. Fornasiero, E. F., Opazo, F. , Wiley Online Library. (2015).
  24. Jeziorowska, D., et al. Differential Sarcomere and Electrophysiological Maturation of Human iPSC-Derived Cardiac Myocytes in Monolayer vs. Aggregation-Based Differentiation Protocols. International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), 1173 (2017).
  25. Kroll, K., et al. Electro-mechanical conditioning of human iPSC-derived cardiomyocytes for translational research. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 130, 212-222 (2017).
  26. Zuppinger, C., et al. Characterization of cytoskeleton features and maturation status of cultured human iPSC-derived cardiomyocytes. European Journal of Histochemistry. 61 (2), 145-153 (2017).
  27. Jradi, F. M., Lavis, L. D. Chemistry of Photosensitive Fluorophores for Single-Molecule Localization Microscopy. ACS Chemical Biology. 14 (6), 1077-1090 (2019).
  28. Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nature Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).
  29. Lampe, A., Haucke, V., Sigrist, S. J., Heilemann, M., Schmoranzer, J. Multi-colour direct STORM with red emitting carbocyanines. Biology of the Cell. 104 (4), 229-237 (2012).
  30. Chamma, I., Levet, F., Sibarita, J. B., Sainlos, M., Thoumine, O. Nanoscale organization of synaptic adhesion proteins revealed by single-molecule localization microscopy. Neurophotonics. 3 (4), 041810 (2016).
  31. Ma, H., Fu, R., Xu, J., Liu, Y. A simple and cost-effective setup for super-resolution localization microscopy. Scientific Reports. 7 (1), 1-9 (2017).
  32. Olivier, N., Keller, D., Gönczy, P., Manley, S. Resolution Doubling in 3D-STORM Imaging through Improved Buffers. PLoS One. 8 (7), 0069004 (2013).
  33. Swoboda, M., et al. Enzymatic oxygen scavenging for photostability without ph drop in single-molecule experiments. ACS Nano. 6 (7), 6364-6369 (2012).
  34. Mikhaylova, M., et al. Resolving bundled microtubules using anti-tubulin nanobodies. Nature Communications. 6 (1), 1-7 (2015).
  35. Venkataramani, V., et al. Enhanced labeling density and whole-cell 3D dSTORM imaging by repetitive labeling of target proteins. Scientific Reports. 8 (1), 1-7 (2018).
  36. Erdélyi, M., et al. Origin and compensation of imaging artefacts in localization-based super-resolution microscopy. Methods. 88, 122-132 (2015).
  37. McGorty, R., Schnitzbauer, J., Zhang, W., Huang, B. Correction of depth-dependent aberrations in 3D single-molecule localization and super-resolution microscopy. Optics Letters. 39 (2), 275 (2014).
  38. Ribeiro, M. C., et al. A cardiomyocyte show of force: A fluorescent alpha-actinin reporter line sheds light on human cardiomyocyte contractility versus substrate stiffness. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 141, 54-64 (2020).
  39. Pioner, J. M., et al. Isolation and mechanical measurements of myofibrils from human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cell Reports. 6 (6), 885-896 (2016).

Tags

Biologi Utgave 165 humane induserte pluripotente stamceller kardiomyocytter superoppløsning modning sarkomerenettverk fotoaktivert lokalisering mikroskopi
Analysere det α-Actinin-nettverket i humane iPSC-avledede kardiomyocytter ved hjelp av enkeltmolekyl lokalisering mikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Johann, L., Chabanovska, O., Lang,… More

Johann, L., Chabanovska, O., Lang, C. I., David, R., Lemcke, H. Analyzing the α-Actinin Network in Human iPSC-Derived Cardiomyocytes Using Single Molecule Localization Microscopy. J. Vis. Exp. (165), e61605, doi:10.3791/61605 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter