Summary

Analysera α-Actinin Network i mänskliga iPSC-härledda kardiomyocyter med hjälp av single molecule lokaliseringsmikroskopi

Published: November 03, 2020
doi:

Summary

Bildandet av en ordentlig sarkomer nätverk är viktigt för mognaden av iPSC-härledda kardiomyocyter. Vi presenterar en super resolution-baserade strategi som möjliggör kvantitativ utvärdering av den strukturella mognaden av stamceller härledda kardiomyocyter, att förbättra kultur villkor främja hjärt utveckling.

Abstract

Mognaden av iPSC-härledda kardiomyocyter är en kritisk fråga för deras tillämpning i regenerativ terapi, drogtester och sjukdom modellering. Trots utvecklingen av flera differentiering protokoll, är generationen av iPSC kardiomyocyter som liknar en vuxen-liknande fenotyp fortfarande utmanande. En viktig aspekt av kardiomyocyter mognad innebär bildandet av en välorganiserad sarkomere nätverk för att säkerställa hög kontraktion kapacitet. Här presenterar vi en super resolution-baserad strategi för semi-kvantitativ analys av α-aktinin nätverk i kardiomyocyter. Använda photoactivated lokalisering mikroskopi en jämförelse av sarcomere längd och z-skiva tjocklek av iPSC-härledda kardiomyocyter och hjärt celler isolerade från neonatal vävnad utfördes. Samtidigt visar vi vikten av korrekt bildframställning villkor för att få tillförlitliga uppgifter. Våra resultat visar att denna metod är lämplig att kvantitativt övervaka den strukturella mognad hjärtceller med hög rumslig upplösning, möjliggör detektering av även subtila förändringar av sarkomere organisation.

Introduction

Hjärt-kärlsjukdomar (CVD) såsom hjärtinfarkt eller kardiomyopati förblir den främsta dödsorsaken i västvärlden1. Eftersom det mänskliga hjärtat bara besitter dålig regenerativ kapacitet, finns det ett behov av strategier för att främja återhämtningen från cvds. Detta inkluderar cell ersättningsterapier för att fylla förlorade kardiomyocyter (CM), samt utveckling av nya anti-arytmiska läkemedel för effektiv och säker farmaceutisk intervention. Inducerad pluripotent stamceller (iPSC) har visat sig vara en lovande cellkälla för obegränsad generation av mänskliga CM in vitro, lämplig för regenerativa terapier, sjukdom modellering, och för utveckling av läkemedelsscreening analyser2,3,4.

Även om många olika protokoll för hjärtdifferentiering finns saknar iPSC-härledda CM fortfarande vissa fenotypiska och funktionella aspekter som hindrar in vitro- och in vivo-tillämpningen5,6. Bredvid elektrophysiologic, metaboliska, och molekylära förändringar, hjärtmognad processen innebär den strukturella organisationen av sarkomerer, som är de grundläggande enheter som krävs för kraft generation och cell kontraktion7. Medan vuxna CMs uppvisar en välorganiserad kontraktil apparat, iPSC-härledda CMs visar ofta disarranged sarcomere glödtrådar, i samband med en minskad kontraktion förmåga och förändrad kontraktiondynamik 8,9. I motsats till mogna CM som visar uniaxial kontraktion mönster, de desorienterade strukturer i omogna CM resulterar i en radiell sammandragning av hela cellen eller främja uppkomsten av kontraktion kontaktpunkter9,10.

För att förbättra hjärtmognad har flera tillvägagångssätt tillämpats, inklusive 3D-cellodlingsmetoder, elektrisk och mekanisk stimulering, samt användning av extracellulära matriser som härmar i vivo-förhållanden11,12,13. För att utvärdera framgång och effektivitet av dessa olika odlingsförhållanden behövs tekniker för att övervaka och uppskatta graden av den strukturella mognaden av iPSC CM, t.ex. I motsats till konventionella confocal imaging, upplösningen vid fotoaktiverad lokalisering mikroskopi (PALM) är ungefär 10x högre. Denna teknik i sin tur möjliggör en mer exakt analys, upptäcka även subtila förändringar av cellulära strukturer14. Med tanke på den höga upplösningen av PALM-baserade bildåtergivning, det övergripande målet för denna metod var den mikroskopiska utvärderingen av sarcomere mognad i iPSC-härledda CMs genom exakt bestämning av z-Disc tjocklek och sarcomere längd. I tidigare studier har dessa strukturella funktioner visat sig vara lämpliga parametrar för att bedöma hjärtmognad15. Till exempel, sjuka iPSC-CM saknar full längd dystrofin uppvisar minskad sarkomere längd och z-band bredd när man jämför med vilda typ celler16. Likaså var längden på enskilda sarkomeres mätt för att undersöka effekterna av topografiska ledtrådar på hjärtutveckling16. Därav tillämpade vi detta tillvägagångssätt för att utvärdera den strukturella mognaden av sarkomere nätverket i iPSC-CM genom att kvantitativt mäta sarkomlängd och z-skiva tjocklek.

Protocol

Alla steg i detta protokoll som involverar neonatal och vuxna möss utfördes enligt de etiska riktlinjerna för djurvård av Rostock University Medical Centre. 1. Odling och dissociation av iPSC-härledda kardiomyocyter Differentiera hiPSC-CMs för 25 dagar med en 2D monolayer metod som beskrivs tidigare17. Prewarm dissociation medium till 37 °C och stöd medelhög till rumstemperatur. Tvätta celler två gånger med PBS. Tills?…

Representative Results

För uppskattning av graden av strukturell mognad av CM, neonatal, fullt mogen vuxen och iPSC CM var ursprungligen märkt CM med α-aktinin antikropp för att visualisera sarcomere nätverket. Efter PALM förvärv, var bilder rekonstrueras, och z-skiva tjocklek mättes med hjälp av plugin-baserade bildbehandling programvara för automatisk upptäckt av bredden av enskilda glödtrådar. Sarcomere längd beräknades genom att mäta avståndet mellan två intilliggande intensitet toppar, motsvarande angränsande glödtråd…

Discussion

Genereringen av funktionella iPSC-härledda CM in vitro är viktigt för regenerativa terapier, sjukdomsmodellering och utveckling av läkemedels-screening plattformar. Men otillräcklig mognad av dessa CM är ett stort hinder i kardiovaskulärforskning 20. I detta avseende behövs högupplösta avbildningstekniker som möjliggör övervakning av det strukturella mognadstillståndet för iPSC-härledda CM. Samtidigt kan super upplösning mikroskopi vara ett värdefullt verktyg för att exakt analy…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Denna studie stöddes av EU:s strukturfond (ESF/14-BM-A55-0024/18). Dessutom stöds H.L. av FORUN-programmet för Rostock University Medical Centre (889001 och 889003) samt Josef och Käthe Klinz Stiftelse (T319/29737/2017). C.I.L. stöds av Clinician Scientist Program vid Rostock University Medical Center. R.D stöds av DFG (DA1296/6-1), DAMP-stiftelsen, Tyska Hjärtstiftelsen (F/01/12) och BMBF (VIP+ 00240).

Vi tackar Madeleine Bartsch för hennes tekniska stöd i iPSC cell kultur och hjärt differentiering.

Materials

human iPSC cell line Takara Y00325
µ-Slide 8 Well Glass Bottom ibidi 80827
0.5ml eppendorf tube Eppendorf 30121023
Bovine serum albumin Sigma Aldrich A906
Cardiomyocyte Dissociation Kit Stem Cell Technologies 05025
Catalase Sigma Aldrich C40-1G
Cyclooctatetraene Sigma Aldrich 138924-1G
Cysteamine Sigma Aldrich 30070-10g
Dulbecco's phosphate-buffered saline without Ca2+ and Mg2+ Thermo Fisher 14190169
F(ab')2-Goat anti-Mouse IgG Alexa Fluor 647 Thermo Fisher A-21237
Fiji image processing software (Image J)
Glucose Carl Roth X997.2
Hydrochloric acid Sigma Aldrich H1758
LSM 780 ELYRA PS.1 system Zeiss
Paraformaldehyde Merck 8187150100
Pyranose oxidase Sigma Aldrich P4234-250UN
sarcomeric α-actinin antibody [EA-53] Abcam ab9465
Sodium chloride Sigma Aldrich S7653
sterile water Carl Roth 3255.1
Triton X-100 Sigma Aldrich X100
Trizma base Sigma Aldrich T1503
β-Mercaptoethanol Sigma Aldrich 63689

References

  1. McAloon, C. J., et al. The changing face of cardiovascular disease 2000-2012: An analysis of the world health organisation global health estimates data. International Journal of Cardiology. 224, 256-264 (2016).
  2. Kussauer, S., David, R., Lemcke, H. hiPSCs Derived Cardiac Cells for Drug and Toxicity Screening and Disease Modeling: What Micro- Electrode-Array Analyses Can Tell Us. Cells. 8 (11), 1331 (2019).
  3. Ylä-Herttuala, S. iPSC-Derived Cardiomyocytes Taken to Rescue Infarcted Heart Muscle in Coronary Heart Disease Patients. Molecular Therapy. 26 (9), 2077 (2018).
  4. Kadota, S., Shiba, Y. Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocyte Transplantation for Heart Disease Treatment. Current Cardiology Reports. 21 (8), 73 (2019).
  5. Jiang, Y., Park, P., Hong, S. M., Ban, K. Maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells: Current strategies and limitations. Molecules and Cells. 41 (7), 613-621 (2018).
  6. Feric, N. T., Radisic, M. Maturing human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes in human engineered cardiac tissues. Advanced Drug Delivery Reviews. 96, 110-134 (2016).
  7. Ali, H., Braga, L., Giacca, M. Cardiac regeneration and remodelling of the cardiomyocyte cytoarchitecture. The FEBS Journal. 287 (3), 417-438 (2020).
  8. Yang, X., Pabon, L., Murry, C. E. Engineering adolescence: maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circulation Research. 114 (3), 511-523 (2014).
  9. Bedada, F. B., Wheelwright, M., Metzger, J. M. Maturation status of sarcomere structure and function in human iPSC-derived cardiac myocytes. Biochimica et Biophysica Acta – Molecular Cell Research. 1863 (7), 1829-1838 (2016).
  10. Dai, Y., et al. Troponin destabilization impairs sarcomere-cytoskeleton interactions in iPSC-derived cardiomyocytes from dilated cardiomyopathy patients. Scientific Reports. 10 (1), 1-15 (2020).
  11. Huang, C. Y., et al. Enhancement of human iPSC-derived cardiomyocyte maturation by chemical conditioning in a 3D environment. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 138, 1-11 (2020).
  12. Ronaldson-Bouchard, K., et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).
  13. Lee, S., et al. Contractile force generation by 3D hiPSC-derived cardiac tissues is enhanced by rapid establishment of cellular interconnection in matrix with muscle-mimicking stiffness. Biomaterials. 131, 111-120 (2017).
  14. Baddeley, D., Bewersdorf, J. Biological Insight from Super-Resolution Microscopy: What We Can Learn from Localization-Based Images. Annual Review of Biochemistry. 87 (1), 965-989 (2018).
  15. Ovesný, M., Křížek, P., Borkovec, J., Švindrych, Z., Hagen, G. M. ThunderSTORM: A comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging. Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).
  16. Mahadev, K., Wu, X., Donnelly, S., Ouedraogo, R., Eckhart, A. D., Goldstein, B. J. Adiponectin inhibits vascular endothelial growth factor-induced migration of human coronary artery endothelial cells. Cardiovascular Research. 78 (2), 376-384 (2008).
  17. Lemcke, H., Skorska, A., Lang, C. I., Johann, L., David, R. Quantitative evaluation of the sarcomere network of human hiPSC-derived cardiomyocytes using single-molecule localization microscopy. International Journal of Molecular Sciences. 21 (8), 2819 (2020).
  18. Ackers-Johnson, M., et al. A simplified, langendorff-Free method for concomitant isolation of viable cardiac myocytes and nonmyocytes from the adult mouse heart. Circulation Research. 119 (8), 909-920 (2016).
  19. Lemcke, H., et al. Applying 3D-FRAP microscopy to analyse gap junction-dependent shuttling of small antisense RNAs between cardiomyocytes. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 98, 117-127 (2016).
  20. Karbassi, E., et al. Cardiomyocyte maturation: advances in knowledge and implications for regenerative medicine. Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).
  21. Krysiak, J., et al. Protein phosphatase 5 regulates titin phosphorylation and function at a sarcomere-associated mechanosensor complex in cardiomyocytes. Nature Communications. 9 (1), 1-14 (2018).
  22. Zaunbrecher, R. J., et al. Cronos Titin Is Expressed in Human Cardiomyocytes and Necessary for Normal Sarcomere Function. Circulation. 140 (20), 1647-1660 (2019).
  23. Fornasiero, E. F., Opazo, F., Fornasiero, E. F., Opazo, F. Super-resolution imaging for cell biologists. BioEssays. , (2015).
  24. Jeziorowska, D., et al. Differential Sarcomere and Electrophysiological Maturation of Human iPSC-Derived Cardiac Myocytes in Monolayer vs. Aggregation-Based Differentiation Protocols. International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), 1173 (2017).
  25. Kroll, K., et al. Electro-mechanical conditioning of human iPSC-derived cardiomyocytes for translational research. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 130, 212-222 (2017).
  26. Zuppinger, C., et al. Characterization of cytoskeleton features and maturation status of cultured human iPSC-derived cardiomyocytes. European Journal of Histochemistry. 61 (2), 145-153 (2017).
  27. Jradi, F. M., Lavis, L. D. Chemistry of Photosensitive Fluorophores for Single-Molecule Localization Microscopy. ACS Chemical Biology. 14 (6), 1077-1090 (2019).
  28. Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nature Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).
  29. Lampe, A., Haucke, V., Sigrist, S. J., Heilemann, M., Schmoranzer, J. Multi-colour direct STORM with red emitting carbocyanines. Biology of the Cell. 104 (4), 229-237 (2012).
  30. Chamma, I., Levet, F., Sibarita, J. B., Sainlos, M., Thoumine, O. Nanoscale organization of synaptic adhesion proteins revealed by single-molecule localization microscopy. Neurophotonics. 3 (4), 041810 (2016).
  31. Ma, H., Fu, R., Xu, J., Liu, Y. A simple and cost-effective setup for super-resolution localization microscopy. Scientific Reports. 7 (1), 1-9 (2017).
  32. Olivier, N., Keller, D., Gönczy, P., Manley, S. Resolution Doubling in 3D-STORM Imaging through Improved Buffers. PLoS One. 8 (7), 0069004 (2013).
  33. Swoboda, M., et al. Enzymatic oxygen scavenging for photostability without ph drop in single-molecule experiments. ACS Nano. 6 (7), 6364-6369 (2012).
  34. Mikhaylova, M., et al. Resolving bundled microtubules using anti-tubulin nanobodies. Nature Communications. 6 (1), 1-7 (2015).
  35. Venkataramani, V., et al. Enhanced labeling density and whole-cell 3D dSTORM imaging by repetitive labeling of target proteins. Scientific Reports. 8 (1), 1-7 (2018).
  36. Erdélyi, M., et al. Origin and compensation of imaging artefacts in localization-based super-resolution microscopy. Methods. 88, 122-132 (2015).
  37. McGorty, R., Schnitzbauer, J., Zhang, W., Huang, B. Correction of depth-dependent aberrations in 3D single-molecule localization and super-resolution microscopy. Optics Letters. 39 (2), 275 (2014).
  38. Ribeiro, M. C., et al. A cardiomyocyte show of force: A fluorescent alpha-actinin reporter line sheds light on human cardiomyocyte contractility versus substrate stiffness. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 141, 54-64 (2020).
  39. Pioner, J. M., et al. Isolation and mechanical measurements of myofibrils from human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cell Reports. 6 (6), 885-896 (2016).

Play Video

Cite This Article
Johann, L., Chabanovska, O., Lang, C. I., David, R., Lemcke, H. Analyzing the α-Actinin Network in Human iPSC-Derived Cardiomyocytes Using Single Molecule Localization Microscopy. J. Vis. Exp. (165), e61605, doi:10.3791/61605 (2020).

View Video