Summary
A formação de uma rede de sarcomere adequada é importante para o amadurecimento dos cardiomiócitos derivados do iPSC. Apresentamos uma abordagem baseada em super resolução que permite a avaliação quantitativa da maturação estrutural dos cardiomiócitos derivados de células-tronco, para melhorar as condições culturais que promovem o desenvolvimento cardíaco.
Abstract
A maturação dos cardiomiócitos derivados do iPSC é uma questão crítica para sua aplicação em terapia regenerativa, testes medicamentosos e modelagem de doenças. Apesar do desenvolvimento de protocolos de diferenciação múltiplos, a geração de cardiomiócitos iPSC semelhantes a um fenótipo semelhante a um adulto permanece desafiadora. Um aspecto importante da maturação dos cardiomiócitos envolve a formação de uma rede de sarcomere bem organizada para garantir alta capacidade de contração. Aqui, apresentamos uma abordagem baseada em super resolução para análise semi-quantitativa da rede α-actinina em cardiomiócitos. Utilizando microscopia de localização fotoativada foi realizada uma comparação do comprimento do sarcomere e da espessura do disco z de cardiomiócitos derivados do iPSC e células cardíacas isoladas do tecido neonatal. Ao mesmo tempo, demonstramos a importância das condições adequadas de imagem para obter dados confiáveis. Nossos resultados mostram que este método é adequado para monitorar quantitativamente a maturidade estrutural das células cardíacas com alta resolução espacial, permitindo a detecção de até mesmo alterações sutis da organização sarcomere.
Introduction
Doenças cardiovasculares (DCV) como infarto do miocárdio ou cardiomiopatia continuam sendo a principal causa de morte no mundo ocidental1. Como o coração humano possui apenas baixa capacidade regenerativa, há necessidade de estratégias para promover a recuperação dos DCV. Isso inclui terapias de substituição celular para repor cardiomiócitos perdidos (CM), bem como o desenvolvimento de novos medicamentos anti-arrítmicos para intervenção farmacêutica eficiente e segura. Células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC) têm se mostrado uma fonte celular promissora para a geração ilimitada de CM humano in vitro, adequado para terapias regenerativas, modelagem de doenças e para o desenvolvimento de ensaios de rastreamento de medicamentos2,,3,4.
Embora existam muitos protocolos de diferenciação cardíaca diferentes, o CM derivado do iPSC ainda carece de certos aspectos fenotípicos e funcionais que impedem a aplicação in vitro e in vivo5,6. Além das alterações eletrofisiológicas, metabólicas e moleculares, o processo de maturação cardíaca envolve a organização estrutural dos sarcomeres, que são as unidades fundamentais necessárias para a geração de força e contração celular7. Enquanto os CMs adultos exibem um aparelho contratil bem organizado, os CMs derivados do iPSC comumente demonstram filamentos sarcomere desaranjados, associados a uma capacidade de contração reduzida e dinâmica de contração alterada8,,9. Em contraste com cm maduros que mostram padrão de contração uniaxial, as estruturas desorientadas em CM imaturos resultam em uma contração radial de toda a célula ou promovem o aparecimento dos pontos focais de contração9,,10.
Para melhorar a maturação cardíaca, foram aplicadas múltiplas abordagens, incluindo métodos de cultura celular 3D, estimulação elétrica e mecânica, bem como o uso de matrizes extracelulares imitando condições in vivo11,,12,,13. Para avaliar o sucesso e a eficiência dessas diferentes condições culturais, são necessárias técnicas para monitorar e estimar o grau de maturação estrutural do CM iPSC, por exemplo, por técnicas microscópicas. Em contraste com a imagem confocal convencional, a resolução em caso de microscopia de localização fotoativada (PALM) é aproximadamente 10x maior. Essa técnica, por sua vez, permite uma análise mais precisa, detectando até mesmo alterações sutis das estruturas celulares14. Considerando a alta resolução da imagem baseada em PALM, o objetivo geral deste método foi a avaliação microscópica da maturidade sarcomere em CMs derivados do iPSC por determinação precisa da espessura do disco z e do comprimento do sarcomere. Em estudos anteriores, essas características estruturais têm se mostrado parâmetros adequados para avaliar a maturidade cardíaca15. Por exemplo, iPSC-CM doente sem distrofina de comprimento total exibe comprimento reduzido de sarcomere e largura de banda z quando comparado com células do tipo selvagem16. Da mesma forma, o comprimento dos sarcomeres individuais foi medido para investigar o impacto das pistas topográficas no desenvolvimento cardíaco16. Assim, aplicamos essa abordagem para avaliar a maturação estrutural da rede sarcomere no iPSC-CM, medindo quantitativamente o comprimento do sarcomere e a espessura do disco Z.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Todas as etapas deste protocolo envolvendo camundongos neonatais e adultos foram realizadas de acordo com as diretrizes éticas para o cuidado animal do Centro Médico da Universidade de Rostock.
