Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Diş Çürüklerini Önlemek İçin Bitkilerin Özlerinden ve Fraksiyonlarından Yeni Antimikrobiyal ve Antibiyofilm Moleküllerini Tanımlamak için Sistematik Yaklaşım

Published: March 31, 2021 doi: 10.3791/61773
Automatic Translation
*1, *1, *2, 2,3, 2, 1
1Department of Dental Materials and Prosthodontics, School of Dentistry, São Paulo State University (UNESP), 2Department of Organic Chemistry, Institute of Chemistry, São Paulo State University (UNESP), 3Faculty of Pharmaceutical Sciences of Ribeiraão Preto (FCFRP-USP), Department of Physics and Chemistry, University of São Paulo
* These authors contributed equally

Summary

Doğal ürünler, yeni ilaçların ve terapötik ajanların gelişimi için umut verici başlangıç noktalarını temsil eder. Bununla birlikte, yüksek kimyasal çeşitlilik nedeniyle, bitkilerden yeni terapötik bileşikler bulmak zor ve zaman alıcı bir iştir. Bitki özlerinden ve fraksiyonlarından antimikrobiyal ve antibiyofilm moleküllerini tanımlamak için basitleştirilmiş bir yaklaşım tanımlıyoruz.

Abstract

Doğal ürünler, sayısız biyolojik aktivite ile yapısal olarak farklı maddeler sağlar. Bununla birlikte, karmaşık bitki matrisi ve zaman alıcı izolasyon ve tanımlama prosedürleri nedeniyle aktif bileşiklerin bitkilerden tanımlanması ve izolasyonu zordur. Bu nedenle, potansiyel olarak aktif moleküllerin izolasyonu ve tanımlanması da dahil olmak üzere bitkilerden doğal bileşiklerin taranmasına yönelik adım adım bir yaklaşım sunulmaktadır. Bitki materyalinin toplanmasını içerir; ham özlerin hazırlanması ve fraksiyonasyonu; analiz ve bileşik tanımlama için kromatografi ve spektrometre (UHPLC-DAD-HRMS ve NMR) yaklaşımları; biyoassaylar (antimikrobiyal ve antibiyofilm aktiviteleri; tükürük pelikül ve seçilen tedavilerle tedavi edilen ilk glukan matrisine bakteriyel "yapışma mukavemeti"); ve veri analizi. Model basittir, tekrarlanabilir ve birden fazla bileşiğin, konsantrasyonların ve tedavi adımlarının yüksek verimli bir şekilde taranabilmesini sağlar. Elde edilen veriler, en aktif özlere ve/veya fraksiyonlara sahip formülasyonlar, moleküllerin izolasyonu, moleküllerin mikrobiyal hücrelerdeki belirli hedeflere modellanması ve biyofilmler de dahil olmak üzere gelecekteki çalışmalar için temel sağlar. Örneğin, kardiyojenik biyofilmi kontrol etmek için bir hedef, hücre dışı matrisin glukanlarını sentezleyen Streptococcus mutans glukoziltransferazlarının aktivitesini inhibe etmektir. Bu enzimlerin inhibisyonu biyofilm birikimini önleyerek virülansını azaltır.

Introduction

Toplumlarda kullanılan en eski tıp modelleri doğal ürünlere (NP) dayanıyordu. O zamandan beri, insanlar doğada ilaçlara dönüştürülebilecek yeni kimyasallararıyorlar 1. Bu arama, etnobotanik tarama 1,2,3için teknolojilerin ve yöntemlerin sürekliiyileştirilmesineneden oldu. NP'ler, alternatif veya yardımcı tedaviler geliştirmek için yararlı olan çok çeşitli biyolojik faaliyetlerle, yapısal olarak çeşitli maddelerin zengin bir kaynağını sunar. Bununla birlikte, doğal karmaşık bitki matrisi, aktif bileşiklerin izolasyonu ve tanımlanmasını zorlu ve zaman alıcı bir görev haline getirir4.

NPS bazlı ilaçlar veya formülasyonlar, diş çürükleri de dahil olmak üzere ağızları etkileyen çeşitli durumları önlemek ve / veya tedavi etmek için kullanılabilir4. Küresel olarak en sık görülen kronik hastalıklardan biri olan diş çürükleri, diş yüzeyinde oluşan ve mikrobiyal metabolizmadan elde edilen organik asitlerin neden olduğu demineralizasyona yol açan şeker bakımından zengin diyet ve mikrobiyal biyofilmlerin (diş plağı) etkileşiminden kaynaklanır ve tedavi edilmezse diş kaybına yol açar5,6. Diğer mikroorganizmalar ilişkili olsa da7, Streptococcus mutans kritik bir kardiyojenik bakteridir çünkü asidojenik, asidikürik ve hücre dışı matris oluşturucudur. Bu tür, virülans belirleyicisi9olan eksopolisakkaritler bakımından zengin hücre dışı matrisi oluşturmak için substrat8 olarak sakkaroz kullanan birden fazla ekzoenzim (örneğin, glikosiltransfezazyonlar veya Gtfs) kodlar. Ayrıca, mantar Candida albicans bu hücre dışı matris üretimini artırmak olabilir7. Çeşitli modalitelerde uygulanan florür, diş çürüklerini önlemenin temeli olmaya devam etse de10, etkinliğini artırmak için yardımcılar olarak yeni yaklaşımlara ihtiyaç vardır. Ek olarak, mevcut anti-plak yöntemleri geniş spektrumlu mikrobisidal ajanların (örneğin klorheksidin) kullanımına dayanmaktadır11. Alternatif olarak, NP'ler biyofilmleri kontrol etmek ve diş çürüklerini önlemek için potansiyel tedavilerdir12,13.

Bitkilerden yeni biyoaktif bileşiklerin keşfinde daha fazla ilerleme, aşağıdaki gibi gerekli adımları veya yaklaşımları içerir: (i) bitkilerin genellikle spesifik değişkenlik gösterdiği göz önüne alındığında, örnekleme için güvenilir ve tekrarlanabilir protokollerin kullanılması; (ii) kapsamlı özlerin ve bunların ilgili fraksiyonlarının küçük ölçekte hazırlanması; (iii) kimyasal profillerinin karakterizasyonu ve/veya dereplication' ı, örneğin GC-MS, LC-DAD-MS veya NMR gibi çok boyutlu verilerin elde edilmesi; (iv) biyoaktiviteyi değerlendirmek için uygulanabilir ve yüksek verimli modellerin kullanılması; (v) çok değişkenli veri analizine veya diğer istatistiksel araçlara dayalı potansiyel yeni isabetlerin seçimi; (vi) hedeflenen bileşiklerin veya gelecek vaat eden adayların izolasyon ve saflaştırılmasını gerçekleştirmek; ve (vii) izole bileşikler kullanılarak karşılık gelen biyolojik faaliyetlerin doğrulanması2,14.

Dereplication, ham ekstrakttaki bilinen bileşiklerin hızla tanımlanması işlemidir ve yeni bileşiklerin daha önce çalışılmış olanlardan ayırt edilmesine izin verir. Ayrıca, biyoaktivite belirli bileşikler için tanımlanmış olduğunda bu işlem izolasyonu önler ve özellikle "sık vurucuları" tespit etmek yararlıdır. Ana bileşik tanımlamadan veya aktivite güdümlü fraksiyonasyonun hızlandırılmasından öz koleksiyonlarının kimyasal profillenmesine kadar farklı hedefsiz iş akışlarında kullanılmıştır. CE'nin hedefsiz kimyasal profillenebilmesi veya metabolitlerin hedefli tanımlanması için metabolomik çalışmalarla tam olarak entegre edilebilir. Tüm bunlar sonuçta izolasyon prosedürlerinden önce özlere öncelik verilmesine yol açar1,15,16,17.

Bu nedenle, mevcut yazıda, bitki özlerinden ve fraksiyonlarından antimikrobiyal ve antibiyofilm moleküllerini tanımlamak için sistematik bir yaklaşım tarif ediyoruz. Dört multidisipliner adım içerir: (1) bitki malzemesinin toplanması; (2) ham özlerin (CE) ve fraksiyonların (CEF) hazırlanması, ardından kimyasal profil analizleri; (3) biyoassaylar; ve (4) biyolojik ve kimyasal veri analizleri (Şekil 1). Bu nedenle, Casearia sylvestris özlerinin ve fraksiyonlarının Streptococcus mutans ve Candida albicans13'ekarşı antimikrobiyal ve antibiyofilm faaliyetlerinin yanı sıra fitokimyasal karakterizasyon ve veri analizi prosedürlerini analiz etmek için geliştirilen protokolü sunuyoruz. Basitlik için, buradaki odak noktası, bakteriyi kullanarak doğal bileşikleri tarama yaklaşımını göstermektir.

Figure 1
Şekil 1: Bitki özlerinden ve fraksiyonlarından aktif molekülleri tanımlamak için Sistematik Yaklaşımın akış şeması. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Bitki Materyali Koleksiyonu

  1. Bitki malzemesi
    1. Bitki materyaline erişimi, koleksiyonun gerçekleşeceği ülkedeki genetik mirasa erişimi düzenleyen elektronik platformlarda kaydedin. Örneğin, Brezilya'da, Genetik Mirasın ve İlişkili Geleneksel Bilginin Yönetimi için Ulusal Sisteme kaydolun - SisGen (web sitesi https://sisgen.gov.br/paginas/login.aspx).
    2. İlgi çekici bitki materyalinin örneklerini toplayın (örneğin, yapraklar, saplar, kökler, çiçekler, meyveler). Malzemenin üreme veya vejetatif aşamada toplanıp toplanmadıklarını kaydedin.
    3. Toplama parametrelerini (tarih, coğrafi referanslama, ortalama yıllık sıcaklık ve ortalama nem yüzdesi) kaydedin.
    4. Örnekleri tam olarak tanımlayın ve bir taksonomist orijinalliği onaylamalıdır.
  2. Tesis numuneleri stabilizasyon ve depolama
    1. Bitki organlarını koleksiyonlardan hemen sonra bireysel plastik torbalarda veya şişelerde ayırır.
    2. Potansiyel enmatik reaksiyonları (i) sıvı nitrojende hemen dondurarak, (ii) sirkülasyonlu bir hava fırınında (40 °C) susuz kalarak veya (iii) numuneleri liyofilizasyonla dondurarak-kurutarak devre dışı bırakın.
    3. Stabilize malzemeyi oda sıcaklığında hermetik olarak kapatılmış torbalarda veya kullanım süresine veya kullanım amacına bağlı olarak kullanıma kadar (-20 veya -80 °C) bir dondurucuda saklayın.
    4. Numuneleri analitik bir frezede (doku tipine veya mevcudiyetine bağlı olarak bıçak veya top) öğütün ve standartlaştırılmış elekler kullanarak parçacık boyutunu standartlaştırın.
    5. Sonraki ekstraksiyon adımları için numuneleri ayrı ayrı tartın.

2. Ham Özlerin (CE) ve Fraksiyonların (CEF) Kimyasal Profil Analizi ve Biyoassaylara Hazırlanması

  1. Ham Özlerin Hazırlanması (CE)
    NOT: Adımlar Şekil 2A'dakiakış grafiğinde gösterilmiştir.
    1. Hidroalkolik bir karışımla bir ekstraksiyon çözücü hazırlayın (örneğin, etanol (EtOH) % 70 veya önceki raporlara göre deneysel tasarımı ile tanımlanan su, EtOH ve diğer değiştiricilerin üçlü karışımları).
    2. Her mL çözücü için 50 ila 100 mg arasında değişen örnek ağırlık (kuru ağırlık, mg)/ ekstraksiyon çözücü (mL) oranını kullanın.
    3. Hızlı ve tekrarlanabilir ekstraksiyonlar için mikrotüpler kullanarak toplu ekstraksiyonlar kullanın.
      NOT: Bu noktada istatistiksel analize izin vermek için en az üç çoğaltma kullanılmalıdır.
    4. Hızlı, kolay ve ucuz hale getirmek için ultrason destekli ekstraksiyonlar (BAE) gerçekleştirin.
    5. En iyi verimlilik için prosedürü üç kez (her biri 15 dakika) tekrarlayın.
    6. Her ekstraksiyon adımından sonra, katı kalıntıyı santrifüjleme ile dekantasyona alın ve süpernatantı çıkarın.
    7. Süpernatantları tek tek birleştirin, filtreleyin ve eşzamanlı kimyasal analiz ve biyoassaylar için aliquots kaydedin. Gerekirse, vakum, azot akışı veya lyophilization altında çıkarma çözücüyü çıkarın ve tartımı ve verimi kaydedin.
    8. Işıktan korunan -20 °C'de saklayın.
      NOT: Protokol, CE'yi taramak ve istenen etkinliği sunanları seçmek için burada duraklatılabilir.
  2. Ham Özlerin Fraksiyonasyonu (CEF)
    NOT: Adımlar Şekil 2B'dekiakış grafiğinde gösterilmiştir.
    1. En az 1 g adsorbent içeren kartuşlar kullanın. CE'de alkaloidler potansiyel olarak mevcutsa, formik asidin (FA) % 0,1'ini içeren çözücüler kullanın.
    2. 100 mg/mL'lik bir numune çözeltisi elde etmek için numuneyi en uygun çözücüde (veya solvent karışımında) seyreltin. Ardından, numune çözeltisinin 1 mL'lik kısmını önceden şartlandırılmış bir katı faz çıkarma kartuşuna aktarın - SPE (1 g adsorbent, 6 mL kapasite).
    3. Kesirlenmeyi, her ekstraksiyon yılan balığının yaklaşık üç ölü hacmini kullanarak gerçekleştirin (1 g'lık bir kartuşa, her çözücüğün 2 mL'sine karşılık gelir). Alkaloidler CE'de potansiyel olarak mevcutsa, SK'nın% 0.1'ini içeren çözücüler kullanın.
    4. Atık su bileşimi ile bir kesir toplayın ve eşzamanlı kimyasal analiz ve biyoassaylar için aliquots kaydedin.
    5. Çözücüyü vakum, azot akışı veya lyophilization altında çıkarın ve tartımı ve verimi kaydedin.
      NOT: CE'nin ilk elution karışımında çözülmesi zorsa, malzemeyi kartuşun üstüne yüklemeden önce CE'yi katı bir fazda (örneğin, C18 veya celite) 1:1 (w/w) oranında dağıtın.
      DİkKAT: Özlerin ve fraksiyonların kütle verimini hesaplamak için mikrotüpleri önceden tartın.
  3. Kimyasal profilleme analizi
    NOT: Her bitki türünün kimyasal analizi için optimize edilmiş ve spesifik yöntemler gerektirdiğini göz önünde bulundurarak, aşağıdaki bölümlerde bitki materyallerini analiz etmek için kullanılan en yaygın analitik yaklaşımları açıklıyoruz. Pratik bir örnek olarak, iki çeşit Casearia sylvestris Swartz (Salicaceae) tarafından farklı olarak biyosinize edilen fenolik bileşiklerin ve clerodane tipi diterpenlerin eşzamanlı analizi için ters fazlı bir sıvı kromatografisi geliştirilmiş ve doğrulanmıştır. UPLC-DAD aparatı bir gaz giderici, kuaterner pompa, otomatik örnekleyici, UV-Vis fotodiyot dizi dedektörü ve bir fırın ile donatılmıştır (Bueno ve ark. 201518'dekiayrıntılara bakın). Aşağıdaki örneklerde açıklanan benzer yaklaşımlar diğer bitki türlerine ve/veya bitki malzemelerine göre optimize edilebilir.
    1. Kromatografik analiz ve heceleme olanakları
      1. Ultra yüksek performanslı sıvı kromatografisi (UPLC) kullanan ayırmalar için uyumlu bir ön sütun tarafından korunan C18 kromatografik sütun (örneğin, 150 × 2,1 mm, 2,6 μm, 100 Å) kullanın.
        NOT: Bitki türüne/malzemesine bağlı olarak diğer sütun evreleri veya kromatografik modlar kullanılabilir. Geleneksel HPLC de kullanılabilir; bu durumda, uygun bir kromatografik sütun seçilmelidir. Mükemmel ayrımlar elde etmek için, akış hızı (μL/dk), kolon sıcaklığı (°C) ve enjeksiyon hacmini (μL) göz önünde bulundurarak kromatografik koşulları ayarlayın. Mobil faz genellikle doğrusal veya çok noktalı elüsyon gradyanları veya izokratik elution kullanılarak su (A) ve asetonitril veya metanolden (B) oluşur. Tamponlar, asitler, bazlar veya diğerleri gibi değiştiriciler de kullanılabilir.
      2. Tesis malzeme analizini (CE ve/veya CEF) gerçekleştirin ve mevcut heceleme işlemine bağlı olarak spektral veriler (UV-Vis ve/veya tercihen MS dedektörleri kullanarak), saklama süresi (min) ve diğerleri gibi ilgili tüm verileri kaydedin.
        NOT: Sıvı kromatografisi (LC) genellikle LC−HRMS olarak yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi (HRMS) ile hecelenmiştir (birleştirilmiştir) ve genellikle CE ou CEF15'temetabolitlerin hızlı ek açıklaması için kullanılır.
      3. Nitel veriler gerekiyorsa ve nicel veriler gerekliyse, aynı protokolü izleyerek kalibrasyon eğrilerini dikkatlice hazırlayın ve enjekte edin.
        NOT: En iyi kromatografik koşulların geliştirilmesi, Bueno ve ark. 201518veya benzeri literatür tarafından açıklandığı gibi deneylerin tasarımı yardımıyla gerçekleştirilebilir. Yöntem geliştirme sırasında iç standartların dahil edilmesini göz önünde bulundurmak önemlidir. Numune hazırlama ve enjeksiyonlar sırasında doğru teknik sapmalara ve veri analizi için daha fazla normalleşmeye izin verdikleri için çok takdir edilmektedirler.
  4. Tek değişkenli ve çok değişkenli veri analizi
    1. Kayıtlı kromatogramları uygun bir biçimde dışa aktarın (örneğin, ASCII, .txt. veya .csv biçimi). Birkaç örnek analiz ediliyorsa ve karşılaştırmalar gerekiyorsa, kromatogramlar birleştirilerek ve hizalanarak tek bir veri matrisi ayarlanabilir. Elde edilen matrisler, kullanılan iç standarda göre kromatogramları normalleştirilmelidir.
    2. Çok değişkenli ve tek değişkenli yöntemler kullanarak bitki metabolomik verilerini analiz edin. Denetimsiz ana bileşen analizi (PCA) ve hiyerarşik kümeleme analizi (HCA) veya denetlenen kısmi en küçük kare analizi (PLS, OPLS, PLS-DA gibi) dahil olmak üzere çok değişkenli istatistiksel yöntemler kullanarak birden fazla değişkenin eşzamanlı analizi yoluyla metabolomik veri kümelerini keşfedin ve görselleştirin. ANOVA, Student's, Tukey ve Welch'in t-testi gibi tek değişkenli yöntemler, örnekler arasındaki nicel farklılıkların kesin analizi için özellikle ilginçtir19.
  5. Dereplication ve bileşikler ek açıklaması
    NOT: Bu adımın amacı, tek veya çok değişkenli veri analizine aynı anda gerçekleştirilebilecek sıkıcı yalıtımı önlemek için bilinen NP'lerin hızlı çevrimiçi tanımlanmasına adanmıştır.
    1. Algılanan veya hedeflenen bileşiklerin tanımlama düzeylerini gerçekleştirin:
      1. Tam 3D yapı ve stereokimya (seviye 0) dahil olmak üzere tanımlanmış bileşik;
      2. Saklama süresi ve MS/MS spektrumu (düzey 1) gibi iki ortogonal parametre ile elde edilen tanımlama;
      3. Putatif açıklamalı bileşikler ve bileşik sınıflar (seviye 2 ve 3);
      4. Analitik verilere göre ayırt edilebilen tanımlanamayan veya sınıflandırılmamış metabolitler (düzey 4)19,20.
    2. Ticari veya genel veritabanlarını kullanarak bilinen bileşikleri karakterize edin. En önemli veritabanları arasında, vurgulanabilir: NIST (https://www.nist.gov), Wiley (https://www.sisweb.com/software/ms/wiley.htm), MassBank (https://massbank.eu/MassBank/), GMD (http://gmd.mpimp-golm.mpg.de/), METLIN (https://metlin.scripps.edu) ve Küresel Doğal Ürünler Sosyal Moleküler Ağ – GNPS veritabanı (https://gnps.ucsd.edu)19.
      NOT: Farklı ek açıklamalar vardır ve bunlar çalışma sırasında kullanılan tireli tekniğe bağlıdır ve şunları içerebilir: MS- (veya NMR) tabanlı spektral veritabanlarının yardımı ve siliko spektral tahmin algoritmalarında.
    3. İzolasyon, saflaştırma ve komple bileşik tanımlama
      NOT: Belirli bir bileşik (kimliği istatistiksel yöntemlerle şüphelenilen) tam yapısal tanımlamaya ihtiyaç duyarsa, bu görevi yerine getirmenin ilk adımı istenen bileşikleri daha büyük ölçekte izole etmek ve arındırmaktır. Zaten geliştirilmiş protokolleri ölçeklendirerek gerçekleştirilebilir.
      1. İyi kurulmuş ve optimize edilmiş kromatografik teknikler hazırlayarak hedef bileşiklerin (ler)in hızlı ve doğrudan izolasyonu gerçekleştirilmelidir. Kuru yük enjeksiyonlu yarı hazırlık hplc, genellikle yüksek yükleme ve numune çözünürlüğü arasında yapılması gereken tavizleri önlemek için kullanılabilir1.
      2. yalıtılmış bileşiklerin tam yapısal karakterizasyonunu ve tanımlanmasını gerçekleştirin. Bu, farklı tekniklerin kombinasyonu ile yapılabilir:
        1. Nükleer Manyetik Rezonans (NMR);
        2. Kütle spektrometresi (MS);
        3. Ultraviyole (UV) ve kızılötesi (IR) bölgelerdeki spektrometrik teknikler de fonksiyonel grupların karakterizasyonu için çok yararlıdır;
        4. Elektronik ve titreşimsel dairesel dikroizm (sırasıyla ECD ve VCD), Raman optik aktivitesi (ROA) ve X-ışını kristalografisi gibi kriyoptik spektroskopi kullanımı mutlak yapılandırma karakterizasyonu için önemli tekniklerdir.

