Summary
適切なサルコメアネットワークの形成は、iPSC由来心筋細胞の成熟にとって重要である。我々は、心臓の発達を促進する培養条件を改善するために、幹細胞由来心筋細胞の構造成熟の定量的評価を可能にする超解像ベースのアプローチを提示する。
Abstract
iPSC由来心筋細胞の成熟は、再生療法、薬物検査および疾患モデリングにおける応用において重要な課題である。複数の分化プロトコルが発達しているにもかかわらず、成人のような表現型に似たiPSC心筋細胞の生成は依然として困難である。心筋細胞成熟の主要な側面の1つは、高い収縮能力を確保するためによく組織されたサルコメアネットワークの形成を含む。ここでは、心筋細胞におけるαアクチニンネットワークの半定量的解析のための超解像ベースのアプローチを提示する。光活性化局在化顕微鏡を用いて、新生児組織から分離したiPSC由来心筋細胞と心臓細胞のサルコメア長さおよびZ-ディスク厚さの比較を行った。同時に、信頼性の高いデータを得るための適切なイメージング条件の重要性を示しています。我々の結果は、この方法が高い空間分解能を有する心細胞の構造的成熟度を定量的に監視するのに適しており、サルコメア組織の微妙な変化を検出することを可能にすることを示している。
Introduction
心筋梗塞や心筋症などの心血管疾患(CVD)は、西洋世界における主要な死因である。人間の心臓は再生能力が乏しいだけであるため、CVDからの回復を促進する戦略が必要です。これには、失われた心筋細胞(CM)を補充するための細胞置換療法と、効率的かつ安全な医薬品介入のための新しい抗不整脈薬の開発が含まれます。誘導多能性幹細胞(iPSC)は、ヒトCMインビトロでの無限の生成のための有望な細胞源であることが示されており、再生療法、疾患モデリング、および薬物スクリーニングアッセイ22、3、43,4の開発に適している。
多くの異なる心臓分化プロトコルが存在するが、iPSC由来のCMは、インビトロおよびインビボアプリケーション55、66を妨げる特定の定型的および機能的な側面をまだ欠いている。電気生理学的、代謝的、および分子変化に加えて、心臓成熟プロセスは、力の生成および細胞収縮に必要な基本的な単位であるサルコメアの構造組織を含む7。成人のCMは、よく組織された収縮装置を示すが、iPSC由来のCMは、収縮能力の低下および収縮性の変化に関連するサルコメアフィラメントの配置解除を一般に示す。,9単軸収縮パターンを示す成熟CMとは対照的に、未熟CMにおける混乱した構造は、細胞全体の径方向収縮を生じ、または収縮焦点99,1010の出現を促進する。
心臓成熟を改善するために、3D細胞培養法、電気的および機械的刺激、ならびに生体内条件11、12、13,12,13における細胞外マトリックスを模倣する細胞外マトリックスの使用を含む、複数のアプローチが適用されている。これらの異なる培養条件の成功と効率を評価するためには、iPSC CMの構造成熟度を監視および推定する技術が必要です。従来の共焦点イメージングとは対照的に、光活性化局在化顕微鏡(PALM)の場合の分解能は約10倍高い。この技術は、細胞構造の微妙な変化を検出し、より正確な分析を可能にします14.PALMベースのイメージングの高解像度を考慮すると、この方法の全体的な目標は、zディスクの厚さとサルコメアの長さの正確な決定によるiPSC由来CDのサルコメア成熟度の顕微鏡的評価でした。これまでの研究では、これらの構造的特徴は、心の成熟度15を評価するための適切なパラメータであることが示されている。例えば、全長のジストロフィンを欠いた疾患のiPSC-CMは、野生型細胞16と比較した場合にサルコメア長さおよびzバンド幅を減少させた。同様に、個々のサルコメアの長さを測定し、心臓発達16に対する地形の手掛かりの影響を調べた。そこで、サルコメアの長さとzディスクの厚さを定量的に測定することにより、iPSC-CMにおけるサルコメアネットワークの構造成熟を評価するためにこのアプローチを適用しました。
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Protocol
新生児マウスと成体マウスを含むこのプロトコルのすべてのステップは、ロストック大学医療センターの動物ケアのための倫理ガイドラインに従って行われました。
1. iPSC由来心筋細胞の培養と解離
- 前述の2D単層法を使用して hiPSC-CM を 25 日間区別します。
- 前温解離媒体を37°Cにし、培地を室温まで支持する。
- PBSで細胞を2回洗浄します。
- 細胞に温め込み解離培地を加え、37°Cおよび5%CO2で12分間インキュベート2する。
- セルにサポート メディアを追加します。
注: 追加するサポート メディアのボリュームは、手順 1.4 で使用される解離媒体の 2 倍のボリュームである必要があります。 - 5 mL血清ピペットを使用して細胞を取り出す。
- 遠心分離細胞は 200xg で5分間、3mLのhiPSC-CM培地培地17でペレットを再懸濁した。
- 75,000細胞/ウェルの細胞密度で8ウェルガラス底チャンバーの種子細胞と3日間培養。
2. 成人心筋細胞の分離
- NMRIマウスからの成体心筋細胞の単離および培養は、以前に報告された18のように行った。
- 8ウェルガラスチャンバースライドおよび培養1日で細胞をシードする。
3. 新生児心筋細胞の分離と培養
- 新生児心筋細胞の分離手順は、NMRIマウスから得られ、前述の19のように行った。
- 8ウェルガラスチャンバースライド内の種子分離細胞は、75,000細胞/ウェルの細胞密度でスライドし、新生児CM培養培地19で3日間培養する。
4. αアクチンネットワークの蛍光標識
注:最適な結果を得るには、細胞は8ウェルガラス底チャンバで培養されます。ラベル付けは、イメージングの1日前に実行する必要があります。
- 37°Cでプリウォーム4%PFA。
- 4%パラホルムアルデヒドを培養培地に直接添加してiPSC-CMを固定し(1:1希釈)、37°Cで15分間インキュベートします。固定のためのPFAの最終濃度は2%である。
- 固定細胞を0.2%トリトン-Xにインキュベートし、PBSで希釈し、室温で5分間培養します。
- 細胞をPBSで2回、それぞれ5分洗います。
- 1%BSA溶液(PBSで希釈)を加え、室温で60分間インキュベートします。
- 1%BSAで1:100 αアクチン抗体を希釈し、0.05%Triton-Xを含有して150μLの一次抗体溶液を調製する。細胞に加え、室温で60分間インキュベートします。
- 細胞を0.2%BSA溶液で2回洗浄し、それぞれ5分ずつ洗浄します。
- ヤギ抗マウスAlexa647抗体を1%BSAで1:100、0.05%Triton-Xを含む2次抗体溶液150 μLを調製します。細胞に加え、室温で40分間インキュベートします。
- 細胞を0.2%BSA溶液で2回洗浄し、それぞれ5分ずつ洗浄します。
- 細胞をPBSで2回、それぞれ5分洗います。PALMイメージングまで、標識された細胞を4°Cで暗闇の中に保管してください。
5. PALMイメージングバッファの調製
注: 各実験に対して、PALM イメージング バッファを新たに準備することが重要です。
- 50gのグルコースを蒸留水50mLに溶解して50%グルコース溶液を調製する。
- 50 mM Tris-HCl、10%のグルコース、10 mMの塩化ナトリウムを含む塩基性バッファーを準備します。
- 塩酸を使用してpHレベルを~8.0に調整します。
- 0.6 mgのピラノースオキシダーゼを316 μLの塩基バッファーに溶解して、ピラノースオキシダーゼ溶液を調製します。
- カタラーゼ溶液を500 μLの基本バッファーに溶解して調製します。10,000 x g で3分間、十分に混ぜ合わせ、遠心分離機を混ぜます。上清は、さらに使用するために保管してください。カタラーゼ溶液は、数日間4°Cで保つことができます。
- 316 μLのピラノースオキシダーゼ溶液、25 μLのカタラーゼ溶液、50%グルコース溶液100μL、50μLのシステマーチン、5μLのシステマチラン、5μLのシクロオスタテトライン、3.5μLのβメルカプトエタノールを混合して、500 μLのPALMイメージングバッファーを調製します。ピラノースオキシダーゼとカタラーゼの最終的な触媒活性は、それぞれ7.5 U、35,000Uである必要があります。
注:PALMイメージングバッファは、3〜5時間の最適なイメージング条件を提供します。蛍光色素の点滅能力が低下した場合は、新しい緩衝液アリコートを調製する。
6. PALM 画像の取得
- 使用前に少なくとも3時間前に顕微鏡のスイッチを入れ、熱平衡を可能にするために、イメージングの前にサンプルを室温に持って来てください。顕微鏡にインキュベーションチャンバーが装備されている場合は、温度を30°Cに調整してください。
- 適切な洗浄溶媒を使用して、チャンバースライドの目的と底部を洗浄します。
- 300 μL の PALM イメージング バッファーをラベル付きセルの 1 つのウェルに加え、チャンバー スライドを顕微鏡のステージ ホルダに挿入します。
