Summary
Bildandet av en ordentlig sarkomer nätverk är viktigt för mognaden av iPSC-härledda kardiomyocyter. Vi presenterar en super resolution-baserade strategi som möjliggör kvantitativ utvärdering av den strukturella mognaden av stamceller härledda kardiomyocyter, att förbättra kultur villkor främja hjärt utveckling.
Abstract
Mognaden av iPSC-härledda kardiomyocyter är en kritisk fråga för deras tillämpning i regenerativ terapi, drogtester och sjukdom modellering. Trots utvecklingen av flera differentiering protokoll, är generationen av iPSC kardiomyocyter som liknar en vuxen-liknande fenotyp fortfarande utmanande. En viktig aspekt av kardiomyocyter mognad innebär bildandet av en välorganiserad sarkomere nätverk för att säkerställa hög kontraktion kapacitet. Här presenterar vi en super resolution-baserad strategi för semi-kvantitativ analys av α-aktinin nätverk i kardiomyocyter. Använda photoactivated lokalisering mikroskopi en jämförelse av sarcomere längd och z-skiva tjocklek av iPSC-härledda kardiomyocyter och hjärt celler isolerade från neonatal vävnad utfördes. Samtidigt visar vi vikten av korrekt bildframställning villkor för att få tillförlitliga uppgifter. Våra resultat visar att denna metod är lämplig att kvantitativt övervaka den strukturella mognad hjärtceller med hög rumslig upplösning, möjliggör detektering av även subtila förändringar av sarkomere organisation.
Introduction
Hjärt-kärlsjukdomar (CVD) såsom hjärtinfarkt eller kardiomyopati förblir den främsta dödsorsaken i västvärlden1. Eftersom det mänskliga hjärtat bara besitter dålig regenerativ kapacitet, finns det ett behov av strategier för att främja återhämtningen från cvds. Detta inkluderar cell ersättningsterapier för att fylla förlorade kardiomyocyter (CM), samt utveckling av nya anti-arytmiska läkemedel för effektiv och säker farmaceutisk intervention. Inducerad pluripotent stamceller (iPSC) har visat sig vara en lovande cellkälla för obegränsad generation av mänskliga CM in vitro, lämplig för regenerativa terapier, sjukdom modellering, och för utveckling av läkemedelsscreening analyser2,3,4.
Även om många olika protokoll för hjärtdifferentiering finns saknar iPSC-härledda CM fortfarande vissa fenotypiska och funktionella aspekter som hindrar in vitro- och in vivo-tillämpningen5,6. Bredvid elektrophysiologic, metaboliska, och molekylära förändringar, hjärtmognad processen innebär den strukturella organisationen av sarkomerer, som är de grundläggande enheter som krävs för kraft generation och cell kontraktion7. Medan vuxna CMs uppvisar en välorganiserad kontraktil apparat, iPSC-härledda CMs visar ofta disarranged sarcomere glödtrådar, i samband med en minskad kontraktion förmåga och förändrad kontraktiondynamik 8,9. I motsats till mogna CM som visar uniaxial kontraktion mönster, de desorienterade strukturer i omogna CM resulterar i en radiell sammandragning av hela cellen eller främja uppkomsten av kontraktion kontaktpunkter9,10.
För att förbättra hjärtmognad har flera tillvägagångssätt tillämpats, inklusive 3D-cellodlingsmetoder, elektrisk och mekanisk stimulering, samt användning av extracellulära matriser som härmar i vivo-förhållanden11,12,13. För att utvärdera framgång och effektivitet av dessa olika odlingsförhållanden behövs tekniker för att övervaka och uppskatta graden av den strukturella mognaden av iPSC CM, t.ex. I motsats till konventionella confocal imaging, upplösningen vid fotoaktiverad lokalisering mikroskopi (PALM) är ungefär 10x högre. Denna teknik i sin tur möjliggör en mer exakt analys, upptäcka även subtila förändringar av cellulära strukturer14. Med tanke på den höga upplösningen av PALM-baserade bildåtergivning, det övergripande målet för denna metod var den mikroskopiska utvärderingen av sarcomere mognad i iPSC-härledda CMs genom exakt bestämning av z-Disc tjocklek och sarcomere längd. I tidigare studier har dessa strukturella funktioner visat sig vara lämpliga parametrar för att bedöma hjärtmognad15. Till exempel, sjuka iPSC-CM saknar full längd dystrofin uppvisar minskad sarkomere längd och z-band bredd när man jämför med vilda typ celler16. Likaså var längden på enskilda sarkomeres mätt för att undersöka effekterna av topografiska ledtrådar på hjärtutveckling16. Därav tillämpade vi detta tillvägagångssätt för att utvärdera den strukturella mognaden av sarkomere nätverket i iPSC-CM genom att kvantitativt mäta sarkomlängd och z-skiva tjocklek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla steg i detta protokoll som involverar neonatal och vuxna möss utfördes enligt de etiska riktlinjerna för djurvård av Rostock University Medical Centre.
