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Biology

एकल अणु स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर मानव आईपीएससी-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स में α-Actinin नेटवर्क का विश्लेषण

Published: November 3, 2020 doi: 10.3791/61605
Automatic Translation
1,2, 1,2, 3, 1,2, 1,2
1Department of Cardiac Surgery, Reference and Translation Center for Cardiac Stem Cell Therapy (RTC), Rostock University Medical Center, 2Faculty of Interdisciplinary Research, Department Life, Light & Matter, University Rostock, 3Department of Cardiology, Rostock University Medical Center

Summary

आईपीएससी-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स की परिपक्वता के लिए उचित सारकोमेरे नेटवर्क का गठन महत्वपूर्ण है। हम एक सुपर संकल्प आधारित दृष्टिकोण पेश करते हैं जो हृदय विकास को बढ़ावा देने वाली संस्कृति स्थितियों में सुधार करने के लिए स्टेम सेल व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स की संरचनात्मक परिपक्वता के मात्रात्मक मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है।

Abstract

आईपीएससी-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स की परिपक्वता पुनर्योजी चिकित्सा, दवा परीक्षण और रोग मॉडलिंग में उनके आवेदन के लिए एक महत्वपूर्ण मुद्दा है। कई भेदभाव प्रोटोकॉल के विकास के बावजूद, वयस्क जैसे फेनोटाइप जैसी आईपीएससी कार्डियोमायोसाइट्स की पीढ़ी चुनौतीपूर्ण बनी हुई है। कार्डियोमायोसाइट्स परिपक्वता के एक प्रमुख पहलू में उच्च संकुचन क्षमता सुनिश्चित करने के लिए एक अच्छी तरह से संगठित सारकोमेरे नेटवर्क का गठन शामिल है। यहां, हम कार्डियोमायोसाइट्स में α-ऐक्टिनिन नेटवर्क के अर्ध-मात्रात्मक विश्लेषण के लिए एक सुपर रिज़ॉल्यूशन-आधारित दृष्टिकोण प्रस्तुत करते हैं। फोटोएक्टिवेटेड लोकलाइजेशन माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके नवजात ऊतक से अलग किए गए आईपीएससी-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स और कार्डियक कोशिकाओं की सारकोमेरे लंबाई और जेड-डिस्क मोटाई की तुलना की गई। साथ ही, हम विश्वसनीय डेटा प्राप्त करने के लिए उचित इमेजिंग स्थितियों के महत्व को प्रदर्शित करते हैं। हमारे परिणाम बताते हैं कि यह विधि उच्च स्थानिक संकल्प के साथ हृदय कोशिकाओं की संरचनात्मक परिपक्वता की मात्रात्मक रूप से निगरानी करने के लिए उपयुक्त है, जिससे सारकोमेरे संगठन के सूक्ष्म परिवर्तनों का पता लगाया जा सके।

Introduction

हृदय रोग (सीवीडी) जैसे मायोकार्डियल इंफार्क्शन या कार्डियोमायोपैथी पश्चिमी दुनिया में मौत का प्रमुख कारण बने हुए हैं1। चूंकि मानव हृदय में केवल खराब पुनर्योजी क्षमता है, इसलिए सीवीडी से वसूली को बढ़ावा देने के लिए रणनीतियों की आवश्यकता है। इसमें खोए हुए कार्डियोमायोसाइट्स (सीएम) को भरने के साथ-साथ कुशल और सुरक्षित दवा हस्तक्षेप के लिए नई एंटी-अतालता दवाओं के विकास के लिए सेल रिप्लेसमेंट उपचार शामिल हैं। प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (आईपीएससी) को विट्रो में मानव मुख्यमंत्री की असीमित पीढ़ी के लिए एक आशाजनक सेल स्रोत के रूप में दिखाया गया है, जो पुनर्योजी चिकित्सा, रोग मॉडलिंग के लिए उपयुक्त है, और दवा स्क्रीनिंग के विकास के लिए2,,3,,4।

यद्यपि कई अलग-अलग कार्डियक विभेदक प्रोटोकॉल मौजूद हैं, आईपीएससी-व्युत्पन्न सीएम में अभी भी कुछ फेनोटाइपिकल और कार्यात्मक पहलुओं की कमी है जो इन विट्रो और वीवो एप्लिकेशन5,,6में बाधा डालते हैं। इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिक, मेटाबोलिक और आणविक परिवर्तनों के अलावा, हृदय परिपक्वता प्रक्रिया में सारकोर्स का संरचनात्मक संगठन शामिल है, जो बल उत्पादन और सेल संकुचन7के लिए आवश्यक मौलिक इकाइयां हैं। जबकि वयस्क सीएम एक अच्छी तरह से संगठित संकुचन तंत्र प्रदर्शित करते हैं, आईपीएससी-व्युत्पन्न सीएम आमतौर पर एक कम संकुचन क्षमता और परिवर्तित संकुचन गतिशीलता8,,9से जुड़े अव्यवस्थित सारकोमेरे तंतुओं का प्रदर्शन करते हैं। परिपक्व सीएम के विपरीत जो एकात्मक संकुचन पैटर्न दिखाते हैं, अपरिपक्व सीएम में विकेंद्रित संरचनाओं के परिणामस्वरूप पूरे सेल का एक रेडियल संकुचन होता है या संकुचन फोकलपॉइंट्स 9,,10की उपस्थिति को बढ़ावा देता है।

हृदय परिपक्वता में सुधार के लिए, कई दृष्टिकोण लागू किए गए हैं, जिनमें 3 डी सेल संस्कृति विधियां, विद्युत और यांत्रिक उत्तेजना, साथ ही वीवो स्थितियों में नकल करने वाले एक्सेलैल्युलर मैट्रिस का उपयोग11,12,,13शामिल हैं।, इन विभिन्न संस्कृति स्थितियों की सफलता और दक्षता का मूल्यांकन करने के लिए, सूक्ष्म तकनीकों द्वारा आईपीएससी सीएम की संरचनात्मक परिपक्वता की डिग्री की निगरानी और अनुमान लगाने के लिए तकनीकों की आवश्यकता होती है। पारंपरिक कॉन्फोकल इमेजिंग के विपरीत, फोटोएक्टिवेटेड लोकलाइजेशन माइक्रोस्कोपी (पाम) के मामले में संकल्प लगभग 10x अधिक है। बदले में यह तकनीक अधिक सटीक विश्लेषण की अनुमति देती है, सेलुलर संरचनाओं के सूक्ष्म परिवर्तन का भी पता लगाती है14। पाम आधारित इमेजिंग के उच्च संकल्प को ध्यान में रखते हुए, इस विधि का समग्र लक्ष्य जेड-डिस्क मोटाई और सारकोर लंबाई के सटीक निर्धारण द्वारा आईपीएससी-व्युत्पन्न सीएम में सारकोमे परिपक्वता का सूक्ष्म मूल्यांकन था। पिछले अध्ययनों में, इन संरचनात्मक विशेषताओं को कार्डियक परिपक्वता15का आकलन करने के लिए उपयुक्त पैरामीटर दिखाया गया है। उदाहरण के लिए, रोगग्रस्त आईपीएससी-सीएम में पूरी लंबाई की कमी डिस्ट्रोफिन प्रदर्शन ने जंगली प्रकार की कोशिकाओं की तुलना में सारकोमेरे लंबाई और जेड-बैंड चौड़ाई कम करदी 16। इसी तरह, हृदय विकास16पर स्थलाकृतिक संकेतों के प्रभाव की जांच करने के लिए व्यक्तिगत सारकोमर की लंबाई मापी गई थी। इसलिए, हमने इस दृष्टिकोण को आईपीएससी-सीएम में सारकोमेरे नेटवर्क की संरचनात्मक परिपक्वता का मूल्यांकन करने के लिए मात्रात्मक रूप से सारकोमेरे लंबाई और जेड-डिस्क मोटाई को मापने के लिए लागू किया।

