Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

منهجية النهج لتحديد رواية مضادات الميكروبات وجزيئات مضادة للبيريو فيلم من مقتطفات النباتات وكسور لمنع تسوس الأسنان

Published: March 31, 2021 doi: 10.3791/61773
Automatic Translation
*1, *1, *2, 2,3, 2, 1
1Department of Dental Materials and Prosthodontics, School of Dentistry, São Paulo State University (UNESP), 2Department of Organic Chemistry, Institute of Chemistry, São Paulo State University (UNESP), 3Faculty of Pharmaceutical Sciences of Ribeiraão Preto (FCFRP-USP), Department of Physics and Chemistry, University of São Paulo
* These authors contributed equally

Summary

المنتجات الطبيعية تمثل نقاط انطلاق واعدة لتطوير الأدوية الجديدة والعوامل العلاجية. ومع ذلك، ونظراً للتنوع الكيميائي العالي، فإن العثور على مركبات علاجية جديدة من النباتات مهمة صعبة وتستغرق وقتاً طويلاً. نحن نصف نهجا مبسطا لتحديد جزيئات مضادات الميكروبات ومضادات الحيوية من مستخلصات نباتية وكسور.

Abstract

توفر المنتجات الطبيعية مواد مختلفة هيكليا، مع عدد لا يحصى من الأنشطة البيولوجية. غير أن تحديد المركبات النشطة وعزلها عن النباتات أمر صعب بسبب مصفوفة النباتات المعقدة وإجراءات العزل والتحديد التي تستغرق وقتا طويلا. ولذلك، يتم عرض نهج متدرج لفحص المركبات الطبيعية من النباتات، بما في ذلك عزل وتحديد الجزيئات التي يحتمل أن تكون نشطة. ويشمل جمع المواد النباتية؛ إعداد وتجزئة مقتطفات الخام؛ نهج الكروماتوغرافيا وقياس الطيف (UHPLC-DAD-HRMS و NMR) لتحليل وتحديد المركبات؛ bioassays (الأنشطة المضادة للميكروبات ومضادات الحيوية؛ البكتيرية "قوة التصاق" إلى pellicle اللعابية ومصفوفة جلوكان الأولية تعامل مع علاجات مختارة)؛ وتحليل البيانات. النموذج بسيط، قابل للتكرار، ويسمح بالفحص عالي الإنتاجية للمركبات المتعددة، يمكن التحكم في التركيزات، والخطوات العلاجية بشكل مستمر. وتوفر البيانات التي تم الحصول عليها الأساس للدراسات المستقبلية، بما في ذلك التركيبات ذات أنشط المقتطفات و/أو الكسور، وعزل الجزيئات، والنمذجة الجزئية لأهداف محددة في الخلايا الميكروبية والأغشية الحيوية. على سبيل المثال، أحد الأهداف للسيطرة على بيو فيلم الكاريوجيني هو تثبيط نشاط المكورات العقدية الطفرات الجلوكوزية التي تجمع الجلوكان المصفوفة خارج الخلية. تثبيط تلك الإنزيمات يمنع تراكم البيوفيلم، مما يقلل من فوعته.

Introduction

وكانت أقدم نماذج الطب المستخدمة في المجتمعات تستند إلى المنتجات الطبيعية. ومنذ ذلك الحين، يبحث البشر عن مواد كيميائية جديدة في الطبيعة يمكن تحويلها إلى أدوية1. هذا البحث تسبب في التحسين المستمر للتقنيات والأساليب للفحص الاثنوباتي1,2,3. توفر مصادر القدرة النووية مصدرًا غنيًا للمواد المتنوعة هيكليًا ، مع مجموعة واسعة من الأنشطة البيولوجية المفيدة لتطوير علاجات بديلة أو مساعدة. ومع ذلك، فإن مصفوفة النباتات المعقدة المتأصلة تجعل من عزل وتحديد المركبات النشطة مهمة صعبة وتستغرق وقتا طويلا4.

يمكن استخدام الأدوية أو التركيبات القائمة على NPs لمنع و / أو علاج العديد من الحالات التي تؤثر على الفم ، بما في ذلك تسوس الأسنان4. تسوس الأسنان، أحد أكثر الأمراض المزمنة انتشاراً عالمياً، مستمد من تفاعل النظام الغذائي الغني بالسكر والأغشية الحيوية الميكروبية (البلاك السني) التي تشكلت على سطح الأسنان الذي يؤدي إلى إزالة الألغام الناجمة عن الأحماض العضوية المستمدة من التمثيل الغذائي الميكروبي، وإذا لم يتم علاجه، يؤدي إلى فقدان الأسنان5،6. على الرغم من أن الكائنات الحية الدقيقة الأخرى قد تكون مرتبطة7، العقديات المطّع هو بكتيريا خطيرة cariogenic لأنه حمضي ، حمض ، وباني مصفوفة خارج الخلية. هذا النوع ترميز exoenzymes متعددة (على سبيل المثال، جليكوسيل ترانسفيراديس أو جفوس) التي تستخدم السكروز كركيزة8 لبناء مصفوفة خارج الخلية الغنية exopolysaccharides، والتي هي المحدد1. أيضا ، يمكن للفطر المبيضات albicans دفع ما يصل إنتاج تلك المصفوفة خارج الخلية7. على الرغم من الفلورايد, تدار في مختلف الطرائق, لا يزال الأساس لمنع تسوس الأسنان10,هناك حاجة إلى نهج جديدة كما adjuvants لزيادة فعاليتها. وبالإضافة إلى ذلك، تستند الطرائق المضادة للبلاك المتاحة على استخدام عوامل الإبادة الميكروبية واسعة الطيف (مثل الكلورهيكسيدين)11. كبديل, NPs هي العلاجات المحتملة للسيطرة على الأغشية الحيوية ومنع تسوس الأسنان12,13.

11- ويشمل التقدم الإضافي في اكتشاف مركبات جديدة نشطة بيولوجياً من النباتات الخطوات أو النهج اللازمة مثل: '1' استخدام بروتوكولات موثوقة وقابلة للتكرار لأخذ العينات، مع مراعاة أن النباتات كثيراً ما تظهر تبايناً داخل خصوصياً؛ و'2' استخدام بروتوكولات موثوقة وقابلة للتكرار لأخذ العينات؛ '2' استخدام المكونات الصناعية في المصانع؛ '3' استخدام المكونات غير القابلة للتكرار؛ '3' استخدام المكونات غير القابلة للتكرار؛ '2' استخدام المكونات الصناعية في المصانع؛ '3' استخدام بروتوكولات موثوقة وقابلة للتكرار في العينات؛ '2' استخدام المكونات غير القابلة للتحلل؛ '3' '2' إعداد مقتطفات شاملة وكسورها على نطاق صغير؛ '3' كان وصف و/أو عدم تجديد ملفاتها الكيميائية التي كانت تعتقد الحصول على بيانات متعددة الأبعاد مثل GC-MS أو LC-DAD-MS أو NMR مثلاً؛ '٤' استخدام نماذج مجدية وعالية الغلة لتقييم النشاط البيولوجي؛ '5' اختيار عدد الزيارات الجديدة المحتملة استنادا إلى تحليل البيانات المتعددة المتغيرات أو الأدوات الإحصائية الأخرى؛ '6' القيام بعزل وتنقية المركبات المستهدفة أو المرشحين الواعدين؛ و "7" التحقق من الأنشطة البيولوجية المقابلة باستخدام المركبات المعزولة2،14.

إزالة replication هو عملية تحديد بسرعة المركبات المعروفة في استخراج الخام ويسمح تمييز المركبات الجديدة من تلك التي سبق أن درست. وعلاوة على ذلك، فإن هذه العملية تمنع العزلة عندما يوصف النشاط البيولوجي بالفعل لبعض المركبات، ومن المفيد بشكل خاص الكشف عن "الضاربين المتكررين". وقد استخدم في مختلف عمليات سير العمل غير المستهدفة التي تتراوح بين تحديد المركبات الرئيسية أو التعجيل بالتجزئة الموجهة من الأنشطة حتى التصنيف الكيميائي لمجموعات المقتطفات. ويمكن دمجها تماما مع الدراسات الأيضية لتحديد الملامح الكيميائية غير المستهدفة من CE أو تحديد استهداف الأيض. كل هذا يؤدي في نهاية المطاف إلى إعطاء الأولوية مقتطفات قبل إجراءات العزل1،15،16،17.

لذلك، في هذه المخطوطة، نحن وصف نهجا منهجيا لتحديد جزيئات مضادات الميكروبات ومضادات الحيوية من مقتطفات نباتية وكسور. ويشمل أربع خطوات متعددة التخصصات: (1) جمع المواد النباتية؛ (2) و(2) جمع المواد النباتية؛ (2) و(3) جمع المواد النباتية؛ (2) و(3) (2) إعداد مستخلصات الخام (CE) وكسور (CEF)، تليها تحليلها للملامح الكيميائية؛ (3) bioassays؛ و (4) تحليل البيانات البيولوجية والكيميائية (الشكل 1). وهكذا، نقدم البروتوكول وضعت لتحليل الأنشطة المضادة للميكروبات ومضادات الحيوية من مستخلصات Sylvestris كاسيريا والكسور ضد المكورات العقدية والمونات المبيضات ألبيكان13، فضلا عن إجراءات التوصيف الكيميائي النباتي وتحليل البيانات. للبساطة، التركيز هنا هو إظهار نهج لفحص المركبات الطبيعية باستخدام البكتيريا.