1. Odling och dissociation av iPSC-härledda kardiomyocyter
- Differentiera hiPSC-CMs för 25 dagar med en 2D monolayer metod som beskrivs tidigare17.
- Prewarm dissociation medium till 37 °C och stöd medelhög till rumstemperatur.
- Tvätta celler två gånger med PBS.
- Tillsätt förvagad dissociation medium till celler och inkubera i 12 min vid 37 °C och 5% CO2.
- Lägg till stödmedium i cellerna.
OBS: Volymen av tillagt stödmedium behöver vara dubbelt så stor som den dissociationsmedium som används i steg 1.4. - Rubba cellerna med hjälp av en 5 mL serologisk pipett.
- Centrifugera celler vid 200 x g i 5 min och resuspend pelleten i 3 mL av hiPSC-CM odling medium17.
- Fröceller i 8 brunnsglasbottenkammare vid en celltäthet på 75 000 celler/brunn och odling i 3 dagar.
2. Isolering av kardiomyocyter för vuxna
- Isolering och odling av vuxna kardiomyocyter från NMRI möss utfördes som rapporterats tidigare18.
- Fröceller i 8 brunnsglaskammarsglas och kultur under en dag.
3. Isolering och odling av neonatal kardiomyocyter
- Isoleringsprocedur av neonatal kardiomyocyter, erhållna från NMRI-möss, utfördes som beskrivits tidigare19.
- Frö isolerade cell i 8 väl glas kammare glida vid en celltäthet av 75.000 celler / väl och kultur i 3 dagar i neonatal CM kultur medium19.
4. Immunofluorescensmärkning av α-aktininnätverket
OBS: För optimalt resultat odlas celler i 8 brunnsglasbottenkammare. Märkning ska utföras en dag före bildbehandling.
- Förkrigsförvar 4% PFA vid 37 °C.
- Fixera iPSC-CM genom att lägga till 4% paraformaldehyd direkt i odlingsmediet (1:1 utspädning) och inkubera vid 37 °C i 15 min. Den slutliga koncentrationen av PFA för fixering är 2%.
- Inkubera fasta celler i 0,2% Triton-X, utspädd i PBS, i 5 min vid rumstemperatur.
- Tvätta celler två gånger med PBS, 5 min vardera.
- Tillsätt 1% BSA-lösning (utspädd i PBS) och inkubera i 60 min i rumstemperatur.
- Bered 150 μL primär antikroppslösning genom att späda α- aktinin antikropp 1:100 i 1% BSA, innehållande 0, 05% Triton-X. Lägg till i celler och inkubera i rumstemperatur i 60 min.
- Tvätta celler två gånger med 0,2% BSA lösning, 5 min vardera.
- Bered 150 μL sekundär antikroppslösning genom att späda ut get-anti-mouse Alexa647 antikropp 1:100 i 1% BSA, innehållande 0,05% Triton-X. Lägg till i cellerna och inkubera i rumstemperatur i 40 min.
- Tvätta celler två gånger med 0,2% BSA lösning, 5 min vardera.
- Tvätta celler två gånger med PBS, 5 min vardera. Håll märkta celler i mörker vid 4 °C tills PALM-avbildning.
5. Beredning av PALM-bildframställningsbufferten
OBS: Det är kritiskt att nyligen förbereda PALM imaging buffert för varje experiment.
- Förbered 50% glukoslösning genom att lösa upp 25 g glukos i 50 mL destillerat vatten.
- Bered grundbuffert innehållande 50 mM Tris-HCl, 10% glukos och 10 mM natriumklorid.
- Justera pH-nivån till ~8.0 med hjälp av saltsyra.
- Bered pyranosoxidaslösning genom att lösa upp 0,6 mg pyranosoxidas i 316 μL basbuffert.
- Bered katalaslösning genom att lösa upp 7 mg katalas i 500 μL grundbuffert. Blanda noggrant och centrifug vid 10 000 x g i 3 min. Håll supernatanten för vidare användning. Katalaslösningen kan hållas vid 4 °C i flera dagar.
- Bered 500 μL av PALM imaging buffert genom att blanda 316 μL av pyranosoxidaslösning, 25 μL katalaslösning, 100 μL av 50% glukoslösning, 50 μL av cysteamin, 5 μL av cyklooctatetraen och 3,5 μL av β-Merkapethanolto. Den slutliga katalytiska aktiviteten av pyranosoxidas och katalas behöver vara 7,5 U, 35,00U respektive.
OBS: PALM imaging buffert ger optimala bildförhållanden för 3-5 h. Om blinkande förmåga fluorescerande färgämnet minskar, förbereda en ny buffert alikvot.
6. PALM bild förvärv
- Slå på mikroskopet minst 3 h före användning och föra provet till rumstemperatur före avbildning för att tillåta termisk jämvikt. Om mikroskopet är utrustat med en inkubationskammare, justera temperaturen till 30 °C.
- Rengör objektivet och botten av kammarens objektglas med hjälp av ett lämpligt rengöringslösningsmedel.
- Tillsätt 300 μL av PALM imaging buffert i en brunn av märkta celler och sätt in kammaren glida i scenen innehavaren av mikroskopet.
- Ställ in parametrarna för anskaffning av PALM-bild.
- Välj 1,57 N.A. 100x oljemål för förvärv.
- Välj PALM-läge och aktivera TIRF-inställningarna.
- Justera antalet ramar som ska förvärvas. Vanligtvis räcker 5, 000-10, 000 ramar för att få optimala resultat. Antalet förvärvade ramar beror dock starkt på märkningseffektiviteten och det fluorescerande färgämnets blinkningsförmåga och kan justeras av användaren.
- Ställ UV-laser makt till 0,1% och 647 laser till 0,2%.
- Ställ in förstärkningsnivån på 50-100.
- Slå på laserbelysningen och välj en målcell. Förstärkningsnivån kan ökas om signalintensiteten är till låg (beroende på fluorescensmärkning).
- Stäng av laserbelysningen
- PALM bild förvärv
- Minska förstärkningen till 0 och öka lasereffekten (ex 647) till 100%.
- Bleka målcellen för ~5 s.
- Öka förstärkningen till 50 och starta PALM bild förvärv.
OBS: Gain måste justeras för att få tillräcklig signalintensitet medan övermättade pixlar bör undvikas. Om signalintensiteten minskar, öka förstärkningsnivån.
- Valfritt, stadigt förstärka UV-lasereffekten (0,1%-10%) att öka signalintensiteten och att främja blinkande av fluorofor.
7. Rekonstruktion av PALM-data
- Öppna programvaran Image J och importera PALM-data.
- Öppna Thunderstorm Plugin och "Kör analys"
- I menyn "Kamera setup" ange pixelstorlek och EM-förstärkning.
OBS: När du använder 100x mål och 1.6x förstoringslins, 100 nm pixelstorlek är lämpligt. Men eftersom pixelstorleken beror på maskinvarufunktionerna i mikroskopet och kameran som används för PALM-avbildning, måste användarna noggrant kontrollera och anpassa denna parameter. EM-förstärkningsvärden kan erhållas från metadata. - I "Kör analysmenyn" ställer parametrar enligt följande: B-spline-ordning: 3, B-spline-skala: 2,0, toppintensitetströskel: stf(Wave.F1), passande radie: 3, initial sigma: 1.6, förstoring: 5.0, uppdateringsfrekvens: 50, laterala skift: 2. Bekräfta genom att klicka på knappen "Ok".
- I menyn "Kamera setup" ange pixelstorlek och EM-förstärkning.
- Efterbearbetning av rekonstruerad PALM-bild
- I menyn "Plot histogram" väljer du "Sigma" -parametern.
- Använd verktyget "Rektangel "för att välja en ROI, exklusive möjliga artefakter och tillämpa ROI på filtret. ROI-värden kommer att visas i rutan filterkommando.
- Lägg till "& osäkerhet <25" till roi-värdena. Ett möjligt filterkommando kommer att se ut så här: "(sigma > 48.6821 & sigma < 1117.40) & osäkerhet <25". Tillämpa valda sigmavärden.
- I menyn "Ta bort dubbletter" anger du ett avståndströskelvärde på "10 nm" och applicera.
- I menyn "Sammanslagning", ställ in maximalt avstånd till "20", maximala bildrutor per molekyl till "0" och maximalt av bildrutor till "1". Tillämpa inställningar.
- I menyn "Driftkorrigering"väljer du korskorrelation och ställer in "Antal lagerplatser" till "5" och "Förstoring" till "5.0". Tillämpa inställningar för avdriftskorrigering.
- Spara den slutliga PALM bilden och exportera post bearbetade data om så önskas.
8. Analys av sarkomerfilament
- Analys av sarkomerlängd
- Öppna Image J programvara och importera den rekonstruerade PALM bilden.
- Rita en linje mellan utvalda sarkomstrukturer som är vinkelräta mot z-skivan för att mäta det kortaste avståndet mellan aktininfilament.
- Välj "Plotprofil" i menyn "Analysera" och anskaffa längden mellan två toppar. Eftersom sarkomlängden kan variera inom en cell bör minst 20 sarkomer mätas i olika områden av målcellen.
- Analys av z-Disc tjocklek
- Öppna Image J programvara och importera den rekonstruerade PALM bilden.
- Omvandla den rekonstruerade PALM-bilden till en bild med 8-bitarsläge.
- Öppna åsen upptäckt plugin och ange följande parametrar: linje bredd: 20, hög kontrast: 230, låg kontrast: 10, sigma: 0,79, lägre tröskel: 25,84, minsta linje längd: 20.
- Ställ in "Uppskattningsbredd", "Utöka linje" och "Visningsresultat".
- Klicka på "Ok" och använd" Mean line width" från resultattabell för ytterligare analyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För uppskattning av graden av strukturell mognad av CM, neonatal, fullt mogen vuxen och iPSC CM var ursprungligen märkt CM med α-aktinin antikropp för att visualisera sarcomere nätverket. Efter PALM förvärv, var bilder rekonstrueras, och z-skiva tjocklek mättes med hjälp av plugin-baserade bildbehandling programvara för automatisk upptäckt av bredden av enskilda glödtrådar. Sarcomere längd beräknades genom att mäta avståndet mellan två intilliggande intensitet toppar, motsvarande angränsande glödtrådar. I figur 1 visas utvärderingen av sarkomereorganisationen i iPSCs-derived CM.
Som presenteras i figur 2A, iPSC-CM och neonatal celler konstaterades uppvisar en liknande α - aktinin mönster med oregelbundna, disargulerade sarcomere strukturer. Likaså visade kvantitativ bedömning att längden och tjockleken på α - aktinin glödtrådar var nästan identiska vilket tyder på ett tidigt utvecklingstillstånd iPSC CM. Mer exakt var den genomsnittliga sarkomerelängden ca 1,83 μm (vuxen jämfört med iPSC CM jämfört med neonatal CM: 1,91 ± 0,02 1,83 ± 0,049 μm jämfört med 1,82±0,03 μm, n=20 celler), medan z-Disc tjocklek var ungefär 74 nm (vuxen vs. iPSC CM vs. neonatal CM: 71,30 ± 1,64 jämfört med 73,95 ± 0,86 nm vs. 74,08 ± 0,12 nm, n=20 celler) (Figur 2B). Däremot vuxen mogna CM visade en vanlig sarkomere nätverk med något ökad sarkomlängd och minskad z-Disc tjocklek.
Jämförelse av konventionella confocal imaging och PALM visat ingen signifikant skillnad av sarkomere längd (Figur 2C) (confocal vs PALM: 1,75 ± 0,02 vs 1,70 ± 0,02, n = 10 celler). Men en djupgående minskad z-Skiva tjocklek upptäcktes när iPSC-CM utsattes för PALM bildbehandling (Figur 2C) (confocal vs. PALM: 224.71 ± 4.31 vs. 73.91 ± 1.31, n=10 celler). Representativa bilder framhäver vinsten i upplösning när PALM tillämpades, med stöd av motsvarande intensitetsritningar (Figur 2D,E). Beräknad full bredd på halv maximal av fluorescens intensitet visade att α-aktinin strukturer är ~ 3-faldig tunnare i PALM bilder om jämfört med standard confocal mikroskopi (Figur 2E).
Enmolekyl lokaliseringsmikroskopi, som PALM, möjliggör detektion av intracellulära strukturer långt under diffraktion gränsen. För att säkerställa maximal rumslig upplösning krävs lämpliga bildförhållanden för exakt detektion av single molecule-lokalisering. Det använda bildbuffertsystemet är avgörande för denna förvärvsprocess eftersom det påverkar det fluorescerande färgämnets fotofysiska egenskaper och har därmed en betydande inverkan på den totala upplösningen och noggrannheten hos den slutliga PALM-bilden. Jämförelse mellan buffert av hög kvalitet och buffert som utarbetats en dag innan bildtagningen visade på en djupgående skillnad i glödtrådens tjocklek (Figur 3A,B). Sarkomstrukturer som förvärvats med buffert av låg kvalitet verkar vara tjockare vid jämförelse med optimala bildförhållanden (figur 3A). Faktum är att kvantitativ utvärdering visade att z-Disc tjocklek ökades med ~ 65% (hög kvalitet jämfört med låg kvalitet: 73,87 ± 1,02 nm jämfört med 113,9 ± 1,33 nm, n = 155 glödtrådar) (Figur 3B). Denna brist på datanoggrannhet beror på minskade blinkande egenskaper hos fluorofore som resulterar i mindre upptäckta fotoner per lokaliseringshändelse (hög kontra låg buffertkvalitet: 29689 fotoner/händelse jämfört med 16422 fotoner/händelser) (Figur 3C). Dessutom är lokalisering precision minskade under försämrad bildframställning villkor (hög kvalitet vs låg kvalitet: 14.25 ± 5.85 nm vs. 19.56 ± 6.7 nm), vilket sänker den övergripande upplösningen av den rekonstruerade PALM bilden (Figur 3C).
Dessutom kan provdrift, t.ex. som orsakas av termisk instabilitet, påverka exakt lokalisering av fluorescerande molekyler och resulterar i suddiga bilder, som presenteras i figur 3D. Medan optimal PALM-avbildning ger tydliga och väldefinierade intensitetstoppar, ger överdriven provdrift ett oregelbundet intensitetsmönster som gör det svårt att exakt bestämma avståndet mellan två intilliggande glödtrådar. Dessa data belyser vikten av hårt kontrollerade bildframställning villkor i enda molekyl lokalisering mikroskopi som även subtila förändringar under förvärvsprocessen dramatiskt kan minska bildkvalitet och data noggrannhet.
Figur 1: Utvärdering av sarkomere organisationen i iPSCs-derived CM.
Sarcomere nätverket var fluorescently märkt med en α-aktinin antikropp, följt av PALM bild förvärv. Efterföljande återuppbyggnad leder till den slutliga PALM bilden som användes för kvantitativ analys. Längden på enskilda sarkomeres bestämdes genom att mäta avståndet mellan två intensitet toppar som motsvarar angränsande sarcomere glödtrådar (1-5). Z-Disc tjocklek beräknades automatiskt av en plugin-baserade bildbehandling verktyg. Skala bar 10 μm. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 2: Kvantitativ jämförelse av z-skiva tjocklek och sarkomerelängd i CM som härrör från iPSCs, vuxna, och neonatal hjärtvävnad.
(A) Rekonstruerade PALM-bilder av α-aktinin-nätverket av iPSC och neonatal CM. (B) En kvantitativ bedömning visade att all neonatal och delar hög likhet i sarkomerelängd (vuxen vs. iPSC CM vs. neonatal CM: 1.91 ± 0.02 1.83 ± 0.049 μm vs. 1.82±0.03 μm) och tjockleken av enskilda glödtrådar (vuxen vs. iPSC CM vs. neonatal CM: 71,30 ± 1,64 vs 73,95 ± 0,86 nm jämfört med 74,08 ± 0,12 nm), som anger den för tidiga fenotypen av iPSC CM. (C) Jämförelse av sarcomere längd och z-Disc tjocklek mellan konventionella confocal imaging och PALM-baserade datainköp. Eftersom sarkomerlängden bestämdes genom att mäta topp-till-toppavståndet var effekten av ökad upplösning på datanoggrannhet mindre uttalad (confocal vs. PALM: 1,75 ± 0,02 jämfört med 1,70 ± 0,02). Däremot upptäcktes en betydligt lägre z-Skiva tjocklek när PALM tillämpades (confocal vs. PALM: 224.71 ± 4.31 vs. 73.91 ± 1.31). (D) Representativa mikroskopiska bilder av iPSC-CM erhållna genom konfokal och PALM-avbildning. (E) Fluorescensintensitetsytningar som motsvarar den röda linjen som visas i (D). Värden representerar full bredd vid halv maximal fluorescensintensitet, vilket tyder på en djupgående ökning av upplösningen i PALM-bilder. Data presenteras som medelvärde ± SEM, n=10-20 celler, 20 sarkomerer per cell utvärderades. Statistisk signifikans fastställdes med hjälp avstudenter t -Test. **p<0.005, Skala bar 10 μm. Klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 3: Inverkan av buffertkvalitet och provavdrift på datans noggrannhet och tillförlitlighet.
(A) Representativa PALM-bilder av iPSC-härledda CM som förvärvats under olika bildframställningsförhållanden. Sarkomfilament visas tjockare i prover som har avbildats med buffert av låg kvalitet. Röda linjer indikerar representativ mätning av sarkomerlängd, medan gröna glödtrådsstrukturer inkluderades i z-Disc-analys. (B) Kvantitativ utvärdering bekräftade en betydande skillnad i z-Disc tjocklek mellan låg- och högklassig buffert (hög kontra låg buffertkvalitet: 73,87 ± 1,02 nm jämfört med 113,9 ± 1,34 nm) (C) Denna skillnad i bildnoggrannhet baserades på en nedsatt blinkförmåga hos fluorofor, vilket ledde till ett minskat antal upptäckta fotoner per molekyl (hög kontra låg buffertkvalitet: 29689 fotoner/händelse kontra 16422 fotoner/händelser). Samtidigt minskade lokaliseringsprecisionen vilket i sin tur sänkte den övergripande upplösningen (hög kontra låg buffertkvalitet: 14,25 ± 5,85 jämfört med 19,56 ± 6,7) (D) Likaså kan överdriven provdrift försämra bildkvaliteten. Medan korrekt bild förvärv utan prov drift resulterar i väldefinierade intensitet toppar av α-aktinin glödtrådar, ökad provdrift framkallar en oregelbunden intensitet mönster, som starkt påverkar noggrann analys av sarkomere längd. Data presenteras som medelvärde ± SEM. 155 filament analyserades. Statistisk signifikans fastställdes med hjälp av studenter t-Test. ****p<0.0001. Skala bar 10μm. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Genereringen av funktionella iPSC-härledda CM in vitro är viktigt för regenerativa terapier, sjukdomsmodellering och utveckling av läkemedels-screening plattformar. Men otillräcklig mognad av dessa CM är ett stort hinder i kardiovaskulärforskning 20. I detta avseende behövs högupplösta avbildningstekniker som möjliggör övervakning av det strukturella mognadstillståndet för iPSC-härledda CM. Samtidigt kan super upplösning mikroskopi vara ett värdefullt verktyg för att exakt analysera funktionen av specifika proteiner, som krävs för korrekt sarkombildning som nyligen visats för titin och troponin10,21,22.
I det aktuella protokollet presenterar vi en PALM-baserad metod för att kvantitativt utvärdera den strukturella mognaden av iPSC CM genom att analysera α-aktinin sarcomere nätverk.
Jämfört med den konventionella ljusmikroskopin möjliggör PALM visualisering av cellulära strukturer med en upplösning på ~20-50 nm23. Således gör det möjligt att upptäcka även subtila förändringar av hjärt sarkomere nätverk som knappt eller inte ens detekterbara av klassisk ljus mikroskopi metoder. Tillämpa PALM, har vi mätt en genomsnittlig sarcomere längd på ~ 1,84 μm i iPSC och neonatal CM (Figur 2). Detta är i linje med flera tidigare rapporter som visar att storleken på enskilda sarkomer är ~1,7-2,0 μm24,25,26. Jämfört med sarkomerlängd är exakt uppskattning av tjockleken på z-linjer mer komplicerad eftersom dess storlek är långt under den klassiska upplösningsgränsen för ljusmikroskopi. Med hjälp av elektronmikroskopi, tidigare studier visade att z-Disc tjocklek varierar från 50 till 80 nm i iPSC CM, som liknar vår PALM-baserade detektion av ~ 73 nm (Figur 2).
Jämförelse med standard confocal mikroskopi visat den dramatiska ökningen av upplösning när PALM tillämpades. Vi hittade en 3-faldig lägre z-Disc tjocklek, efter PALM imaging (Figur 2). Ingen signifikant skillnad mättes dock för sarkomerlängden. Eftersom denna parameter mäts genom att detektera topp-till-topp-avståndet av intensitetsytter, är effekten av ökad upplösning mindre uttalad.
För att uppnå denna höga rumsliga upplösning kräver PALM väldefinierade bildförhållanden som måste åtgärdas noggrant av användaren. För en noggrann lokalisering av enstaka molekyler behövs fluoroforer som har speciella fotofysiska egenskaper, vilket möjliggör snabb växling mellan fluorescerande och mörkt tillstånd, som kallas blinkar27. Som tidigare visats kan urvalet av fluoroforer starkt påverka bildkvaliteten28. En djupgående blinkande förmåga beskrevs för Alexa 647, en av de bästa och allmänt använda färgämnen för single molecule lokalisering mikroskopi29,30,31. Men eftersom ett flertal PALM fluoroforer finns tillgängliga, kommer användarna att ha hög flexibilitet när det gäller provmärkning27,28.
Förutom val av lämplig fluorophore, imaging buffertsystemet är en annan kritisk punkt i PALM imaging som det dikterar de fotofysiska egenskaperna hos fluorescerande färgämne. Vi har tillämpat pyranos oxidas som en syre asätare system som är överlägsen glukosoxidas eftersom det ger en ökad pH stabilitet, därav, möjliggör långsiktig avbildning utan en signifikant minskning av fluorophore blinkar med tiden32,33. Men eftersom imaging-buffertens livslängd är begränsad till flera timmar måste den vara nyberedd för varje experiment för att säkerställa hög reproducerbarhet. Våra resultat visar en dramatisk minskning av datanoggrannheten efter PALM-bildbehandling med låg kvalitetsbuffert, vilket leder till försämrad blinkförmåga och minskad lokaliseringsprecision (Figur 3A-C).
Dessutom är termisk stabilitet i bildsystemet obligatoriskt för att undvika ökad provdrift. Medan måttlig drift kan korrigeras genom beräkningsanalys, leder överdriven provrörelse till felberäknad lokalisering av upptäckta fluoroforer och minskar bildkvaliteten och datanoggrannheten. Detta kan förhindras genom att mikroskop med värmekammare används och tillräcklig termisk jämvikt av respektive prov innan handflatan påbörjas. Dessutom bör märkningstäthet och effektivitet samt användning av antikroppsfragment eller nanokroppar övervägas för att optimera bildförhållandena34,35,36.
Förvärvsprocessen av stora cellulära strukturer kan ta 10-30 min, beroende på bildframställning parametrar (synfält, fluorescerande sond, imaging buffert etc.). Denna långa förvärvstid är en nackdel med PALM vilket gör det mindre lämpligt för livecellsavbildning. Normalt fångas 5.000-10.000-ramar för att uppnå ett tillräckligt antal blinkande händelser med hög lokaliseringsprecision. Också är bilddjupet vanligtvis begränsat till några hundra nanometer, vilket gör det svårt att undersöka tjockare prover. Dock kan förstärkt upplösning i z-riktning erhållas med en 3D PALM setup37.
Vi har valt ut två parametrar för att karakterisera α-aktinin-nätverket av iPSC CM, inklusive sarkomerlängd och z-Disc-tjocklek. Ytterligare funktioner skulle kunna samlas in för att få en mer omfattande syn på sarkomereställningen, till exempel glödtrådsorientering. Likaså kan 3D PALM bidra till att kvantitativt analysera hela sarkomerstrukturen genom uppskattning av nuvarande noder och förgreningar inom nätverket.
Även palm möjliggör en mycket detaljerad analys av sarkomer struktur, tillåter denna metod inte förvärv av funktionella parametrar som cellulär kontraktilitet, vilket är en annan viktig funktion för att utvärdera hjärt mognad. Tidigare rapporter har visat att mikroskopibaserad bedömning av sarkomerstrukturen kan kombineras med videoanalys för att få funktionella data38,39. Men eftersom författarna har använt konventionella fluorescens mikroskopi erhållna data om sarcomere strukturen är mindre exakt om jämfört med PALM. Vårt tillvägagångssätt ger också möjlighet att korrelera PALM-data med tidigare tidsförloppsinspelningar och möjliggör därför förvärv av kontraktionsmätningar.
Sammanfattningsvis ger detta protokoll en metod för att kvantitativt utvärdera den strukturella mognaden av sarkomere nätverket i CM. Med hjälp av denna super upplösning-baserade metoden, strategier kan fastställa inriktning en förbättrad hjärt utveckling av iPSC-härledda CM att få en mer vuxen-liknande fenotyp.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar ingen intressekonflikt.
Acknowledgments
Denna studie stöddes av EU:s strukturfond (ESF/14-BM-A55-0024/18). Dessutom stöds H.L. av FORUN-programmet för Rostock University Medical Centre (889001 och 889003) samt Josef och Käthe Klinz Stiftelse (T319/29737/2017). C.I.L. stöds av Clinician Scientist Program vid Rostock University Medical Center. R.D stöds av DFG (DA1296/6-1), DAMP-stiftelsen, Tyska Hjärtstiftelsen (F/01/12) och BMBF (VIP+ 00240).
Vi tackar Madeleine Bartsch för hennes tekniska stöd i iPSC cell kultur och hjärt differentiering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| human iPSC cell line | Takara | Y00325 | |
| µ-Slide 8 Well Glass Bottom | ibidi | 80827 | |
| 0.5ml eppendorf tube | Eppendorf | 30121023 | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A906 | |
| Cardiomyocyte Dissociation Kit | Stem Cell Technologies | 05025 | |
| Catalase | Sigma Aldrich | C40-1G | |
| Cyclooctatetraene | Sigma Aldrich | 138924-1G | |
| Cysteamine | Sigma Aldrich | 30070-10g | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline without Ca2+ and Mg2+ | Thermo Fisher | 14190169 | |
| F(ab')2-Goat anti-Mouse IgG Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher | A-21237 | |
| Fiji image processing software (Image J) | |||
| Glucose | Carl Roth | X997.2 | |
| Hydrochloric acid | Sigma Aldrich | H1758 | |
| LSM 780 ELYRA PS.1 system | Zeiss | ||
| Paraformaldehyde | Merck | 8187150100 | |
| Pyranose oxidase | Sigma Aldrich | P4234-250UN | |
| sarcomeric α-actinin antibody [EA-53] | Abcam | ab9465 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S7653 | |
| sterile water | Carl Roth | 3255.1 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
| Trizma base | Sigma Aldrich | T1503 | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | 63689 |
References
- McAloon, C. J., et al. The changing face of cardiovascular disease 2000-2012: An analysis of the world health organisation global health estimates data. International Journal of Cardiology. 224, 256-264 (2016).
- Kussauer, S., David, R., Lemcke, H. hiPSCs Derived Cardiac Cells for Drug and Toxicity Screening and Disease Modeling: What Micro- Electrode-Array Analyses Can Tell Us. Cells. 8 (11), 1331 (2019).
- Ylä-Herttuala, S. iPSC-Derived Cardiomyocytes Taken to Rescue Infarcted Heart Muscle in Coronary Heart Disease Patients. Molecular Therapy. 26 (9), 2077 (2018).
- Kadota, S., Shiba, Y. Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocyte Transplantation for Heart Disease Treatment. Current Cardiology Reports. 21 (8), 73 (2019).
- Jiang, Y., Park, P., Hong, S. M., Ban, K. Maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells: Current strategies and limitations. Molecules and Cells. 41 (7), 613-621 (2018).
- Feric, N. T., Radisic, M. Maturing human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes in human engineered cardiac tissues. Advanced Drug Delivery Reviews. 96, 110-134 (2016).
- Ali, H., Braga, L., Giacca, M. Cardiac regeneration and remodelling of the cardiomyocyte cytoarchitecture. The FEBS Journal. 287 (3), 417-438 (2020).
- Yang, X., Pabon, L., Murry, C. E. Engineering adolescence: maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circulation Research. 114 (3), 511-523 (2014).
- Bedada, F. B., Wheelwright, M., Metzger, J. M. Maturation status of sarcomere structure and function in human iPSC-derived cardiac myocytes. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1863 (7), 1829-1838 (2016).
- Dai, Y., et al. Troponin destabilization impairs sarcomere-cytoskeleton interactions in iPSC-derived cardiomyocytes from dilated cardiomyopathy patients. Scientific Reports. 10 (1), 1-15 (2020).
- Huang, C. Y., et al. Enhancement of human iPSC-derived cardiomyocyte maturation by chemical conditioning in a 3D environment. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 138, 1-11 (2020).
- Ronaldson-Bouchard, K., et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).
- Lee, S., et al. Contractile force generation by 3D hiPSC-derived cardiac tissues is enhanced by rapid establishment of cellular interconnection in matrix with muscle-mimicking stiffness. Biomaterials. 131, 111-120 (2017).