3. Bioassays

NOT: Biyolojik tarama: CE ve CEF'nin potansiyel biyoaktivitesini hızlı bir şekilde değerlendirmek için doğal maddelerin ilk taraması düzenli ve anlaşılır olmalıdır.

  1. Biyoassaylar için CE ve CEF hazırlanması
    1. Kuru maddeyi mümkün olan en iyi çözücülerle (deneysel olarak belirlenebilir) yeniden inşa eder. Deneysel tasarım21,22 stok çözeltisini ve çözücülerin konsantrasyonunu tanımlar.
    2. Stok çözeltisinin çözücü konsantrasyonunu hesaplayın. Bunu yapmak için şu formülü kullanın: C1 x V1 = C2 x V2, burada C1, CE ve/veya CEF'nin stok çözümünü (mg) temsil eder; V1 çözücünün hacmini temsil eder; C2, CE ve/veya CEF'nin ağırlığıdır; V2, stok çözeltisinin son hacmidir (mL).
      NOT: Örneğin, stok çözeltisinin çözücü konsantrasyonu olarak %84,15 EtOH ve %15 dimetil sülfit (DMSO) seçtik. CE'nin stok konsantrasyonunu 6 mg/ mL'ye ve CEF'yi 1 mg / mL13'ehazırladık. CE ve CEF'yi seyreltmek için çözücü biyolojik aktivitenin değerlendirme yöntemine bağlı olacaktır. Araç olarak kullanılan çözücü biyolojik ve toksikolojik aktiviteye müdahale etmemelidir. Tipik olarak, su, DMSO, EtOH veya EtOH bazlı sulu bir çözücü, bitki özlerini veya bitki türevlerini çözünürlüğe getirmek için kullanılır4,13.
  2. Test organizmalarının hazırlanması
    1. Bir mikrobiyal suşu yeniden etkinleştirin, örneğin kan agarında S. mutans UA159 (48 saat, 37 °C, %5 CO2) ve sıvı kültür ortamında kültür (örneğin, tryptone-maya özü suyu [TYE: %2,5 (w/v) tryptone ile %1,5 (w/v) maya özü] 16 saat, 37 ° C, %5 CO2için %1 glikoz (w/v) (TYEg) içerir.
    2. Aynı kültür ortamında mikroorganizmanın başlangıç kültürünün 1:20 seyreltilmesini gerçekleştirin (ilk kültürün seyreltme oranı deneysel tasarıma göre değişebilir).
    3. Orta günlük büyüme aşamasına ulaşana kadar kuluçkaya yatırın.
    4. Inoculum'u antimikrobiyal tahliller için TYEg'de tanımlanmış bir popülasyona (örneğin, mililitre başına 2x106 koloni oluşturan üniteler - CFU/mL) ve biyofilm tahlilleri için %1 sakkaroz (w/v) (TYEs) ile TYE için hazırlayın.
      NOT: Büyüme koşulları test edilen mikroorganizmaya bağlı olacaktır.
  3. Antimikrobiyal aktivite
    NOT: Adımlar Şekil 3'te gösterilmiştir.
    1. 96 kuyulu bir plakaya, CE ve/veya CEF stok çözeltisinin (tedaviler) bir aliquot (μL) ekleyin. Aliquot'un hacmi, önceki çalışmalara dayanarak seçilmesi gereken test konsantrasyonu ile tanımlanır. Örneğin, CE'yi 0,5 mg/mL test konsantrasyonunda test etmek için, stok çözeltisinin 16,67 μL aliquot'ını 6 mg/mL'de kullanın. Bu hesaplama için şu formülü kullanın: C1 x V1 = C2 x V2, burada C1 stok konsantrasyonudur, V1 stok çözeltisi aliquot hacmidir, C2 test konsantrasyonudur ve V2 96 kuyu plakasının hacmidir (200 μL'ye karşılık gelir). Bu deneysel durumda, çözücülerin (aracın) test konsantrasyonu% 7 EtOH ve% 1.25 DMSO olacaktır.
    2. Her plaka için bir dizi kontrol ekleyin: inoculum olmadan tedavileri olan bir sütun (tedavi başına boş kontrol, kendini mikrobiyal büyümeden kullanan tedavi ile bulanıklığı ayırt etmeye yardımcı olun); araç ve inoculum içeren bir sütun (CE veya CEF seyreltici veya 0 mg / mL kontrolü); yalnızca kültür ortamına sahip bir sütun (kültür ortamı kontrolü) ve yalnızca inoculum (mikrobiyal büyüme kontrolü) içeren bir sütun.
    3. TYEg kullanarak ses seviyesini 100 μL'ye ayarlayın. Daha sonra, örneğin 24 saat, 37 °C, %5 CO2 (test edilen mikroorganizma bağlı olarak) kuluçkaya yaslanın.
    4. 100 μL mikroorganizma inoculum (1x 106 CFU/mL) 96 kuyu plakasına aşılanın.
    5. Kuyuların görsel muayenesi (açık veya bulutlu) ile bulanıklığa göre bakteri üremesini analiz edin. Açık: mikroorganizmanın görsel büyümesinin olmadığı anlamına gelir. Bulutlu: mikroorganizmanın görsel büyümesi olduğu anlamına gelir.
    6. Her kuyudaki bakteri kültürünün emilimini (optik yoğunluk veya O.D.) ölçmek (540 nm kullanan ELISA okuyucu). Daha sonra, kültürlerin 100 μL'sini 900 μL salin çözeltisi (%0,89 NaCl) içeren mikrotüplere aktarın, girdapla iyice karıştırın. Ardından, istenen değere kadar on kat seri seyreltme yapmaya devam edin.
    7. Belirli agar plakalarında (yinelenen) istenen seyreltmenin bir aliquotunu aşılayın. Örneğin, kan agar plakalarında belirli bir seyreltmenin 10 μL'si.
    8. Kuluçkaya yaslanın. Mikroorganizmalar arasında koşullar değişebilir, örneğin, S. mutans: 48 h, 37 °C, %5 CO2.
    9. Daha sonra CFU/mL'ye (Bir dizi koloni x 10n)/qolarak dönüşüm içinplakalarda koloni sayımları gerçekleştirin. Bu formülde,n seyreltmenin mutlak değerine eşittir (0, 1, 2 veya 3) ve q, agar plakasında kaplanmış her seyreltme için pipetlenmiş mL miktarına eşittir. Ayrıca, CFU/mL günlük değerlerine dönüştürülebilir.
      NOT: Bitki özleri kültür ortamına eklendiğinde, özlerden parçacıkların çökeltmeleri meydana gelebilir. Bu gerçek sonuçları yorumlamayı zorlaştırabilir. Aynı şey, bir mikro plaka okuyucusu bulanıklığı ölçtürürken, bazı durumlarda hücrelerin mikro plakanın altına yığıldığında da ortaya çıkar. Ek olarak, kullanılan öze bağlı olarak, bitki yaprağı özlerinin rengi bulanıklığı ölçmeyi zorlaştırabilir23,24. Alternatif bir yöntem, mikrobiyal hücrelerin metabolik olarak aktif olup olmadığını ortaya çıkan boyalar kullanır24.
  4. Antibiyofilm etkinliği
    NOT: Tedavilerin biyofilm oluşumu üzerindeki etkisini değerlendirme adımları Şekil 4'tegösterilmiştir.
    1. Biyofilmlerin oluşumu ve işlenmesi
      1. Antimikrobiyal Aktivite protokolünün adımlarında açıklandığı gibi kültür ortamında (TYE) tedavileri 96 kuyulu bir tabakta seyreltin.
      2. Tabağı kuluçkaya yatır. S. mutans örneğinde, inkübasyon 24 saat boyunca, 37 ° C'de ve% 5 CO2'de gerçekleştirilir.
      3. kuluçkadan sonra, biyofilme yapışmayan hücreleri gevşetmek için plakaları bir yörünge çalkalayıcısına (5 dk, 37 °C, 75 rpm) yerleştirin. Daha sonra, yapışmayan hücreleri içeren kültür ortamını atın ve yapışmayan hücreleri çıkarmak için kalan biyofilmleri% 0.89 NaCl ile üç kezyıkayın.
    2. Tedavi edilen biyofilmlerden biyokütlenin ölçülmesi
      NOT: Adımlar Şekil 4A'dakiakış şemasında gösterilmiştir.
      1. Biyofilmleri plakada yıkayın ve her kuyuya% 1 kristal menekşe sulu çözeltisinin 50 μL'sini ekleyin.
      2. Plakayı oda sıcaklığında 35 dakika kuluçkaya yatırın.
      3. Lekeli kuyuları MilliQ suyla (üç kez) yıkayın ve ardından 60-90 dakika boyunca havayla kurutun.
      4. Plakayı yörüngesel bir çalkalayıcıda (5 dk, 37 °C, 75 rpm) inkübe ederek% 99 EtOH'un 200 μL'si ile lekeli kuyulardan kristal menekşeyi elute edin.