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Protocol

नवजात और वयस्क चूहों से जुड़े इस प्रोटोकॉल में सभी कदम रोस्टॉक विश्वविद्यालय चिकित्सा केंद्र के पशु देखभाल के लिए नैतिक दिशा निर्देशों के अनुसार किए गए थे ।

1. आईपीएससी-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स की खेती और वियोजन

  1. पहले17वर्णित 2डी मोनोलेयर विधि का उपयोग करके 25 दिनों के लिए हिप्ससी-सीएम में अंतर करें।
  2. प्रीवार्म डिसोशेशन माध्यम से 37 डिग्री सेल्सियस तक और मध्यम से कमरे के तापमान का समर्थन करते हैं।
  3. पीबीएस के साथ दो बार कोशिकाओं को धोएं।
  4. कोशिकाओं में प्रीवार्म्ड डिसोसिएशन माध्यम जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस और 5%सीओ2 पर 12 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  5. कोशिकाओं में समर्थन माध्यम जोड़ें।
    नोट: जोड़ा समर्थन माध्यम की मात्रा के लिए दो बार वियोजन मध्यम चरण १.४ में इस्तेमाल की मात्रा की जरूरत है ।
  6. 5 एमएल सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके कोशिकाओं को उखाड़ फेंकना।
  7. 5 मिनट के लिए 200 x ग्राम पर सेंट्रलाइज कोशिकाएं और आईआईपीएससी-सीएम कल्चर मीडियम17के 3 एमसीएल में गोली को फिर से रीस्ब्ड करें।
  8. 8 अच्छी तरह से ग्लास नीचे कक्षों में बीज कोशिकाओं ७५,००० कोशिकाओं के एक सेल घनत्व पर/

2. वयस्क कार्डियोमायोसाइट अलगाव

  1. एनएमआरआई चूहों से वयस्क कार्डियोमायोसाइट्स का अलगाव और खेती पहले18की रिपोर्ट के अनुसार की गई थी ।
  2. 8 अच्छी तरह से ग्लास चैंबर स्लाइड और संस्कृति में बीज कोशिकाओं को एक दिन के लिए ।

3. नवजात कार्डियोमायोसाइट्स का अलगाव और खेती

  1. एनएमआरआई चूहों से प्राप्त नवजात कार्डियोमायोसाइट्स की अलगाव प्रक्रिया, पहले19वर्णित के रूप में की गई थी।
  2. 8 वेल ग्लास चैंबर स्लाइड में बीज पृथक कोशिका नवजात सीएम कल्चर मीडियम19में 3 दिनों के लिए 75,000 कोशिकाओं/

4. α-ऐक्टिनिन नेटवर्क की इम्यूनोफ्लोरेसेंस लेबलिंग

नोट: इष्टतम परिणामों के लिए, कोशिकाओं को 8 अच्छी तरह से ग्लास बॉटम कक्षों में सुसंस्कृत किया जाता है। लेबलिंग इमेजिंग से एक दिन पहले किया जाना चाहिए।

  1. प्रीवार्म 4% पीएफए 37 डिग्री सेल्सियस पर।
  2. आईपीएससी-सीएम को सीधे कल्चर मीडिया (1:1 कमजोर पड़ने) में जोड़कर और 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करके ठीक करें। निर्धारण के लिए पीएफए की अंतिम एकाग्रता 2% है।
  3. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए, पीबीएस में पतला, 0.2% ट्राइटन-एक्स में फिक्स्ड कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
  4. पीबीएस, 5 मिनट प्रत्येक के साथ दो बार कोशिकाओं को धोएं।
  5. 1% बीएसए समाधान जोड़ें (पीबीएस में पतला) और कमरे के तापमान पर 60 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  6. 1% बीएसए में α-ऐक्टिन एंटीबॉडी 1:100 को कमजोर करके प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान के 150 माइक्रोन तैयार करें, जिसमें 0.05% ट्राइटन-एक्स शामिल हैं। कोशिकाओं में जोड़ें और 60 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
  7. 0.2% बीएसए समाधान, 5 मिनट प्रत्येक के साथ दो बार कोशिकाओं को धोएं।
  8. 1% बीएसए में बकरी-एंटी-माउस एलेक्सा647 एंटीबॉडी 1:100 को कमजोर करके माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान के 150 माइक्रोन तैयार करें, जिसमें 0.05% ट्राइटन-एक्स शामिल है। कोशिकाओं में जोड़ें और 40 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
  9. 0.2% बीएसए समाधान, 5 मिनट प्रत्येक के साथ दो बार कोशिकाओं को धोएं।
  10. पीबीएस, 5 मिनट प्रत्येक के साथ दो बार कोशिकाओं को धोएं। पाम इमेजिंग तक 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में लेबल कोशिकाओं रखें।

5. पाम इमेजिंग बफर की तैयारी

नोट: प्रत्येक प्रयोग के लिए पाम इमेजिंग बफर को ताजा तैयार करना महत्वपूर्ण है।

  1. आसुत पानी के 50 एमएल में 25 ग्राम ग्लूकोज घोलकर 50 प्रतिशत ग्लूकोज घोल तैयार करें।
  2. 50 एमएम ट्राइस-एचसीएल, 10 प्रतिशत ग्लूकोज और 10 एमएम सोडियम क्लोराइड युक्त बेसिक बफर तैयार करें।
    1. हाइड्रोक्लोरिक एसिड का उपयोग करके पीएच स्तर को ~ 8.0 तक समायोजित करें।
  3. बेसिक बफर के 316 माइक्रोन में 0.6 मिलीग्राम पायरानोस ऑक्सीडेस को भंग करके पायरानोस ऑक्सीडेस समाधान तैयार करें।
  4. बेसिक बफर के 500 माइक्रोन में 7 मिलीग्राम कैटालस को घोलकर कैटालेज सॉल्यूशन तैयार करें। 3 मिनट के लिए 10,000 x ग्राम पर अच्छी तरह से और अपकेंद्रित्र मिलाएं। आगे के उपयोग के लिए सुपरनेट रखें। कैटालस सॉल्यूशन को कई दिनों तक 4 डिग्री सेल्सियस पर रखा जा सकता है।
  5. पाइरानोस ऑक्सीडेस सॉल्यूशन के 316 माइक्रोन, कैटालेस सॉल्यूशन के 25 माइक्रोन, 50% ग्लूकोज सॉल्यूशन के 100 माइक्रोन, सिस्टेमीन के 50 माइक्रोन, साइकोक्टेनेने की 5 माइक्रोन और β-मर्केप्टो इथेनॉल के 3.5 माइक्रोन मिलाकर पाम इमेजिंग बफर के 500 माइक्रोन तैयार करें। पायरानोस ऑक्सीडेस और कैटालेस की अंतिम उत्प्रेरक गतिविधि क्रमशः 7.5 यू, 35,00U होने की आवश्यकता है।
    नोट: पाम इमेजिंग बफर 3-5 घंटे के लिए इष्टतम इमेजिंग शर्तों प्रदान करता है । यदि फ्लोरोसेंट डाई की निमिष क्षमता कम हो जाती है, तो एक नया बफर एलिकोट तैयार करें।