- PALM 画像取得パラメータを設定します。
- 1.57 N.A. 100xの石油の目標を選択して取得します。
- PALM モードを選択し、TIRF 設定を有効にします。
- 取得するフレーム数を調整します。通常、5,000~10,000フレームで最適な結果を得ることができます。しかし、獲得したフレームの数は、蛍光色素の標識効率および点滅能力に強く依存し、使用者によって調整され得る。
- UV レーザーパワーを 0.1%、647 レーザーを 0.2% に設定します。
- ゲインレベルを50~100に設定します。
- レーザー照明をオンにして、ターゲットセルを選択します。ゲインレベルは、信号強度が低い場合(蛍光標識に依存して)増加させることができます。
- レーザー照明をオフにする
- PALM画像取得
- ゲインを 0 に減らし、レーザーパワー(ex 647)を 100% に増やします。
- ターゲットセルを~5 sに漂白します。
- ゲインを50に増やし、PALM画像の取得を開始します。
注:ゲインは十分な信号強度を得るために調整する必要がありますが、過飽和ピクセルは避けるべきです。信号強度が低下する場合は、ゲインレベルを上げます。
- 必要に応じて、UVレーザーパワーを着実に増強(0.1%-10%)信号強度を高め、蛍光素の点滅を促進します。
7. PALMデータの再構築
- イメージJソフトウェアを開き、PALMデータをインポートします。
- 開く雷雨プラグインと "実行分析"
- [カメラの設定] メニューにピクセル サイズと EM ゲインを入力します。
注:100xの目標と1.6倍の拡大レンズを使用する場合、100 nmピクセルサイズが適しています。ただし、ピクセルサイズは、PALMイメージングに使用される顕微鏡とカメラのハードウェア機能に依存するため、ユーザーはこのパラメータを慎重に確認して適応する必要があります。EM ゲイン値はメタデータから取得できます。 - 「ラン分析メニュー」では、パラメータを次のように設定します: B スプラインの順序: 3、B スプライン スケール: 2.0、ピーク強度しきい値: stf(Wave.F1)、フィッティング半径: 3、初期シグマ: 1.6、倍率: 5.0、更新頻度: 50、横シフト:"OK"ボタンをクリックして確認します。
- [カメラの設定] メニューにピクセル サイズと EM ゲインを入力します。
- 再構築されたPALM画像の後処理
- [プロットヒストグラム] メニューで 、 "Sigma" パラメータを選択します。
- [長方形] ツールを使用して、可能なアーティファクトを除外して ROI を選択し、ROI をフィルタに適用します。ROI 値は、フィルタ コマンド ボックスに表示されます。
- ROI 値に "と不確定性 <25" を追加します。可能なフィルターコマンドは次のようになります: "(シグマ > 48.6821 & シグマ < 1117.40) & 不確実性 <25"。選択したシグマ値を適用します。
- [重複を削除]メニューで、距離のしきい値を「10 nm」と入力して適用します。
- 「マージメニュー」で最大距離を「20」、最大分子あたりのフレーム数を「0」、最大オフフレームを「1」に設定します。設定を適用します。
- [ドリフト補正] メニューで相互相関を選択し、"ビン数" を "5" と "拡大" に設定して "5.0" にします。ドリフト補正設定を適用します。
- 最終的な PALM イメージを保存し、必要に応じてポスト処理データをエクスポートします。
サルコメアフィラメントの分析
- サルコメア長さの分析
- イメージJソフトウェアを開き、再構築されたPALMイメージをインポートします。
- 選択したサルコメア構造の間にZディスクに垂直な線を引き、アクチニンフィラメント間の最短距離を測定します。
- [分析] メニューの [プロット プロファイル] を選択し、2 つのピーク間の長さを取得します。サルコメアの長さは1つの細胞内で変化する可能性があるため、ターゲットセルの異なる領域で最低20個のサルコメアを測定する必要があります。
- Z-ディスク厚さの分析
- イメージJソフトウェアを開き、再構築されたPALMイメージをインポートします。
- 再構築された PALM イメージを 8 ビット モードのイメージに変換します。
- リッジ検出プラグインを開き、次のパラメータを入力します: 20、ハイコントラスト: 230、低コントラスト: 10、シグマ: 0.79、低いしきい値: 25.84、最小行長: 20.
- 「見積もり幅」「線を延長」「結果を表示」を設定します。
- [OK] をクリックし、結果表の [平均線幅] を使用して、さらに分析を行います。
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Representative Results
CMの構造成熟度を推定するために、新生児、完全に成熟した成人、およびiPSC CMは、最初に、サルコメアネットワークを視覚化するためにαアクチニン抗体でCMに標識した。PALMの取得後、画像を再構築し、個々のフィラメントの幅を自動検出するためのプラグインベースの画像処理ソフトウェアを用いてZディスク厚さを測定した。サルコメア長さは、隣接するフィラメントに対応する2つの隣接する強度ピーク間の距離を測定することによって算出した。 図1 は、iPSC由来CMにおけるサルコメア組織の評価を示す。
図2Aに示されるように、iPSC-CMおよび新生児細胞は、不規則で配置が不整れたサルコメア構造を有する同様のα−アクチニンパターンを示すことが判明した。同様に、定量的評価は、α-アクチニンフィラメントの長さと厚さがほぼ同じであることを示し、iPSC CMの早期発生状態を示す。より正確には、平均サルコメア長さは約1.83 μm(成人対iPSC CM対新生児CM:1.91±0.02 1.83±0.049 μm対であった。 1.82±0.03 μm、n=20細胞)、Zディスク厚さは約74nm(成人対iPSC CM対新生児CM:71.30±1.64対73.95±0.86 nm対73.95±0.12nm、n=20細胞)対照的に、成人成熟CMは、サルコメアの長さがわずかに増加し、Z-ディスクの厚さを減少させた規則的なサルコメアネットワークを示した。
従来の共焦点イメージングとPALMの比較では、サルコメアの長さに有意な差が見られた(図2C)(共焦点対PALM:1.75±0.02対1.70±0.02、n=10細胞)。しかし、iPSC-CMがPALMイメージング(図2C)を受けた際に、Zディスクの厚さが大幅に減少した(図2C)(共焦点対PALM:224.71±4.31対73.91±1.31、n=10細胞)が検出されました。代表的な画像は、PALM が適用されたときの解像度のゲインを強調し、対応する強度プロット(図 2D,E)でサポートされています。蛍光強度の半極限で計算された全幅は、標準的な共焦点顕微鏡と比較した場合、PALM画像においてαアクチニン構造が〜3倍薄いことが明らかになった(図2E)。
PALMのような単一分子局在化顕微鏡は、回折限界をはるかに下回る細胞内構造の検出を可能にする。最大の空間分解能を確保するためには、単一分子の局在を正確に検出するために適切なイメージング条件が必要です。使用されたイメージングバッファシステムは、蛍光色素の光物性に影響を与え、最終的なPALM画像の全体的な解像度と精度に大きな影響を与えるため、この取得プロセスにとって重要です。イメージングの1日前に調製した高品質のバッファとバッファの比較は、フィラメント厚さの大きな違いを明らかにした(図3A,B)。低品質のバッファーで取得したサルコメア構造は、最適なイメージング条件と比較して厚く見える (図 3A)。実際、定量的評価では、z-ディスクの厚さが〜65%増加した(高品質対低品質:73.87±1.02 nm対113.9±1.33nm、n=155フィラメント)が示された(図3B)。このデータ精度の欠如は、蛍光呼び出しの点滅特性が低下し、ローカリゼーションイベントあたりのフォトンの検出数が少なくなるためです(高対低バッファ品質:29689フォトン/イベント対16422フォトン/イベント) (図3C)。さらに、劣化した画像化条件下でローカリゼーション精度が低下する(高品質対低品質:14.25±5.85nm対19.56±6.7nm)、再構築されたPALM画像の全体的な解像度を低下させる(図3C)。
さらに、サンプルドリフトは、例えば、熱不安定によって引き起こされる、蛍光分子の正確な局在化に影響を及ぼし、 図3Dに示すように、ぼやけた画像をもたらす。最適な PALM イメージングは、明確かつ明確に定義された強度ピークを与えますが、過度のサンプルドリフトは不規則な強度パターンを生成し、隣接する 2 つのフィラメント間の距離を正確に決定することが困難になります。これらのデータは、取得プロセス中の微妙な変化でさえ画像品質とデータ精度を劇的に低下させることができるため、単一分子局在化顕微鏡における厳密に制御されたイメージング条件の重要性を強調しています。
図1 iPSCs由来CMにおけるサルコメア組織の評価
サルコメアネットワークをαアクチン抗体で蛍光標識し、続いてPALM画像取得を行った。その後の再構成は、定量分析に使用された最終的なPALM画像につながります。個々のサルコメアの長さは、隣接するサルコメアフィラメントに対応する2つの強度ピーク間の距離を測定することによって決定した(1-5)。Z-ディスクの厚さは、プラグインベースの画像処理ツールによって自動的に計算されました。スケールバー 10 μm. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:iPSC、成体、新生児心臓組織に由来するCMにおけるzディスク厚さおよびサルコメア長さの定量比較
(A)iPSCおよび新生児CMのαアクチニンネットワークの再構成されたPALM画像(B)定量的評価により、すべての新生児および共有の類似性がサルコメアの長さ(成人対iPSC CM対新生児CM:1.91±0.02 1.83±0.049μm対1.82±0.03μmの個人の厚さ)と個人の厚さ(1.82±0.03μm)の厚さ(個人の厚さ) iPSC CM対新生児CM:71.30±1.64対73.95±0.86nm対74.08±0.12 nm)は、iPSC CMの早期表現型を示す(C)従来の共焦点イメージングとPALMベースのデータ取得との間のサルコメア長さとz-ディスク厚さの比較。サルコメアの長さはピークからピークまでの距離を測定することによって決定されたので、データ精度に対する解像度の増加の影響はあまり顕著ではなかった(共焦点対PALM:1.75±0.02対1.70±0.02)。これに対し、PALM を適用した際に有意に低い Z ディスク厚さが検出されました (共焦点対 PALM: 224.71 ± 4.31 対 73.91 ± 1.31)。(D)共焦点およびPALMイメージングにより得られたiPSC-CMの代表的な顕微鏡画像。(E)(D)に示す赤線に対応する蛍光強度プロット。E値は、蛍光強度の半分の最大値で全幅を表し、PALM 画像の解像度の大幅な増加を示します。データはSEM±平均として提示され、n=10〜20細胞、1細胞当たり20個のサルコメアを評価した。統計的有意性は学生を使用して決定されました t -Test. **p<0.005, スケールバー 10 μm.ここをクリックして、この図のより大きなバージョンを表示してください。
図3:データの精度と信頼性に対するバッファ品質とサンプルドリフトの影響
(A) 異なるイメージング条件下で取得したiPSC由来CMの代表的なPALM画像。サルコメアフィラメントは、低品質のバッファーで画像化されたサンプルにおいてより厚く見えます。赤い線はサルコメア長さの代表的な測定を示し、緑のフィラメント構造はz-Disc分析に含まれていた。(B)定量的評価により、低品質バッファーと高品質バッファー(高対比較)の間でZディスク厚さが有意差に生じます。 低バッファ品質: 73.87 ± 1.02 nm vs. 113.9 ± 1.34 nm)(C)この画像精度の違いは、フルオロフォアの点滅能力の低下に基づいており、分子あたりの検出光子の数が減少しました(高対低バッファ品質:29689光/イベント対)。同時に、ローカリゼーション精度が低下し、全体的な解像度(高対低バッファ品質:14.25±5.85対19.56±6.7)(D)D同様に、過度のサンプルドリフトが画質を損なう可能性があります。サンプルドリフトのない適切な画像取得は、αアクチンフィラメントの明示された強度ピークをもたらす一方で、サンプルドリフトの増加は、サルコメア長さの正確な分析に強く影響を与える不規則な強度パターンを引き起こします。データは、SEM155フィラメント±分析された平均値として提示される。統計的有意性は、学生t-テストを使用して決定されました。スケールバー10μm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
iPSC由来のCM in vitroの生成は、再生療法、疾患モデリング、薬物スクリーニングプラットフォームの開発にとって重要です。しかし、これらのCMの成熟度が不十分な心血管研究20における大きな障害である。この点に関して、iPSC由来CMの構造成熟状態のモニタリングを可能にする高分解能イメージング技術が必要である。同時に、超分解能顕微鏡は、チチンおよびトロポニン10、21、22,21,22に対して最近実証されるように、適切なサルコメア形成に必要な特定のタンパク質の機能を正確に分析するための貴重なツールとなり得る。
現在のプロトコルでは、αアクチニンサルコメアネットワークを解析することにより、iPSC CMの構造成熟を定量的に評価するPALMベースのアプローチを提示する。
従来の光顕微鏡と比較して、PALMは〜20〜50 nm23の解像度で細胞構造の可視化を可能にする。したがって、古典的な光顕微鏡アプローチによって検出がかろうじてまたは検出できない心臓サルコメアネットワークの微妙な変化を検出することができます。PALMを適用し、iPSCおよび新生児CMで平均サルコメア長さ〜1.84μmを測定しました(図2)。これは、個々のサルコメアのサイズが〜1.7-2.0 μm24,25,26であることを示すいくつかの以前のレポートと一致しています。サルコメアの長さと比較すると、Z線の厚さの正確な推定は、そのサイズが光顕微鏡の古典的解像度限界をはるかに下回っているため、より複雑です。電子顕微鏡を用いて、これまでの研究では、z-ディスクの厚さはiPSC CMで50〜80nmの範囲であり、これは私たちのPALMベースの検出と同様である(図2)。
標準的な共焦点顕微鏡との比較は、PALMが適用されたときの解像度の劇的な増加を示した。PALMイメージングに続いて、3倍のZディスク厚さを見つけました(図2)。しかし、サルコメア長さに対して有意差は測定されなかった。このパラメータは強度プロットのピークからピークまでの距離を検出することによって測定されるため、解像度の向上の効果はあまり顕著ではありません。
この高い空間分解能を実現するためには、PALM は、ユーザーが注意深く対処する必要がある、明確に定義されたイメージング条件を必要とします。単一分子の正確な局在化のためには、特殊な光物性を有する蛍光体が必要であり、蛍光と暗い状態の間で急速に切り替え可能である27.前述のように、蛍光体の選択は、画像品質28に強く影響を与える可能性があります。Alexa 647には、単一分子局在化顕微鏡,29、30、31,30に最適で広く使用されている色素の1つである、深い点滅能力が記載されています。31しかし、多数のPALM蛍光体が利用可能であるため、サンプルラベリング27、28,の点で高い柔軟性を持つユーザーが得られます。
適切な蛍光色素の選択に加えて、イメージングバッファシステムは、蛍光色素の光物性を指示するパームイメージングのもう一つの重要なポイントです。ピルノースオキシダーゼは、グルコースオキシダーゼよりも優れた酸素捕捉酵素システムとしてpH安定性を高め、従って、時間32,33,33での蛍光呼びまつきの有意な減少なしに長期イメージングを可能にした。しかし、イメージングバッファの寿命は数時間に制限され、高い再現性を確保するために各実験に対して新たに準備する必要があります。我々の結果は、低品質バッファを用いたPALMイメージング後のデータ精度の劇的な低下を示し、点滅能力の低下とローカリゼーション精度の低下を招く(図3A-C)。
さらに、画像システムの熱安定性は、サンプルドリフトの増加を避けるために必須である。中程度のドリフトは計算解析によって補正できますが、サンプルの過剰な動きは検出された蛍光体の局在を誤って計算し、画像の品質とデータ精度を低下させます。これは、PALMイメージングを開始する前に、加熱チャンバーと各サンプルの十分な熱平衡を用いて顕微鏡を使用することによって防止することができる。また、標識密度や効率、抗体フラグメントまたはナノボディの使用は、イメージング条件34、35、36,35,36を最適化するために考慮されるべきである。
大きな細胞構造の取得プロセスは、撮像パラメータ(視野、蛍光プローブ、イメージングバッファなど)に応じて10〜30分かかる場合があります。この長い取得時間は、生細胞イメージングに適さないPALMの欠点です。通常、5.000~10.000 フレームは、ローカリゼーションの精度の高い十分な数の点滅イベントを実現するためにキャプチャされます。また、イメージングの深さは通常数百ナノメートルに制限されており、より厚いサンプルの調査が困難です。しかし、3D PALM セットアップ37を使用すると、Z 方向の解像度を向上させることができます。
iPSC CMのαアクチニンネットワークを特徴付けるパラメータとして、サルコメアの長さやz-ディスクの厚さを含む2つのパラメータを選択しました。フィラメントの向きなど、サルコメア足場をより包括的に見るために、追加の機能を収集することができます。同様に、3D PALMは、ネットワーク内の現在のノードとブランチの推定によってサルコメア構造全体を定量的に分析するのに役立ちます。
PALMはサルコメア構造の非常に詳細な分析を可能にするが、この方法は、心臓の成熟度を評価するもう一つの重要な特徴である細胞収縮性のような機能的パラメータの取得を可能にしない。以前の報告によると、サルコメア構造の顕微鏡ベースの評価をビデオ分析と組み合わせて機能データ38,39,39を得ることができる。しかし、著者らは従来の蛍光顕微鏡を用いてきたので、サルコメア構造に関するデータはPALMと比較すると精度が低い。また、PALMデータを以前のタイムラプス記録と相関させる可能性も提供し、収縮測定の取得を可能にします。
要約すると、このプロトコルは、CMにおけるサルコメアネットワークの構造成熟を定量的に評価する方法を提供する。この超解像度ベースのアプローチを用いて、より成人的な表現型を得るためにiPSC由来CMの改善された心臓開発を標的にする戦略を確立することができる。
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Disclosures
著者らは利益相反を宣言しない。
Acknowledgments
この研究は、EU構造基金(ESF/14-BM-A55-0024/18)によって支援されました。さらに、H.L.はロストック大学医療センター(889001および889003)のFORUNプログラムとヨーゼフとケーテ・クリンツ財団(T319/29737/2017)によってサポートされています。C.I.L.は、ロストック大学医療センターの臨床医科学者プログラムによってサポートされています。R.DはDFG(DA1296/6-1)、DAMP財団、ドイツ心臓財団(F/01/12)、BMBF(VIP+ 00240)によってサポートされています。
マドレーヌ・バルチュは、iPSC細胞培養と心臓分化における彼女の技術サポートに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| human iPSC cell line | Takara | Y00325 | |
| µ-Slide 8 Well Glass Bottom | ibidi | 80827 | |
| 0.5ml eppendorf tube | Eppendorf | 30121023 | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A906 | |
| Cardiomyocyte Dissociation Kit | Stem Cell Technologies | 05025 | |
| Catalase | Sigma Aldrich | C40-1G | |
| Cyclooctatetraene | Sigma Aldrich | 138924-1G | |
| Cysteamine | Sigma Aldrich | 30070-10g | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline without Ca2+ and Mg2+ | Thermo Fisher | 14190169 | |
| F(ab')2-Goat anti-Mouse IgG Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher | A-21237 | |
| Fiji image processing software (Image J) | |||
| Glucose | Carl Roth | X997.2 | |
| Hydrochloric acid | Sigma Aldrich | H1758 | |
| LSM 780 ELYRA PS.1 system | Zeiss | ||
| Paraformaldehyde | Merck | 8187150100 | |
| Pyranose oxidase | Sigma Aldrich | P4234-250UN | |
| sarcomeric α-actinin antibody [EA-53] | Abcam | ab9465 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S7653 | |
| sterile water | Carl Roth | 3255.1 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
| Trizma base | Sigma Aldrich | T1503 | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | 63689 |
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