      5. Eluted boya ile her kuyudan başka bir plakaya 150 μL aliquot aktarın ve numune biyokütlesini ölçün (ELISA okuyucu 570 nm).
    3. Tedavi edilen biyofilmlerin uygulanabilir mikrobiyal popülasyonunun (CFU/mL) ölçülmesi
      NOT: Adımlar Şekil 4B'dekiakış şemasında gösterilmiştir.
      1. Yıkanmış biyofilmleri bir pipet ve 200 μL NaCl% 0.89 ile plakadan çıkarın ve elde edilen süspansiyonu steril mikrotüplere ayrı ayrı aktarın.
      2. Kuyu başına% 0.89 ek 200 μL NaCl kullanın ve zaten ilk biyofilm süspansiyonunun 200 μL'sini içeren ilgili tüpe aktarın. Orijinal kuyu başına toplam 1 mL biyofilm süspansiyona ulaşana kadar bu işlemi gerçekleştirin.
      3. On kat seri seyreltme yapmak için her tüpten bir aliquot kullanın.
      4. Belirli agar plakalarında (yinelenen) istenen seyreltmenin bir aliquotunu aşılayın. Örneğin, kan agar plakalarında belirli bir seyreltmenin 10 μL'si.
      5. Agar plakalarını kuluçkaya yatırın (örneğin, 48 h, 37 °C, %5 CO2),daha sonra yukarıda açıklandığı gibi CFU/mL'yi belirlemek için kolonileri sayın.
  5. Biyolojik Aktivite Doğrulama Aşaması
    1. Tükürük pelikül oluşumu
      1. Tükürük filmini oluşturmak için yüzey olarak Hidroksiapatit (HA) boncukları (Macro-Prep Ceramic Hydroxyapatite Type I 80 μm)kullanın. Bu boncuk yüzeyi diş minelerini taklit eder.
      2. HA boncuklarını (örneğin, 10 mg) mikrotüplerde tartın ve sterilize edin. Ardından, adsorpsiyon tamponu kullanın (AB tamponu: 50 mM KCl, 1 mM KPO4, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, dd-H2O' da, pH 6.5] boncukları yıkamak için 0.1 mM fenilmetilsülfonil florür (PMSF) ve% 0.02 sodyum azit (NaN3)içeren25.
      3. İnsan tükürüğü toplayın ve hazırlayın26. Kurumsal etik kurul onayı almak gerekir.
      4. Mikrotüplere 500 μL tükürük ekleyin ve kuluçkaya yaslanın (40 dk, 37 °C, 24 rpm).
      5. Daha sonra, tükürük üstnatanını çıkarın ve boncukları yıkayın (PMSF ve NaN3içeren AB tamponu ile üç kez). SHA boncukları (tükürük peliküllü HA boncuk) artık aşağı akış tahlilleri için hazırdır.
        NOT: Tükürük sağlıklı gönüllülerden toplanır. Toplama işleminden sonra tükürüğü (1: 1 v/v) AB tamponu ve santrifüj (1699 x g, 20 dk, 4 °C) ile seyreltin. Filtrasyon ile sterilize edin (0,22 μm proteinlere düşük bağlamalı poliethersülfon membran filtresi)26. Kurumsal Etik Kurulu çalışmayı onaylamalıdır. Bizim durumumuzda Kurumun Etik Kurulu çalışmayı onaylamaktadır (CAAE: 68161417.0.0000.5416).
    2. Seçilen özlerle tedavi edilen tükürük ve glukan filme yapıştıktan sonra S. mutanların dekupajı
      1. Yukarıda açıklandığı gibi, mikroorganizması orta kütük büyüme aşamasına kadar geliştirin.
      2. Kültürler istenen O.D.'ye ulaştığında, santrifüj (20 dakika boyunca 4000 × g), % 0.89 NaCl çözeltisi ile yıkayın ve kültür ortamının aynı başlangıç hacmini kullanarak peleti% 0.89 NaCl ile yeniden kullanın.
      3. S. mutansgibi bir streptokok kullanıyorsanız, kültürleri zincirden arındırmak için bir sonda ile sonicate edin (30 s, 7 W, üç kez). Tek bir hücre organizması kullanıyorsanız, bu adım atlanabilir.
      4. Konsantrasyonu 2 x 106 CFU/mL'ye ayarlamak için O.D.'yi (540 nm) kontrol edin.
    3. S. mutansların tükürük peliküllerine (sHA) yapışmış hücrelere yapışmasının
      NOT: Adımlar Şekil 5'teki akış şemasında gösterilmiştir.
      1. Yukarıda açıklandığı gibi sHA örneklerini edinin.
      2. Seçilen tedavilerden bir aliquot (örnekte, 500 μL ekliyoruz) (test konsantrasyonunda; örneğin, 0,5 mg / mL) veya sHAörnekleri içeren mikrotüplere kontroller ekleyin.
      3. SHA örneklerini tedaviler veya kontrollerle kuluçkaya yatırın (30 dk, 37 °C, 24 rpm); ardından, boncukları AB tamponu (PMSF ve NaN3içeren) ile üç kez yıkayın.
      4. Mikroorganizma kültürünü ekleyin. Örnekte, her mikrotüpe 500 μL S. mutans kültürü (2 x 106 CFU/mL) ekliyoruz.
      5. Kuluçkaya yaslanın (1 h, 37 °C, 24 rpm) ve ardından AB tamponu ile üç kez yıkayarak ilişkisiz hücreleri çıkarın.
      6. Her numuneyi bir aliquot (örnekte, 1000 μL ekliyoruz) ab tamponu ve sonikat ile bir prob (30 s, 7 W) ile yeniden ıslatın.
      7. Belirli agar plakalarına (48 h, 37 °C, %5 CO2)kaplama yaparak uygulanabilir kolonilerin sayısını belirlemek için on kat seri seyreltme için her süspansiyonun bir aliquotunu kullanın. Ardından, yukarıda açıklandığı gibi CFU/mL'yi belirlemek için kolonileri sayın.
        NOT: Sonikate adımı, sHA'yayapışmış hücreleri ayırmak için gerçekleştirilir.
    4. S. mutansların ilk glukan matrisine (gsHA) yapışmış hücrelere yapışmasının
      NOT: Adımlar Şekil 6'daki akış şemasında gösterilmiştir. GtfB enzimi, GtfB üretmek için tasarlanan kültür süpernatantı Streptococcus milleri KSB8'den arındırıldı. Saflaştırma, iki proteaz inhibitörü (0.1 mM PMSF ve% 0.02 NaN3)içeren tamponlar kullanılarak hidroksiapatit boncuklar içeren bir kromatografi sütunu ile27,28ile gerçekleştirildi. Daha sonra enzim akrilamid jel (SDS-PAGE) üzerinde kontrol edildi ve gümüş nitrat ile boyandı. Enzimin aliquotları kullanıma kadar -80 °C'de depolandı.
      1. Yukarıda açıklandığı gibi sHA örneklerini edinin. Daha sonra, her tüpe bir aliquot (örnekte, 500 μL ekliyoruz) ekleyin ve bir homojenizatörde (40 dk, 37 °C, 24 rpm) kuluçkaya yatırın. Ardından, AB tamponu ile üç kez yıkayın (PMSF ve NaN3içerir).
      2. Her mikrotüpe tedavileri (veya test konsantrasyonundaki kontrolleri( örneğin, 0,5 mg/mL) içeren bir aliquot (örneğin, 500 μL) sakkaroz substratı (100 mmol sakkaroz) ekleyin.
      3. Numuneleri bir homojenizatörde (4 saat, 37 °C, 24 rpm) kuluçkaya yatırın. Daha sonra, sentezlenmiş glukanlara (gsHAörnekleri) dahil olmayan sakkarozun tedavilerini ve fazlalığını gidermek için AB tamponu (PMSF ve NaN3ile) ile üç yıkama gerçekleştirin.
      4. Her mikrotüpe bir aliquot (örnekte 500 μL ekliyoruz) S. mutans inoculum (2 x 106 CFU/mL) ekleyin.
      5. Bir homojenizatörde (1 h, 37 °C, 24 rpm) kuluçkaya yatırın ve ilişkisiz hücreleri çıkarmak için AB tamponuyla (PMSF ve NaN3ile) üç kez yıkayın.
      6. Her numuneyi bir aliquot (örneğin, 1000 μL) AB tamponu (PMSF ve NaN 3 ile) ile yeniden biriktirin ve gsHA'ya (30s, 7 W) yapıştığı hücreleri ayırmak için bir prob ile sonicate edin.
      7. Belirli agar plakalarına (48 h, 37 °C, %5 CO2)kaplama yaparak uygulanabilir kolonilerin sayısını belirlemek için on kat seri seyreltme için her süspansiyonun bir aliquotunu kullanın. Ardından, yukarıda açıklandığı gibi CFU/mL'yi belirlemek için kolonileri sayın.