Figure 1
الشكل 1: مخطط تدفقي للنهج المنهجي لتحديد الجزيئات النشطة من مستخلصات النباتات والكسور. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. جمع المواد النباتية

  1. المواد النباتية
    1. تسجيل الوصول إلى المواد النباتية على المنصات الإلكترونية التي تنظم الوصول إلى التراث الوراثي في البلد الذي سيتم فيه جمعها. على سبيل المثال، في البرازيل، سجل في النظام الوطني لإدارة التراث الوراثي والمعارف التقليدية المرتبطة به - SisGen (الموقع https://sisgen.gov.br/paginas/login.aspx).
    2. جمع عينات من المواد النباتية ذات الأهمية (على سبيل المثال، أوراق الشجر، والسيقان، والجذور، والزهور، والفواكه). تسجيل إذا تم جمع المواد خلال مرحلة الإنجاب أو الطور الخضري.
    3. تسجيل معلمات الجمع (التاريخ، وادرج الجغرافية، ومتوسط درجة الحرارة السنوية، ومتوسط نسبة الرطوبة).
    4. تحديد العينات بدقة، ويجب على التصنيف تأكيد صحة.
  2. تثبيت عينات النباتات وتخزينها
    1. منفصلة الأجهزة النباتية في أكياس بلاستيكية فردية أو قارورة مباشرة بعد المجموعات.
    2. تعطيل التفاعلات الأنزيمية المحتملة عن طريق (1) التجميد الفوري في النيتروجين السائل، (2) الجفاف في فرن الهواء المتداول (40 درجة مئوية)، أو (3) تجميد تجفيف العينات عن طريق الجفاف.
    3. تخزين المواد استقرت في أكياس مختومة بإحكام في درجة حرارة الغرفة أو في الثلاجة حتى الاستخدام (-20 أو -80 درجة مئوية، اعتمادا على فترة التخزين أو الاستخدام المقصود).
    4. طحن العينات في طاحونة تحليلية (سكين أو الكرة، اعتمادا على نوع الأنسجة أو توافر) وتوحيد حجم الجسيمات باستخدام الغربال القياسية.
    5. وزن العينات بشكل فردي لخطوات الاستخراج اللاحقة.

2. إعداد مقتطفات الخام (CE) وكسور (CEF) لتحليل الملف التعريفي الكيميائي و Bioassays

  1. إعداد المستخلصات الخام (CE)
    ملاحظة: يتم توضيح الخطوات في مخطط التدفق في الشكل 2A.
    1. إعداد مذيب استخراج مع خليط الهيدرولكووليك (مثل الإيثانول (EtOH) 70٪ أو خلائط غير ية من الماء، EtOH، وغيرها من المعدلات، التي يحددها التصميم التجريبي وفقا لتقارير سابقة).
    2. استخدام نسبة وزن العينة (الوزن الجاف، ملغ)/ استخراج المذيبات (مل) تتراوح بين 50 إلى 100 ملغ لكل مل من المذيبات.
    3. للاستخراج السريع والقابل للتكرار، استخدم عمليات الاستخراج الدفعي باستخدام الأنابيب الدقيقة.
      ملاحظة: يجب استخدام ثلاثة نسخ متماثلة على الأقل في هذه المرحلة للسماح للتحليل الإحصائي.
    4. إجراء عمليات استخراج بمساعدة الموجات فوق الصوتية (الإمارات العربية المتحدة) لجعلها سريعة وسهلة ورخيصة.
    5. كرر الإجراء ثلاث مرات (15 دقيقة لكل من هذه الاجراءات) للحصول على أفضل كفاءة.
    6. بعد كل خطوة استخراج، وdedeant بقايا الصلبة عن طريق الطرد المركزي وإزالة عظمى.
    7. الجمع بين super بشكل فردي، تصفية، وحفظ aliquots لتحليل الكيميائية في وقت واحد وbioassays. إذا لزم الأمر، وإزالة المذيب المستخرج تحت فراغ، وتدفق النيتروجين، أو التجميل، وتسجيل الوزن والعائد.
    8. يُخزن في -20 درجة مئوية محمي من الضوء.
      ملاحظة: يمكن أن يكون مؤقتاً البروتوكول هنا إلى شاشة CE وتحديد تلك التي تقدم النشاط المطلوب.
  2. تجزئة مستخلصات النفط الخام (CEF)
    ملاحظة: يتم توضيح الخطوات في المخطط التدفقي في الشكل 2B.
    1. استخدم الخراطيش التي بها 1 غرام على الأقل من الامتزاز. إذا قلويدات يحتمل أن تكون موجودة في CE، استخدم المذيبات التي تحتوي على 0.1٪ من حمض الفورميك (FA).
    2. تمييع العينة في المذيبات الأكثر ملاءمة (أو خليط المذيبات) للحصول على حل عينة 100 ملغ / مل. ثم، نقل 1 مل من حل عينة لخراطيش استخراج مرحلة صلبة مكيفة مسبقة - SPE (1 غرام من الامتزاز، 6 مل من القدرة).
    3. تنفيذ تجزئة باستخدام حوالي ثلاثة مجلدات ميتة من كل استخراج eluent (لخراطيش من 1 ز، وسوف تتوافق مع 2 مل من كل مذيب). إذا قلويدات يحتمل أن تكون موجودة في CE، استخدم المذيبات التي تحتوي على 0.1٪ من FA.
    4. جمع كسر واحد من تكوين مُمَرَد وحفظ aliquots للتحليل الكيميائي المتزامن والسامية الحيوية.
    5. إزالة المذيبات تحت فراغ، وتدفق النيتروجين، أو التجميل وتسجيل الوزن والعائد.
      ملاحظة: إذا كان من الصعب CE للذوبان في خليط elution الأولي، تشتت CE في مرحلة صلبة (على سبيل المثال، C18 أو السيليت) في 1:1 (ث / ث) نسبة قبل تحميل المواد على الجزء العلوي من خرطوشة.
      تنبيه: وزن microtubes مقدما لحساب العائد الشامل من مقتطفات وكسور.
  3. تحليل التنميط الكيميائي
    ملاحظة: بالنظر إلى أن كل نوع من أنواع النباتات يتطلب أساليب محسنة ومحددة لتحليله الكيميائي، فإننا في الأقسام التالية، نُصف أكثر الأساليب التحليلية شيوعاً المستخدمة في تحليل المواد النباتية. وكمثال عملي، تم تطوير كلوغرافيا سائلة من المرحلة العكسية والتحقق من صحتها من أجل التحليل المتزامن للمركبات الفينولية والدايترية من نوع كليرودان الأحيائية بشكل تفاضلي بواسطة نوعين من الكاشاريا سيلفسترينسيس شوارتز (Salicaceae). وقد تم تجهيز جهاز UPLC-DAD مع ديجاسر، ومضخة رباعية، وعينات أوتوماتيكية، كاشف صفيف ضوئي للأشعة فوق البنفسجية-فيس، وفرن (انظر التفاصيل في Bueno وآخرون. 201518). ويمكن تحسين النهج المماثلة الوارد وصفها في الأمثلة التالية وفقا لأنواع نباتية أخرى و/أو مواد نباتية.
    1. تحليل الكروماتوغرافي وإمكانيات الواصلة
      1. في حالة الفواصل التي تستخدم اللوني السائل فائق الأداء (UPLC)، استخدم عمود C18 كروماتوغرافي (على سبيل المثال، 150 × 2.1 مم، 2.6 ميكرومتر، 100 Å) محمياً بعمود مسبق متوافق.
        ملاحظة: يمكن استخدام مراحل العمود الأخرى أو الأوضاع الكروماتوغرافية اعتمادا على الأنواع النباتية / المواد. ويمكن أيضا أن تستخدم التقليدية HPLC; في هذه الحالة، يجب اختيار عمود كروماتوغرافي مناسب. لتحقيق فصل ممتاز، ضبط الظروف الكروماتوغرافية بالنظر إلى معدل التدفق (μL / دقيقة)، درجة حرارة العمود (°C)، وحجم الحقن (μL). تتكون المرحلة المتنقلة عادة من الماء (A) والأسيتونيتريل أو الميثانول (B) باستخدام تدرجات الإلطوانات الخطية أو متعددة المستويات أو الإيلاء الأيزوكراتي. يمكن أيضاً استخدام المعدلات مثل المخازن المؤقتة أو الأحماض أو القواعد أو غيرها.
      2. إجراء تحليل المواد النباتية (CE و / أو CEF) وتسجيل جميع البيانات ذات الصلة، مثل البيانات الطيفية (باستخدام الأشعة فوق البنفسجية فيس و / أو، بشكل تفضيلي، أجهزة الكشف عن مرض التصلب العصبي المتعدد)، ووقت الاحتفاظ (دقيقة)، وغيرها، اعتمادا على الواصلة المتاحة.
        ملاحظة: عادة ما يتم الواصلة اللونية السائلة (LC) (مقرونة) مع قياس الطيف الكتلي عالي الدقة (HRMS) ، كـ LC-HRMS ، ويستخدم عادة للشروح السريعة من المستقلب في CE ou CEF15.
      3. إذا كانت البيانات النوعية مطلوبة والبيانات الكمية ضرورية، إعداد بعناية وحقن منحنيات المعايرة، اتباع نفس البروتوكول.
        ملاحظة: يمكن تنفيذ تطوير أفضل الظروف الكروماتوغرافية بمساعدة تصميم التجارب، كما وصفها بوينو وآخرون 201518، أو ما شابه ذلك من الأدب. من المهم النظر في إدراج المعايير الداخلية أثناء تطوير الأسلوب. هم جداً محل تقدير كبير لأنها تسمح الانحرافات التقنية الصحيحة أثناء إعداد العينة والحقن، ومزيد من التطبيع لتحليل البيانات.
  4. تحليل بيانات أحادية المتغيرة ومتعددة المتغيرات
    1. تصدير الكروماتوجرامات المسجلة في شكل مناسب (على سبيل المثال، ASCII، .txt أو شكل .csv). يمكن تعيين مصفوفة بيانات واحدة عن طريق الانضمام إلى الكروماتوجرامات ومحاذاتها إذا كان يجري تحليل عدة عينات، ومطلوب إجراء مقارنات. يجب تطبيع المصفوفات الناتجة الكروماتوجرامات وفقا للمعيار الداخلي المستخدم.
    2. تحليل بيانات المستقلب النباتية باستخدام أساليب متعددة المتغيرات و univariate. استكشاف وتصور مجموعات بيانات المستقلب من خلال التحليل المتزامن لمتغيرات متعددة باستخدام أساليب إحصائية متعددة المتغيرات، بما في ذلك تحليل المكون الرئيسي غير الخاضع للرقابة (PCA) وتحليل المجموعات الهرمية (HCA)، أو التحليل الجزئي الأقل المربعات الخاضعة للإشراف (مثل PLS، OPLS، PLS-DA). أساليب أحادية المتغيرات، مثل ANOVA، الطالب، توكي ويلش t اختبار، هي مثيرة للاهتمام خاصة لتحليل دقيق للاختلافات الكمية بين العينات19.
  5. التعليق التوضيحي للاناء والمركبات
    ملاحظة: يتم تخصيص الهدف من هذه الخطوة لتعريف السريع على الخط من NPs المعروفة لتجنب العزلة tedious التي يمكن تنفيذها في نفس الوقت إلى أحادي أو تحليل البيانات متعددة المتغيرات.
    1. تنفيذ مستويات تحديد المركبات المكتشفة أو المستهدفة:
      1. مركب محدد، بما في ذلك الهيكل ثلاثي الأبعاد الكامل والكيمياء المجسمة (المستوى 0)؛
      2. (أ) تحديد الهوية الذي تحقق بواسطة المعلمات متعامدتين، مثل وقت الاحتفاظ بالمواصفات الطيفية للتصلّد MS/MS (المستوى 1)؛
      3. مركبات مشروحة على نحو مُنَهَدٍ ومركب (المستويين 2 و3)؛
      4. الأيض غير معروف أو غير مصنف يمكن تمييزه على أساس البيانات التحليلية (المستوى 4)19،20.
    2. ميز المركبات المعروفة باستخدام قواعد البيانات التجارية أو العامة. ومن بين أهم قواعد البيانات، يمكن تسليط الضوء عليها: NIST (https://www.nist.gov)، وايلي (https://www.sisweb.com/software/ms/wiley.htm)، MassBank (https://massbank.eu/MassBank/)، GMD (http://gmd.mpimp-golm.mpg.de/)، METLIN (https://metlin.scripps.edu)، والمنتجات الطبيعية العالمية الشبكات الجزيئية الاجتماعية - قاعدة بيانات GNPS (https://gnps.ucsd.edu)19.
      ملاحظة: هناك مستويات مختلفة من الشروح وهي تعتمد على تقنية واصلة المستخدمة أثناء الدراسة ويمكن أن تشمل: مساعدة MS- (أو NMR) قواعد البيانات الطيفية القائمة، وفي الخوارزميات التكهن الطيفية silico.
    3. العزل، والتنقية، واستكمال تحديد هوية المركب
      ملاحظة: إذا كان مركب معين (الذي كان يشتبه في هويته من قبل الأساليب الإحصائية) يحتاج إلى تحديد هيكلي كامل، فإن الخطوة الأولى لإنجاز هذه المهمة هي عزل وتنقية المركبات المطلوبة في نطاق أكبر. ويمكن تحقيق ذلك من خلال توسيع نطاق البروتوكولات التي سبق وضعها.
      1. تنفيذ العزلة السريعة والمباشرة للمجمع الهدف (ق) من خلال تقنيات الكروماتوغرافية إعداد راسخة ومحسنة. يمكن استخدام HPLC شبه إعداد مع حقن الحمولة الجافة لتجنب التنازلات التي تحتاج عموما إلى أن يتم بين التحميل العالي وعينة solubilization1.
      2. إنجاز التوصيف الهيكلي الكامل وتحديد المركبات المعزولة. ويمكن إجراء ذلك من خلال الجمع بين تقنيات مختلفة:
        1. الرنين المغناطيسي النووي (NMR);
        2. القياس الطيفي الكتلي (MS)؛
        3. كما أن تقنيات القياس الطيفي في المناطق فوق البنفسجية والأشعة تحت الحمراء مفيدة جداً في توصيف المجموعات الوظيفية؛
        4. استخدام التحليل الطيفي بتقويم العمود الفقري مثل الدق اللوني الدائري الإلكتروني والذبذبات (ECD وVCD على التوالي)، والنشاط البصري رامان (ROA)، والأشعة السينية البلورية هي تقنيات هامة لتوصيف التكوين المطلق.