- Baddeley, D., Bewersdorf, J. Biological Insight from Super-Resolution Microscopy: What We Can Learn from Localization-Based Images. Annual Review of Biochemistry. 87 (1), 965-989 (2018).
- Ovesný, M., Křížek, P., Borkovec, J., Švindrych, Z., Hagen, G. M. ThunderSTORM: A comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging. Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).
- Mahadev, K., Wu, X., Donnelly, S., Ouedraogo, R., Eckhart, A. D., Goldstein, B. J. Adiponectin inhibits vascular endothelial growth factor-induced migration of human coronary artery endothelial cells. Cardiovascular Research. 78 (2), 376-384 (2008).
- Lemcke, H., Skorska, A., Lang, C. I., Johann, L., David, R. Quantitative evaluation of the sarcomere network of human hiPSC-derived cardiomyocytes using single-molecule localization microscopy. International Journal of Molecular Sciences. 21 (8), 2819 (2020).
- Ackers-Johnson, M., et al. A simplified, langendorff-Free method for concomitant isolation of viable cardiac myocytes and nonmyocytes from the adult mouse heart. Circulation Research. 119 (8), 909-920 (2016).
- Lemcke, H., et al. Applying 3D-FRAP microscopy to analyse gap junction-dependent shuttling of small antisense RNAs between cardiomyocytes. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 98, 117-127 (2016).
- Karbassi, E., et al. Cardiomyocyte maturation: advances in knowledge and implications for regenerative medicine. Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).
- Krysiak, J., et al. Protein phosphatase 5 regulates titin phosphorylation and function at a sarcomere-associated mechanosensor complex in cardiomyocytes. Nature Communications. 9 (1), 1-14 (2018).
- Zaunbrecher, R. J., et al. Cronos Titin Is Expressed in Human Cardiomyocytes and Necessary for Normal Sarcomere Function. Circulation. 140 (20), 1647-1660 (2019).
- Fornasiero, E. F., Opazo, F. Super-resolution imaging for cell biologists. BioEssays. Fornasiero, E. F., Opazo, F. , Wiley Online Library. (2015).
- Jeziorowska, D., et al. Differential Sarcomere and Electrophysiological Maturation of Human iPSC-Derived Cardiac Myocytes in Monolayer vs. Aggregation-Based Differentiation Protocols. International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), 1173 (2017).
- Kroll, K., et al. Electro-mechanical conditioning of human iPSC-derived cardiomyocytes for translational research. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 130, 212-222 (2017).
- Zuppinger, C., et al. Characterization of cytoskeleton features and maturation status of cultured human iPSC-derived cardiomyocytes. European Journal of Histochemistry. 61 (2), 145-153 (2017).
- Jradi, F. M., Lavis, L. D. Chemistry of Photosensitive Fluorophores for Single-Molecule Localization Microscopy. ACS Chemical Biology. 14 (6), 1077-1090 (2019).
- Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nature Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).
- Lampe, A., Haucke, V., Sigrist, S. J., Heilemann, M., Schmoranzer, J. Multi-colour direct STORM with red emitting carbocyanines. Biology of the Cell. 104 (4), 229-237 (2012).
- Chamma, I., Levet, F., Sibarita, J. B., Sainlos, M., Thoumine, O. Nanoscale organization of synaptic adhesion proteins revealed by single-molecule localization microscopy. Neurophotonics. 3 (4), 041810 (2016).
- Ma, H., Fu, R., Xu, J., Liu, Y. A simple and cost-effective setup for super-resolution localization microscopy. Scientific Reports. 7 (1), 1-9 (2017).
- Olivier, N., Keller, D., Gönczy, P., Manley, S. Resolution Doubling in 3D-STORM Imaging through Improved Buffers. PLoS One. 8 (7), 0069004 (2013).
- Swoboda, M., et al. Enzymatic oxygen scavenging for photostability without ph drop in single-molecule experiments. ACS Nano. 6 (7), 6364-6369 (2012).
- Mikhaylova, M., et al. Resolving bundled microtubules using anti-tubulin nanobodies. Nature Communications. 6 (1), 1-7 (2015).
- Venkataramani, V., et al. Enhanced labeling density and whole-cell 3D dSTORM imaging by repetitive labeling of target proteins. Scientific Reports. 8 (1), 1-7 (2018).
- Erdélyi, M., et al. Origin and compensation of imaging artefacts in localization-based super-resolution microscopy. Methods. 88, 122-132 (2015).
- McGorty, R., Schnitzbauer, J., Zhang, W., Huang, B. Correction of depth-dependent aberrations in 3D single-molecule localization and super-resolution microscopy. Optics Letters. 39 (2), 275 (2014).
- Ribeiro, M. C., et al. A cardiomyocyte show of force: A fluorescent alpha-actinin reporter line sheds light on human cardiomyocyte contractility versus substrate stiffness. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 141, 54-64 (2020).
- Pioner, J. M., et al. Isolation and mechanical measurements of myofibrils from human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cell Reports. 6 (6), 885-896 (2016).