1. Cultivo e dissociação de cardiomiócitos derivados do iPSC
- Diferencie hiPSC-CMs por 25 dias usando um método de monocamadas 2D, conforme descrito anteriormente17.
- Dissociação pré-inaque de médio a 37 °C e suporte temperatura média a ambiente.
- Lave as células duas vezes com PBS.
- Adicione a dissociação pré-armada de meio às células e incubar por 12 min a 37 °C e 5% de CO2.
- Adicione meio de suporte às células.
NOTA: O volume do meio de suporte adicionado precisa ser o dobro do volume do meio de dissociação utilizado na etapa 1.4. - Desaloja as células usando uma pipeta sorológica de 5 mL.
- Centrífugas a 200 x g por 5 min e resuspensam a pelota em 3 mL de cultura hiPSC-CM média17.
- Células de sementes em 8 câmaras de fundo de vidro bem a uma densidade celular de 75.000 células/bem e cultura por 3 dias.
2. Isolamento do cardiomiócito adulto
- O isolamento e o cultivo de cardiomiócitos adultos de camundongos NMRI foram realizados como relatado anteriormente18.
- Células de sementes em 8 bem vidro câmara slide e cultura por um dia.
3. Isolamento e cultivo de cardiomiócitos neonatais
- O procedimento de isolamento dos cardiomiócitos neonatais, obtidos a partir de camundongos NMRI, foi realizado conforme descrito anteriormente19.
- Célula isolada de sementes em 8 poços de vidro de câmara deslizam a uma densidade celular de 75.000 células/bem e cultura por 3 dias na cultura neonatal CM médio19.
4. Rotulagem de imunofluorescência da rede α-actinin
NOTA: Para obter resultados ótimos, as células são cultivadas em 8 câmaras de fundo de vidro. A rotulagem deve ser realizada um dia antes da imagem.
- Pré-aquecimento 4% PFA a 37 °C.
- Corrija o iPSC-CM adicionando 4% de paraformaldeído diretamente na mídia cultural (diluição 1:1) e incubar a 37 °C por 15 min. A concentração final de PFA para fixação é de 2%.
- Incubar células fixas em 0,2% Triton-X, diluídas em PBS, por 5 min a temperatura ambiente.
- Lave as células duas vezes com PBS, 5 min cada.
- Adicione 1% de solução BSA (diluída em PBS) e incubar por 60 min a temperatura ambiente.
- Prepare 150 μL de solução de anticorpos primários diluindo anticorpo α-actinin 1:100 em 1% BSA, contendo 0,05% Triton-X. Adicione às células e incubar à temperatura ambiente por 60 minutos.
- Lave as células duas vezes com solução BSA de 0,2%, 5 min cada.
- Prepare 150 μL de solução secundária de anticorpos diluindo o anticorpo Alexa647 1:100 em 1% BSA, contendo 0,05% Triton-X. Adicione às células e incubar à temperatura ambiente por 40 minutos.
- Lave as células duas vezes com solução BSA de 0,2%, 5 min cada.
- Lave as células duas vezes com PBS, 5 min cada. Mantenha as células rotuladas no escuro a 4 °C até que a imagem PALM.
5. Preparação do tampão de imagem PALM
NOTA: É fundamental preparar recentemente o tampão de imagem PALM para cada experimento.
- Prepare 50% de solução de glicose dissolvendo 25 g de glicose em 50 mL de água destilada.
- Prepare o tampão básico contendo 50 mM Tris-HCl, 10% de glicose e cloreto de sódio de 10 mM.
- Ajuste o nível de pH para ~8.0 usando ácido clorídrico.
- Prepare a solução de pianose oxidase dissolvendo 0,6 mg de pianose oxidase em 316 μL de tampão básico.
- Prepare a solução de catalase dissolvendo 7 mg de catalase em 500 μL de buffer básico. Misture bem e centrífugue a 10.000 x g por 3 min. Mantenha o supernatante para uso posterior. A solução catalase pode ser mantida a 4 °C por vários dias.
- Prepare 500 μL de tampão de imagem PALM misturando 316 μL de solução de piróanose oxidase, 25 μL de solução catalase, 100 μL de solução de glicose de 50%, 50 μL de cisteamina, 5 μL de ciclooctatetraene e 3,5 μL de β-Merctoapeol. A atividade catalítica final de pianose oxidase e catalase precisa ser de 7,5 U, 35.00U, respectivamente.
NOTA: O tampão de imagem PALM fornece condições de imagem ideais para 3-5 h. Se a capacidade de piscar do corante fluorescente diminuir, prepare uma nova alíquota tampão.
6. Aquisição de imagem palm
- Ligue o microscópio pelo menos 3 h antes de usar e leve a amostra à temperatura ambiente antes da imagem para permitir o equilíbrio térmico. Se o microscópio estiver equipado com uma câmara de incubação, ajuste a temperatura para 30 °C.
- Limpe o objetivo e o fundo do slide da câmara usando um solvente de limpeza adequado.
- Adicione 300 μL de tampão de imagem PALM em um poço de células rotuladas e insira o slide da câmara no suporte do estágio do microscópio.
- Defina os parâmetros de aquisição de imagem PALM.
- Selecione 1,57 N.A. 100x objetivo de óleo para aquisição.
- Selecione o modo PALM e ative as configurações de TIRF.
- Ajuste o número de quadros a serem adquiridos. Normalmente 5.000-10.000 quadros são suficientes para obter resultados ideais. No entanto, o número de quadros adquiridos depende fortemente da eficiência de rotulagem e da capacidade piscando do corante fluorescente e pode ser ajustado pelo usuário.
- Defina a potência laser UV para 0,1% e 647 laser para 0,2%.
- Defina o nível de ganho para 50-100.
- Ligue a iluminação laser e selecione uma célula alvo. O nível de ganho pode ser aumentado se a intensidade do sinal for baixa (dependendo da rotulagem de fluorescência).
- Desligue a iluminação laser
- Aquisição de imagem PALM
- Reduza o ganho para 0 e aumente a potência laser (ex 647) para 100%.
- Alvejar a célula alvo por ~5 s.
- Aumente o ganho para 50 e inicie a aquisição de imagem palm.
NOTA: O ganho precisa ser ajustado para obter intensidade de sinal suficiente, enquanto pixels supersaturados devem ser evitados. Se a intensidade do sinal reduzir, aumente o nível de ganho.
- Opcionalmente, melhore constantemente a potência do laser UV (0,1%-10%) para aumentar a intensidade do sinal e promover o piscar do fluorforo.
7. Reconstrução de dados palm
- Abra o software Image J e importe os dados do PALM.
- Plugin de tempestade aberta e "análise de execução"
- No menu "Configuração da câmera" digite o tamanho do pixel e o ganho EM.
NOTA: Ao usar objetivos de 100x e lente de ampliação de 1,6x, o tamanho de 100 nm pixel é apropriado. No entanto, como o tamanho do pixel depende dos recursos de hardware do microscópio e da câmera usado para imagens PALM, os usuários precisam verificar cuidadosamente e adaptar este parâmetro. Os valores de ganho EM podem ser obtidos a partir dos metadados. - No menu de análise "Executar" definir parâmetros da seguinte forma: ordem B-spline: 3, escala B-spline: 2.0, limiar de intensidade máxima: stf (Wave.F1), raio de montagem: 3, sigma inicial: 1.6, ampliação: 5.0, frequência de atualização: 50, mudanças laterais: 2. Confirme clicando no botão "Ok".
- No menu "Configuração da câmera" digite o tamanho do pixel e o ganho EM.
- Pós processamento de imagem PALM reconstruída
- No menu "Plot histogram" selecione o parâmetro "Sigma".
- Use a ferramenta "Retângulo" para selecionar um ROI, excluindo possíveis artefatos e aplicar ROI no filtro. Os valores do ROI aparecerão na caixa de comando do filtro.
- Adicione "& incerteza e 25" aos valores do ROI. Um possível comando de filtro será assim: "(sigma > 48.6821 & sigma < 1117.40) & incerteza <25". Aplique valores sigma selecionados.
- No menu "Remover duplicatas", digite um limiar de distância de "10 nm" e aplique.
- No menu "Merging", defina distância máxima para "20", quadros máximos por molécula a "0" e máximo off frames para "1". Aplique as configurações.
- No menude correção " Drift", selecione correlação cruzada e defina " Número decaixas" para "5" e "Ampliação" para "5.0". Aplique as configurações de correção de deriva.
- Salve a imagem PALM final e exporte dados processados pós-processo, se desejar.
8. Análise de filamentos de sarcomere
- Análise do comprimento do sarcomere
- Abra o software Imagem J e importe a imagem PALM reconstruída.
- Desenhe uma linha entre estruturas de sarcomere selecionadas perpendiculares ao disco z para medir a menor distância entre filamentos de actinin.
- Selecione "Plot profile" no menu "Analisar" e adquira o comprimento entre dois picos. Como o comprimento do sarcomere pode variar dentro de uma célula, um mínimo de 20 sarcomeres deve ser medido em diferentes áreas da célula alvo.
- Análise da espessura do z-Disco
- Abra o software Imagem J e importe a imagem PALM reconstruída.
- Converta a imagem PALM reconstruída em uma imagem de modo de 8 bits.
- Abra o plugin de detecção de cume e digite os seguintes parâmetros: largura de linha: 20, alto contraste: 230, baixo contraste: 10, sigma: 0,79, limiar inferior: 25,84, comprimento mínimo da linha: 20.
- Definir "Largura de estimativa", " Linhaestendida" e " Resultadosde exibição".
- Clique em "Ok" e use "Largura de linha média" da tabela de resultados para novas análises.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Para a estimativa do grau de maturação estrutural de CM, adulto neonatal, adulto totalmente maduro e CM iPSC foram inicialmente rotulados como CM com anticorpo α-actinin para visualizar a rede de sarcomere. Após a aquisição do PALM, as imagens foram reconstruídas e a espessura do disco z foi medida por meio de um software de processamento de imagem baseado em plugin para a detecção automática da largura dos filamentos individuais. O comprimento de Sarcomere foi calculado medindo a distância entre dois picos de intensidade adjacentes, correspondendo aos filamentos vizinhos. A Figura 1 mostra a avaliação da organização sarcomere no CM derivado do iPSCs.
Conforme apresentado na Figura 2A,foram encontradas células iPSC-CM e neonatais com padrão de α-actinina semelhante com estruturas de sarcomere irregulares e desáxidas. Da mesma forma, a avaliação quantitativa demonstrou que o comprimento e a espessura dos filamentos de α- actinin eram quase idênticos, o que indica um estado de desenvolvimento prematuro do CM iPSC. Mais precisamente, o comprimento médio do sarcomere foi de cerca de 1,83 μm (adulto versus. iPSC CM vs. CM neonatal: 1,91 ± 0,02 1,83 ± 0,049 μm vs. 1,82±0,03 μm, n=20 células), enquanto a espessura do disco z foi de aproximadamente 74 nm (adulto vs. iPSC CM vs. CM neonatal: 71,30 ± 1,64 vs. 73,95 ± 0,86 nm vs. 74,08 ± 0,12 nm, n=20 células)(Figura 2B). Em contraste, o CM maduro adulto mostrou uma rede regular de sarcomere com comprimento de sarcomere ligeiramente aumentado e espessura reduzida de z-Disc.
A comparação das imagens confocal convencionais e palm não demonstrou diferença significativa do comprimento do sarcomere(Figura 2C) (confocal vs. PALM: 1,75 ± 0,02 vs. 1,70 ± 0,02, n=10 células). No entanto, foi detectada uma profunda redução da espessura do disco z quando o iPSC-CM foi submetido à imagem PALM(Figura 2C) (confocal vs. PALM: 224,71 ± 4,31 vs. 73,91 ± 1,31, n=10 células). Imagens representativas destacam o ganho de resolução quando o PALM foi aplicado, apoiado por parcelas de intensidade correspondentes(Figura 2D,E). A largura total calculada à metade do máximo de intensidade de fluorescência revelou que as estruturas de α-actinina são ~3 vezes mais finas em imagens PALM se comparadas à microscopia confocal padrão(Figura 2E).
A microscopia de localização de moléculas únicas, como palm, permite a detecção de estruturas intracelulares muito abaixo do limite de difração. Para garantir a máxima resolução espacial, são necessárias condições de imagem adequadas para a detecção precisa da localização de moléculas únicas. O sistema tampão de imagem usado é fundamental para este processo de aquisição, pois influencia as propriedades fotofísicas do corante fluorescente e, portanto, tem um impacto significativo na resolução geral e precisão da imagem PALM final. A comparação entre tampão de alta qualidade e tampão preparado um dia antes da imagem revelou uma profunda diferença na espessura do filamento(Figura 3A,B). As estruturas de sarcomere adquiridas com tampão de baixa qualidade parecem ser mais espessas quando comparadas às condições de imagem ideais(Figura 3A). De fato, a avaliação quantitativa mostrou que a espessura do disco z foi aumentada em ~65% (alta qualidade versus baixa qualidade: 73,87 ± 1,02 nm vs. 113,9 ± 1,33 nm, n=155 filamentos)(Figura 3B). Essa falta de precisão dos dados deve-se à redução das propriedades piscando do fluoróforo que resulta em fótons menos detectados por evento de localização (alta versus baixa qualidade de buffer: 29689 fótons/evento vs. 16422 fótons/eventos) (Figura 3C). Além disso, a precisão de localização é diminuída em condições de imagem deterioradas (alta qualidade versus baixa qualidade: 14,25 ± 5,85 nm vs. 19,56 ± 6,7 nm), o que reduz a resolução global da imagem PALM reconstruída(Figura 3C).
Além disso, a deriva amostral, por exemplo, causada pela instabilidade térmica, pode afetar a localização precisa de moléculas fluorescentes e resulta em imagens embaçadas, como apresentado na Figura 3D. Enquanto a imagem PALM ideal dá picos de intensidade claros e bem definidos, a deriva excessiva da amostra produz um padrão de intensidade irregular que dificulta determinar com precisão a distância entre dois filamentos adjacentes. Esses dados destacam a importância de condições de imagem fortemente controladas na microscopia de localização de moléculas únicas, pois mesmo mudanças sutis durante o processo de aquisição podem diminuir drasticamente a qualidade da imagem e a precisão dos dados.
Figura 1: Avaliação da organização sarcomere em CM derivado do iPSCs.
A rede de sarcomere foi rotulada fluorescentemente com um anticorpo α-actinin, seguido pela aquisição de imagem PALM. A reconstrução subsequente leva à imagem palm final utilizada para análise quantitativa. O comprimento dos sarcomeres individuais foi determinado medindo a distância entre dois picos de intensidade correspondentes aos filamentos sarcomere vizinhos (1-5). A espessura do disco Z foi calculada automaticamente por uma ferramenta de processamento de imagem baseada em plugin. Barra de escala 10 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Comparação quantitativa da espessura do disco z e comprimento de sarcomere em CM derivado de iPSCs, tecido cardíaco adulto e neonatal.
(A) Imagens de PALM reconstruídas da rede α-actinin de iPSC e CM neonatal. (B) A avaliação quantitativa revelou que todos os neonatais e compartilham alta similaridade no comprimento do sarcomere (adulto vs. iPSC CM vs. CM neonatal: 1,91 ± 0,02 1,83 ± 0,049 μm vs. 1,82±0,03 μm) e espessura de filamentos individuais (adulto vs. iPSC CM vs. CM neonatal: 71,30 ± 1,64 vs. 73,95 ± 0,86 nm vs. 74,08 ± 0,12 nm), indicando o fenótipo prematuro do iPSC CM. (C) Comparação do comprimento sarcomere e da espessura z-Disc entre a imagem congênita e os dados de aquisição baseados em PALM. Como o comprimento do sarcomere foi determinado medindo a distância de pico ao pico, o impacto do aumento da resolução na precisão dos dados foi menos pronunciado (confocal vs. PALM: 1,75 ± 0,02 vs. 1,70 ± 0,02). Em contraste, detectou-se uma espessura z-Disc significativamente menor quando o PALM foi aplicado (confocal vs. PALM: 224,71 ± 4,31 contra 73,91 ± 1,31). (D) Imagens microscópicas representativas do iPSC-CM obtidas por imagem confocal e PALM. (E) Parcelas de intensidade de fluorescência correspondentes à linha vermelha mostrada em (D). Os valores representam largura total ao meio máximo de intensidade de fluorescência, indicando um aumento profundo da resolução nas imagens PALM. Os dados são apresentados como média ± SEM, n=10-20 células, 20 sarcomeres por célula foram avaliados. A significância estatística foi determinada usando o t-Teste dos alunos. **p<0.005, Barra de escala 10 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Impacto da qualidade do buffer e deriva da amostra na precisão e confiabilidade dos dados.
(A) Imagens de PALM representativas do CM derivado do iPSC adquiridas sob diferentes condições de imagem. Filamentos de sarcomere aparecem mais espessos em amostras que foram imagens com tampão de baixa qualidade. As linhas vermelhas indicam medição representativa do comprimento do sarcomere, enquanto estruturas de filamento verde foram incluídas na análise z-Disc. (B) A avaliação quantitativa confirmou uma diferença significativa na espessura do z-Disco entre buffer de baixa e alta qualidade (alta vs. baixa qualidade de buffer: 73,87 ± 1,02 nm vs. 113,9 ± 1,34 nm) (C) Essa diferença na precisão da imagem foi baseada em uma capacidade de piscar reduzida do fluoróforo, levando a um número reduzido de fótons detectados por molécula (alta versus baixa qualidade tampão: 29689 fototons/evento vs. 16422/eventos). Ao mesmo tempo, a precisão de localização diminuiu, o que por sua vez reduziu a resolução geral (alta versus baixa qualidade do buffer: 14,25 ± 5,85 vs. 19,56 ± 6,7) (D) Da mesma forma, a deriva excessiva da amostra pode prejudicar a qualidade da imagem. Enquanto a aquisição adequada de imagens sem deriva de amostra resulta em picos de intensidade bem definidos de filamentos de α-actin, o aumento da deriva da amostra provoca um padrão de intensidade irregular, que afeta fortemente a análise precisa do comprimento do sarcomere. Os dados são apresentados como média ± foram analisados 155 filamentos. A significância estatística foi determinada por meio do teste dosalunos. ****p<0,0001. Barra de escala 10μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
A geração de CM in vitro derivada do iPSC funcional é importante para terapias regenerativas, modelagem de doenças e desenvolvimento de plataformas de rastreamento de medicamentos. No entanto, a maturidade insuficiente desses CM é um grande obstáculo na pesquisa cardiovascular20. Nesse sentido, são necessárias técnicas de imagem de alta resolução que permitam o monitoramento do estado de maturação estrutural do CM derivado do iPSC. Ao mesmo tempo, a microscopia de super resolução pode ser uma ferramenta valiosa para analisar com precisão a função de proteínas específicas, necessárias para a formação adequada de sarcomere, como recentemente demonstrado para titina e troponina10,,21,22.
No protocolo atual, apresentamos uma abordagem baseada em PALM para avaliar quantitativamente a maturação estrutural do CM iPSC, analisando a rede de sarcomere α-actinin.
Em comparação com a microscopia de luz convencional, palm permite visualização de estruturas celulares com uma resolução de ~20-50 nm23. Assim, permite detectar até mesmo alterações sutis da rede de sarcomere cardíaco que são pouco ou nem mesmo detectáveis por abordagens clássicas de microscopia de luz. Aplicando palm, medimos um comprimento médio de sarcomere de ~1,84 μm em iPSC e CM neonatal(Figura 2). Isso está em linha com vários relatórios anteriores mostrando que o tamanho dos sarcomeres individuais é ~1,7-2,0 μm24,25,26. Em comparação com o comprimento do sarcomere, a estimativa precisa da espessura das linhas z é mais complicada, pois seu tamanho está muito abaixo do limite de resolução clássica da microscopia leve. Usando microscopia eletrônica, estudos anteriores revelaram que a espessura do disco z varia de 50 a 80 nm no iPSC CM, que é semelhante à nossa detecção baseada em PALM de ~73 nm(Figura 2).
A comparação com a microscopia confocal padrão demonstrou o aumento dramático da resolução quando o PALM foi aplicado. Encontramos uma espessura z-Disc 3 vezes menor, seguindo a imagem PALM(Figura 2). No entanto, nenhuma diferença significativa foi medida para o comprimento do sarcomere. Uma vez que este parâmetro é medido pela detecção da distância de pico a pico de parcelas de intensidade, o efeito do aumento da resolução é menos pronunciado.
Para alcançar essa alta resolução espacial, palm requer condições de imagem bem definidas que precisam ser cuidadosamente abordadas pelo usuário. Para uma localização precisa de moléculas únicas, são necessários fluoroforos que possuem propriedades fotofísicas especiais, permitindo uma rápida comutação entre o estado fluorescente e o estado escuro, chamado de piscar27. Como demonstrado anteriormente, a seleção de fluoroforos pode afetar fortemente a qualidade da imagem28. Uma profunda capacidade de piscar foi descrita para alexa 647, um dos corantes melhores e amplamente utilizados para microscopia de localização de moléculas únicas29,,30,,31. No entanto, como inúmeros fluoroforos PALM estão disponíveis, os usuários terão alta flexibilidade em termos de rotulagem amostral27,28.
Além da seleção de fluoróforo adequado, o sistema tampão de imagem é outro ponto crítico na imagem PALM, pois dita as propriedades fotofísicas do corante fluorescente. Aplicamos a pianose oxidase como um sistema de catadores de oxigênio superior à glicose oxidase, pois proporciona um aumento da estabilidade do pH, permitindo, portanto, imagens de longo prazo sem uma diminuição significativa do fluoróforo piscando ao longo do tempo32,33. No entanto, como a vida útil do buffer de imagem é limitada a várias horas, ele deve estar recém-preparado para cada experimento para garantir alta reprodutibilidade. Nossos resultados demonstram uma redução drástica da precisão dos dados após a imagem palm com buffer de baixa qualidade, levando a capacidade de piscar prejudicada e precisão de localização reduzida(Figura 3A-C).
Além disso, a estabilidade térmica do sistema de imagem é obrigatória para evitar o aumento da deriva amostral. Enquanto a deriva moderada pode ser corrigida pela análise computacional, o movimento excessivo da amostra leva à localização mal calculada de fluoroforos detectados e reduz a qualidade da imagem e a precisão dos dados. Isso pode ser evitado usando microscópios com câmaras de aquecimento e equilíbrio térmico suficiente da respectiva amostra antes de iniciar a imagem PALM. Além disso, a densidade de rotulagem e eficiência, bem como o uso de fragmentos de anticorpos ou nanocorpos devem ser considerados para otimizar as condições de imagem34,,35,,36.
O processo de aquisição de grandes estruturas celulares pode levar de 10 a 30 minutos, dependendo dos parâmetros de imagem (campo de visão, sonda fluorescente, tampão de imagem etc.). Este longo tempo de aquisição é uma desvantagem do PALM, o que o torna menos apropriado para imagens de células vivas. Normalmente, 5.000-10.000 quadros são capturados para alcançar um número adequado de eventos piscando com alta precisão de localização. Além disso, a profundidade de imagem é geralmente limitada a algumas centenas de nanômetros, o que dificulta a investigação de amostras mais grossas. No entanto, a resolução aprimorada na direção z pode ser obtida com uma configuração PALM 3D37.
Selecionamos dois parâmetros para caracterizar a rede α-actinin do iPSC CM, incluindo comprimento de sarcomere e espessura z-Disc. Recursos adicionais poderiam ser coletados para obter uma visão mais abrangente sobre o andaime sarcomere, como orientação de filamento. Da mesma forma, o PALM 3D pode ajudar a analisar quantitativamente toda a estrutura do sarcomere por estimativa de nós e ramos atuais dentro da rede.
Embora o PALM possibilite uma análise muito detalhada da estrutura do sarcomere, este método não permite a aquisição de parâmetros funcionais como a contralução celular, que é outra característica importante para avaliar a maturidade cardíaca. Relatórios anteriores mostraram que a avaliação baseada em microscopia da estrutura sarcomere pode ser combinada com análise de vídeo para obter dados funcionais38,39. No entanto, uma vez que os autores têm usado microscopia de fluorescência convencional obtida dados sobre a estrutura sarcomere são menos precisos se comparados com palm. Nossa abordagem também oferece a possibilidade de correlacionar dados palm com registros de lapso de tempo anteriores e, portanto, permite a aquisição de medidas de contração.
Em resumo, este protocolo fornece um método para avaliar quantitativamente a maturação estrutural da rede sarcomere em CM. Utilizando essa abordagem baseada em super resolução, estratégias podem ser estabelecidas visando um melhor desenvolvimento cardíaco do CM derivado do iPSC para obter um fenótipo mais adulto.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não declaram conflito de interesses.
Acknowledgments
Este estudo foi apoiado pelo Fundo Estrutural da UE (ESF/14-BM-A55-0024/18). Além disso, o H.L. é apoiado pelo Programa FORUN do Centro Médico da Universidade de Rostock (889001 e 889003) e pela Fundação Josef e Käthe Klinz (T319/29737/2017). C.I.L. é apoiado pelo Programa de Cientistas Clínicos do Centro Médico da Universidade de Rostock. A R.D é apoiada pelo DFG (DA1296/6-1), pela fundação DAMP, pela Fundação Alemã do Coração (F/01/12) e pela BMBF (VIP+ 00240).
Agradecemos a Madeleine Bartsch por seu apoio técnico na cultura celular iPSC e diferenciação cardíaca.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| human iPSC cell line | Takara | Y00325 | |
| µ-Slide 8 Well Glass Bottom | ibidi | 80827 | |
| 0.5ml eppendorf tube | Eppendorf | 30121023 | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A906 | |
| Cardiomyocyte Dissociation Kit | Stem Cell Technologies | 05025 | |
| Catalase | Sigma Aldrich | C40-1G | |
| Cyclooctatetraene | Sigma Aldrich | 138924-1G | |
| Cysteamine | Sigma Aldrich | 30070-10g | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline without Ca2+ and Mg2+ | Thermo Fisher | 14190169 | |
| F(ab')2-Goat anti-Mouse IgG Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher | A-21237 | |
| Fiji image processing software (Image J) | |||
| Glucose | Carl Roth | X997.2 | |
| Hydrochloric acid | Sigma Aldrich | H1758 | |
| LSM 780 ELYRA PS.1 system | Zeiss | ||
| Paraformaldehyde | Merck | 8187150100 | |
| Pyranose oxidase | Sigma Aldrich | P4234-250UN | |
| sarcomeric α-actinin antibody [EA-53] | Abcam | ab9465 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S7653 | |
| sterile water | Carl Roth | 3255.1 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
| Trizma base | Sigma Aldrich | T1503 | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | 63689 |
References
- McAloon, C. J., et al. The changing face of cardiovascular disease 2000-2012: An analysis of the world health organisation global health estimates data. International Journal of Cardiology. 224, 256-264 (2016).
- Kussauer, S., David, R., Lemcke, H. hiPSCs Derived Cardiac Cells for Drug and Toxicity Screening and Disease Modeling: What Micro- Electrode-Array Analyses Can Tell Us. Cells. 8 (11), 1331 (2019).
- Ylä-Herttuala, S. iPSC-Derived Cardiomyocytes Taken to Rescue Infarcted Heart Muscle in Coronary Heart Disease Patients. Molecular Therapy. 26 (9), 2077 (2018).
- Kadota, S., Shiba, Y. Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocyte Transplantation for Heart Disease Treatment. Current Cardiology Reports. 21 (8), 73 (2019).
- Jiang, Y., Park, P., Hong, S. M., Ban, K. Maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells: Current strategies and limitations. Molecules and Cells. 41 (7), 613-621 (2018).
- Feric, N. T., Radisic, M. Maturing human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes in human engineered cardiac tissues. Advanced Drug Delivery Reviews. 96, 110-134 (2016).
- Ali, H., Braga, L., Giacca, M. Cardiac regeneration and remodelling of the cardiomyocyte cytoarchitecture. The FEBS Journal. 287 (3), 417-438 (2020).
- Yang, X., Pabon, L., Murry, C. E. Engineering adolescence: maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circulation Research. 114 (3), 511-523 (2014).
- Bedada, F. B., Wheelwright, M., Metzger, J. M. Maturation status of sarcomere structure and function in human iPSC-derived cardiac myocytes. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1863 (7), 1829-1838 (2016).
- Dai, Y., et al. Troponin destabilization impairs sarcomere-cytoskeleton interactions in iPSC-derived cardiomyocytes from dilated cardiomyopathy patients. Scientific Reports. 10 (1), 1-15 (2020).
- Huang, C. Y., et al. Enhancement of human iPSC-derived cardiomyocyte maturation by chemical conditioning in a 3D environment. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 138, 1-11 (2020).
- Ronaldson-Bouchard, K., et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).
- Lee, S., et al. Contractile force generation by 3D hiPSC-derived cardiac tissues is enhanced by rapid establishment of cellular interconnection in matrix with muscle-mimicking stiffness. Biomaterials. 131, 111-120 (2017).
- Baddeley, D., Bewersdorf, J. Biological Insight from Super-Resolution Microscopy: What We Can Learn from Localization-Based Images. Annual Review of Biochemistry. 87 (1), 965-989 (2018).
- Ovesný, M., Křížek, P., Borkovec, J., Švindrych, Z., Hagen, G. M. ThunderSTORM: A comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging. Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).
- Mahadev, K., Wu, X., Donnelly, S., Ouedraogo, R., Eckhart, A. D., Goldstein, B. J. Adiponectin inhibits vascular endothelial growth factor-induced migration of human coronary artery endothelial cells. Cardiovascular Research. 78 (2), 376-384 (2008).
- Lemcke, H., Skorska, A., Lang, C. I., Johann, L., David, R. Quantitative evaluation of the sarcomere network of human hiPSC-derived cardiomyocytes using single-molecule localization microscopy. International Journal of Molecular Sciences. 21 (8), 2819 (2020).
- Ackers-Johnson, M., et al. A simplified, langendorff-Free method for concomitant isolation of viable cardiac myocytes and nonmyocytes from the adult mouse heart. Circulation Research. 119 (8), 909-920 (2016).
- Lemcke, H., et al. Applying 3D-FRAP microscopy to analyse gap junction-dependent shuttling of small antisense RNAs between cardiomyocytes. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 98, 117-127 (2016).
- Karbassi, E., et al. Cardiomyocyte maturation: advances in knowledge and implications for regenerative medicine. Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).
- Krysiak, J., et al. Protein phosphatase 5 regulates titin phosphorylation and function at a sarcomere-associated mechanosensor complex in cardiomyocytes. Nature Communications. 9 (1), 1-14 (2018).
- Zaunbrecher, R. J., et al. Cronos Titin Is Expressed in Human Cardiomyocytes and Necessary for Normal Sarcomere Function. Circulation. 140 (20), 1647-1660 (2019).
- Fornasiero, E. F., Opazo, F. Super-resolution imaging for cell biologists. BioEssays. Fornasiero, E. F., Opazo, F. , Wiley Online Library. (2015).
- Jeziorowska, D., et al. Differential Sarcomere and Electrophysiological Maturation of Human iPSC-Derived Cardiac Myocytes in Monolayer vs. Aggregation-Based Differentiation Protocols. International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), 1173 (2017).
- Kroll, K., et al. Electro-mechanical conditioning of human iPSC-derived cardiomyocytes for translational research. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 130, 212-222 (2017).
- Zuppinger, C., et al. Characterization of cytoskeleton features and maturation status of cultured human iPSC-derived cardiomyocytes. European Journal of Histochemistry. 61 (2), 145-153 (2017).
- Jradi, F. M., Lavis, L. D. Chemistry of Photosensitive Fluorophores for Single-Molecule Localization Microscopy. ACS Chemical Biology. 14 (6), 1077-1090 (2019).
- Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nature Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).
- Lampe, A., Haucke, V., Sigrist, S. J., Heilemann, M., Schmoranzer, J. Multi-colour direct STORM with red emitting carbocyanines. Biology of the Cell. 104 (4), 229-237 (2012).
- Chamma, I., Levet, F., Sibarita, J. B., Sainlos, M., Thoumine, O. Nanoscale organization of synaptic adhesion proteins revealed by single-molecule localization microscopy. Neurophotonics. 3 (4), 041810 (2016).
- Ma, H., Fu, R., Xu, J., Liu, Y. A simple and cost-effective setup for super-resolution localization microscopy. Scientific Reports. 7 (1), 1-9 (2017).
- Olivier, N., Keller, D., Gönczy, P., Manley, S. Resolution Doubling in 3D-STORM Imaging through Improved Buffers. PLoS One. 8 (7), 0069004 (2013).
- Swoboda, M., et al. Enzymatic oxygen scavenging for photostability without ph drop in single-molecule experiments. ACS Nano. 6 (7), 6364-6369 (2012).
- Mikhaylova, M., et al. Resolving bundled microtubules using anti-tubulin nanobodies. Nature Communications. 6 (1), 1-7 (2015).
- Venkataramani, V., et al. Enhanced labeling density and whole-cell 3D dSTORM imaging by repetitive labeling of target proteins. Scientific Reports. 8 (1), 1-7 (2018).
- Erdélyi, M., et al. Origin and compensation of imaging artefacts in localization-based super-resolution microscopy. Methods. 88, 122-132 (2015).
- McGorty, R., Schnitzbauer, J., Zhang, W., Huang, B. Correction of depth-dependent aberrations in 3D single-molecule localization and super-resolution microscopy. Optics Letters. 39 (2), 275 (2014).
- Ribeiro, M. C., et al. A cardiomyocyte show of force: A fluorescent alpha-actinin reporter line sheds light on human cardiomyocyte contractility versus substrate stiffness. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 141, 54-64 (2020).
- Pioner, J. M., et al. Isolation and mechanical measurements of myofibrils from human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cell Reports. 6 (6), 885-896 (2016).
