Summary
La formación de una red adecuada de sarcomere es importante para la maduración de los cardiomiocitos derivados del iPSC. Presentamos un enfoque basado en la super resolución que permite la evaluación cuantitativa de la maduración estructural de los cardiomiocitos derivados de células madre, para mejorar las condiciones de cultivo promoviendo el desarrollo cardíaco.
Abstract
La maduración de los cardiomiocitos derivados de iPSC es un problema crítico para su aplicación en la terapia regenerativa, las pruebas de drogas y el modelado de enfermedades. A pesar del desarrollo de múltiples protocolos de diferenciación, la generación de cardiomiocitos iPSC que se asemejan a un fenotipo similar a un adulto sigue siendo un reto. Un aspecto importante de la maduración de los cardiomiocitos consiste en la formación de una red de sarcomere bien organizada para garantizar una alta capacidad de contracción. Aquí, presentamos un enfoque basado en la superrescencia para el análisis semicuantitativo de la red α-actinina en cardiomiocitos. Mediante la microscopía de localización fotoactivada se realizó una comparación de la longitud de los sarcomos y el grosor del disco z de los cardiomiocitos derivados de iPSC y las células cardíacas aisladas del tejido neonatal. Al mismo tiempo, demostramos la importancia de las condiciones de imagen adecuadas para obtener datos fiables. Nuestros resultados muestran que este método es adecuado para monitorear cuantitativamente la madurez estructural de las células cardíacas con alta resolución espacial, permitiendo la detección de cambios incluso sutiles de la organización del sarcomere.
Introduction
Las enfermedades cardiovasculares (ECV) como el infarto de miocardio o la miocardiopatía siguen siendo la principal causa de muerte en el mundo occidental1. Como el corazón humano sólo posee una mala capacidad regenerativa, es necesario establecer estrategias para promover la recuperación de las enfermedades cardiovasculares. Esto incluye terapias de reemplazo celular para reponer los cardiomiocitos perdidos (CM), así como el desarrollo de nuevos fármacos antiarrítmicos para una intervención farmacéutica eficiente y segura. Se ha demostrado que las células madre pluripotentes inducidas (iPSC) son una fuente celular prometedora para la generación ilimitada de CM humano in vitro, adecuada para terapias regenerativas, modelado de enfermedades y para el desarrollo de ensayos de detección de fármacos2,,3,,4.
Aunque existen muchos protocolos de diferenciación cardiaca diferentes, la CM derivada de iPSC todavía carece de ciertos aspectos fenotípicos y funcionales que impiden la aplicación in vitro e in vivo5,6. Además de los cambios electrofisiológicos, metabólicos y moleculares, el proceso de maduración cardíaca implica la organización estructural de los sarcomeres, que son las unidades fundamentales necesarias para la generación de fuerza y la contracción celular7. Mientras que los CM adultos exhiben un aparato contráctil bien organizado, los CM derivados de iPSC suelen demostrar filamentos de sarcomer desarbanados, asociados con una capacidad de contracción reducida y una dinámica de contracción alterada8,,9. A diferencia de la CM madura que muestra un patrón de contracción noxial, las estructuras desorientadas en CM inmaduro resulta en una contracción radial de toda la célula o promueven la aparición de puntos focales de contracción9,,10.
Para mejorar la maduración cardiaca, se han aplicado múltiples enfoques, incluyendo métodos de cultivo celular 3D, estimulación eléctrica y mecánica, así como el uso de matrices extracelulares que imitan las condiciones in vivo11,,12,,13. Para evaluar el éxito y la eficiencia de estas diferentes condiciones de cultivo, se necesitan técnicas para monitorear y estimar el grado de maduración estructural del iPSC CM, por ejemplo, mediante técnicas microscópicas. A diferencia de las imágenes confocales convencionales, la resolución en caso de microscopía de localización fotoactivada (PALM) es aproximadamente 10 veces mayor. Esta técnica a su vez permite un análisis más preciso, detectando incluso alteraciones sutiles de las estructuras celulares14. Teniendo en cuenta la alta resolución de las imágenes basadas en PALM, el objetivo general de este método fue la evaluación microscópica de la madurez de los sarcomeres en los CM derivados de iPSC mediante la determinación precisa del espesor del z-Disc y la longitud del sarcomere. En estudios anteriores, se ha demostrado que estas características estructurales son parámetros adecuados para evaluar la madurez cardíaca15. Por ejemplo, el iPSC-CM enfermo que carece de distrofina de longitud completa exhibe una longitud reducida de sarcomere y ancho de banda z en comparación con las celdas de tipo salvaje16. Del mismo modo, se midió la longitud de los sarcomeres individuales para investigar el impacto de las señales topográficas en el desarrollo cardíaco16. Por lo tanto, aplicamos este enfoque para evaluar la maduración estructural de la red de sarcomere en iPSC-CM midiendo cuantitativamente la longitud de sarcomere y el espesor del disco z.
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Protocol
Todos los pasos de este protocolo que involucran ratones neonatales y adultos se realizaron de acuerdo con las pautas éticas para el cuidado animal del Centro Médico de la Universidad de Rostock.
1. Cultivo y disociación de cardiomiocitos derivados de iPSC
- Diferencie hiPSC-CMs durante 25 días utilizando un método monocapa 2D como se describió anteriormente17.
- Precalentamiento medio de disociación a 37 oC y soporte de temperatura media a ambiente.
- Lave las células dos veces con PBS.
- Añadir medio de disociación precalentado a las células e incubar durante 12 min a 37oC y 5% de CO2.
- Agregue un medio de soporte a las celdas.
NOTA: El volumen del medio de soporte añadido debe ser el doble del volumen del medio de disociación utilizado en el paso 1.4. - Desalojar las células con una pipeta serológica de 5 ml.
- Células centrífugas a 200 x g durante 5 min y resuspend el pellet en 3 ml del medio de cultivo hiPSC-CM17.
- Células de semillas en cámaras inferiores de vidrio de 8 pozos con una densidad celular de 75.000 células/pozo y cultivo durante 3 días.
2. Aislamiento de cardiomiocitos para adultos
- El aislamiento y cultivo de cardiomiocitos adultos a partir de ratones NMRI se realizó según se informó previamentede 18.
- Células de semillas en tobogán de cámara de vidrio de 8 pozos y cultivo durante un día.
3. Aislamiento y cultivo de cardiomiocitos neonatales
- El procedimiento de aislamiento de los cardiomiocitos neonatales, obtenidos a partir de ratones NMRI, se realizó como se describió anteriormente19.
- Célula aislada de semilla en 8 biens de vidrio de la cámara de deslizamiento a una densidad celular de 75.000 células / pozo y cultivo durante 3 días en medio de cultivo de CM neonatal19.
4. Etiquetado de inmunofluorescencia de la red α-actinin
NOTA: Para obtener resultados óptimos, las células se cultivan en cámaras inferiores de vidrio de 8 pozos. El etiquetado debe realizarse un día antes de la toma de imágenes.
- Precalienta el 4% de PFA a 37oC.
- Fijar iPSC-CM añadiendo un 4% de paraformaldehído directamente en los medios de cultivo (1:1 dilución) e incubar a 37 oC durante 15 min. La concentración final de PFA para la fijación es del 2%.
- Incubar células fijas en 0.2% Tritón-X, diluidas en PBS, durante 5 min a temperatura ambiente.
- Lave las células dos veces con PBS, 5 min cada una.
- Añadir 1% de solución de BSA (diluido en PBS) e incubar durante 60 minutos a temperatura ambiente.
- Preparar 150 l de solución primaria de anticuerpos diluyendo α anticuerpo-actinina 1:100 en 1% de BSA, que contiene 0,05% Tritón-X. Añadir a las células e incubar a temperatura ambiente durante 60 min.
- Lave las células dos veces con una solución de BSA al 0,2%, 5 min cada una.
- Preparar 150 l de solución secundaria de anticuerpos diluyendo el anticuerpo Alexa647 anti-ratón de cabra 1:100 en 1% de BSA, que contiene 0,05% Tritón-X. Añadir a las células e incubar a temperatura ambiente durante 40 min.
- Lave las células dos veces con una solución de BSA al 0,2%, 5 min cada una.
- Lave las células dos veces con PBS, 5 min cada una. Mantenga las células etiquetadas en la oscuridad a 4 oC hasta que se realicen imágenes PALM.