3. الـ Bioassays

ملاحظة: الفحص البيولوجي: من أجل تقييم النشاط البيولوجي المحتمل لـ CE وCEF، ينبغي أن يكون الفحص الأولي للمواد الطبيعية منظماً ومباشراً.

  1. إعداد CE وCEF للـ bioassays
    1. إعادة تكوين المادة الجافة مع أفضل المذيبات الممكنة (والتي يمكن تحديد تجريبيا). تصميمالتجريبية 21،22 تحديد حل الأسهم وتركيز المذيبات.
    2. حساب تركيز المذيبات من محلول الأسهم. للقيام بذلك، استخدم الصيغة: C1 x V1 = C2 x V2، حيث يمثل C1 حل المخزون (ملغ) من CE و / أو CEF؛ V1 يمثل حجم المذيبات; C2 هو وزن CE و / أو CEF; V2 هو الحجم النهائي (مل) من حل الأسهم.
      ملاحظة: على سبيل المثال، اخترنا 84.15٪ EtOH و 15٪ ثنائي الفينيل ثنائي أكسيد (DMSO) كتركيز المذيبات من محلول الأسهم. أعددنا تركيز الأسهم من CE إلى 6 ملغ / مل وCEF إلى 1 ملغ / مل13. المذيب لتخفيف CE وCEF تعتمد على طريقة تقييم النشاط البيولوجي. يجب أن المذيب المستخدم كوسيلة لا تتداخل مع النشاط البيولوجي والسمي. عادة، يتم استخدام المياه، DMSO، EtOH، أو المذيبات المائية على أساس EtOH ل solubilize مستخلصات نباتية أو مشتقات نباتية4،13.
  2. إعداد الكائنات الحية الاختبارية
    1. إعادة تنشيط سلالة ميكروبية، على سبيل المثال S. mutans UA159 على أجار الدم (48 ساعة، 37 درجة مئوية، 5٪ CO2، والثقافة في الوسط ثقافة السائل (على سبيل المثال، التربتون الخميرة استخراج مرق [TYE: 2.5٪ (ث / الخامس) tryptone مع 1.5٪ (ث / الخامس) استخراج الخميرة) التي تحتوي على 1٪ الجلوكوز (ث / الخامس) (TYEg) لمدة 16 ساعة، 37 درجة مئوية، 5٪CO2.
    2. تنفيذ 1:20 تخفيف من الثقافة الأولية للكائنات الحية الدقيقة في نفس الوسط ثقافة (قد تتغير نسبة التخفيف من الثقافة الأولية وفقا للتصميم التجريبي).
    3. احتضان حتى تصل إلى مرحلة النمو منتصف السجل.
    4. إعداد inoculum ل bioassays مع عدد محدد من السكان (على سبيل المثال، 2x106 وحدات تشكيل مستعمرة لكل ملليلتر - CFU / مل) في TYEg لمقايس مضادات الميكروبات و TYE مع 1٪ السكروز (ث / الخامس) (TYEs) لمقايسات الأغشية الحيوية.
      ملاحظة: سوف تعتمد ظروف النمو على الكائنات الحية الدقيقة التي تم اختبارها.
  3. نشاط مضاد للميكروبات
    ملاحظة: يتم توضيح الخطوات في الشكل 3.
    1. في لوحة 96-well، إضافة aliquot (μL) من CE و / أو CEF حل الأسهم (العلاجات). يتم تعريف حجم aliquot من قبل تركيز الاختبار، والتي يجب أن يتم اختيارها على أساس الدراسات السابقة. على سبيل المثال، لاختبار CE في تركيز اختبار 0.5 ملغ/مل، استخدم 16.67 ميكروغرام من محلول المخزون عند 6 ملغ/مل. لهذا الحساب، استخدم الصيغة: C1 x V1 = C2 x V2،حيث C1 هو تركيز المخزون، والخامس1 هو حجم aliquot حل المخزون، C2 هو تركيز الاختبار، والخامس2 هو حجم لوحة 96-well (الذي يتوافق مع 200 ميكرولتر). في هذه الحالة التجريبية، سيكون تركيز اختبار المذيبات (المركبة) 7٪ ETOH و 1.25٪ DMSO.
    2. وتشمل مجموعة من الضوابط لكل لوحة: عمود مع العلاجات، دون inoculum (تحكم فارغة لكل علاج، وتساعد على التمييز بين التعكر من قبل العلاج المستخدمة نفسها من النمو الميكروبي)؛ عمود مع السيارة وentoculum (diluent من CE أو CEF أو 0 ملغ / مل السيطرة)؛ عمود مع الثقافة فقط المتوسطة (ثقافة التحكم المتوسط) وعمود مع inoculum فقط (مراقبة النمو الميكروبي).
    3. باستخدام TYEg، ضبط مستوى الصوت إلى 100 μL. المقبل، احتضان، على سبيل المثال، 24 ساعة، 37 درجة مئوية، 5٪ CO2 (اعتمادا على الكائنات الحية الدقيقة اختبار).
    4. تلقيح 100 μL من الكائنات الحية الدقيقة inoculum (1x 106 CFU / مل) في لوحة 96 جيدا.
    5. تحليل النمو البكتيري وفقا ل عكارة عن طريق الفحص البصري للآبار (واضحة أو غائمة). واضح: يعني أنه لا يوجد نمو بصري للكائنات الحية الدقيقة. غائم: يعني أن هناك نمو البصرية من الكائنات الحية الدقيقة.
    6. قياس الامتصاص (الكثافة البصرية أو O.D.) من الثقافة البكتيرية في كل بئر (قارئ ELISA باستخدام 540 نانومتر). بعد ذلك، نقل 100 ميكرولتر من الثقافات إلى الأنابيب الدقيقة التي تحتوي على 900 ميكرولتر من محلول ملحي (0.89٪ NaCl)، اخلط جيدا من خلال دوامة. بعد ذلك، استمر في تنفيذ تخفيف تسلسلي عشرة أضعاف حتى القيمة المطلوبة.
    7. تلقيح aliquot من التخفيف المطلوب في لوحات agar محددة (في مكررة). على سبيل المثال، 10 ميكرولتر من تخفيف معين على لوحات أجار الدم.
    8. احتضان. يمكن أن تتغير الظروف بين الكائنات الدقيقة ، على سبيل المثال ، S. mutans: 48 h ، 37 °C ، 5 ٪ CO2.
    9. تنفيذ حساب مستعمرة على لوحات لتحويل لاحق إلى CFU / مل كما(عدد من المستعمرات x 10 ن)/q. في هذه الصيغة،n يساوي القيمة المطلقة لتخفيف (0، 1، 2، أو 3)، وQ يساوي المبلغ، في مل، pipetted لكل تخفيف مطلي على لوحة أجار. أيضاً، يمكن تحويل CFU/mL إلى قيم السجل.
      ملاحظة: عندما تضاف مستخلصات نباتية إلى الوسط الثقافي، قد يحدث هطول للجسيمات من المستخلصات. وهذه الحقيقة قد تجعل من الصعب تفسير النتائج. ويحدث الشيء نفسه عندما يقيس قارئ اللوح الدقيق التعكر، حيث تتجمع الخلايا في بعض الحالات في الجزء السفلي من اللوح الصغير. وبالإضافة إلى ذلك، اعتمادا على استخراج المستخدمة، يمكن أن لون المستخلصات ورقة النبات تجعل من الصعب تحديد التعكر23،24. وهناك طريقة بديلة تستخدم الأصباغ التي تكشف ما إذا كانت الخلايا الميكروبية نشطة الأيضية أو لا24.
  4. نشاط مضاد biofilm
    ملاحظة: خطوات تقييم تأثير العلاجات على تكوين بيو فيلم موضحة في الشكل 4.
    1. تشكيل وتجهيز الأغشية الحيوية
      1. تخفيف العلاجات في الوسط الثقافة (TYEs) في لوحة 96-well كما هو موضح في خطوات بروتوكول النشاط المضاد للميكروبات.
      2. احتضان لوحة. في المثال مع S. الطفرات, يتم تنفيذ حضانة خلال 24 ح, في 37 درجة مئوية, و 5٪ CO2.
      3. بعد الحضانة، ضع اللوحات على شاكر مداري (5 دقائق، 37 درجة مئوية، 75 دورة في الدقيقة) لتخفيف الخلايا التي لم تلتزم بالبيوفيلم. ثم، تجاهل الوسط ثقافة تحتوي على الخلايا غير الملتزم بها، وغسل الأغشية الحيوية المتبقية ثلاث مرات مع 0.89٪ NaCl لإزالة الخلايا غيرالمنضمة.
    2. القياس الكمي للكتلة الحيوية من الأغشية الحيوية المعالجة
      ملاحظة: يتم توضيح الخطوات في المخطط التدفقي في الشكل 4A.
      1. الحفاظ على الأغشية الحيوية غسلها على لوحة وإضافة 50 μL من 1٪ الكريستال البنفسجي محلول مائي لكل بئر.
      2. احتضان لوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 35 دقيقة.
      3. اغسل الآبار الملطخة بالماء المليك (ثلاث مرات) ثم جففها الهواء لمدة 60-90 دقيقة.
      4. إلوت البنفسجي البلوري من الآبار الملطخة مع 200 ميكرولتر من EtOH 99٪ عن طريق احتضان اللوحة في شاكر المدارية (5 دقائق، 37 درجة مئوية، 75 دورة في الدقيقة).
      5. نقل aliquot 150 ميكرولتر من كل بئر مع صبغة مائل إلى لوحة أخرى وتحديد الكتلة الحيوية عينة (ELISA القارئ 570 نانومتر).