4. Biyolojik Veri Analizi

  1. Bioassays Verileri
    1. Elektronik tabloya bioassays için ham veri girin. Her tedaviye göre mikrobiyal büyüme inhibisyonunun günlüğünü(Tedavilerin CFU/mL'si + 1) x log10olarak hesaplayın. Daha sonra, araç kontrolüne kıyasla mikrobiyal büyüme inhibisyonunun günlük yüzdesini hesaplayın (Alog10 CFU/mL tedavi/ortalama Alog10 CFU/mL araç kontrolü)x%100.
    2. Tedaviler (CE ve CEF tedavi grupları) ve araç kontrolü (negatif kontrol) ile tedavi edilen planktonik kültürlerin ve biyokütlenin doğru O.D. Düzeltme için, tedavi edilen kuyuların emiciliğini sadece kültür ortamı (Ablank) içeren kuyularda elde edilen kuyulardan (Atedavi edilen gruplar orta /A negatif kontrolortamı)x% 100 olarak çıkarın.
    3. Bu düzeltmeden sonra, araç kontrolüne kıyasla biyokütle inhibisyonunun yüzdesini (Atedavi edilmiş biyokütle/ ortalama biraraç kontrolü)x% 100 olarak hesaplayın.
    4. Belirli bir yazılım kullanarak verilerin istatistiksel analizi için oluşturulan ham verileri gönderin.
      NOT: Belirli bir tedavinin etkinliğinin yorumlanması, IC50 /IC90gibi kesme noktaları kullanılarak belirlenir. Bu değerler, bakteri üremesi veya biyofilm oluşumunun sırasıyla% 50 ve% 90'ını inhibe edebilen bir tedavinin minimum konsantrasyonu olarak tanımlanır24. Bu parametreler verileri yorumlamaya yardımcı olabilir ve daha iyi aktiviteye sahip bileşikleri seçmek için bir temel sağlayabilir13,29.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Olası yeni çürük önleyici tedaviler için potansiyel olarak aktif molekülleri tanımlamak için bitki özlerinin ve fraksiyonlarının biyolojik aktivitesini taramak için sistematik bir yaklaşım kullanarak bir örnek sunuyoruz: Casearia sylvestris özlerinin Streptococcus mutans ve Candida albicans13'ekarşı farklı Brezilya biyomlarından antimikrobiyal ve antibiyofilm aktiviteleri 13 .

Arka plan
Sakkaroz ve nişasta bakımından zengin spesifik oral mikroorganizmalar-konak faktörleri-diyet arasındaki karmaşık etkileşimler patojenik biyofilmlerin oluşumunu modüle edebilir ve karyojenik bir süreç başlatabilir30,31. S. mutans, diş çürüklerinin gelişimiyle ilişkili biyofilmlerin patojenikliğini düzenler, çünkü asitojenikliği ve asitlik31'inyanı sıra ekzopolisakkarit sentezden sorumlu Gtf'ler üretir. Ek olarak, Gtfs Candida albicans (ve diğer mikroorganizmalar) yapışması sağlar, biyofilm virülansını artırarak32,33. S. mutans ve C. albicans13'ekarşı lingua ve sylvestris çeşitlerine ait, farklı Brezilya biyomlarından C. sylvestris yaprak özlerinin ve fraksiyonlarının antimikrobiyal ve antibiyofilm faaliyetlerinin taramasını gerçekleştirdik. C. sylvestris ("guaçatonga"), Brezilya ve Güney Amerika ve Asya'nın diğer ülkelerinde popüler ve geleneksel kullanımın bir parçasıdır34,35. Bu bitki, Brezilya'da yüksek insidanslı hastalıkları tedavi edebilecek 71 türü içeren "SUS'a İlgi Tıbbi Bitkiler Ulusal Listesi"nde (RENISUS) belirtilmiştir36. Var. sylvestris yaprak özlerinin kimyasal profili zengin bir fitokimyasal bileşim sunar, bol miktarda diterpen35, fenolik bileşikler (esas olarak flavonoidler) var. lingua18'debaskındır.

C. sylvetris'in hangi özlerinin ve fraksiyonlarının değerlendirilen mikroorganizmalar için en aktif olduğunu belirlemek için protokolde açıklanan yaklaşımı kullanıyoruz ve basit modeller kullanarak elde edilen sonuçlara dayanarak, hangi tedavilerin in vitro kompleks modellerde (hidroksiapatit diskler, mikrokozmlar) test edileceğini seçiyoruz37,38. Burada, on iki CE'nin S. mutanlarakarşı taranması sonuçlarını sunuyoruz. Odak noktası, verileri yorumlamak ve tartışmak yerine doğal bileşikleri taramak için bu yaklaşımın yararlılığını göstermektir.

Brezilya'daki on iki farklı popülasyondan C. sylvestris'in iki çeşidinden bireylerin yapraklarını topladık, Brezilya biyomlarının farklı oluşumlarından oluşan (lütfen, Ribeiro ve ark. 201913'tekiayrıntılara bakın). Koleksiyon Haziran ve Eylül 2012 ve 2013 tarihleri arasında gerçekleştirildi (SisGen; Kayıt #A00892A). İkincil metabolitlerin kimyasal değişkenliğini gidermek için farklı kemotiplerden ve farklı biyomlardan bireyler de dahil olmak üzere temsili örneklerin top alınmasını öneririz. Varsa, en az 3 ila 5 kişi toplanmalıdır. Bitki infraspesifik kimyasal değişkenliği ile ilgili önceki bilgiler, Ribeiro ve ark. 2019 ve Bueno ve ark. 201513,18tarafından açıklandığı gibi de düşünülmelidir. CE'nin kimyasal bileşimi Adım 2'de belirtilen kromatografik ile incelenmiş ve Şekil 7'dekimyasal profili sağlıyoruz. Kimyasal profilin analizi, biyolojik taramada elde edilen verilerin yorumlanmasını entegre etmek için gereklidir.

CE'ler Hex, AcOEt ve MeOH fraksiyonlarında kesirlendi. CE'nin fraksiyonasyonu, karışımın basitleştirilmesinin potansiyel olarak aktif bileşiklerin konsantrasyonunu artırmasına ve bileşikler arasındaki sinerjilerin ve düşmanlıkların olanaklarını azaltmasına izin verir. Ek olarak, daha basit karışımlarda (fraksiyonlar), bileşiklerin spektral verilerini elde etmek CE'den daha kolaydır ve dereplication analiziyapmak 2. Genellikle, fraksiyonasyon, C18 (40 μm, 100 Å) gibi tercihen ters fazlı adsorbent içeren sıvı-sıvı ekstraksiyonu veya katı fazlı ekstraksiyon kartuşları (SPE) ile yapılabilir. çalışma amaçlarına veya istenen bileşiklerin kimyasal doğasına bağlı olarak diğer adsorbentler veya adsorbent karışımları seçilebilir. Seçilen teknik SPE ise, kartuşlar daha önce saf organik çözücü (örneğin EtOH) ile etkinleştirilmeli ve ilk elüent ile şartlandırılmalıdır. Standartlaştırılmış protokoller mevcuttur. Böylece okuyucu, ilgi çekici çalışma ve bitki materyaline göre danışabilir ve uyarlayabilir.

On iki CE% 84.15 EtOH ve% 15 DMSO ile 6 mg / mL (stok çözeltisi) elde etmek için çözündü. Tarama testlerden önce, mikrobiyal büyümeyi engellemeyen seyreltici konsantrasyonu (araç) test ettik. Bu adım önemlidir, çünkü tedavileri test ederken çözücülerin antimikrobiyal ve antibiyofilm eylemlerinin sonuçları etkilemesini önler. Testler, ilgi çekici mikroorganizmanın kültürünü farklı çözücü konsantrasyonları (ilişkili ve/veya izole) ile tedavi ederek 96 kuyulu bir plaka üzerinde yapılabilir. Böylece CE ile 0.5 mg/mL'de, araç ise %7 EtOH ve %1.25 DMSO konsantrasyonda taramamıza başladık.