5. Preparación del búfer de imágenes PALM
NOTA: Es fundamental preparar recién el búfer de imágenes PALM para cada experimento.
- Preparar una solución de glucosa al 50% disolviendo 25 g de glucosa en 50 ml de agua destilada.
- Preparar tampón básico que contenga 50 mM de Tris-HCl, 10% de glucosa y cloruro de sodio de 10 mM.
- Ajuste el nivel de pH a 8,0 con ácido clorhídrico.
- Preparar la solución de piranose oxidasa disolviendo 0,6 mg de piranosa oxidasa en 316 l de tampón básico.
- Preparar la solución de catalasa disolviendo 7 mg de catalasa en 500 ml de tampón básico. Mezclar bien y centrifugar a 10.000 x g durante 3 min. Mantenga el sobrenadante para su uso posterior. La solución de catalasa se puede mantener a 4 oC durante varios días.
- Preparar 500 l de tampón de imágenes PALM mezclando 316 l de solución de piranose oxidasa, 25 l de solución de catalasa, 100 l de solución de glucosa al 50%, 50 ml de cistemina, 5 l de ciclooctato y 3,5 l de β-Mercaptoetanol. La actividad catalítica final de la piranosa oxidasa y la catalasa debe ser de 7,5 U, 35,00U respectivamente.
NOTA: El búfer de imágenes PALM proporciona condiciones óptimas de imagen durante 3-5 h. Si la capacidad de parpadeo del tinte fluorescente disminuye, prepare una nueva alícuota tampón.
6. Adquisición de imágenes PALM
- Encienda el microscopio al menos 3 horas antes de su uso y lleve la muestra a temperatura ambiente antes de la toma de imágenes para permitir el equilibrio térmico. Si el microscopio está equipado con una cámara de incubación, ajuste la temperatura a 30 oC.
- Limpie el objetivo y la parte inferior del portaobjetos de la cámara con un disolvente de limpieza adecuado.
- Agregue 300 l de tampón de imágenes PALM en un pocóculo de células etiquetadas e inserte la diapositiva de la cámara en el soporte de escenario del microscopio.
- Establezca los parámetros de adquisición de imágenes PALM.
- Seleccione 1.57 N.A. 100x objetivo de petróleo para la adquisición.
- Seleccione el modo PALM y active la configuración de TIRF.
- Ajuste el número de fotogramas que se van a adquirir. Por lo general, 5,000-10, 000 tramas son suficientes para obtener resultados óptimos. Sin embargo, el número de fotogramas adquiridos depende en gran medida de la eficiencia de etiquetado y la capacidad de parpadeo del tinte fluorescente y puede ser ajustado por el usuario.
- Establezca la potencia del láser UV en 0.1% y 647 láser a 0.2%.
- Establezca el nivel de ganancia en 50-100.
- Encienda la iluminación láser y seleccione una celda de destino. El nivel de ganancia se puede aumentar si la intensidad de la señal es baja (dependiendo del etiquetado de fluorescencia).
- Apague la iluminación láser
- Adquisición de imágenes PALM
- Reduzca la ganancia a 0 y aumente la potencia del láser (ex 647) al 100%.
- Blanquee la celda de destino durante 5 s.
- Aumente la ganancia a 50 e inicie la adquisición de imágenes PALM.
NOTA: La ganancia debe ajustarse para obtener suficiente intensidad de señal, mientras que se deben evitar los píxeles sobresaturados. Si la intensidad de la señal se reduce, aumente el nivel de ganancia.
- Opcionalmente, mejorar constantemente la potencia del láser UV (0,1%-10%) para aumentar la intensidad de la señal y promover el parpadeo del fluoróforo.
7. Reconstrucción de los datos de PALM
- Abra el software Image J e importe los datos PALM.
- Abra Thunderstorm Plugin y "Ejecutar análisis"
- En el menú"Configuración de la cámara"introduzca el tamaño de píxel y la ganancia em.
NOTA: Cuando se utilizan objetivos de 100x y lente de aumento de 1,6x, el tamaño de píxel de 100 nm es adecuado. Sin embargo, dado que el tamaño del píxel depende de las características de hardware del microscopio y la cámara utilizadas para las imágenes PALM, los usuarios deben comprobar y adaptar cuidadosamente este parámetro. Los valores de ganancia EM se pueden obtener de los metadatos. - En el"Menú de análisis de ejecución"establecer parámetros de la siguiente manera: orden B-spline: 3, escala B-spline: 2.0, umbral de intensidad máxima: stf (Wave.F1), radio de ajuste: 3, sigma inicial: 1.6, ampliación: 5.0, frecuencia de actualización: 50, desplazamientos laterales: 2. Confirme haciendo clic en el botón "Ok".
- En el menú"Configuración de la cámara"introduzca el tamaño de píxel y la ganancia em.
- Postprocesamiento de la imagen PALM reconstruida
- En el menú "Histograma de trazado" seleccione el parámetro "Sigma".
- Utilice la herramienta"Rectángulo"para seleccionar un ROI, excluyendo posibles artefactos y aplicar ROI al filtro. Los valores de ROI aparecerán en el cuadro de comando de filtro.
- Agregue "& uncertainty <25" a los valores de ROI. Un posible comando de filtro tendrá este aspecto: "(sigma > 48.6821 & sigma < 1117.40) & uncertainty <25". Aplique los valores de sigma seleccionados.
- En el menú"Eliminar duplicados",introduzca un umbral de distancia de "10 nm" y aplique.
- En el"Menú de fusión",establezca la distancia máxima en "20", los fotogramas máximos por molécula en "0" y los fotogramas máximos apagados en "1". Aplique la configuración.
- En el"Menú de corrección de deriva",seleccione correlación cruzada y establezca "Número de bins" en "5" y"Ampliación"en "5.0". Aplique ajustes de corrección de deriva.
- Guarde la imagen PALM final y exporte los datos posteriores a los procesados si lo desea.
8. Análisis de filamentos de sarcomere
- Análisis de la longitud del sarcomere
- Abra el software Image J e importe la imagen PALM reconstruida.
- Dibuje una línea entre las estructuras de sarcomer seleccionadas perpendiculares al disco z para medir la distancia más corta entre los filamentos de actinina.
- Seleccione "Trazar perfil" en el menú "Analizar" y adquirir la longitud entre dos picos. Dado que la longitud del sarcomere puede variar dentro de una célula, se debe medir un mínimo de 20 sarcomeres en diferentes áreas de la célula objetivo.
- Análisis del espesor de z-Disc
- Abra el software Image J e importe la imagen PALM reconstruida.
- Convierta la imagen PALM reconstruida en una imagen en modo de 8 bits.
- Abra el plugin de detección de crestas e introduzca los siguientes parámetros: ancho de línea: 20, alto contraste: 230, contraste bajo: 10, sigma: 0.79, umbral inferior: 25.84, longitud mínima de línea: 20.
- Establezca "Anchura de estimación", "Extender línea"y "Mostrar resultados".
- Haga clic en "Aceptar"y utilice "Ancho de línea medio" de la tabla de resultados para análisis adicionales.
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Representative Results
Para estimar el grado de maduración estructural de CM, neonatal, adulto completamente maduro, y iPSC CM fueron etiquetados inicialmente el CM con anticuerpos α-actinin para visualizar la red de sarcomere. Después de la adquisición de PALM, se reconstruyeron imágenes y se midió el grosor del disco z utilizando un software de procesamiento de imágenes basado en plugins para la detección automática del ancho de los filamentos individuales. La longitud de los sarcomeres se calculó midiendo la distancia entre dos picos de intensidad adyacentes, correspondientes a los filamentos vecinos. La Figura 1 muestra la evaluación de la organización de sarcomere en CM derivado de iPSC.
Como se presenta en la Figura 2A,se encontró que las células iPSC-CM y neonatales mostraban un patrón similar α- actinina con estructuras de sarcomere irregulares y desorganizadas. Asimismo, la evaluación cuantitativa demostró que la longitud y el grosor de los filamentos de α-actinina eran casi idénticos, lo que indica un estado de desarrollo prematuro del iPSC CM. Más precisamente, la longitud media de los sarcomos fue de aproximadamente 1,83 m (adulto frente a iPSC CM frente a CM neonatal: 1,91 ± 0,02 1,83 ± 0,049 m frente a 1,82±0,03 m, n-20 células), mientras que el espesor del z-Disc fue de aproximadamente 74 nm (adulto frente a iPSC CM frente a CM neonatal: 71,30 ± 1,64 frente a 73,95 ± 0,86 nm frente a 74,08 ± 0,12 nm, n-20 celdas)(Figura 2B). Por el contrario, cm maduro adulto mostró una red regular de sarcomere con un ligera aumento de la longitud de sarcomere y un espesor de z-Disc reducido.
La comparación de las imágenes confocales convencionales y PALM no demostró ninguna diferencia significativa de la longitud de la sarcomere (Figura 2C) (confocal frente a PALM: 1.75 ± 0.02 frente a 1.70 ± 0.02, n-10 células). Sin embargo, se detectó un espesor profundo reducido del z-Disc cuando el iPSC-CM se sometió a imágenes PALM (Figura 2C) (confocal frente a PALM: 224,71 ± 4,31 frente a 73,91 ± 1,31, n-10 de las células). Las imágenes representativas resaltan la ganancia en resolución cuando se aplicó PALM, respaldada por las gráficas de intensidad correspondientes (Figura 2D,E). La anchura completa calculada a la mitad de la intensidad de fluorescencia reveló que las estructuras de α-actinin son 3 veces más delgadas en las imágenes PALM si se comparan con la microscopía confocal estándar (Figura 2E).
La microscopía de localización de molécula única, como PALM, permite la detección de estructuras intracelulares muy por debajo del límite de difracción. Para garantizar la máxima resolución espacial, se requieren condiciones de imagen adecuadas para la detección precisa de la localización de moléculas únicas. El sistema de búfer de imágenes utilizado es fundamental para este proceso de adquisición, ya que influye en las propiedades fotofísicas del tinte fluorescente y, por lo tanto, tiene un impacto significativo en la resolución general y la precisión de la imagen final de PALM. La comparación entre el tampón de alta calidad y el tampón preparado un día antes de la toma de imágenes reveló una profunda diferencia en el grosor del filamento (Figura 3A,B). Las estructuras de sarcomere adquiridas con tampón de baja calidad parecen ser más gruesas en comparación con las condiciones óptimas de imagen(Figura 3A). De hecho, la evaluación cuantitativa mostró que el espesor del z-Disc se incrementó en un 65% (alta calidad frente a baja calidad: 73,87 ± 1,02 nm frente a 113,9 ± 1,33 nm, n-155 filamentos)(Figura 3B). Esta falta de precisión de datos se debe a la reducción de las propiedades de parpadeo del fluoróforo que da como resultado menos fotones detectados por evento de localización (alta frente a baja calidad de búfer: 29689 fotones/evento frente a 16422 fotones/eventos) (Figura 3C). Además, la precisión de localización se reduce en condiciones de imagen deterioradas (alta calidad frente a baja calidad: 14,25 ± 5,85 nm frente a 19,56 ± 6,7 nm), lo que reduce la resolución general de la imagen PALM reconstruida (Figura 3C).
Además, la deriva de la muestra, por ejemplo, causada por la inestabilidad térmica, puede afectar a la localización precisa de moléculas fluorescentes y da lugar a imágenes borrosas, como se presenta en la Figura 3D. Mientras que la imagen PALM óptima proporciona picos de intensidad claros y bien definidos, la deriva excesiva de la muestra produce un patrón de intensidad irregular que dificulta determinar con precisión la distancia entre dos filamentos adyacentes. Estos datos ponen de relieve la importancia de las condiciones de imagen estrechamente controladas en la microscopía de localización de moléculas únicas, ya que incluso los cambios sutiles durante el proceso de adquisición pueden reducir drásticamente la calidad de imagen y la precisión de los datos.
Figura 1: Evaluación de la organización de sarcomere en CM derivado de iPSC.
La red de sarcomere fue etiquetada fluorescentemente con un anticuerpo α-actinin, seguido de la adquisición de imágenes PALM. La reconstrucción posterior conduce a la imagen final de PALM que se utilizó para el análisis cuantitativo. La longitud de los sarcomeres individuales se determinó midiendo la distancia entre dos picos de intensidad correspondientes a los filamentos de sarcomere vecinos (1-5). El grosor de Z-Disc se calculó automáticamente mediante una herramienta de procesamiento de imágenes basada en plugins. Barra de escala de 10 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Comparación cuantitativa del espesor del disco z y la longitud de la sarcomere en CM derivada de iPSC, tejido cardíaco adulto y neonatal.
(A) Imágenes PALM reconstruidas de la red α-actinin de iPSC y CM neonatal. (B) La evaluación cuantitativa reveló que todos los neonatales y comparten una alta similitud en la longitud del sarcomere (adulto frente a iPSC CM frente a CM neonatal: 1,91 ± 0,02 1,83 ± 0,049 m frente a 1,82±0,03 m) y el espesor de los filamentos individuales (vs. CM neonatal: 71,30 ± 1,64 frente a 73,95 ± 0,86 nm frente a 74,08 ± 0,12 nm), lo que indica el fenotipo prematuro de iPSC CM. (C) Comparación de la longitud de la sarcomere y el espesor del disco z entre imágenes confocales convencionales y la adquisición de datos basada en PALM. Como la longitud de la sarcomere se determinó midiendo la distancia pico a pico, el impacto del aumento de la resolución en la precisión de los datos fue menos pronunciado (confocal frente a PALM: 1.75 ± 0.02 frente a 1.70 ± 0.02). Por el contrario, se detectó un espesor z-Disc significativamente menor cuando se aplicó PALM (confocal frente a PALM: 224,71 ± 4,31 frente a 73,91 ± 1,31). (D) Imágenes microscópicas representativas de iPSC-CM obtenidas mediante imágenes confocales y PALM. (E) Gráficas de intensidad de fluorescencia correspondientes a la línea roja mostrada en (D). Los valores representan la anchura completa a la mitad máxima de intensidad de fluorescencia, lo que indica un aumento profundo de la resolución en las imágenes PALM. Los datos se presentan como la media ± SEM, no 10-20 células, se evaluaron 20 sarcomeres por célula. La significación estadística se determinó usando los estudiantes t-Test. **p<0.005, Barra de escala 10 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Impacto de la calidad del búfer y deriva de la muestra en la precisión y fiabilidad de los datos.
(A) Imágenes representativas de PALM de CM derivado de iPSC adquiridas bajo diferentes condiciones de imagen. Los filamentos de sarcomere parecen más gruesos en las muestras que han sido imagenadas con tampón de baja calidad. Las líneas rojas indican una medición representativa de la longitud de los sarcomeres, mientras que las estructuras de filamentos verdes se incluyeron en el análisis z-Disc. (B) La evaluación cuantitativa confirmó una diferencia significativa en el espesor del disco z entre el búfer de baja y alta calidad (alta frente a baja calidad del búfer: 73,87 ± 1,02 nm frente a. 113.9 ± 1.34 nm) (C) Esta diferencia en la precisión de la imagen se basó en una capacidad de parpadeo reducida del fluoróforo, lo que llevó a un número reducido de fotones detectados por molécula (alta frente a baja calidad de búfer: 29689 fotones/evento frente a 16422 fotones/eventos). Al mismo tiempo, la precisión de localización disminuyó lo que a su vez redujo la resolución global (alta frente a baja calidad de búfer: 14,25 ± 5,85 frente a 19,56 ± 6,7) (D) Del mismo modo, la deriva excesiva de la muestra puede afectar a la calidad de la imagen. Mientras que la adquisición adecuada de imágenes sin deriva de la muestra da como resultado picos de intensidad bien definidos de filamentos de α-actinina, el aumento de la deriva de la muestra provoca un patrón de intensidad irregular, lo que afecta fuertemente al análisis preciso de la longitud del sarcomere. Los datos se presentan como medio ± se analizaron 155 filamentos. La importancia estadística se determinó utilizando los estudiantes t-Test. ****p<0.0001. Barra de escala de 10 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La generación de CM in vitro funcional derivada de iPSC es importante para las terapias regenerativas, el modelado de enfermedades y el desarrollo de plataformas de detección de fármacos. Sin embargo, la madurez insuficiente de estos CM es un obstáculo importante en la investigación cardiovascular20. En este sentido, se necesitan técnicas de imagen de alta resolución que permitan supervisar el estado de maduración estructural de la CM derivada de iPSC. Al mismo tiempo, la microscopía de superrescía puede ser una herramienta valiosa para analizar con precisión la función de proteínas específicas, necesarias para una adecuada formación de sarcomeres como se ha demostrado recientemente para la titina y la troponina10,,21,,22.
En el protocolo actual, presentamos un enfoque basado en PALM para evaluar cuantitativamente la maduración estructural de iPSC CM mediante el análisis de la red de sarcomer de α-actinina.
En comparación con la microscopía de luz convencional, PALM permite la visualización de estructuras celulares con una resolución de 20-50 nm23. Por lo tanto, permite detectar incluso alteraciones sutiles de la red de sarcomere cardiaca que apenas son o ni siquiera detectables por los enfoques clásicos de microscopía de luz. Aplicando PALM, hemos medido una longitud media de sarcomere de 1,84 m en iPSC y CM neonatal(Figura 2). Esto está en línea con varios informes anteriores que muestran que el tamaño de los sarcomeres individuales es de 1,7 a 2,0 m24,25,26. En comparación con la longitud de los sarcomos, la estimación precisa del grosor de las líneas z es más complicada, ya que su tamaño está muy por debajo del límite de resolución clásico de la microscopía de luz. Mediante microscopía electrónica, estudios anteriores revelaron que el espesor de z-Disc oscila entre 50 y 80 nm en iPSC CM, lo que es similar a nuestra detección basada en PALM de 73 nm(Figura 2).
La comparación con la microscopía confocal estándar demostró el aumento dramático de la resolución cuando se aplicó PALM. Encontramos un espesor z-Disc 3 veces menor, después de la imagen PALM(Figura 2). Sin embargo, no se midió ninguna diferencia significativa para la longitud de la sarcomere. Dado que este parámetro se mide mediante la detección de la distancia pico a pico de las gráficas de intensidad, el efecto de mayor resolución es menos pronunciado.
Para lograr esta alta resolución espacial, PALM requiere condiciones de imagen bien definidas que deben ser abordadas cuidadosamente por el usuario. Para una localización precisa de moléculas individuales, se necesitan fluoróforos que posean propiedades fotofísicas especiales, lo que permite un cambio rápido entre el estado fluorescente y el estado oscuro, llamado parpadeo27. Como se ha demostrado anteriormente, la selección de fluoróforos puede afectar fuertemente a la calidad de imagen28. Se describió una profunda capacidad de parpadeo para Alexa 647, uno de los mejores y ampliamente utilizados tintes para microscopía de localización de molécula única29,,30,,31. Sin embargo, dado que hay numerosos fluoróforos PALM disponibles, los usuarios tendrán una alta flexibilidad en términos de etiquetado de muestras27,28.
Además de la selección de fluoróforo adecuado, el sistema de amortiguación de imágenes es otro punto crítico en la toma de imágenes PALM, ya que dicta las propiedades fotofísicas del tinte fluorescente. Hemos aplicado la piranosa oxidasa como un sistema de barrido de oxígeno que es superior a la glucosa oxidasa ya que proporciona una mayor estabilidad del pH, por lo tanto, permitiendo imágenes a largo plazo sin una disminución significativa de fluoróforo parpadeando con el tiempo32,,33. Sin embargo, como la vida útil del búfer de imágenes está limitada a varias horas, debe estar recién preparado para cada experimento para garantizar una alta reproducibilidad. Nuestros resultados demuestran una disminución espectacular de la precisión de los datos después de la creación de imágenes PALM con búfer de baja calidad, lo que conduce a una capacidad de parpadeo deteriorada y una precisión de localización reducida(Figura 3A-C).
Además, la estabilidad térmica del sistema de imágenes es obligatoria para evitar un aumento de la deriva de la muestra. Mientras que la deriva moderada se puede corregir mediante el análisis computacional, el movimiento excesivo de la muestra conduce a la localización mal calculado de los fluoróforos detectados y reduce la calidad de la imagen y la precisión de los datos. Esto se puede prevenir mediante el uso de microscopios con cámaras de calentamiento y el equilibrio térmico suficiente de la muestra respectiva antes de iniciar la toma de imágenes PALM. Además, debe considerarse la densidad y la eficiencia del etiquetado, así como el uso de fragmentos de anticuerpos o nanocueldos para optimizar las condiciones de imagen34,35,36.
El proceso de adquisición de grandes estructuras celulares puede tardar de 10 a 30 minutos, dependiendo de los parámetros de imagen (campo de visión, sonda fluorescente, búfer de imágenes, etc.). Este largo tiempo de adquisición es un inconveniente de PALM, lo que lo hace menos apropiado para la toma de imágenes de células vivas. Normalmente, se capturan 5.000-10.000 fotogramas para lograr un número adecuado de eventos de parpadeo con alta precisión de localización. Además, la profundidad de la imagen suele estar limitada a unos pocos cientos de nanómetros, lo que dificulta la investigación de muestras más gruesas. Sin embargo, la resolución mejorada en dirección z se puede obtener con una configuración 3D PALM37.
Hemos seleccionado dos parámetros para caracterizar la red α-actinin de iPSC CM, incluyendo la longitud de sarcomere y el espesor z-Disc. Se podrían recopilar características adicionales para obtener una vista más completa del andamio de sarcomere, como la orientación del filamento. Del mismo modo, 3D PALM puede ayudar a analizar cuantitativamente toda la estructura de sarcomere mediante la estimación de los nodos y ramas presentes dentro de la red.
Aunque PALM permite un análisis muy detallado de la estructura de la sarcomere, este método no permite la adquisición de parámetros funcionales como la contractilidad celular, que es otra característica importante para evaluar la madurez cardíaca. Los informes anteriores han demostrado que la evaluación basada en microscopía de la estructura de los sarcomeres puede combinarse con el análisis de vídeo para obtener datos funcionales38,,39. Sin embargo, dado que los autores han utilizado la microscopía de fluorescencia convencional obtenida datos sobre la estructura de sarcomere son menos precisos si se comparan con PALM. Nuestro enfoque también ofrece la posibilidad de correlacionar los datos palm con las grabaciones de lapso de tiempo anteriores y, por lo tanto, permite la adquisición de mediciones de contracción.
En resumen, este protocolo proporciona un método para evaluar cuantitativamente la maduración estructural de la red de sarcomere en CM. Utilizando este enfoque basado en la super resolución, las estrategias se pueden establecer apuntando a un mejor desarrollo cardíaco de CM derivado de iPSC para obtener un fenotipo más adulto.
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Disclosures
Los autores no declaran ningún conflicto de intereses.
Acknowledgments
Este estudio contó con el apoyo del Fondo Estructural de la UE (FSE/14-BM-A55-0024/18). Además, H.L. cuenta con el apoyo del Programa FORUN del Centro Médico de la Universidad de Rostock (889001 y 889003) y la Fundación Josef y Klinz (T319/29737/2017). C.I.L. es apoyado por el Programa Científico Clínico del Centro Médico de la Universidad de Rostock. R.D cuenta con el apoyo de la DFG (DA1296/6-1), la fundación DAMP, la Fundación Alemana del Corazón (F/01/12) y la BMBF (VIP+ 00240).
Agradecemos a Madeleine Bartsch por su apoyo técnico en el cultivo celular iPSC y la diferenciación cardíaca.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| human iPSC cell line | Takara | Y00325 | |
| µ-Slide 8 Well Glass Bottom | ibidi | 80827 | |
| 0.5ml eppendorf tube | Eppendorf | 30121023 | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A906 | |
| Cardiomyocyte Dissociation Kit | Stem Cell Technologies | 05025 | |
| Catalase | Sigma Aldrich | C40-1G | |
| Cyclooctatetraene | Sigma Aldrich | 138924-1G | |
| Cysteamine | Sigma Aldrich | 30070-10g | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline without Ca2+ and Mg2+ | Thermo Fisher | 14190169 | |
| F(ab')2-Goat anti-Mouse IgG Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher | A-21237 | |
| Fiji image processing software (Image J) | |||
| Glucose | Carl Roth | X997.2 | |
| Hydrochloric acid | Sigma Aldrich | H1758 | |
| LSM 780 ELYRA PS.1 system | Zeiss | ||
| Paraformaldehyde | Merck | 8187150100 | |
| Pyranose oxidase | Sigma Aldrich | P4234-250UN | |
| sarcomeric α-actinin antibody [EA-53] | Abcam | ab9465 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S7653 | |
| sterile water | Carl Roth | 3255.1 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
| Trizma base | Sigma Aldrich | T1503 | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | 63689 |
References
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