6. पाम छवि अधिग्रहण

  1. उपयोग से पहले कम से कम 3 घंटे माइक्रोस्कोप पर स्विच करें और थर्मल संतुलन की अनुमति देने के लिए इमेजिंग से पहले नमूना को कमरे के तापमान पर लाएं। यदि माइक्रोस्कोप एक इनक्यूबेशन कक्ष से लैस है, तो तापमान को 30 डिग्री सेल्सियस तक समायोजित करें।
  2. एक उपयुक्त सफाई सॉल्वेंट का उपयोग करके कक्ष स्लाइड के उद्देश्य और नीचे को साफ करें।
  3. लेबल कोशिकाओं के एक कुएं में पाम इमेजिंग बफर के 300 माइक्रोन जोड़ें और माइक्रोस्कोप के चरण धारक में चैंबर स्लाइड डालें।
  4. पाम छवि अधिग्रहण मापदंडों सेट करें।
    1. अधिग्रहण के लिए 1.57 एनए 100x तेल उद्देश्य का चयन करें।
    2. पाम मोड का चयन करें और टीआईआरएफ सेटिंग्स को सक्रिय करें।
    3. अधिग्रहीत किए जाने वाले फ्रेम की संख्या को समायोजित करें। आमतौर पर 5, 000-10, 000 फ्रेम इष्टतम परिणाम प्राप्त करने के लिए पर्याप्त हैं। हालांकि, अधिग्रहीत फ्रेम की संख्या दृढ़ता से लेबलिंग दक्षता और फ्लोरोसेंट डाई की निमिष क्षमता पर निर्भर करती है और उपयोगकर्ता द्वारा समायोजित की जा सकती है।
    4. 0.1% और 647 लेजर करने के लिए 0.2% करने के लिए यूवी लेजर पावर सेट करें।
    5. लाभ स्तर को 50-100 तक सेट करें।
    6. लेजर रोशनी पर स्विच करें और एक लक्ष्य सेल का चयन करें। यदि सिग्नल तीव्रता कम हो जाती है (फ्लोरेसेंस लेबलिंग के आधार पर) लाभ स्तर को बढ़ाया जा सकता है।
    7. लेजर रोशनी बंद करें
  5. पाम छवि अधिग्रहण
    1. 0 को लाभ कम करने और लेजर शक्ति (पूर्व 647) 100% करने के लिए वृद्धि हुई है।
    2. ~ 5 एस के लिए लक्ष्य सेल ब्लीच।
    3. 50 करने के लिए लाभ में वृद्धि और पाम छवि अधिग्रहण शुरू करते हैं।
      नोट: लाभ के लिए पर्याप्त संकेत तीव्रता प्राप्त करने के लिए समायोजित किया जाना चाहिए, जबकि oversaturated पिक्सल से बचा जाना चाहिए । यदि सिग्नल की तीव्रता कम हो जाए तो गेन लेवल बढ़ाएं।
  6. वैकल्पिक रूप से, यूवी लेजर पावर (0.1%-10%) सिग्नल तीव्रता बढ़ाने के लिए और फ्लोरोफोर के निमिष को बढ़ावा देने के लिए।

7. पाम डेटा का पुनर्निर्माण

  1. इमेज जे सॉफ्टवेयर खोलें और पाम डेटा आयात करें।
  2. ओपन आंधी प्लगइन और"भागो विश्लेषण"
    1. "कैमरासेटअप"मेनू में पिक्सेल आकार और EM लाभ दर्ज करें।
      नोट: 100x उद्देश्यों और 1.6x आवर्धन लेंस का उपयोग करते समय, 100 एनएम पिक्सेल आकार उपयुक्त है। हालांकि, पिक्सेल का आकार पाम इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किए जाने वाले माइक्रोस्कोप और कैमरे की हार्डवेयर सुविधाओं पर निर्भर करता है, इसलिए उपयोगकर्ताओं को इस पैरामीटर की सावधानीपूर्वक जांच और अनुकूलन करने की आवश्यकता है। ईएम लाभ मान मेटाडेटा से प्राप्त किया जा सकता है।
    2. "भागो विश्लेषण मेनू"में मापदंडों को इस प्रकार निर्धारित करें: बी-स्प्लीन ऑर्डर: 3, बी-स्प्लीन स्केल: 2.0, पीक तीव्रता सीमा: एसटीएफ (वेव.एफ 1), फिटिंग रेडियस: 3, प्रारंभिक सिग्मा: 1.6, आवर्धन: 5.0, अपडेट आवृत्ति: 50, पार्श्व पाली: 2. क्लिक करके पुष्टि करें"ओके"बटन।
  3. खंगाला पाम छवि के बाद प्रसंस्करण
    1. 'प्लॉटहिस्टोग्राम'में मेन्यू'सिग्मा'पैरामीटर का चयन करें।
    2. संभावित कलाकृतियों को छोड़कर आरओआई का चयन करने और फ़िल्टर पर आरओआई लागू करने के लिए"आयत"उपकरण का उपयोग करें। आरओआई मान फ़िल्टर कमांड बॉक्स में दिखाई देंगे।
    3. आरओआईमूल्यों में "और अनिश्चितता और लेफ्टिनेंट; 25"जोड़ें। एक संभावित फिल्टर कमांड इस तरह दिखेगा: "(सिग्मा एंड जीटी; 48.6821 और सिग्मा एंड एलटी; 1117.40) और अनिश्चितता और लेफ्टिनेंट;25"। चयनित सिग्मा मानों लागू करें।
    4. "डुप्लिकेट हटाएं"मेनू में, "10 एनएम" की दूरी सीमा में प्रवेश करें और लागू करें।
    5. "विलयमेनू"में, "20" के लिए अधिकतम दूरी निर्धारित, "0" और अधिकतम बंद फ्रेम "1" के लिए प्रति अणु अधिकतम फ्रेम । सेटिंग्स लागू करें।
    6. "बहावसुधार मेनू"में, क्रॉस सहसंबंध का चयन करें और"डिब्बे की संख्या"को "5" और"आवर्धन"को "5.0" सेट करें। बहाव सुधार सेटिंग्स लागू करें।
    7. वांछित होने पर अंतिम पाम छवि और निर्यात पोस्ट प्रोसेस्ड डेटा सहेजें।

8. सारकोमेरे तंतु का विश्लेषण

  1. सारकोमेरे लंबाई का विश्लेषण
    1. छवि जे सॉफ्टवेयर खोलें और खंगाला पाम छवि आयात करें।
    2. ऐक्टिनिन फिलामेंट्स के बीच सबसे कम दूरी को मापने के लिए जेड-डिस्क के लंबवत चयनित सारकोमेरे संरचनाओं के बीच एक लाइन ड्रा करें।
    3. "विश्लेषण"मेनू में"प्लॉट प्रोफाइल"का चयन करें और दो चोटियों के बीच लंबाई प्राप्त करें। चूंकि सारकोमर की लंबाई एक कोशिका के भीतर भिन्न हो सकती है, इसलिए लक्ष्य प्रकोष्ठ के विभिन्न क्षेत्रों में न्यूनतम 20 सारकोमर मापा जाना चाहिए।
  2. जेड-डिस्क मोटाई का विश्लेषण
    1. छवि जे सॉफ्टवेयर खोलें और खंगाला पाम छवि आयात करें।
    2. पुनर्निर्मित पाम छवि को 8-बिट मोड छवि में परिवर्तित करें।
    3. रिज डिटेक्शन प्लगइन खोलें और निम्नलिखित मापदंडों में प्रवेश करें: लाइन चौड़ाई: 20, उच्च विपरीत: 230, कम विपरीत: 10, सिग्मा: 0.79, निचली सीमा: 25.84, न्यूनतम लाइन लंबाई: 20।
    4. "अनुमानचौड़ाई","विस्तार रेखा"और"प्रदर्शन परिणाम"सेट करें।
    5. क्लिक करें"ठीक है"और आगे के विश्लेषण के लिए परिणाम तालिका से"मतलब लाइन चौड़ाई"का उपयोग करें।

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Representative Results

सीएम की संरचनात्मक परिपक्वता की डिग्री का आकलन करने के लिए, नवजात, पूरी तरह से परिपक्व वयस्क, और आईपीएससी सीएम को शुरू में सीएम को सारकोमेरे नेटवर्क की कल्पना करने के लिए α-ऐक्टिन एंटीबॉडी के साथ लेबल किया गया था। पाम अधिग्रहण के बाद, छवियों को खंगाला गया, और जेड-डिस्क मोटाई को अलग-अलग फिलामेंट्स की चौड़ाई का स्वचालित पता लगाने के लिए प्लगइन-आधारित छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके मापा गया था। सारकोमेरे लंबाई की गणना पड़ोसी तंतुओं के अनुरूप दो आसन्न तीव्रता चोटियों के बीच की दूरी को मापने के द्वारा की गई थी। चित्र 1 आईपीएससी-व्युत्पन्न सीएम में सारकोमीर संगठन का मूल्यांकन दिखाता है।

जैसा कि चित्र 2 एमें प्रस्तुत किया गया है, आईपीएससी-सीएम और नवजात कोशिकाओं को अनियमित, अव्यवस्थित सारकोमेर संरचनाओं के साथ एक समान α-ऐक्टिविन पैटर्न प्रदर्शित करने के लिए पाया गया । इसी तरह, मात्रात्मक आकलन से पता चला कि α-ऐक्टिन फिलामेंट्स की लंबाई और मोटाई लगभग समान थी जो आईपीएससी सीएम की समय से पहले विकास की स्थिति को इंगित करती है । अधिक सटीक रूप से, औसत सारकोमेरे लंबाई लगभग 1.83 माइक्रोन (वयस्क बनाम) थी। आईपीएससी सीएम बनाम नवजात मुख्यमंत्री: 1.91 ± 0.02 1.83 ± 0.049 माइक्रोन बनाम 1.82±0.03 माइक्रोन, एन = 20 कोशिकाएं), जबकि जेड-डिस्क मोटाई लगभग 74 एनएम (वयस्क बनाम) थी। आईपीएससी सीएम बनाम नवजात सीएम: 71.30 ± 1.64 बनाम 73.95 ± 0.86 एनएम बनाम 74.08 ± 0.12 एनएम, एन= 20 सेल)(चित्रा 2B)। इसके विपरीत, वयस्क परिपक्व मुख्यमंत्री थोड़ा वृद्धि हुई सारकोमेरे लंबाई और कम जेड डिस्क मोटाई के साथ एक नियमित सारकोमेरे नेटवर्क दिखाया ।

पारंपरिक कॉन्फोकल इमेजिंग और पाम की तुलना में सारकोमेरे लंबाई(चित्रा 2C)(कॉन्फोकल बनाम पाम: 1.75 ± 0.02 बनाम 1.70 ± 0.02, एन = 10 कोशिकाओं) का कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं दिखा। हालांकि, एक गहरा कम जेड डिस्क मोटाई का पता चला जब iPSC-CM पाम इमेजिंग(चित्रा 2C)(confocal बनाम पाम के अधीन थे: २२४.७१ ± ४.३१ बनाम ७३.९१ ± १.३१, n = 10 कोशिकाओं) । प्रतिनिधि छवियां संकल्प में लाभ को उजागर करती हैं जब पाम लागू किया गया था, इसी तीव्रता भूखंडों(चित्रा 2डी, ई)द्वारा समर्थित। फ्लोरेसेंस तीव्रता के आधे अधिकतम पर पूर्ण चौड़ाई की गणना से पता चला है कि α-actinin संरचनाओं ~ 3-पाम छवियों में पतले अगर मानक confocal माइक्रोस्कोपी(चित्रा 2E)की तुलना में कर रहे हैं ।

पाम की तरह एकल अणु स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी, अंतरकोशिकीय संरचनाओं का पता लगाने को डिफेक्शन सीमा से बहुत नीचे सक्षम बनाता है। अधिकतम स्थानिक संकल्प सुनिश्चित करने के लिए, एकल अणु स्थानीयकरण का सटीक पता लगाने के लिए उपयुक्त इमेजिंग शर्तों की आवश्यकता होती है। इस अधिग्रहण प्रक्रिया के लिए प्रयुक्त इमेजिंग बफर सिस्टम महत्वपूर्ण है क्योंकि यह फ्लोरोसेंट डाई के फोटोफिजिकल गुणों को प्रभावित करता है और इस प्रकार, अंतिम पाम छवि के समग्र संकल्प और सटीकता पर महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ता है। इमेजिंग से एक दिन पहले तैयार उच्च गुणवत्ता वाले बफर और बफर के बीच तुलना से फिलामेंटमोटाई (चित्र 3ए, बी)में गहरा अंतर पता चला। इष्टतम इमेजिंग स्थितियों(चित्रा 3 ए)की तुलना में कम गुणवत्ता वाले बफर के साथ अधिग्रहीत सारकोमर संरचनाएं मोटा दिखाई देती हैं। दरअसल, मात्रात्मक मूल्यांकन से पता चला है कि जेड-डिस्क मोटाई ~ 65% (उच्च गुणवत्ता बनाम निम्न गुणवत्ता: 73.87 ± 1.02 एनएम बनाम 113.9 ± 1.33 एनएम, एन = 155 फिलामेंट्स)(चित्रा 3B)द्वारा वृद्धि हुई थी। डेटा सटीकता की यह कमी फ्लोरोफोर के कम निमिष गुणों के कारण है जिसके परिणामस्वरूप प्रति स्थानीयकरण घटना कम पता चला फोटॉन (उच्च बनाम कम बफर गुणवत्ता: 29689 फोटॉन/Figure 3C इसके अलावा, स्थानीयकरण परिशुद्धता बिगड़ी इमेजिंग स्थितियों के तहत कम हो जाती है (उच्च गुणवत्ता बनाम निम्न गुणवत्ता: 14.25 ± 5.85 एनएम बनाम 19.56 ± 6.7 एनएम), जो पुनर्निर्मित पाम छवि(चित्रा 3 सी)के समग्र संकल्प को कम करती है।

इसके अलावा, नमूना बहाव, उदाहरण के लिए, थर्मल अस्थिरता के कारण, फ्लोरोसेंट अणुओं के सटीक स्थानीयकरण को प्रभावित कर सकता है और परिणाम धुंधली छवियों में होता है, जैसा कि चित्र 3 डीमें प्रस्तुत किया गया है। जबकि इष्टतम पाम इमेजिंग स्पष्ट और अच्छी तरह से परिभाषित तीव्रता चोटियों देता है, अत्यधिक नमूना बहाव एक अनियमित तीव्रता पैटर्न है कि यह मुश्किल सही दो आसन्न तंतु के बीच की दूरी का निर्धारण करने के लिए बनाता है पैदा करता है । ये डेटा एकल अणु स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी में कसकर नियंत्रित इमेजिंग स्थितियों के महत्व को उजागर करते हैं क्योंकि अधिग्रहण प्रक्रिया के दौरान सूक्ष्म परिवर्तन भी नाटकीय रूप से छवि की गुणवत्ता और डेटा सटीकता को कम कर सकते हैं।

Figure 1
चित्र 1: आईपीएससी-व्युत्पन्न सीएम में सारकोमी संगठन का मूल्यांकन।
सारकोमेरे नेटवर्क को फ्लोरोसेंट रूप से α-ऐक्टिनिन एंटीबॉडी के साथ लेबल किया गया था, जिसके बाद पाम इमेज अधिग्रहण हुआ था। बाद के पुनर्निर्माण से अंतिम पाम छवि बनती है जिसका उपयोग मात्रात्मक विश्लेषण के लिए किया जाता था। व्यक्तिगत सारकोमर की लंबाई पड़ोसी सारकोमेरे तंतुओं (1-5) के अनुरूप दो तीव्रता चोटियों के बीच की दूरी को मापने के द्वारा निर्धारित की गई थी। जेड-डिस्क मोटाई स्वचालित रूप से एक प्लगइन आधारित छवि प्रसंस्करण उपकरण द्वारा गणना की गई थी। स्केल बार 10 माइक्रोन करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्र 2: सीएम में जेड-डिस्क मोटाई और सारकोमेरे लंबाई की मात्रात्मक तुलना आईपीएससी, वयस्क और नवजात हृदय ऊतक से प्राप्त होती है।
(A)आईपीएससी और नवजात सीएम के α-ऐक्टिन नेटवर्क की खंगाली गई पाम छवियां ।(ख)मात्रात्मक आकलन से पता चला है कि सभी नवजात और सारकोमेरे लंबाई (वयस्क बनाम) में उच्च समानता साझा करते हैं । आईपीएससी सीएम बनाम नवजात सीएम: 1.91 ± 0.02 1.83 ± 0.049 माइक्रोन बनाम 1.82±0.03 माइक्रोन) और व्यक्तिगत फिलामेंट्स (वयस्क बनाम आईपीएससी सीएम बनाम) की मोटाई। नवजात मुख्यमंत्री: 71.30 ± 1.64 बनाम 73.95 ± 0.86 एनएम बनाम 74.08 ± 0.12 एनएम), आईपीएससी सीएम के समय से पहले फेनोटाइप का संकेत देता है।(सी)पारंपरिक कॉन्फोकल इमेजिंग और पाम-आधारित डेटा के बीच सारकोयर लंबाई और जेड-डिस्क मोटाई की तुलना। के रूप में सारकोमेरे लंबाई पीक-टू-पीक दूरी को मापने के द्वारा निर्धारित किया गया था, डेटा सटीकता पर बढ़ी हुई संकल्प का प्रभाव कम स्पष्ट था (कॉन्फोकल बनाम पाम: 1.75 ± 0.02 बनाम 1.70 ± 0.02)। इसके विपरीत, पाम लागू होने पर काफी कम जेड-डिस्क मोटाई का पता चला (कॉन्फोकल बनाम पाम: 224.71 ± 4.31 बनाम 73.91 ± 1.31)। }Dइम्प्लांटिक और पाम इमेजिंग द्वारा प्राप्त आईपीएससी-सीएम की प्रतिनिधि सूक्ष्म छवियां। (ई)फ्लोरेसेंस तीव्रता भूखंडों में दिखाया गया लाल रेखा के अनुरूप (डी) । मान फ्लोरेसेंस तीव्रता के आधे अधिकतम पर पूर्ण चौड़ाई का प्रतिनिधित्व करते हैं, जो पाम छवियों में संकल्प की गहरी वृद्धि का संकेत देता है। डेटा को मतलब ± एसईएम, एन = 10-20 कोशिकाओं, प्रति सेल 20 सारकोमर्स के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। सांख्यिकीय महत्व छात्रों टी-टेस्टका उपयोग करके निर्धारित किया गया था । **p<0.005, स्केल बार 10 μm । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: डेटा सटीकता और विश्वसनीयता पर बफर गुणवत्ता और नमूना बहाव का प्रभाव।
(एक)आईपीएससी-व्युत्पन्न सीएम की प्रतिनिधि पाम छवियां विभिन्न इमेजिंग परिस्थितियों में अधिग्रहीत की गईं । साकोमरे फिलामेंट्स उन नमूनों में मोटे दिखाई देते हैं जिन्हें कम गुणवत्ता के बफर के साथ चित्रित किया गया है। लाल रेखाएं सारकोमेरे लंबाई के प्रतिनिधि माप का संकेत देती हैं, जबकि हरी फिलामेंट संरचनाओं को जेड-डिस्क विश्लेषण में शामिल किया गया था। (ख)मात्रात्मक मूल्यांकन ने कम और उच्च गुणवत्ता वाले बफर (उच्च बनाम कम बफर गुणवत्ता: 73.87 ± 1.02 एनएम बनाम के बीच जेड-डिस्क मोटाई में महत्वपूर्ण अंतर की पुष्टि की। 113.9 ± 1.34 एनएम)(C)छवि सटीकता में यह अंतर फ्लोरोफोर की कम निमिष क्षमता पर आधारित था, जिससे प्रति अणु पता लगाया फोटॉनों की संख्या कम हो गई (उच्च बनाम कम बफर गुणवत्ता: 29689 फोटॉन/घटना बनाम 16422 फोटॉन/इवेंट)। इसके साथ ही, स्थानीयकरण परिशुद्धता में कमी आई जिसने बदले में समग्र संकल्प (उच्च बनाम कम बफर गुणवत्ता: 14.25 ± 5.85 बनाम 19.56 ± 6.7)(डी)इसी तरह, अत्यधिक नमूना बहाव छवि की गुणवत्ता को ख़राब कर सकता है। जबकि नमूना बहाव के बिना उचित छवि अधिग्रहण α-actinin तंतुओं की अच्छी तरह से परिभाषित तीव्रता चोटियों में परिणाम, वृद्धि हुई नमूना बहाव एक अनियमित तीव्रता पैटर्न है, जो दृढ़ता से सारकोमेरे लंबाई के सटीक विश्लेषण को प्रभावित करता है भड़काती । डेटा को मतलब के रूप में प्रस्तुत किया जाता है ± एसईएम 155 फिलामेंट्स का विश्लेषण किया गया था। सांख्यिकीय महत्व छात्रों टी-टेस्टका उपयोग कर निर्धारित किया गया था । ***** पी एंड एलटी;0.0001 । स्केल बार 10μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

कार्यात्मक आईपीएससी-व्युत्पन्न सीएम इन विट्रो का उत्पादन पुनर्योजी चिकित्सा, रोग मॉडलिंग और दवा स्क्रीनिंग प्लेटफार्मों के विकास के लिए महत्वपूर्ण है। हालांकि, इन सीएम की अपर्याप्त परिपक्वता हृदय अनुसंधान20में एक बड़ी बाधा है । इस संबंध में, उच्च संकल्प इमेजिंग तकनीकों की आवश्यकता है जो आईपीएससी-व्युत्पन्न सीएम की संरचनात्मक परिपक्वता स्थिति की निगरानी में सक्षम हैं। इसके साथ ही, सुपर रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी विशिष्ट प्रोटीन के कार्य का ठीक से विश्लेषण करने के लिए एक मूल्यवान उपकरण हो सकता है, जो उचित सारकोमेरे गठन के लिए आवश्यक है, जैसा कि हाल ही में टिटिन और ट्रोपोनिन10, 21,,,22के लिए प्रदर्शित किया गया है।21

वर्तमान प्रोटोकॉल में, हम α-ऐक्टिन सरकोमेरे नेटवर्क का विश्लेषण करके आईपीएससी सीएम की संरचनात्मक परिपक्वता का मात्रात्मक मूल्यांकन करने के लिए पाम-आधारित दृष्टिकोण प्रस्तुत करते हैं।

पारंपरिक प्रकाश माइक्रोस्कोपी की तुलना में, पाम ~ 20-50 एनएम23के संकल्प के साथ सेलुलर संरचनाओं के दृश्य को सक्षम बनाता है। इस प्रकार, यह हृदय सारकोमेरे नेटवर्क के सूक्ष्म परिवर्तनों का पता लगाने की अनुमति देता है जो शास्त्रीय प्रकाश माइक्रोस्कोपी दृष्टिकोणों द्वारा मुश्किल से या पता लगाने योग्य भी नहीं हैं। पाम लागू करते हुए, हमने आईपीएससी और नवजात सीएम(चित्रा 2)में ~ 1.84 माइक्रोन की औसत सारकोमीर लंबाई मापी है। यह कई पिछली रिपोर्टों के अनुरूप है जिसमें यह दर्शाया गया है कि व्यक्तिगत सारकोम का आकार ~ 1.7-2.0 माइक्रोन24,25,26है। सारकोमेरे लंबाई की तुलना में, जेड-लाइनों की मोटाई का सटीक अनुमान अधिक जटिल है क्योंकि इसका आकार प्रकाश माइक्रोस्कोपी की शास्त्रीय संकल्प सीमा से बहुत नीचे है। इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग करते हुए, पिछले अध्ययनों से पता चला है कि जेड-डिस्क की मोटाई आईपीएससी सीएम में 50 से 80 एनएम तक होती है, जो ~ 73 एनएम(चित्रा 2)के हमारे पाम आधारित पता लगाने के समान है।

मानक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के साथ तुलना ने जब पाम लागू किया गया था तो संकल्प में नाटकीय वृद्धि का प्रदर्शन किया। पाम इमेजिंग(चित्रा 2)के बाद हमें 3 गुना कम जेड-डिस्क मोटाई मिली। हालांकि, सारकोमेरे लंबाई के लिए कोई महत्वपूर्ण अंतर मापा गया था। चूंकि इस पैरामीटर को तीव्रता वाले भूखंडों की चोटी से चोटी की दूरी का पता लगाकर मापा जाता है, इसलिए बढ़े हुए संकल्प का प्रभाव कम स्पष्ट होता है।

इस उच्च स्थानिक संकल्प को प्राप्त करने के लिए, पाम को अच्छी तरह से परिभाषित इमेजिंग स्थितियों की आवश्यकता होती है जिन्हें उपयोगकर्ता द्वारा सावधानीपूर्वक संबोधित करने की आवश्यकता होती है। एकल अणुओं के सटीक स्थानीयकरण के लिए, फ्लोरोफोरेस की आवश्यकता होती है जिसमें विशेष फोटोफिजिकल गुण होते हैं, जो फ्लोरोसेंट और अंधेरे स्थिति के बीच तेजी से स्विचन को सक्षम करते हैं, जिसे निमिष27कहा जाता है। जैसा कि पहले प्रदर्शित किया गया था, फ्लोरोफोरस का चयन छवि गुणवत्ता28को दृढ़ता से प्रभावित कर सकता है। एलेक्सा 647 के लिए एक गहरी निमिष क्षमता का वर्णन किया गया था, जो एकल अणु स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी29,30,,31के लिए सबसे अच्छे और व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले रंगों में से एक था।, हालांकि, चूंकि कई पाम फ्लोरोफोरस उपलब्ध हैं, इसलिए उपयोगकर्ताओं को नमूना लेबलिंग27, 28,28के मामले में उच्च लचीलापन होगा।

उपयुक्त फ्लोरोफोर के चयन के अलावा, इमेजिंग बफर सिस्टम पाम इमेजिंग में एक और महत्वपूर्ण बिंदु है क्योंकि यह फ्लोरोसेंट डाई के फोटोफिजिकल गुणों को तय करता है। हमने पायरानोस ऑक्सीडेस को ऑक्सीजन मेहतर प्रणाली के रूप में लागू किया है जो ग्लूकोज ऑक्सीडेस से बेहतर है क्योंकि यह एक बढ़ी हुई पीएच स्थिरता प्रदान करता है, इसलिए, समय32, 33,के साथ फ्लोरोफोर निमिष की एक महत्वपूर्ण कमी के बिनादीर्घकालिकइमेजिंग की अनुमति देता है। फिर भी, इमेजिंग बफर का जीवनकाल कई घंटों तक सीमित है, इसलिए उच्च प्रजनन क्षमता सुनिश्चित करने के लिए प्रत्येक प्रयोग के लिए इसे ताजा तैयार किया जाना चाहिए। हमारे परिणाम कम गुणवत्ता वाले बफर के साथ पाम इमेजिंग के बाद डेटा सटीकता की नाटकीय कमी प्रदर्शित करते हैं, जिससे निमिष क्षमता बिगड़ी हुई है और स्थानीयकरण परिशुद्धता(चित्रा 3ए-सी)कम हो जाती है।

इसके अलावा, बढ़ी हुई नमूना बहाव से बचने के लिए इमेजिंग सिस्टम की थर्मल स्थिरता अनिवार्य है। जबकि मध्यम बहाव को कम्प्यूटेशनल विश्लेषण द्वारा ठीक किया जा सकता है, अत्यधिक नमूना आंदोलन से पता चला फ्लोरोफोरस का गलत गणना स्थानीयकरण होता है और छवि की गुणवत्ता और डेटा सटीकता को कम कर देता है। पाम इमेजिंग शुरू करने से पहले हीटिंग कक्षों और संबंधित नमूने के पर्याप्त थर्मल संतुलन के साथ माइक्रोस्कोप का उपयोग करके इसे रोका जा सकता है। इसके अलावा, लेबलिंग घनत्व और दक्षता के साथ - साथ एंटीबॉडी के टुकड़ों या नैनोबॉडी के उपयोग को इमेजिंग स्थितियों को अनुकूलित करने के लिए विचार किया जाना चाहिए34,,35,,36.

इमेजिंग मापदंडों (देखने के क्षेत्र, फ्लोरोसेंट जांच, इमेजिंग बफर आदि) के आधार पर बड़े सेलुलर संरचनाओं की अधिग्रहण प्रक्रिया में 10-30 मिनट लग सकते हैं। यह लंबे अधिग्रहण का समय पाम की एक खामी है जो इसे लाइव सेल इमेजिंग के लिए कम उपयुक्त बनाती है। आमतौर पर, उच्च स्थानीयकरण परिशुद्धता के साथ निमिष घटनाओं की एक पर्याप्त संख्या को प्राप्त करने के लिए 5.000-10.000 फ्रेम पर कब्जा कर लिया जाता है। इसके अलावा, इमेजिंग गहराई आमतौर पर कुछ सौ नैनोमीटर तक सीमित होती है, जिससे मोटे नमूनों की जांच करना मुश्किल हो जाता है। हालांकि, जेड-दिशा में बढ़ाया संकल्प एक 3 डी पाम सेटअप३७के साथ प्राप्त किया जा सकता है ।

हमने आईपीएससी सीएम के α-ऐक्टिन नेटवर्क की विशेषता के लिए दो मापदंडों का चयन किया है, जिसमें सारकोमेरे लंबाई और जेड-डिस्क मोटाई शामिल है । अतिरिक्त सुविधाओं को इस तरह के फिलामेंट अभिविन्यास के रूप में सारकोमेरे पाड़, पर एक अधिक व्यापक दृश्य प्राप्त करने के लिए एकत्र किया जा सकता है । इसी तरह, 3डी पाम नेटवर्क के भीतर वर्तमान नोड्स और शाखाओं के अनुमान के द्वारा पूरे सारकोमेरे संरचना का मात्रात्मक विश्लेषण करने में मदद कर सकता है।

यद्यपि पाम सारकोमेरे संरचना का एक बहुत विस्तृत विश्लेषण सक्षम बनाता है, यह विधि सेलुलर संकुचन जैसे कार्यात्मक मापदंडों के अधिग्रहण की अनुमति नहीं देती है, जो हृदय परिपक्वता का मूल्यांकन करने के लिए एक और महत्वपूर्ण विशेषता है। पूर्व रिपोर्टों से पता चला है कि सरकोमेरे संरचना के माइक्रोस्कोपी आधारित मूल्यांकन को कार्यात्मक डेटा38,,39प्राप्त करने के लिए वीडियो विश्लेषण के साथ जोड़ा जा सकता है। हालांकि, चूंकि लेखकों ने पारंपरिक फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग किया है, इसलिए यदि पाम की तुलना में सारकोमेरे संरचना के बारे में डेटा प्राप्त किया जाता है, तो कम सटीक होते हैं। हमारा दृष्टिकोण पिछले समय चूक रिकॉर्डिंग के साथ पाम डेटा को सहसंबंधित करने की संभावना भी प्रदान करता है और इसलिए संकुचन मापन के अधिग्रहण की अनुमति देता है।

संक्षेप में, यह प्रोटोकॉल सीएम में सारकोमेरे नेटवर्क की संरचनात्मक परिपक्वता का मात्रात्मक मूल्यांकन करने के लिए एक विधि प्रदान करता है। इस सुपर संकल्प-आधारित दृष्टिकोण का उपयोग करके, रणनीतियों को अधिक वयस्क-जैसे फेनोटाइप प्राप्त करने के लिए आईपीएससी-व्युत्पन्न सीएम के बेहतर हृदय विकास को लक्षित करने के लिए स्थापित किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखक हितों के टकराव की घोषणा नहीं करते हैं ।

Acknowledgments

इस अध्ययन को ईयू स्ट्रक्चरल फंड (ESF/14-BM-A55-0024/18) ने समर्थन दिया था । इसके अलावा, एच.एल. रोस्टॉक विश्वविद्यालय चिकित्सा केंद्र (889001 और 889003) और जोसेफ और Käthe Klinz Foundation (T319/29737/2017) के FORUN कार्यक्रम द्वारा समर्थित है। C.I.L. रोस्टॉक विश्वविद्यालय चिकित्सा केंद्र के चिकित्सक वैज्ञानिक कार्यक्रम द्वारा समर्थित है। आर डी DFG (DA1296/6-1), नम फाउंडेशन, जर्मन हार्ट फाउंडेशन (F/01/12) और बीएमबीएफ (वीआईपी + ००२४०) द्वारा समर्थित है ।

हम आईपीएससी सेल संस्कृति और हृदय भेदभाव में उसकी तकनीकी सहायता के लिए Madeleine Bartsch शुक्रिया अदा करते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
human iPSC cell line Takara Y00325
µ-Slide 8 Well Glass Bottom ibidi 80827
0.5ml eppendorf tube Eppendorf 30121023
Bovine serum albumin Sigma Aldrich A906
Cardiomyocyte Dissociation Kit Stem Cell Technologies 05025
Catalase Sigma Aldrich C40-1G
Cyclooctatetraene Sigma Aldrich 138924-1G
Cysteamine Sigma Aldrich 30070-10g
Dulbecco's phosphate-buffered saline without Ca2+ and Mg2+ Thermo Fisher 14190169
F(ab')2-Goat anti-Mouse IgG Alexa Fluor 647 Thermo Fisher A-21237
Fiji image processing software (Image J)
Glucose Carl Roth X997.2
Hydrochloric acid Sigma Aldrich H1758
LSM 780 ELYRA PS.1 system Zeiss
Paraformaldehyde Merck 8187150100
Pyranose oxidase Sigma Aldrich P4234-250UN
sarcomeric α-actinin antibody [EA-53] Abcam ab9465
Sodium chloride Sigma Aldrich S7653
sterile water Carl Roth 3255.1
Triton X-100 Sigma Aldrich X100
Trizma base Sigma Aldrich T1503
β-Mercaptoethanol Sigma Aldrich 63689

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References

  1. McAloon, C. J., et al. The changing face of cardiovascular disease 2000-2012: An analysis of the world health organisation global health estimates data. International Journal of Cardiology. 224, 256-264 (2016).
  2. Kussauer, S., David, R., Lemcke, H. hiPSCs Derived Cardiac Cells for Drug and Toxicity Screening and Disease Modeling: What Micro- Electrode-Array Analyses Can Tell Us. Cells. 8 (11), 1331 (2019).
  3. Ylä-Herttuala, S. iPSC-Derived Cardiomyocytes Taken to Rescue Infarcted Heart Muscle in Coronary Heart Disease Patients. Molecular Therapy. 26 (9), 2077 (2018).
  4. Kadota, S., Shiba, Y. Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocyte Transplantation for Heart Disease Treatment. Current Cardiology Reports. 21 (8), 73 (2019).
  5. Jiang, Y., Park, P., Hong, S. M., Ban, K. Maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells: Current strategies and limitations. Molecules and Cells. 41 (7), 613-621 (2018).
  6. Feric, N. T., Radisic, M. Maturing human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes in human engineered cardiac tissues. Advanced Drug Delivery Reviews. 96, 110-134 (2016).
  7. Ali, H., Braga, L., Giacca, M. Cardiac regeneration and remodelling of the cardiomyocyte cytoarchitecture. The FEBS Journal. 287 (3), 417-438 (2020).
  8. Yang, X., Pabon, L., Murry, C. E. Engineering adolescence: maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circulation Research. 114 (3), 511-523 (2014).
  9. Bedada, F. B., Wheelwright, M., Metzger, J. M. Maturation status of sarcomere structure and function in human iPSC-derived cardiac myocytes. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1863 (7), 1829-1838 (2016).
  10. Dai, Y., et al. Troponin destabilization impairs sarcomere-cytoskeleton interactions in iPSC-derived cardiomyocytes from dilated cardiomyopathy patients. Scientific Reports. 10 (1), 1-15 (2020).
  11. Huang, C. Y., et al. Enhancement of human iPSC-derived cardiomyocyte maturation by chemical conditioning in a 3D environment. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 138, 1-11 (2020).
  12. Ronaldson-Bouchard, K., et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).
  13. Lee, S., et al. Contractile force generation by 3D hiPSC-derived cardiac tissues is enhanced by rapid establishment of cellular interconnection in matrix with muscle-mimicking stiffness. Biomaterials. 131, 111-120 (2017).
  14. Baddeley, D., Bewersdorf, J. Biological Insight from Super-Resolution Microscopy: What We Can Learn from Localization-Based Images. Annual Review of Biochemistry. 87 (1), 965-989 (2018).
  15. Ovesný, M., Křížek, P., Borkovec, J., Švindrych, Z., Hagen, G. M. ThunderSTORM: A comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging. Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).
  16. Mahadev, K., Wu, X., Donnelly, S., Ouedraogo, R., Eckhart, A. D., Goldstein, B. J. Adiponectin inhibits vascular endothelial growth factor-induced migration of human coronary artery endothelial cells. Cardiovascular Research. 78 (2), 376-384 (2008).
  17. Lemcke, H., Skorska, A., Lang, C. I., Johann, L., David, R. Quantitative evaluation of the sarcomere network of human hiPSC-derived cardiomyocytes using single-molecule localization microscopy. International Journal of Molecular Sciences. 21 (8), 2819 (2020).
  18. Ackers-Johnson, M., et al. A simplified, langendorff-Free method for concomitant isolation of viable cardiac myocytes and nonmyocytes from the adult mouse heart. Circulation Research. 119 (8), 909-920 (2016).
  19. Lemcke, H., et al. Applying 3D-FRAP microscopy to analyse gap junction-dependent shuttling of small antisense RNAs between cardiomyocytes. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 98, 117-127 (2016).
  20. Karbassi, E., et al. Cardiomyocyte maturation: advances in knowledge and implications for regenerative medicine. Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).
  21. Krysiak, J., et al. Protein phosphatase 5 regulates titin phosphorylation and function at a sarcomere-associated mechanosensor complex in cardiomyocytes. Nature Communications. 9 (1), 1-14 (2018).
  22. Zaunbrecher, R. J., et al. Cronos Titin Is Expressed in Human Cardiomyocytes and Necessary for Normal Sarcomere Function. Circulation. 140 (20), 1647-1660 (2019).
  23. Fornasiero, E. F., Opazo, F. Super-resolution imaging for cell biologists. BioEssays. Fornasiero, E. F., Opazo, F. , Wiley Online Library. (2015).
  24. Jeziorowska, D., et al. Differential Sarcomere and Electrophysiological Maturation of Human iPSC-Derived Cardiac Myocytes in Monolayer vs. Aggregation-Based Differentiation Protocols. International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), 1173 (2017).
  25. Kroll, K., et al. Electro-mechanical conditioning of human iPSC-derived cardiomyocytes for translational research. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 130, 212-222 (2017).
  26. Zuppinger, C., et al. Characterization of cytoskeleton features and maturation status of cultured human iPSC-derived cardiomyocytes. European Journal of Histochemistry. 61 (2), 145-153 (2017).
  27. Jradi, F. M., Lavis, L. D. Chemistry of Photosensitive Fluorophores for Single-Molecule Localization Microscopy. ACS Chemical Biology. 14 (6), 1077-1090 (2019).
  28. Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nature Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).
  29. Lampe, A., Haucke, V., Sigrist, S. J., Heilemann, M., Schmoranzer, J. Multi-colour direct STORM with red emitting carbocyanines. Biology of the Cell. 104 (4), 229-237 (2012).
  30. Chamma, I., Levet, F., Sibarita, J. B., Sainlos, M., Thoumine, O. Nanoscale organization of synaptic adhesion proteins revealed by single-molecule localization microscopy. Neurophotonics. 3 (4), 041810 (2016).
  31. Ma, H., Fu, R., Xu, J., Liu, Y. A simple and cost-effective setup for super-resolution localization microscopy. Scientific Reports. 7 (1), 1-9 (2017).
  32. Olivier, N., Keller, D., Gönczy, P., Manley, S. Resolution Doubling in 3D-STORM Imaging through Improved Buffers. PLoS One. 8 (7), 0069004 (2013).
  33. Swoboda, M., et al. Enzymatic oxygen scavenging for photostability without ph drop in single-molecule experiments. ACS Nano. 6 (7), 6364-6369 (2012).
  34. Mikhaylova, M., et al. Resolving bundled microtubules using anti-tubulin nanobodies. Nature Communications. 6 (1), 1-7 (2015).
  35. Venkataramani, V., et al. Enhanced labeling density and whole-cell 3D dSTORM imaging by repetitive labeling of target proteins. Scientific Reports. 8 (1), 1-7 (2018).
  36. Erdélyi, M., et al. Origin and compensation of imaging artefacts in localization-based super-resolution microscopy. Methods. 88, 122-132 (2015).
  37. McGorty, R., Schnitzbauer, J., Zhang, W., Huang, B. Correction of depth-dependent aberrations in 3D single-molecule localization and super-resolution microscopy. Optics Letters. 39 (2), 275 (2014).
  38. Ribeiro, M. C., et al. A cardiomyocyte show of force: A fluorescent alpha-actinin reporter line sheds light on human cardiomyocyte contractility versus substrate stiffness. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 141, 54-64 (2020).
  39. Pioner, J. M., et al. Isolation and mechanical measurements of myofibrils from human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cell Reports. 6 (6), 885-896 (2016).

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Johann, L., Chabanovska, O., Lang, C. I., David, R., Lemcke, H. Analyzing the α-Actinin Network in Human iPSC-Derived Cardiomyocytes Using Single Molecule Localization Microscopy. J. Vis. Exp. (165), e61605, doi:10.3791/61605 (2020).

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