    3. القياس الكمي للسكان الميكروبيات القابلة للحياة (CFU/mL) من الأغشية الحيوية المعالجة
      ملاحظة: يتم توضيح الخطوات في المخطط التدفقي في الشكل 4B.
      1. إزالة الأغشية الحيوية غسلها من لوحة مع ماصة و 200 ميكرولتر من 0.89٪ NaCl ونقل التعليق الناتجة بشكل فردي إلى الأنابيب الدقيقة العقيمة.
      2. استخدم 200 ميكرولتر إضافي من NaCl 0.89٪ لكل بئر ونقلها إلى الأنبوب المقابل ، الذي يحتوي بالفعل على 200 ميكرولتر من تعليق البيو فيلم الأولي. تنفيذ هذه العملية حتى تصل إلى تعليق إجمالي 1 مل بيو فيلم لكل بئر الأصلي.
      3. استخدام aliquot من كل أنبوب لأداء تخفيف المسلسل عشرة أضعاف.
      4. تلقيح aliquot من التخفيف المطلوب في لوحات agar محددة (في مكررة). على سبيل المثال، 10 ميكرولتر من تخفيف معين على لوحات أجار الدم.
      5. احتضان لوحات أجار (على سبيل المثال، 48 ساعة، 37 درجة مئوية، 5٪ CO2)،ثم عد المستعمرات لتحديد CFU / مل كما هو موضح أعلاه.
  5. مرحلة التحقق من النشاط البيولوجي
    1. تشكيل البليكل اللعابي
      1. استخدام Hydroxyapatite (HA) الخرز (ماكرو الإعدادية سيراميك هيدروكسيباتيت نوع I 80 μm) كسطح لتشكيل فيلم اللعاب25. هذه الخرز سطح تقليد المينا الأسنان.
      2. وزن الخرز HA (على سبيل المثال، 10 ملغ) في الأنابيب الدقيقة وتعقيم. ثم، استخدام العازلة الامتزاز (AB العازلة: 50 MM KCl، 1 mM KPO4, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, في dd-H2O, pH 6.5]25 تحتوي على 0.1 mm phenylmethylsulfonyl Fluoride (PMSF) و 0.02٪ أزيم الصوديوم (NaN3) لغسل الخرز.
      3. جمع وإعداد اللعاب البشري26. ومن الضروري الحصول على موافقة لجنة الأخلاقيات المؤسسية.
      4. إضافة 500 ميكرولتر من اللعاب إلى الأنابيب الدقيقة واحتضان (40 دقيقة، 37 درجة مئوية، 24 دورة في الدقيقة).
      5. بعد ذلك ، قم بإزالة اللعاب المابير وغسل الخرز (ثلاث مرات مع AB العازلة التي تحتوي على PMSF و NaN3). حبات sHA (حبة HA مع البليكل اللعابي) هي الآن جاهزة للمنافقات المصب.
        ملاحظة: يتم جمع اللعاب من متطوعين أصحاء. بعد جمع، وتمييع اللعاب (1: 1 v/v) مع AB العازلة والطرد المركزي (1699 × ز، 20 دقيقة، 4 درجة مئوية). تعقيم عن طريق الترشيح (فلتر غشاء البولي إيثرسولفون مع انخفاض الربط إلى 0.22 ميكرومتر البروتينات)26. ويجب أن توافق لجنة الأخلاقيات المؤسسية على الدراسة. في حالتنا، وافقت لجنة الأخلاقيات في المؤسسة على الدراسة (CAAE: 68161417.0.0000.5416).
    2. مفرزة من S. mutans بعد الالتصاق إلى الفيلم اللعابي وglucans تعامل مع مقتطفات مختارة
      1. زراعة الكائنات الحية الدقيقة حتى منتصف مرحلة النمو سجل، كما هو موضح أعلاه.
      2. عندما وصلت الثقافات إلى O.D. المطلوبة، الطرد المركزي (4000 × ز لمدة 20 دقيقة)، وغسل مع 0.89٪ محلول كلوريد الزرع وإعادة تعليق بيليه مع 0.89٪ ناCl باستخدام نفس الحجم الأولي من المتوسطة الثقافة.
      3. إذا كان استخدام العقدية، مثل S. mutans، سونيكات الثقافات مع مسبار ل dechain (30 ق، 7 ث، ثلاث مرات). إذا كان استخدام كائن حي وحيد الخلية، يمكن تخطي هذه الخطوة.
      4. تحقق من O.D. (540 نانومتر) لضبط التركيز إلى 2 × 106 CFU / مل.
    3. التصاق S. الطفرات إلى البليكل اللعابي (sHA) وانفصال الخلايا الملتزم بها
      ملاحظة: يتم توضيح الخطوات في المخطط التدفقي في الشكل 5.
      1. الحصول على عينات sHA كما هو موضح أعلاه.
      2. إضافة aliquot (في المثال، نضيف 500 ميكرولتر) من العلاجات المختارة (في تركيز الاختبار؛ على سبيل المثال، 0.5 ملغ /مليلتر) أو عناصر التحكم في الأنابيب الدقيقة التي تحتوي على عينات من sha.
      3. احتضان عينات sHA مع العلاجات أو الضوابط (30 دقيقة، 37 درجة مئوية، 24 دورة في الدقيقة)؛ ثم، وغسل الخرز ثلاث مرات مع AB العازلة (التي تحتوي على PMSF وNaN3).
      4. إضافة ثقافة الكائنات الحية الدقيقة. في المثال، نضيف 500 ميكرولتر من ثقافة S. mutans (2 × 106 CFU / مل) إلى كل microtube.
      5. احتضان (1 ساعة، 37 درجة مئوية، 24 دورة في الدقيقة) ثم إزالة الخلايا غير المنضمة عن طريق غسل ثلاث مرات مع AB العازلة.
      6. Resuspend كل عينة مع aliquot (في المثال، ونحن إضافة 1000 μL) من AB العازلة و sonicate مع مسبار (30 ث، 7 W).
      7. استخدام aliquot من كل تعليق لتخفيف المسلسل عشرة أضعاف لتحديد عدد المستعمرات قابلة للحياة عن طريق الطلاء على لوحات آجار محددة (48 ح، 37 درجة مئوية، 5٪ CO2). بعد ذلك، عد المستعمرات لتحديد CFU/mL كما هو موضح أعلاه.
        ملاحظة: يتم تنفيذ خطوة sonicate لفصل الخلايا الملتزمة sHA.
    4. التصاق S. الطفرات إلى مصفوفة جلوكان الأولية (gsHA) ومفرزة من الخلايا الملتزم بها
      ملاحظة: يتم توضيح الخطوات في المخطط التدفقي في الشكل 6. تم تنقية إنزيم GtfB من المكورات العقدية فائقة الثقافة ميليلي KSB8 هندسيا لإنتاج GtfB. تم إجراء عملية تنقية مع عمود الكروماتوغرافيا التي تحتوي على الخرز هيدروكسيباتيت باستخدام مخازن تحتوي على اثنين من مثبطات protease (0.1 mM PMSF و 0.02٪ NaN3)27،28. ثم تم فحص الإنزيم على جل الأكريلاميد (SDS-PAGE) وملطخة بنترات الفضة. تم تخزين Aliquots من الانزيم في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
      1. الحصول على عينات sHA كما هو موضح أعلاه. بعد ذلك، أضف aliquot (في المثال، نضيف 500 ميكرولتر) من إنزيم GtfB إلى كل أنبوب واحتضان في التجانس (40 دقيقة، 37 درجة مئوية، 24 دورة في الدقيقة). ثم، غسل ثلاث مرات مع AB العازلة (التي تحتوي على PMSF و NaN3).
      2. إضافة aliquot (على سبيل المثال، 500 ميكرولتر) من الركيزة السكروز (100 مليمول من السكروز) التي تحتوي على العلاجات (أو عناصر التحكم في تركيز الاختبار، على سبيل المثال، 0.5 ملغ/مل) لكل ميكروتيتوب.
      3. احتضان العينات في التجانس (4 ساعة، 37 درجة مئوية، 24 دورة في الدقيقة). ثم, أداء ثلاثة يغسل مع AB العازلة (مع PMSF وNaN3) لإزالة العلاجات والفائض من السكروز لم تدرج في glucans توليفها (عينات من gsHA).
      4. إضافة aliquot (في المثال، نضيف 500 ميكرولتر) من s. الطفرات inoculum (2 × 106 CFU / مل) إلى كل microtube.
      5. احتضان في التجانس (1 ساعة، 37 درجة مئوية، 24 دورة في الدقيقة) وغسل ثلاث مرات مع AB العازلة (مع PMSF وNaN3) لإزالة الخلايا غير المنضمة.
      6. Resuspend كل عينة مع aliquot (على سبيل المثال، 1000 ميكرولتر) من AB العازلة (مع PMSF وNaN3)و sonicate مع مسبار لفصل الخلايا انضمت إلى gsHA (30 ث، 7 W).
      7. استخدام aliquot من كل تعليق لتخفيف المسلسل عشرة أضعاف لتحديد عدد المستعمرات قابلة للحياة عن طريق الطلاء على لوحات آجار محددة (48 ح، 37 درجة مئوية، 5٪ CO2). بعد ذلك، عد المستعمرات لتحديد CFU/mL كما هو موضح أعلاه.

4- تحليل البيانات البيولوجية

  1. بيانات الـ Bioassays
    1. إدخال البيانات الأولية للbiosassays في جدول البيانات. حساب سجل من مثبطات النمو الميكروبي من قبل كل علاج(A CFU / مل من العلاجات + 1) × سجل10. ثم، وحساب نسبة سجل من تثبيط النمو الميكروبي، مقارنة مع التحكم في السيارة باستخدام(a log10 CFU/mL من العلاج/ يعنيA log10 CFU/mL من التحكم في السيارة)x 100٪.
    2. O.D. الصحيح من الثقافات planktonic والكتلة الحيوية المعالجة من قبل العلاجات (CE ومجموعات CEF المعالجة) والتحكم في السيارة (التحكم السلبي). للتصويب، طرح امتصاص الآبار المعالجة من تلك التي تم الحصول عليها في الآبار التي تحتوي على الثقافة فقط المتوسطة (AA المجموعات المعالجة المتوسطة / A وسيط التحكمالسلبي)x 100٪.
    3. بعد هذا التصحيح، حساب النسبة المئوية من تثبيط الكتلة الحيوية، مقارنة مع مراقبة المركبات(A الكتلة الحيوية المعالجة/ يعنيالتحكم في السيارة)x 100٪.
    4. تقديم البيانات الأولية التي تم إنشاؤها للتحليل الإحصائي للبيانات باستخدام برامج محددة.
      ملاحظة: يتم تحديد تفسير فعالية معالجة معينة باستخدام نقاط التوقف، مثل IC50/IC90. وتعرف هذه القيم على أنها الحد الأدنى لتركيز العلاج قادرة على تثبيط 50٪ و 90٪ على التوالي، من النمو البكتيري أو تكوين بيو فيلم24. يمكن لهذه المعلمات أن تساعد في تفسير البيانات وتوفر أساسًا لتحديد المركبات ذات النشاط الأفضل13،29.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ونحن نقدم مثالا على استخدام نهج منهجي لفحص النشاط البيولوجي من مستخلصات وكسور النباتات لتحديد الجزيئات التي يحتمل أن تكون نشطة للعلاجات المضادة للسوس الجديدة المحتملة: أنشطة مضادات الميكروبات ومضادات الحيوية من مستخلصات الكاشاريا Sylvestris من المناطق الحيوية البرازيلية المتميزة ضد الطفرات العقدية والمبيضات ألبيكانس13.

الخلفيه
التفاعلات المعقدة بين الكائنات الدقيقة الفم محددة المضيفة العوامل الغنية في السكروز والنشا يمكن أن تعدل تشكيل الأغشية الحيوية المسببة للأمراض والشروع في عملية cariogenic30,31. S. الطفرات تنسق إمراضية من الأغشية الحيوية المرتبطة بتطوير تسوس الأسنان لأنها تنتج جاتفس المسؤولة عن تخليق exopolysaccharides، إلى جانب حمضيتها و aciduricity31. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن جي تي في التصاق المبيضات ألبيكان (والكائنات الدقيقة الأخرى)، وزيادة فحوى بيو فيلم32،33. أجرينا فحصا لأنشطة مضادات الميكروبات ومضادات الحيوية من C. sylvestris مقتطفات ورقة وكسور من المناطق الحيوية البرازيلية المختلفة، التي تنتمي إلى أصناف lingua والميلفيسريس ضد S. mutans و C. albicans13. C. sylvestris ("guaçatonga") هو جزء من الاستخدام الشعبي والتقليدي في البرازيل، وغيرها من بلدان أمريكا الجنوبية وآسيا34،35. هذا النبات مذكور في "القائمة الوطنية للنباتات الطبية ذات الأهمية لSS" (RENISUS) ، والتي تحتوي على 71 نوعًا يمكن أن يعالج الأمراض مع ارتفاع معدل الإصابة في البرازيل36. الملف التعريفي الكيميائي من مستخلصات ورقة من فار. sylvestris يقدم تركيبة غنية في الصناعات الكيميائية النباتية، مع diterpenes وفيرة35، في حين أن المركبات الفينولية (الفلافونويدات أساسا) تسود في فار. lingua18.

نحن نستخدم النهج الموصوف في البروتوكول لتحديد أي مقتطفات وكسور من C. sylvetris هي الأكثر نشاطا للكائنات الحية الدقيقة التي تم تقييمها، واستنادا إلى النتائج باستخدام نماذج مبسطة، نختار العلاجات التي سيتم اختبارها في النماذج المعقدة في المختبر (أقراص هيدروكسيباتيت، microcosms)37،38. هنا، نقدم نتائج الفرز من اثني عشر م ضد س. طفرات. وينصب التركيز على توضيح فائدة هذا النهج في فحص المركبات الطبيعية بدلا من تفسير البيانات ومناقشتها.

جمعنا أوراق الأفراد من نوعين من C. sylvestris من اثني عشر مجموعة سكانية مختلفة في البرازيل ، تضم تشكيلات مختلفة من المناطق الحيوية البرازيلية (من فضلك ، انظر التفاصيل في ريبيرو وآخرون 201913). وقد نُفذت المجموعة بين حزيران/يونيه و أيلول/سبتمبر 2012 و2013 (SisGen؛ و SisGen؛ و 2013). سجل #A00892A). نوصي بجمع عينات تمثيلية، بما في ذلك أفراد من أنواع كيميائية مختلفة ومن مناطق حيوية مختلفة، لمعالجة التباين الكيميائي للاستقلابات الثانوية. إذا كان ذلك متاحا، ينبغي جمع ما لا يقل عن 3 إلى 5 أفراد. وينبغي أيضاً النظر في المعلومات السابقة المتعلقة بالتباين الكيميائي في ما دون محدد من النباتات كما وصفها ريبيرو وآخرون 2019 وبوينو وآخرون 201513،18. تم فحص التركيب الكيميائي للمي قبل الكروماتوغرافي المذكور في الخطوة 2 ونحن نقدم النبذة الكيميائية في الشكل 7. وتحليل النبذة الكيميائية ضروري لإدماج تفسير البيانات التي يتم الحصول عليها في الفحص البيولوجي.

تم تجزئة CEs في الكسور الهكية و AcOEt و MeOH. تجزئة CE يسمح تبسيط الخليط لزيادة تركيز المركبات التي يحتمل أن تكون نشطة وتقلل من إمكانيات التآزر والعداء بين المركبات. وبالإضافة إلى ذلك، في خليط أكثر بساطة (الكسور)، فمن الأسهل الحصول على البيانات الطيفية للمركبات مما كانت عليه في CE وإجراءتحليلإزالة 2. عادة، يمكن أن يتم تجزئة عن طريق استخراج السائل السائل أو خراطيش استخراج المرحلة الصلبة (SPE) التي تحتوي على الممتزات الطور عكس تفضيلية مثل C18 (40 ميكرومتر، 100 Å). يمكن اختيار اكمتات امتزازات أخرى أو خليط من الامتزازات، اعتمادا على أغراض الدراسة أو الطبيعة الكيميائية للمركبات المطلوبة. إذا كانت التقنية المختارة هي SPE ، فيجب تنشيط الخراطيش مسبقًا بمذيب عضوي نقي (مثل EtOH) ومكيفة مع الـ eluent الأولي. بروتوكولات موحدة متاحة. وهكذا ، يمكن للقارئ التشاور وتكييفها وفقا للدراسة المقصودة والمواد النباتية ذات الاهتمام.

وSO22 كانت solubilized مع 84.15٪ EtOH و 15٪ DMSO لتحقيق 6 ملغ / مل (حل الأسهم). قبل اختبارات الفحص، اختبرنا تركيز المُزَدِي (المركبة) الذي لا يتداخل مع النمو الميكروبي. هذه الخطوة مهمة لأنها تمنع إجراءات مضادات الميكروبات ومضادات الحيوية المذيبات من التأثير على النتائج عند اختبار العلاجات. يمكن إجراء الاختبارات على لوحة 96-جيدا عن طريق علاج ثقافة الكائنات الحية الدقيقة ذات الاهتمام مع تركيزات مختلفة من المذيبات (المرتبطة و / أو معزولة). وهكذا، بدأنا الفحص لدينا مع CE في 0.5 ملغم / مل والمركبات بتركيز 7٪ ETOH و 1.25٪ DMSO.

وفيما يتعلق بفحص نشاط مضادات الميكروبات ومضادات البيوفيوم، تم التعامل مع 96 بئراً كما هو موضح أعلاه. ولهذا الغرض، أضيف حجم محلول الأسهم CE 16.67 ميكرولتر (6 ملغ/مل) لاختبار كل CE بتركيز 0.5 ملغ/مل. تمت معالجة الأغشية الحيوية التي تم تشكيلها كما هو موضح في الخطوة 3. تم استخدام المستخلصات الفعالة ضد S. الطفرات (IC50 أو 3 سجلات) لتقييم "قوة التصاق" هذه البكتيريا إلى المصفوفة اللزعابية والمصفوفة الجلوكين الأولية ، كما هو موضح في الخطوة 3.

وقد تم تنظيم البيانات الخام التي تم الحصول عليها من الإحصاءات البيولوجية في Excel (كما هو موضح في الخطوة 4) وحللت مع المعالجة الإحصائية المناسبة13. وكان نقطة قطع لتحديد مقتطفات مع أفضل نشاط IC50 تثبيط (3 سجلات). من هذه المعلمة، وأظهرت أربعة مقتطفات استجابة مواتية (الشكل 8). تُظهر البيانات الكروماتوغرافية لهذه المقتطفات الأربعة الوجود المتزامن للدايتربينات من نوع كليرودان والفلافونويدات الجليكوسيتلات. وبالإضافة إلى ذلك، فهي تشمل نفس المنطقة البيولوجية (الغابات الأطلسية) ومتنوعة (sylvestris). للمساعدة في تفسير البيانات البيولوجية، قارنا الملف الكروماتوغرافي للمقتطفات الأربعة مع أفضل نشاط مع المقتطفات الأخرى التي تم فحصها. بالمقارنة مع الآخرين، مقتطفات مع أفضل نشاط لديها كمية أعلى من diterpenes كليرودان من نوع و، في وقت واحد، الفلافونويدات جليكوسيتريد. وتشير هذه الملاحظة إلى أن فعالية هذه المقتطفات ترجع على الأرجح إلى تفاعل تآزري بين المستقلبين الثانويين، مما يزيد من نشاطهما البيولوجي. وهذا هو، التأثير المشترك من diterpenes كليرودان من نوع والفلافونويدات جليكوميلات أكبر من مجموع آثارها منفصلة13.

لتأكيد البيانات التي تم الحصول عليها في الفحص، قمنا بتقييم انفصال S. mutans بعد التصاقه بالليلية اللعابية وglucans المعالجة بـ CE مختارة. وتستخدم المقايسات نماذج بيو فيلم من الأنواع المفردة في المختبر لتقييم أفضل للنشاط البيولوجي للمقتطفات الخام المختارة وتحديد أهداف العمل الممكنة. يتحقق التحليل الأول مما إذا كانت العلاجات المستخدمة قادرة على تثبيط التزام S. mutans بـ pellicle اللعابية ، ولكن بشكل رئيسي ، ما إذا كانت خلايا الكائنات الدقيقة التي التزمت بالبيليكل المعالج يمكن إزالتها من السطح بسهولة أكبر من خلال التحفيز الميكانيكي ، وبالتالي مقاطعة المرحلة الأولى من تكوين بيو فيلم. إضافة CE (مع نشاط أفضل) خلال تركيب الجلوكان لم تعدل البليكل اللعابي لأن لا CE أثرت بشكل كبير على إزالة الخلايا التي تلتزم بليلية اللعابية(الشكل 9A).

الالتصاق من المصفوفة الجلوكين الأولي(gsHA)يحقق ما إذا كانت العلاجات يمكن أن تمنع التصاق S. الطفرات إلى مصفوفة الجلوكان الأولية. ومع ذلك ، فإن هذه المنهجية تتحقق مما إذا كانت خلايا الكائنات الدقيقة التي التزمت بالغلوكانات المعالجة يمكن إزالتها بواسطة التحفيز الميكانيكي بسهولة أكبر من السطح ، وبالتالي مقاطعة تكوين بيو فيلم المرحلة. ثلاثة CE أثرت على نوعية الجلوكان التي شكلتها GtfB وبالتالي أضعفت التصاق S. mutans إلى مصفوفة جلوكان الأولية (معظم الخلايا S. تم إزالة الطنين بعد التصاق لglucans; الشكل 9 ب). ونحن نعتقد أن هذا السلوك يرتبط التآزر بين الأيض الثانوي13.

وقد ساعدنا النهج المنهجي في تحديد واختيار مقتطفات خام نشطة لوقف تشكيل الأغشية الحيوية الكاروجينية. بمجرد اختيارها وبناء على الملف الكروماتوغرافي، لدينا الأساس لتوضيح الآليات الجزيئية للعمل في نماذج معقدة.

Figure 2
الشكل 2: مخطط انسيابي لاستخراج المواد النباتية وتجزئة. يبين الرسم التوضيحي التصميم التجريبي لإعداد المستخلصات الخام (أ) وتجزئة مستخلصات الخام (B). الإمارات العربية المتحدة: استخراج بمساعدة الموجات فوق الصوتية; SPE: استخراج المرحلة الصلبة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: التصميم التجريبي لتقييم نشاط مضادات الميكروبات في 96 بئراً. يصور الرسم التوضيحي العلاجات (المستخلصات الخام أو الكسور) والضوابط. للفحص من العلاجات المتعددة، استخدم تركيز واحد (ملغ/مل) في كل بئر. CFU /مل: مستعمرة تشكيل وحدات لكل ملليلتر. O.D.: الكثافة البصرية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: التصميم التجريبي لم مقايسة مضادات ابيو فيلم في 96-صحن بئر. يبين الرسم التوضيحي العلاجات (المستخلصات الخام والكسور) والضوابط. للفحص من العلاجات المختلفة، استخدم تركيز واحد (ملغ/ مل) في كل بئر. في A، يتم توضيح الخطوات اللازمة لتحديد الكتلة الحيوية من الأغشية الحيوية المعالجة. في B، يتم عرض الخطوات لتحديد عدد السكان (CFU / mL) من الأغشية الحيوية المعالجة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: تصميم تجريبي لتقييم التصاق إلى بيلليكل اللعاب، تليها انفصال الخلايا المنضمة. يبين الرسم التوضيحي الخطوات التي سيتم تنفيذها. العلاجات: مختارة على أساس الفحص البيولوجي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: التصميم التجريبي لتقييم الالتصاق بمصفوفة الجلوكان الأولية(gsHA)متبوعاً بمفرزة الخلايا الملتصقة. يبين الرسم التوضيحي الخطوات التي سيتم تنفيذها. العلاجات: مختارة على أساس الفحص البيولوجي. الركيزة السكروز: 100 مليمول من السكروز. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 7
الشكل 7: كمية من الدايتريات من نوع كليرودان والفلافونويدات الجلاينوسيلات في مقتطفات C. sylvestris من المناطق الأحيائية البرازيلية. الحروف S،الأول، وL تشير إلى أصناف sylvestris،وسيطة، ولينغوا،على التوالي. الاتصالات الشخصية من قبل الدكتور بولا كارولينا بيريس بوينو. وقد تم تعديل هذا الرقم من ريبيرو وآخرون13. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 8
الشكل 8: نشاط مضادات الميكروبات ومضادات الحيوية من مقتطفات C. sylvestris الخام من المناطق الحيوية البرازيلية ضد S. mutans.  A. ٪ CFU (سجل10) من الخلايا المعالجة planktonic؛ ب. ٪ من الكتلة الحيوية من الأغشية الحيوية المعالجة. C. ٪ CFU (سجل10) من بيو فيلم المعالجة. البيانات الموصوفة هي متوسط (آثار) و بين الربعين (مربعات). تمثل أشرطة الخطأ القيم القصوى والدنيا. تشير العلامات النجمية إلى اختلاف مهم إحصائيًا في مستخرج محدد مقابل التحكم في السيارة (V) ، حيث: ****p ≤ 0.0001 ؛ 0.0001 ؛ 0.0001 ؛ 0.0001 ؛ 0.0001؛ 0.0001؛ 0.0001؛ 0.0001 10000000000000000000000000 p ≤ 0.001؛ ** ص ≤ 0.01; و* ف ≤ 0.05 (Kruskal - واليس اختبار ، تليها دان متعددة المقارنات الاختبار). يتم تمثيل كل عنصر تحكم في نمو الأنواع (بدون علاج) كـ Sm لS. mutans. تمثل ألوان الأشرطة في كل رسم بياني التنوع الذي تنتمي إليه المقتطفات ، في اللون الرمادي الداكن: var. sylvestris؛ رمادي فاتح: فار. المتوسطة والأبيض: فار. lingua. وقد تم تعديل هذا الرقم من ريبيرو وآخرون13. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 9
الشكل 9: S. المتعة انفصال بعد الالتصاق إلى بليلية اللعابية المعالجة والمصفوفة الأولية من الجلوكان. وتظهر بيانات ما بعد الافراج عن S. الطفرات إلى بليسيل اللعابي المعالجة وglucans في (A) و (B)، على التوالي. لم يكن هناك فرق بين مركبة التحكم (V)، والمقتطفات التي تم اختبارها لكل من التحليلين. تم الحصول على النسبة المئوية للCFU / مل النظر في مراقبة السيارة (V) بنسبة 100٪. البيانات الموصوفة هي متوسط (آثار) و بين الربعين (مربعات). تمثل أشرطة الخطأ القيم القصوى والدنيا. تشير العلامات النجمية إلى اختلاف مهم إحصائيًا في مستخرج محدد مقابل التحكم في السيارة (V) ، حيث ****p = 0.0001 و **p < 0.0031 (اختبار Kruskal-Wallis ، يليه اختبار المقارنة المتعددة لدان). يتم تمثيل التحكم في النمو من قبل Sm لS. mutans. تمثل ألوان قضبان الرسم البياني التنوع الذي تنتمي إليه المقتطفات ، حيث تكون اللون الرمادي الداكن إلى sylvestris var. وقد تم تعديل هذا الرقم من ريبيرو وآخرون13. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

التحديات الرئيسية المتعلقة بالعمل مع مقتطفات الخام الطبيعية تشمل تكوينها المعقدة وأوجه القصور في دراسات العزل الكلاسيكية الموجهة بيولوجيا. وعلى الرغم من أن هذه العملية بطيئة، فإنها فعالة وأدت إلى نتائج رئيسية في بحوث NP. وترشيداً، يلزم إجراء دراسات تستند إلى الأولويات من أجل الترشيد. وهكذا، فإن استخدام نُهج التنميط الكيميائي الحديثة لتحليل CE و dereplication قبل العزلة مهمة لتوصيف المواد المدروسة ومفيدة بشكل خاص لتجنب إعادة عزل المركبات المعروفة مع النشاط البيولوجي الموصوف بالفعل2،15. وعلاوة على ذلك، فإن الحصول على بيانات متعددة الأبعاد ضروري لإجراء المزيد من تحليل البيانات المتعددة المتغيرات للعثور على المرشحين المحتملين المسؤولين عن الأنشطة البيولوجية التي تمت ملاحظتها. وبالتالي، يمكن للباحث التركيز على عزل (على نطاق واسع) من هؤلاء المرشحين المحتملين.

هنا، نقدم نهجا منهجيا لتحديد bioassay الموجهة (في المختبر) من المركبات النشطة من مستخلصات نباتية وكسور. يسمح هذا البروتوكول بطريقة متعددة الأهداف للفحص والتحليل بحيث يمكن فحص المكونات النشطة المتعددة وتحليلها في وقت واحد. وbioassays على نطاق صغير وارتفاع الغلة ، وسريعة وفعالة من حيث التكلفة ، وسهلة التكاثر ، وتستهلك أقل من الكواشف من الأساليب التقليدية (على سبيل المثال ، والعزلة الأولية للمركبات ذات الفائدة)39. بالنسبة لأي بحث عن المنتجات الطبيعية، من الأهمية بمكان الأدوات التحليلية (على سبيل المثال، HPLC-UV، HPLC-DAD، LC-MS). وفي الآونة الأخيرة، يكون النهج أكثر توجهاً نحو الهيكل (القائم على الكيمياء) باستخدام، بدرجة أعلى، لمنصات التحليل واوضاء الهياكل (LC-HRMS و HRMS/MS، و NMR عالية المجال) واستراتيجيات إزالة الشهادات، التي تتمثل في التحديد السريع للجزيئات المعروفة بالفعل. هذه الخطوة تساعد على فهم العلاقة ملف تعريف الكيميائية مع الاستجابة البيولوجية مما أدى إلى عزل أكثر تركيزا من المستقلبات النشطة المرشح3. هناك عدة طرق راسخة لتحليل الكروماتوغرافي. بالنسبة لـ NPs غير معروف، قد يكون من الضروري أحيانًا إجراء طيارين للعثور على أفضل طريقة ممكنة. على سبيل المثال، نستخدم طريقة تحليلية من الكروماتوغرافيا التحقق من صحة لتحليل في وقت واحد من المستقلبات الثانوية التي تنتجها نوعين من C. sylvestris13،18. عند اختيار طريقة الكروماتوغرافيا، نقترح النظر في بروتوكول يستند إلى المركب الهدف (ق)، ومزايا وعيوب جميع الأساليب المتاحة، مع التركيز بشكل خاص على كفاءتها، وبطبيعة الحال، فإن التكلفة الإجمالية التي تنطويعليها 40.

23- وعلى الرغم من أن النهج المنهجي قد أثبت جدواه في الإسراع في فرز وتحليل المرشحين النشطين بيولوجياً في مصادر القدرة النووية، لا تزال هناك قيود هامة. على سبيل المثال، قد تستنسخ قراءات مرئية و O.D. للكتلة الحيوية وثقافات planktonic نتائج إيجابية خاطئة13و23و24. قد تفشل تحديد عكر الثقافات مع قارئ microplate عند استخدامها للمركبات الطبيعية23,24. تحدث هذه الإخفاقات لأن '1' في بعض الكائنات الاختبارية، تتجمع الخلايا في قاع البئر، وفي الكائنات الأخرى، تبقى الخلايا في حالة تعليق؛ '2' الجسيمات الصلبة الموجودة في الترسبات والتسبب في التعكر في الآبار23،24. إنّ "رقم الH" للـ "نُو" هو عامل يجب أن يُؤخذ في الاعتبار أيضاً. ويرتبط هذا الأمر بالتركيب الكيميائي لمركبات الأيض الثانوية، وبالتالي يؤثر على الاستجابة البيولوجية. على الرغم من أن الـ PH ليست محدودة، إلا أنه ينبغي تقييمها بحذر، حسب الغرض من الدراسة. على سبيل المثال، في نماذج بيو فيلم على أسطح مينا الأسنان، الحموضة يمكن أن يسبب إزالة الألغام المينا غير المرغوب فيها. في هذه الحالات ، من الضروري ضبط درجة PH بمساعدة من مخازن مناسبة. ولذلك، من الضروري إجراء اختبارات للتحقق مما إذا كان تعديل الرقم الHH قد أثر على الاستجابة البيولوجية التي لوحظت سابقاً.

وتشمل الاختبارات الكلاسيكية لتقييم نشاط المركبات الجديدة تحديد الحد الأدنى من التركيز المثبط (MIC) والحد الأدنى للتركيزات المبيد للجراثيم أو فطرية (MBC أو MFC)29,41. ومع ذلك، عندما يكون الهدف هو فحص العديد من المستخلصات والكسور النباتية، يصبح هذا الأسلوب شاملة. يمكن إجراء الفحص الحيوي بتركيز واحد من العلاجات المتعددة (على سبيل المثال، مستخلصات نباتية من أماكن متميزة)13،42،29. بالنسبة لهذه الحالات، الأسلوب المنتظم هو أسلوب مع الأداء العالي إرجاع نتائج متناسقة في وقت عمل أقل. يمكن تقييم العلاجات المختارة في الفحص البيولوجي باستخدام نماذج محسنة (ذات صلة سريرية، قابلة للحياة، وقابلة للتكرار) لتأكيد النشاط البيولوجي. للسيطرة على بيو فيلم الكارينيك، يجب أن تركز الدراسات المعملية بشكل رئيسي على الأغشية الحيوية التي تشكلت على هيدروكسيباتيت (بديل مينا الأسنان) أو أسطح المينا وضعت في وضع مستقيم المغلفة مع بيلليكل اللعاب37. كما يسمح بفحص عينات النباتات من مختلف الأصناف والأراضي الحيوية بطريقة قابلة للتكرار وسريعة. ويعتبر إدراج هذين المتغيرين (المكونات البيولوجية والتنوع) أمراً حيوياً لأنهما يؤثران على تباين التركيب الكيميائي للاستقلاباتالثانوية 18 ويُعدل الاستجابة البيولوجية. ويمكن تكييف هذا النهج المنهجي / تعديل لتطبيقات خارج البحوث بيو فيلم الشفوي. على سبيل المثال، يمكن أن تكون مفيدة بشكل خاص في المجالات الأخرى ذات الصلة بيو فيلم، وذلك باستخدام الأنواع الأخرى ذات الأهمية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

لم يُعلن عن تضارب المصالح.

Acknowledgments

ونعبر عن امتناننا لـ Núcleo de Bioensaios، وBiosíntese e Ecofisiologia de Produtos Naturais (NuBBE) التابع لمعهد الكيمياء التابع لبرنامج الأمم المتحدة للبيئة والأمن، Araraquara/SP، لتوفير مختبرات لإعداد المواد النباتية. كما نشكر مختبر الميكروبيولوجيا التطبيقية التابع لقسم مواد الأسنان والأطراف الصناعية الاصطناعية، UNESP، Araraquara/SP. وقد تم دعم هذا البحث من خلال منحة بحثية من مؤسسة ساو باولو للبحوث (FAPESP #2013/07600-3 إلى AJC) والمنح الدراسية بالإضافة إلى الأموال العامة (FAPESP #2017/07408-6 وFAPESP #2019/23175-7 إلى SMR؛ #2011/21440-3 و #2012/21921-4 إلى PCPB). وقدم المجلس الوطني للتنمية العلمية والتكنولوجية بالتعاون مع الاتحاد دعما إضافيا (المركز الوطني للتكهبت #465637/2014-0، وFAPESP #2014/50926-0 إلى اللجنة الاستشارية لنقابات المحامين).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well microplates  Kasvi Flat bottom
Activated carbon LABSYNTH Clean up and/or fractionation step
Analytical mill Ika LabortechniK Model A11 Basic
Blood agar plates Laborclin
Chromatographic column C18 Phenomenex Kinetex 150 × 2.1 mm, 2.6 µm, 100Â
Dimethyl sulfoxide  Sigma-Aldrich Vehicle solution
ELISA plate reader Biochrom Ez
Ethanol J. T. Baker For extraction and fractionation steps, and mobile phase composition
Ethanol Sigma-Aldrich Vehicle solution
Ethyl acetate J. T. Baker Fractionation step
GraphPad Software La Jolla GraphPad Prism7
Hexane J. T. Baker Fractionation step
Incubator Thermo Scientific
Isopropanol J. T. Baker For extraction step
Lyophilizer (a freeze dryer) Savant Modulyo
Nylon Millipore LAC 0.22 µm x 13 mm
Orbital shaker Quimis Model G816 M20
Polyamide solid phase extraction cartridge Macherey-Nagel Clean up and/or fractionation step
Silica gel Merck 40–63 μm, 60 Â
Sodium Chloride (NaCl) Synth 0,89% in water
Solid phase extraction cartridges (SPE) Macherey-Nagel Clean up and/or fractionation step
Tryptone Difco
UHPLC-DAD Dionex Ultimate 3000 RS
Ultrasonic bath UNIQUE Model USC 2800
Yeast extract Difco

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Newman, D. J., Cragg, G. M. Natural Products as Sources of New Drugs over the Nearly Four Decades from 01/1981 to 09/2019. Journal of Natural Products. 83 (3), 770-803 (2020).
  2. Wolfender, J. L., Litaudon, M., Touboul, D., Queiroz, E. F. Innovative omics-based approaches for prioritisation and targeted isolation of natural products – new strategies for drug discovery. Natural Product Report. 36 (6), 855-868 (2019).
  3. Michel, T., Halabalaki, M., Skaltsounis, A. New Concepts, Experimental Approaches, and Dereplication Strategies for the Discovery of Novel Phytoestrogens from Natural Sources. Planta Medica. 79 (7), 514-532 (2013).
  4. Jeon, J. G., Rosalen, P. L., Falsetta, M. L., Koo, H. Natural products in caries research: current (limited) knowledge, challenges and future perspective. Caries Research. 45 (3), 243-263 (2011).
  5. Tonetti, M. S., Jepsen, S., Jin, L., Otomo-Corgel, J. Impact of the global burden of periodontal diseases on health, nutrition and wellbeing of mankind: A call for global action. Journal of Clinical Periodontology. 44 (5), 456-462 (2017).
  6. Peres, M. A., et al. Oral diseases: a global public health challenge. Lancet. 394 (10194), 249-260 (2019).
  7. Bowen, W. H., Burne, R. A., Wu, H., Koo, H. Oral biofilms: pathogens, matrix, and polymicrobial interactions in microenvironments. Trends Microbiology. 26 (3), 229-242 (2018).
  8. Paes Leme, A. F., Koo, H., Bellato, C. M., Bedi, G., Cury, J. A. The role of sucrose in cariogenic dental biofilm formation--new insight. Journal of Dental Research. 85 (10), 878-887 (2006).
  9. Koo, H., Falsetta, M. L., Klein, M. I. The exopolysaccharide matrix: a virulence determinant of cariogenic biofilm. Journal of Dental Research. 92 (12), 1065-1073 (2013).
  10. Cury, J. A., de Oliveira, B. H., dos Santos, A. P., Tenuta, L. M. Are dental fluoride releasing materials clinically effective on caries control. Dental Materials. 32 (3), 323-333 (2016).
  11. Mattos-Graner, R. O., Klein, M. I., Smith, D. J. Lessons Learned from Clinical Studies: Roles of Mutans Streptococci in the Pathogenesis of Dental Caries. Current Oral Health Reports. 1, 70-78 (2014).
  12. Rocha, G. R., Florez Salamanca, E. J., de Barros, A. L., Lobo, C. I. V., Klein, M. I. Effect of tt-farnesol and myricetin on in vitro biofilm formed by Streptococcus mutans and Candida albicans. BMC Complementary and Alternative Medicine. 18 (1), 61 (2018).
  13. Ribeiro, S. M., et al. Antimicrobial and antibiofilm activities of Casearia sylvestris extracts from distinct Brazilian Biomes against Streptococcus mutans and Candida albicans. BMC Complementary and Alternative Medicine. 19 (1), 308 (2019).
  14. Pilon, A. C., et al. Metabolômica de plantas: métodos e desafios. Quimica Nova. 43 (3), 329-354 (2020).
  15. Wolfender, J. L., Nuzillard, J. M., Hooft, J. J. J., Renault, J. H., Bertrand, S. Accelerating Metabolite Identification in Natural Product Research: Toward an Ideal Combination of Liquid Chromatography-High-Resolution Tandem Mass Spectrometry and NMR Profiling, in Silico Databases, and Chemometrics. Analytical Chemistry. 91 (1), 704-742 (2019).
  16. Allard, P. M., et al. Pharmacognosy in the digital era: shifting to contextualized metabolomics. Current opinion in biotechnology. 54, 57-64 (2018).
  17. Hubert, J., Nuzillard, J., Renault, J. Dereplication strategies in natural product research: How many tools and methodologies behind the same concept. Phytochemistry Reviews. 16, 55-95 (2017).
  18. Bueno, P. C. P., Pereira, F. M. V., Torres, R. B., Cavalheiro, A. J. Development of a comprehensive method for analysing clerodane-type diterpenes and phenolic compounds from Casearia sylvestris Swartz (Salicaceae) based on ultra-high performance liquid chromatography combined with chemometric tools. Journal of separation science. 38 (10), 1649-1656 (2015).
  19. Bueno, P. C. P., Lopes, N. P. Metabolomics to Characterize Adaptive and Signaling Responses in Legume Crops under Abiotic Stresses. American Chemical Society omega. 5 (4), 1752-1763 (2020).
  20. Blaženović, I., Kind, T., Ji, J., Fiehn, O. Software tools and approaches for compound identification of LC-MS/MS data in metabolomics. Metabolites. 8 (2), 31 (2018).
  21. Eloff, J. N. Quantifying the bioactivity of plant extracts during screening and bioassay-guided fractionation. Phytomedicine: International Journal Of Phytotherapy And Phytopharmacology. 11 (4), 370-371 (2004).
  22. Rios, J. L., Recio, M. C. Medicinal plants and antimicrobial activity. Journal of Ethnopharmacology. 100 (1-2), 80-84 (2005).
  23. Eloff, J. N. A sensitive and quick microplate method to determine the minimal inhibitory concentration of plant extracts for bacteria. Planta Medica. 64, 711-714 (1998).
  24. Eloff, J. N. Avoiding pitfalls in determining antimicrobial activity of plant extracts and publishing the results. BMC Complementary and Alternative Medicine. 19 (1), 106 (2019).
  25. Klein, M. I., Xiao, J., Heydorn, A., Koo, H. An analytical tool-box for comprehensive biochemical, structural and transcriptome evaluation of oral biofilms mediated by mutans streptococci. Journal of Visualized Experiments. (47), e2512 (2011).
  26. Lemos, J. A., Abranches, J., Koo, H., Marquis, R. E., Burne, R. A. Protocols to study the physiology of oral biofilms. Methods in molecular biology. 666, 87-102 (2010).
  27. Venkitaraman, A. R., Vacca-Smith, A. M., Kopec, L. K., Bowen, W. H. Characterization of glucosyltransferase B, GtfC, and GtfD in solution and on the surface of hydroxyapatite. Journal of Dental Research. 74, 1695-1701 (1995).
  28. Vacca-Smith, A. M., Venkitaraman, A. R., Quivey, R. G. Jr, Bowen, W. H. Interactions of streptococcal glucosyltransferases with alpha-amylase and starch on the surface of saliva-coated hydroxyapatite. Archives of Oral Biology. 41, 291-298 (1996).
  29. Van Dijck, P., et al. Methodologies for in vitro and in vivo evaluation of efficacy of antifungal and antibiofilm agents and surface coatings against fungal biofilms. Microbial Cell. 5 (7), 300-326 (2018).
  30. Marsh, P. D. Are dental diseases examples of ecological catastrophes. Microbiology. 149 (2), 279-294 (2003).
  31. Bowen, W. H., Koo, H. Biology of Streptococcus mutans-derived glucosyltransferases: role in extracellular matrix formation of cariogenic biofilms. Caries Research. 45 (1), 69-86 (2011).
  32. Lobo, C. I. V., et al. Dual-species biofilms of Streptococcus mutans and Candida albicans exhibit more biomass and are mutually beneficial compared with single-species biofilms. Journal of Oral Microbioly. 11 (1), 1581520 (2019).
  33. Kim, D., et al. Candida albicans stimulates Streptococcus mutans microcolony development via crosskingdom biofilm-derived metabolites. Scientific reports. 7, 41332 (2017).
  34. Ferreira, P. M. Folk uses and pharmacological properties of Casearia sylvestris: a medicinal review. Anais da Academia Brasileira de Ciencias. 83 (4), 1373-1384 (2011).
  35. Xia, L., Guo, Q., Tu, P., Chai, X. The genus Casearia: a phytochemical and pharmacological overview. Phytochemistry Reviews. 14, 99-135 (2015).
  36. Ferreira, P. M. P., et al. Toxicological findings about an anticancer fraction with casearins described by traditional and alternative techniques as support to the Brazilian Unified Health System (SUS). Journal of Ethnopharmacol. 15, 241 (2019).
  37. Koo, H., Xiao, J., Klein, M. I., Jeon, J. G. Exopolysaccharides produced by Streptococcus mutans glucosyltransferases modulate the establishment of microcolonies within multispecies biofilms. Journal of Bacteriology. 192 (12), 3024-3032 (2010).
  38. Maske, T. T., van de Sande, F. H., Arthur, R. A., Huysmans, M. -C. D. N. J. M., Cenci, M. S. In vitro biofilm models to study dental caries: a systematic review. Biofouling. 33 (8), 661-675 (2017).
  39. Fu, Y., Luo, J., Qin, J., Yang, M. Screening techniques for the identification of bioactive compounds in natural products. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 168, 189-200 (2019).
  40. Sarker, S. D., Nahar, L. An introduction to natural products isolation. Methods in molecular biology. 864, 1-25 (2012).
  41. Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI). Performance standards for antimicrobial susceptibility testing; twenty-fifth informational supplement. Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI). , Wayne, PA. CLSI document M100-S25 (2015).
  42. Saputo, S., Faustoferri, R. C., Quivey, R. G. Jr A drug repositioning approach reveals that Streptococcus mutans is susceptible to a diverse range of established antimicrobials and nonantibiotics. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 62 (1), 01674 (2018).

Tags

علم الأحياء، العدد 169، علم الأحياء الدقيقة، بيو فيلم، المنتجات الطبيعية، المتطاول العقدية، مضادات الميكروبات، تسوس الأسنان، اكتشاف المخدرات، النهج البيولوجية
منهجية النهج لتحديد رواية مضادات الميكروبات وجزيئات مضادة للبيريو فيلم من مقتطفات النباتات وكسور لمنع تسوس الأسنان
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ribeiro, S. M., Fratucelli, É. D.… More

Ribeiro, S. M., Fratucelli, É. D. O., Fernandes, J. M., Bueno, P. C. P., Cavalheiro, A. J., Klein, M. I. Systematic Approach to Identify Novel Antimicrobial and Antibiofilm Molecules from Plants' Extracts and Fractions to Prevent Dental Caries. J. Vis. Exp. (169), e61773, doi:10.3791/61773 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter