Bildandet av en ordentlig sarkomer nätverk är viktigt för mognaden av iPSC-härledda kardiomyocyter. Vi presenterar en super resolution-baserade strategi som möjliggör kvantitativ utvärdering av den strukturella mognaden av stamceller härledda kardiomyocyter, att förbättra kultur villkor främja hjärt utveckling.
Mognaden av iPSC-härledda kardiomyocyter är en kritisk fråga för deras tillämpning i regenerativ terapi, drogtester och sjukdom modellering. Trots utvecklingen av flera differentiering protokoll, är generationen av iPSC kardiomyocyter som liknar en vuxen-liknande fenotyp fortfarande utmanande. En viktig aspekt av kardiomyocyter mognad innebär bildandet av en välorganiserad sarkomere nätverk för att säkerställa hög kontraktion kapacitet. Här presenterar vi en super resolution-baserad strategi för semi-kvantitativ analys av α-aktinin nätverk i kardiomyocyter. Använda photoactivated lokalisering mikroskopi en jämförelse av sarcomere längd och z-skiva tjocklek av iPSC-härledda kardiomyocyter och hjärt celler isolerade från neonatal vävnad utfördes. Samtidigt visar vi vikten av korrekt bildframställning villkor för att få tillförlitliga uppgifter. Våra resultat visar att denna metod är lämplig att kvantitativt övervaka den strukturella mognad hjärtceller med hög rumslig upplösning, möjliggör detektering av även subtila förändringar av sarkomere organisation.
Hjärt-kärlsjukdomar (CVD) såsom hjärtinfarkt eller kardiomyopati förblir den främsta dödsorsaken i västvärlden1. Eftersom det mänskliga hjärtat bara besitter dålig regenerativ kapacitet, finns det ett behov av strategier för att främja återhämtningen från cvds. Detta inkluderar cell ersättningsterapier för att fylla förlorade kardiomyocyter (CM), samt utveckling av nya anti-arytmiska läkemedel för effektiv och säker farmaceutisk intervention. Inducerad pluripotent stamceller (iPSC) har visat sig vara en lovande cellkälla för obegränsad generation av mänskliga CM in vitro, lämplig för regenerativa terapier, sjukdom modellering, och för utveckling av läkemedelsscreening analyser2,3,4.
Även om många olika protokoll för hjärtdifferentiering finns saknar iPSC-härledda CM fortfarande vissa fenotypiska och funktionella aspekter som hindrar in vitro- och in vivo-tillämpningen5,6. Bredvid elektrophysiologic, metaboliska, och molekylära förändringar, hjärtmognad processen innebär den strukturella organisationen av sarkomerer, som är de grundläggande enheter som krävs för kraft generation och cell kontraktion7. Medan vuxna CMs uppvisar en välorganiserad kontraktil apparat, iPSC-härledda CMs visar ofta disarranged sarcomere glödtrådar, i samband med en minskad kontraktion förmåga och förändrad kontraktiondynamik 8,9. I motsats till mogna CM som visar uniaxial kontraktion mönster, de desorienterade strukturer i omogna CM resulterar i en radiell sammandragning av hela cellen eller främja uppkomsten av kontraktion kontaktpunkter9,10.
För att förbättra hjärtmognad har flera tillvägagångssätt tillämpats, inklusive 3D-cellodlingsmetoder, elektrisk och mekanisk stimulering, samt användning av extracellulära matriser som härmar i vivo-förhållanden11,12,13. För att utvärdera framgång och effektivitet av dessa olika odlingsförhållanden behövs tekniker för att övervaka och uppskatta graden av den strukturella mognaden av iPSC CM, t.ex. I motsats till konventionella confocal imaging, upplösningen vid fotoaktiverad lokalisering mikroskopi (PALM) är ungefär 10x högre. Denna teknik i sin tur möjliggör en mer exakt analys, upptäcka även subtila förändringar av cellulära strukturer14. Med tanke på den höga upplösningen av PALM-baserade bildåtergivning, det övergripande målet för denna metod var den mikroskopiska utvärderingen av sarcomere mognad i iPSC-härledda CMs genom exakt bestämning av z-Disc tjocklek och sarcomere längd. I tidigare studier har dessa strukturella funktioner visat sig vara lämpliga parametrar för att bedöma hjärtmognad15. Till exempel, sjuka iPSC-CM saknar full längd dystrofin uppvisar minskad sarkomere längd och z-band bredd när man jämför med vilda typ celler16. Likaså var längden på enskilda sarkomeres mätt för att undersöka effekterna av topografiska ledtrådar på hjärtutveckling16. Därav tillämpade vi detta tillvägagångssätt för att utvärdera den strukturella mognaden av sarkomere nätverket i iPSC-CM genom att kvantitativt mäta sarkomlängd och z-skiva tjocklek.
Genereringen av funktionella iPSC-härledda CM in vitro är viktigt för regenerativa terapier, sjukdomsmodellering och utveckling av läkemedels-screening plattformar. Men otillräcklig mognad av dessa CM är ett stort hinder i kardiovaskulärforskning 20. I detta avseende behövs högupplösta avbildningstekniker som möjliggör övervakning av det strukturella mognadstillståndet för iPSC-härledda CM. Samtidigt kan super upplösning mikroskopi vara ett värdefullt verktyg för att exakt analy…
The authors have nothing to disclose.
Denna studie stöddes av EU:s strukturfond (ESF/14-BM-A55-0024/18). Dessutom stöds H.L. av FORUN-programmet för Rostock University Medical Centre (889001 och 889003) samt Josef och Käthe Klinz Stiftelse (T319/29737/2017). C.I.L. stöds av Clinician Scientist Program vid Rostock University Medical Center. R.D stöds av DFG (DA1296/6-1), DAMP-stiftelsen, Tyska Hjärtstiftelsen (F/01/12) och BMBF (VIP+ 00240).
Vi tackar Madeleine Bartsch för hennes tekniska stöd i iPSC cell kultur och hjärt differentiering.
human iPSC cell line | Takara | Y00325 | |
µ-Slide 8 Well Glass Bottom | ibidi | 80827 | |
0.5ml eppendorf tube | Eppendorf | 30121023 | |
Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A906 | |
Cardiomyocyte Dissociation Kit | Stem Cell Technologies | 05025 | |
Catalase | Sigma Aldrich | C40-1G | |
Cyclooctatetraene | Sigma Aldrich | 138924-1G | |
Cysteamine | Sigma Aldrich | 30070-10g | |
Dulbecco's phosphate-buffered saline without Ca2+ and Mg2+ | Thermo Fisher | 14190169 | |
F(ab')2-Goat anti-Mouse IgG Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher | A-21237 | |
Fiji image processing software (Image J) | |||
Glucose | Carl Roth | X997.2 | |
Hydrochloric acid | Sigma Aldrich | H1758 | |
LSM 780 ELYRA PS.1 system | Zeiss | ||
Paraformaldehyde | Merck | 8187150100 | |
Pyranose oxidase | Sigma Aldrich | P4234-250UN | |
sarcomeric α-actinin antibody [EA-53] | Abcam | ab9465 | |
Sodium chloride | Sigma Aldrich | S7653 | |
sterile water | Carl Roth | 3255.1 | |
Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
Trizma base | Sigma Aldrich | T1503 | |
β-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | 63689 |