Antimikrobiyal ve antibiyofilm aktivitesini taramak için yukarıda açıklandığı gibi 96 kuyu plakası tedavi edildi. Bu amaçla, her CE'yi 0,5 mg/mL konsantrasyonda test etmek için 16,67 μL stok çözeltisi CE (6 mg/mL) hacmi eklendi. Oluşan biyofilmler Adım 3'te açıklandığı gibi işlendi. S. mutanslara (IC50 veya 3 kütükler) karşı etkili olan ekstraktlar, Adım 3'te açıklandığı gibi, bu bakterinin tükürük pelikül ve ilk glukan matrisine "yapışma mukavemetini" değerlendirmek için kullanılmıştır.

Biyolojik tahlillerden elde edilen ham veriler Excel'de düzenlenmiştir (Adım 4'te açıklandığı gibi) ve uygun istatistiksel tedavi ile analiz edilmiştir13. Özleri en iyi aktiviteyle tanımlamak için kesme noktası IC50 inhibisyonuydu (3 kütük). Bu parametreden, dört öz olumlu bir yanıt gösterdi (Şekil 8). Bu dört özün kromatografik verileri, clerodane tipi diterpenlerin ve glikosillenmiş flavonoidlerin aynı anda varlığını göstermektedir. Ek olarak, aynı biyom (Atlantik Ormanı) ve çeşitliliği(sylvestris)içerirler. Biyolojik verilerin yorumlanmasına yardımcı olmak için, dört özün kromatografik profilini en iyi aktivite ile diğer taranmış özlerle karşılaştırdık. Diğerlerine kıyasla, en iyi aktiviteye sahip özler daha yüksek miktarda clerodane tipi diterpenlere ve aynı zamanda glikosillenmiş flavonoidlere sahiptir. Bu gözlem, bu özlerin etkinliğinin iki ikincil metabolit arasındaki sinerjik bir etkileşimden kaynaklandığını ve böylece biyolojik aktivitelerini artırdığını göstermektedir. Yani, clerodane tipi diterpenlerin ve glikosillenmiş flavonoidlerin kombine etkisi, ayrı etkilerinin toplamından daha büyüktür13.

Taramada elde edilen verileri doğrulamak için, seçilen CE ile tedavi edilen tükürük pelikül ve glukanlara yapıştıktan sonra S. mutanların müfrezesini değerlendirdik. Tahliller, seçilen ham özlerin biyolojik aktivitesini daha iyi değerlendirmek ve olası eylem hedeflerini belirlemek için in vitro tek türlerin biyofilm modellerini kullanır. İlk analiz, kullanılan tedavilerin S. mutansların tükürük pelikülüne yapışmasını engelleyip engelleyemeyeceğini, ancak esas olarak, tedavi edilen peliküle yapışan mikroorganizmanın hücrelerinin mekanik uyaran tarafından yüzeyden daha kolay çıkarılıp çıkarılamayacağı ve böylece biyofilm oluşumunun ilk aşamasının kesintiye uğrayıp uğratılamayacağını doğrular. Glukanların sentezi sırasında CE 'nin (daha iyi aktivite ile) eklenmesi tükürük pelikülünü değiştirmedi, çünkü hiçbir CE tükürük peliküline yapışan hücrelerin çıkarılmasını önemli ölçüde etkilemedi (Şekil 9A).

İlk glukan matrisinin(gsHA)yapışması, tedavilerin S. mutansların ilk glukan matrisine yapışmasını engelleyip engelleyemeyeceği araştırır. Yine de, bu metodoloji, tedavi edilen glukanlara yapışan mikroorganizma hücrelerinin yüzeyin mekanik uyaranı tarafından daha kolay çıkarılıp çıkarılabileceğini doğrular, böylece aşama biyofilm oluşumunu keser. Üç CE, GtfB'nin oluşturduğu glukanların kalitesini etkiledi ve bu nedenle S. mutanların ilk glukan matrisine yapışmasını zayıflattı (çoğu S. mutans hücresi glukanlar için yapıştıktan sonra çıkarıldı; Şekil 9B). Bu davranışın ikincil metabolitler arasındaki sinerji ile ilgili olduğuna inanıyoruz13.

Sistematik Yaklaşım, kardiyojenik biyofilmlerin oluşumunu durdurmak için aktif ham özleri tanımlamamıza ve seçmemize yardımcı oldu. Seçildikten ve kromatografik profile dayanarak, karmaşık modellerde moleküler etki mekanizmalarını aydınlatan temellere sahibiz.

Figure 2
Şekil 2: Bitki malzemesi ekstraksiyonu ve fraksiyonasyonu akış şeması. Resimde, ham özleri (A) ve ham özlerin fraksiyonasyonunu (B) hazırlamak için deneysel tasarım gösterilmektedir. BAE: Ultrason Destekli Ekstraksiyon; SPE: Katı Faz Ekstraksiyonu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: 96 kuyu plakalarında antimikrobiyal aktiviteyi değerlendirmek için deneysel tasarım. Resimde tedaviler (ham özler veya kesirler) ve kontroller gösterilmektedir. Birden fazla tedavinin taranmasında, her kuyuda tek bir konsantrasyon (mg / mL) kullanın. CFU/mL: mililitre başına koloni şekillendirme birimleri. O.D.: optik yoğunluk. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: 96 kuyu plakalarında antibiyofilm tahlil için deneysel tasarım. Resimde tedaviler (ham özler ve fraksiyonlar) ve kontroller gösterilmektedir. Çeşitli tedavilerin taranmasında, her kuyuda tek bir konsantrasyon (mg / mL) kullanın. A'da, tedavi edilen biyofilmlerin biyokütlesini ölçme adımları gösterilmiştir. B'de, tedavi edilen biyofilmlerin popülasyonlarını (CFU/mL) belirleme adımları gösterilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: Tükürük peliküllerine yapışma ve ardından yapışan hücrelerin ayrılışını değerlendirmek için deneysel tasarım. Resimde gerçekleştirilecek adımlar gösterilmektedir. Tedaviler: biyolojik taramaya göre seçilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 6
Şekil 6: İlk glukan matrisine(gsHA)yapışma ve ardından yapışan hücrelerin kopmasını değerlendirmek için deneysel tasarım. Resimde gerçekleştirilecek adımlar gösterilmektedir. Tedaviler: biyolojik taramaya göre seçilir. Sakkaroz substratı: 100 mmol sakkaroz. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 7
Şekil 7: Brezilya biyomlarından C. sylvestris özlerinde clerodane tipi diterpenler ve glikosillenmiş flavonoidlerin miktarı.  S,I ve L harfleri sırasıyla sylvestris, orta ve linguaçeşitlerini gösterir. Dr. Paula Carolina Pires Bueno'nun kişisel iletişimi. Bu rakam Ribeiro ve ark.13'ten değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 8
Şekil 8: Brezilya biyomlarından elde edilen C. sylvestris ham özlerinin S. mutanlarakarşı antimikrobiyal ve antibiyofilm aktivitesi .  A. Tedavi edilen planktonik hücrelerin % CFU'sı (kütüğü10); B. Tedavi edilen biyofilmlerin % biyokütlesi. C. Tedavi edilen biyofilm %CFU (log10). Açıklanan veriler ortanca (izlemeler) ve interquartile (kutular) 'dır. Hata çubukları en büyük ve en düşük değerleri temsil eder. Yıldız işaretleri, belirli bir özün araç kontrolüne (V) karşı istatistiksel olarak anlamlı bir farkını gösterir, burada: ****p ≤ 0.0001; s ≤ 0.001; ** s ≤ 0.01; ve *p ≤ 0.05 (Kruskal-Wallis testi, ardından Dunn'ın çoklu karşılaştırma testi). Her tür büyüme kontrolü (tedavi olmadan) S. mutansiçin Sm olarak temsil edilir. Her grafikteki çubukların renkleri, özlerin ait olduğu çeşitliliği, koyu gri renkte temsil eder: var. sylvestris; açık gri: var. orta ve beyaz: var. lingua. Bu rakam Ribeiro ve ark.13'ten değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 9
Şekil 9: S. mutans, tedavi edilen tükürük pelikül ve glukanların ilk matrisine yapışma sonrası ayrılır.  S. mutans'ın tedavi edilen tükürük pelikül ve glukanlara salınım sonrası verileri sırasıyla (A) ve (B)olarak gösterilmiştir. Kontrol aracı (V) ile her iki analiz için test edilen ekstraktlar arasında hiçbir fark yoktu. Araç kontrolü (V) %100 olarak dikkate alınarak CFU/mL yüzdesi elde edildi. Açıklanan veriler ortanca (izlemeler) ve interquartile (kutular) 'dır. Hata çubukları en büyük ve en düşük değerleri temsil eder. Yıldız işaretleri, belirli bir özün araç kontrolüne (V) karşı istatistiksel olarak anlamlı bir farkını gösterir, burada ****p = 0.0001 ve **p < 0.0031 (Kruskal-Wallis testi, ardından Dunn'ın çoklu karşılaştırma testi). Büyüme kontrolü S. mutansiçin Sm ile temsil edilir. Grafiğin çubuklarının renkleri, özlerin ait olduğu çeşitliliği temsil eder, koyu griden var. sylvestris'e kadar olan renktir. Bu rakam Ribeiro ve ark.13'ten değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Doğal ham özlerle yapılan çalışmalarla ilgili temel zorluklar, karmaşık bileşimlerini ve klasik biyo-güdümlü izolasyon çalışmalarının yetersizliklerini içerir. Bu süreç yavaş olmasına rağmen etkilidir ve NP araştırmalarında önemli bulgulara yol açmıştır. Rasyonalize etmek için önceliklendirme odaklı çalışmalara ihtiyaç vardır. Bu nedenle, izolasyondan önce CE ve dereplication analizi için modern kimyasal profilleme yaklaşımlarının kullanılması, çalışılan malzemeyi karakterize etmek için önemlidir ve özellikle biyolojik aktivite2,15ile bilinen bileşiklerin yeniden izolasyonu önlemek için yararlıdır. Ayrıca, gözlemlenen biyolojik faaliyetlerden sorumlu potansiyel isabet adaylarını bulmak için daha fazla çok değişkenli veri analizi yapmak için çok boyutlu verilerin eldeılması gereklidir. Sonuç olarak, araştırmacı bu potansiyel adayların izolasyonuna (büyük ölçekte) odaklanabilir.

Burada, bitki özlerinden ve fraksiyonlarından aktif bileşiklerin biyoassay güdümlü tanımlanması (in vitro) için sistematik bir yaklaşım sunuyoruz. Bu protokol, birden çok etkin bileşenin aynı anda taranabilmesi ve analiz edilebilmesi için çok hedefli bir tarama ve analiz yöntemi sağlar. Biyoassaylar küçük ölçekte ve yüksek verime sahip, hızlı, uygun maliyetli, üremesi kolay ve geleneksel yöntemlerden daha az reaktif tüketiyor (örneğin, ilgi bileşiklerinin ilk izolasyonu)39. Herhangi bir doğal ürün araştırması için analitik araçlardan (örneğin, HPLC-UV, HPLC-DAD, LC-MS) önemlidir. Son zamanlarda, yaklaşım daha yüksek bir dereceye kadar analitik ve elucidation platformlarının (LC-HRMS ve HRMS / MS, yüksek alan NMR) gücünü ve zaten bilinen moleküllerin hızlı tanımlanmasından oluşan dereplication stratejilerini kullanarak daha yapı odaklıdır (kimya tabanlı). Bu adım, aday aktif metabolitlerin daha odaklı izolasyonu ile sonuçlanan biyolojik yanıt ile kimyasal profil ilişkisini anlamaya yardımcı olur3. Kromatografik analiz için birkaç köklü yöntem vardır. Bilinmeyen NP'ler için, bazen mümkün olan en iyi yöntemi bulmak için pilotları gerçekleştirmek gerekebilir. Örneğin, iki çeşit C. sylvestris13,18tarafından üretilen ikincil metabolitlerin eşzamanlı analizi için doğrulanmış analitik bir kromatografi yöntemi kullanıyoruz. Bir kromatografi yöntemi seçerken, hedef bileşiklere (ler) ve mevcut tüm yöntemlerin avantaj ve dezavantajlarına dayalı bir protokol düşünmenizi öneririz, özellikle verimliliklerine ve tabii ki toplam maliyete odaklanarak40.

Sistematik yaklaşım, NP'lerdeki biyoaktif adayların hızlı bir şekilde taranıp analiz edilerek analiz için yararlı olsa da, önemli sınırlamalar olmaya devam etmektedir. Örneğin, biyokütle ve planktonik kültürlerin görsel ve O.D. okumaları yanlış-pozitif sonuçlar üretebilir13,23,24. Kültürlerin bulanıklığının mikro plaka okuyucu ile belirlenmesi doğal bileşikler için kullanıldığında başarısız olabilir23,24. Bu başarısızlıklar, (i) bazı test organizmalarında hücrelerin kuyunun dibinde kümelenmesi ve diğer organizmalarda hücrelerin süspansiyonda kalması nedeniyle ortaya çıkar; (ii) CE çökeltisinde bulunan katı parçacıklar ve kuyularda bulanıklığa neden olur23,24. NP'lerin pH'ı da dikkate alınması gereken bir faktördür. Arıtma çözeltisinin pH'ı ikincil metabolitlerin kimyasal bileşimi ile ilgilidir ve bu nedenle biyolojik yanıtı etkiler. pH bir sınırlama olmasa da, çalışmanın amacına bağlı olarak dikkatli bir şekilde değerlendirilmelidir. Örneğin, diş minesi yüzeylerindeki biyofilm modellerinde asitlik istenmeyen emaye demineralizasyonuna neden olabilir. Bu durumlarda, pH'ı uygun tamponlar yardımıyla ayarlamak gerekir. Bu nedenle, pH ayarının daha önce gözlenen biyolojik yanıtı etkileyip etkilemediğini doğrulamak için testler yapmak gerekir.

Yeni bileşiklerin aktivitesini değerlendirmek için yapılan klasik testler arasında minimum inhibitör konsantrasyonun (MIC) ve minimum bakterisidal veya mantar öldürücü konsantrasyonun (MBC veya MFC) belirlenmesi yer almaktadır29,41. Bununla birlikte, amaç birçok bitki özünü ve fraksiyonunu taramak olduğunda, teknik kapsamlı hale gelir. Biyoscreening, tek bir çoklu işlem konsantrasyonu ile yapılabilir (örneğin, farklı yerlerden bitki özleri)13,42,29. Bu durumlar için sistematik yaklaşım, daha az çalışma süresiyle tutarlı sonuçlar veren yüksek performansa sahip bir yöntemdir. Biyolojik taramada seçilen tedaviler, biyolojik aktiviteyi doğrulamak için rafine modeller (klinik olarak ilgili, uygulanabilir ve tekrarlanabilir) kullanılarak değerlendirilebilir. Karyojenik biyofilm kontrolü için, laboratuvar çalışmaları esas olarak hidroksiapatit (diş minesi ikamesi) veya tükürük pelikül37ile kaplanmış dik konuma yerleştirilmiş emaye yüzeyler üzerinde oluşturulan biyofilmlere odaklanmalıdır. Ayrıca farklı çeşit ve biyomlardaki bitki örneklerinin tekrarlanabilir ve hızlı bir şekilde taranarak taranır. Bu iki değişkenin (biyom ve çeşitlilik) dahil edilmesi hayati önem taşır, çünkü ikincilmetabolitler 18'in kimyasal bileşiminin değişkenliğini etkiler ve biyolojik yanıtı modüle eder. Bu sistematik yaklaşım oral biyofilm araştırması dışındaki uygulamalar için uyarlanabilir/değiştirilebilir. Örneğin, diğer ilgi alanlarını kullanarak biyofilm ile ilgili diğer alanlar için özellikle yararlı olabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Çıkar çatışması bildirilmedi.

Acknowledgments

UnESP, Araraquara/SP Kimya Enstitüsü'nden Núcleo de Bioensaios, Biossíntese e Ecofisiologia de Produtos Naturais'e (NuBBE) tesis malzemesi hazırlamak için laboratuvarları sağladığı için şükranlarımızı sunuyoruz. Diş Malzemeleri ve Prosthodonti Bölümü, UNESP, Araraquara/SP Uygulamalı Mikrobiyoloji Laboratuvarı'na da teşekkür ediyoruz. Bu araştırma, São Paulo Araştırma Vakfı'nın (FAPESP #2013/07600–3'ten AJC'ye) bir araştırma hibesi ve bursların yanı sıra genel gider fonları (FAPESP #2017/07408–6 ve FAPESP #2019/23175-7'den SMR'ye; #2011/21440–3 ve #2012/21921–4 ila PCPB). FAPESP ile birlikte Ulusal Bilimsel ve Teknolojik Gelişim Konseyi ek destek sağladı (INCT CNPq #465637/2014–0 ve FAPESP #2014/50926–0'dan AJC'ye).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well microplates  Kasvi Flat bottom
Activated carbon LABSYNTH Clean up and/or fractionation step
Analytical mill Ika LabortechniK Model A11 Basic
Blood agar plates Laborclin
Chromatographic column C18 Phenomenex Kinetex 150 × 2.1 mm, 2.6 µm, 100Â
Dimethyl sulfoxide  Sigma-Aldrich Vehicle solution
ELISA plate reader Biochrom Ez
Ethanol J. T. Baker For extraction and fractionation steps, and mobile phase composition
Ethanol Sigma-Aldrich Vehicle solution
Ethyl acetate J. T. Baker Fractionation step
GraphPad Software La Jolla GraphPad Prism7
Hexane J. T. Baker Fractionation step
Incubator Thermo Scientific
Isopropanol J. T. Baker For extraction step
Lyophilizer (a freeze dryer) Savant Modulyo
Nylon Millipore LAC 0.22 µm x 13 mm
Orbital shaker Quimis Model G816 M20
Polyamide solid phase extraction cartridge Macherey-Nagel Clean up and/or fractionation step
Silica gel Merck 40–63 μm, 60 Â
Sodium Chloride (NaCl) Synth 0,89% in water
Solid phase extraction cartridges (SPE) Macherey-Nagel Clean up and/or fractionation step
Tryptone Difco
UHPLC-DAD Dionex Ultimate 3000 RS
Ultrasonic bath UNIQUE Model USC 2800
Yeast extract Difco

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Newman, D. J., Cragg, G. M. Natural Products as Sources of New Drugs over the Nearly Four Decades from 01/1981 to 09/2019. Journal of Natural Products. 83 (3), 770-803 (2020).
  2. Wolfender, J. L., Litaudon, M., Touboul, D., Queiroz, E. F. Innovative omics-based approaches for prioritisation and targeted isolation of natural products – new strategies for drug discovery. Natural Product Report. 36 (6), 855-868 (2019).
  3. Michel, T., Halabalaki, M., Skaltsounis, A. New Concepts, Experimental Approaches, and Dereplication Strategies for the Discovery of Novel Phytoestrogens from Natural Sources. Planta Medica. 79 (7), 514-532 (2013).
  4. Jeon, J. G., Rosalen, P. L., Falsetta, M. L., Koo, H. Natural products in caries research: current (limited) knowledge, challenges and future perspective. Caries Research. 45 (3), 243-263 (2011).
  5. Tonetti, M. S., Jepsen, S., Jin, L., Otomo-Corgel, J. Impact of the global burden of periodontal diseases on health, nutrition and wellbeing of mankind: A call for global action. Journal of Clinical Periodontology. 44 (5), 456-462 (2017).
  6. Peres, M. A., et al. Oral diseases: a global public health challenge. Lancet. 394 (10194), 249-260 (2019).
  7. Bowen, W. H., Burne, R. A., Wu, H., Koo, H. Oral biofilms: pathogens, matrix, and polymicrobial interactions in microenvironments. Trends Microbiology. 26 (3), 229-242 (2018).
  8. Paes Leme, A. F., Koo, H., Bellato, C. M., Bedi, G., Cury, J. A. The role of sucrose in cariogenic dental biofilm formation--new insight. Journal of Dental Research. 85 (10), 878-887 (2006).
  9. Koo, H., Falsetta, M. L., Klein, M. I. The exopolysaccharide matrix: a virulence determinant of cariogenic biofilm. Journal of Dental Research. 92 (12), 1065-1073 (2013).
  10. Cury, J. A., de Oliveira, B. H., dos Santos, A. P., Tenuta, L. M. Are dental fluoride releasing materials clinically effective on caries control. Dental Materials. 32 (3), 323-333 (2016).
  11. Mattos-Graner, R. O., Klein, M. I., Smith, D. J. Lessons Learned from Clinical Studies: Roles of Mutans Streptococci in the Pathogenesis of Dental Caries. Current Oral Health Reports. 1, 70-78 (2014).
  12. Rocha, G. R., Florez Salamanca, E. J., de Barros, A. L., Lobo, C. I. V., Klein, M. I. Effect of tt-farnesol and myricetin on in vitro biofilm formed by Streptococcus mutans and Candida albicans. BMC Complementary and Alternative Medicine. 18 (1), 61 (2018).
  13. Ribeiro, S. M., et al. Antimicrobial and antibiofilm activities of Casearia sylvestris extracts from distinct Brazilian Biomes against Streptococcus mutans and Candida albicans. BMC Complementary and Alternative Medicine. 19 (1), 308 (2019).
  14. Pilon, A. C., et al. Metabolômica de plantas: métodos e desafios. Quimica Nova. 43 (3), 329-354 (2020).
  15. Wolfender, J. L., Nuzillard, J. M., Hooft, J. J. J., Renault, J. H., Bertrand, S. Accelerating Metabolite Identification in Natural Product Research: Toward an Ideal Combination of Liquid Chromatography-High-Resolution Tandem Mass Spectrometry and NMR Profiling, in Silico Databases, and Chemometrics. Analytical Chemistry. 91 (1), 704-742 (2019).
  16. Allard, P. M., et al. Pharmacognosy in the digital era: shifting to contextualized metabolomics. Current opinion in biotechnology. 54, 57-64 (2018).
  17. Hubert, J., Nuzillard, J., Renault, J. Dereplication strategies in natural product research: How many tools and methodologies behind the same concept. Phytochemistry Reviews. 16, 55-95 (2017).
  18. Bueno, P. C. P., Pereira, F. M. V., Torres, R. B., Cavalheiro, A. J. Development of a comprehensive method for analysing clerodane-type diterpenes and phenolic compounds from Casearia sylvestris Swartz (Salicaceae) based on ultra-high performance liquid chromatography combined with chemometric tools. Journal of separation science. 38 (10), 1649-1656 (2015).
  19. Bueno, P. C. P., Lopes, N. P. Metabolomics to Characterize Adaptive and Signaling Responses in Legume Crops under Abiotic Stresses. American Chemical Society omega. 5 (4), 1752-1763 (2020).
  20. Blaženović, I., Kind, T., Ji, J., Fiehn, O. Software tools and approaches for compound identification of LC-MS/MS data in metabolomics. Metabolites. 8 (2), 31 (2018).
  21. Eloff, J. N. Quantifying the bioactivity of plant extracts during screening and bioassay-guided fractionation. Phytomedicine: International Journal Of Phytotherapy And Phytopharmacology. 11 (4), 370-371 (2004).
  22. Rios, J. L., Recio, M. C. Medicinal plants and antimicrobial activity. Journal of Ethnopharmacology. 100 (1-2), 80-84 (2005).
  23. Eloff, J. N. A sensitive and quick microplate method to determine the minimal inhibitory concentration of plant extracts for bacteria. Planta Medica. 64, 711-714 (1998).
  24. Eloff, J. N. Avoiding pitfalls in determining antimicrobial activity of plant extracts and publishing the results. BMC Complementary and Alternative Medicine. 19 (1), 106 (2019).
  25. Klein, M. I., Xiao, J., Heydorn, A., Koo, H. An analytical tool-box for comprehensive biochemical, structural and transcriptome evaluation of oral biofilms mediated by mutans streptococci. Journal of Visualized Experiments. (47), e2512 (2011).
  26. Lemos, J. A., Abranches, J., Koo, H., Marquis, R. E., Burne, R. A. Protocols to study the physiology of oral biofilms. Methods in molecular biology. 666, 87-102 (2010).
  27. Venkitaraman, A. R., Vacca-Smith, A. M., Kopec, L. K., Bowen, W. H. Characterization of glucosyltransferase B, GtfC, and GtfD in solution and on the surface of hydroxyapatite. Journal of Dental Research. 74, 1695-1701 (1995).
  28. Vacca-Smith, A. M., Venkitaraman, A. R., Quivey, R. G. Jr, Bowen, W. H. Interactions of streptococcal glucosyltransferases with alpha-amylase and starch on the surface of saliva-coated hydroxyapatite. Archives of Oral Biology. 41, 291-298 (1996).
  29. Van Dijck, P., et al. Methodologies for in vitro and in vivo evaluation of efficacy of antifungal and antibiofilm agents and surface coatings against fungal biofilms. Microbial Cell. 5 (7), 300-326 (2018).
  30. Marsh, P. D. Are dental diseases examples of ecological catastrophes. Microbiology. 149 (2), 279-294 (2003).
  31. Bowen, W. H., Koo, H. Biology of Streptococcus mutans-derived glucosyltransferases: role in extracellular matrix formation of cariogenic biofilms. Caries Research. 45 (1), 69-86 (2011).
  32. Lobo, C. I. V., et al. Dual-species biofilms of Streptococcus mutans and Candida albicans exhibit more biomass and are mutually beneficial compared with single-species biofilms. Journal of Oral Microbioly. 11 (1), 1581520 (2019).
  33. Kim, D., et al. Candida albicans stimulates Streptococcus mutans microcolony development via crosskingdom biofilm-derived metabolites. Scientific reports. 7, 41332 (2017).
  34. Ferreira, P. M. Folk uses and pharmacological properties of Casearia sylvestris: a medicinal review. Anais da Academia Brasileira de Ciencias. 83 (4), 1373-1384 (2011).
  35. Xia, L., Guo, Q., Tu, P., Chai, X. The genus Casearia: a phytochemical and pharmacological overview. Phytochemistry Reviews. 14, 99-135 (2015).
  36. Ferreira, P. M. P., et al. Toxicological findings about an anticancer fraction with casearins described by traditional and alternative techniques as support to the Brazilian Unified Health System (SUS). Journal of Ethnopharmacol. 15, 241 (2019).
  37. Koo, H., Xiao, J., Klein, M. I., Jeon, J. G. Exopolysaccharides produced by Streptococcus mutans glucosyltransferases modulate the establishment of microcolonies within multispecies biofilms. Journal of Bacteriology. 192 (12), 3024-3032 (2010).
  38. Maske, T. T., van de Sande, F. H., Arthur, R. A., Huysmans, M. -C. D. N. J. M., Cenci, M. S. In vitro biofilm models to study dental caries: a systematic review. Biofouling. 33 (8), 661-675 (2017).
  39. Fu, Y., Luo, J., Qin, J., Yang, M. Screening techniques for the identification of bioactive compounds in natural products. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 168, 189-200 (2019).
  40. Sarker, S. D., Nahar, L. An introduction to natural products isolation. Methods in molecular biology. 864, 1-25 (2012).
  41. Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI). Performance standards for antimicrobial susceptibility testing; twenty-fifth informational supplement. Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI). , Wayne, PA. CLSI document M100-S25 (2015).
  42. Saputo, S., Faustoferri, R. C., Quivey, R. G. Jr A drug repositioning approach reveals that Streptococcus mutans is susceptible to a diverse range of established antimicrobials and nonantibiotics. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 62 (1), 01674 (2018).

Tags

Biyoloji Sayı 169 Mikrobiyoloji biyofilm doğal ürünler mutans streptokoklar antimikrobiyaller diş çürükleri ilaç keşfi biyolojik yaklaşımlar
Diş Çürüklerini Önlemek İçin Bitkilerin Özlerinden ve Fraksiyonlarından Yeni Antimikrobiyal ve Antibiyofilm Moleküllerini Tanımlamak için Sistematik Yaklaşım
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ribeiro, S. M., Fratucelli, É. D.… More

Ribeiro, S. M., Fratucelli, É. D. O., Fernandes, J. M., Bueno, P. C. P., Cavalheiro, A. J., Klein, M. I. Systematic Approach to Identify Novel Antimicrobial and Antibiofilm Molecules from Plants' Extracts and Fractions to Prevent Dental Caries. J. Vis. Exp. (169), e61773, doi:10.3791/61773 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter