Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Систематический подход к выявлению новых противомикробных и антибиопленных молекул из экстрактов растений и фракций для предотвращения кариеса зубов

Published: March 31, 2021 doi: 10.3791/61773
Automatic Translation
*1, *1, *2, 2,3, 2, 1
1Department of Dental Materials and Prosthodontics, School of Dentistry, São Paulo State University (UNESP), 2Department of Organic Chemistry, Institute of Chemistry, São Paulo State University (UNESP), 3Faculty of Pharmaceutical Sciences of Ribeiraão Preto (FCFRP-USP), Department of Physics and Chemistry, University of São Paulo
* These authors contributed equally

Summary

Натуральные продукты представляют собой перспективные отправные точки для разработки новых лекарственных средств и терапевтических средств. Однако, из-за высокого химического разнообразия, поиск новых терапевтических соединений из растений является сложной и трудоемкой задачей. Мы описываем упрощенный подход к выявлению молекул противомикробных препаратов и антибиоплений из растительных экстрактов и фракций.

Abstract

Натуральные продукты обеспечивают структурно различные вещества, с множеством биологических видов деятельности. Однако выявление и изоляция активных соединений от растений являются сложными из-за сложной матрицы растений и трудоемких процедур изоляции и идентификации. Поэтому представлен пошаговая подход к скринингу природных соединений растений, включая изоляцию и идентификацию потенциально активных молекул. Она включает в себя сбор растительного материала; подготовка и фракция сырых экстрактов; подходы к хроматографии и спектрометрии (UHPLC-DAD-HRMS и NMR) для анализа и идентификации соединений; биоанализ (антимикробная и антибиопленная деятельность; бактериальная "сила адгезии" к слюнной пелликуле и начальной глюканой матрице, обработанной отдельными методами лечения); и анализ данных. Модель проста, воспроизводима и позволяет последовательно контролировать скрининг нескольких соединений, концентраций и этапов лечения. Полученные данные обеспечивают основу для будущих исследований, включая формулировки с наиболее активными экстрактами и/или фракциями, изоляцию молекул, моделирование молекул до конкретных целей в микробных клетках и биопленки. Например, одной из мишеней для контроля кариогенной биопленки является ингибирование активности глюканов стрептококка мутан, которые синтезируют глюканы внеклеточной матрицы. Ингибирование этих ферментов предотвращает накопление биопленки, уменьшая ее вирулентность.

Introduction

Самые ранние модели медицины, используемые в обществах, основывались на натуральных продуктах (НП). С тех пор люди искали новые химические вещества в природе, которые могут быть преобразованы в наркотики1. Этот поиск вызвал постоянное совершенствование технологий и методов этноботалогическогоскрининга 1,2,3. NPs предлагают богатый источник структурно разнообразных веществ, с широким спектром биологической деятельности, полезной для разработки альтернативных или адъювантных методов лечения. Тем не менее, присущая комплексная матрица растений делает изоляцию и идентификацию активных соединений сложной и трудоемкой задачей4.

NPs-основанные снадобья или формулировки можно использовать для того чтобы предотвратить and/or обработать несколько условий влияя на устные, включая зубовогокариеса 4. Кариес зубов, один из самых распространенных хронических заболеваний во всем мире, вытекает из взаимодействия богатых сахаром диеты и микробных биопленок (зубной налет), образуется на поверхности зуба, что приводит к деминерализации, вызванной органическими кислотами, полученными из микробного метаболизма, и если не лечить,приводит к потере зубов 5,6. Хотя другие микроорганизмы могут бытьсвязаны 7, Streptococcus mutans является одним из важнейших кариогенных бактерий, потому что это кислогенный, кислый, и внеклеточной матрицы строитель. Этот вид кодирует несколько экзоэнзимов (например, гликозилтрансферазы или Гтфы), которые используют сахарозу вкачестве субстрата 8 для построения внеклеточной матрицы, богатой экзополисахаридами, которые являются детерминантомвирулентности 9. Кроме того, грибОк Candida Albicans может привести к производству, что внеклеточной матрицы7. Хотя фтор, вводят в различных условиях, остается основой для предотвращениякариеса зубов 10, новые подходы необходимы в качестве адъювантов для повышения его эффективности. Кроме того, имеющиеся методы борьбы с бляшками основаны на использовании микробицидных агентов широкого спектра действия (например, хлоргексидина)11. В качестве альтернативы, NPs являются потенциальными методами лечения для контроля биопленок и предотвращениякариеса зубов 12,13.

Дальнейший прогресс в открытии новых биологически активных соединений растений включает в себя необходимые шаги или подходы, такие, как: i) использование надежных и воспроизводимых протоколов отбора проб, учитывая, что растения часто проявляют внутриспецифическую изменчивость; ii) подготовка всеобъемлющих экстрактов и их соответствующих фракций в небольших масштабах; iii) характеристика и/или dereplication их химических профилей думали приобретение многомерных данных, таких как GC-MS, LC-DAD-MS, или NMR, например; iv) использование жизнеспособных и высокодоходных моделей для оценки биоактивности; v) выбор потенциальных новых попаданий на основе многовариантного анализа данных или других статистических инструментов; vi) для выполнения изоляции и очистки целевых соединений или перспективных кандидатов; и (vii) проверка соответствующих биологических действий с использованием изолированныхсоединений 2,14.

Dereplication является процесс быстрого выявления известных соединений в сырой экстракт и позволяет дифференциации новых соединений из тех, которые уже были изучены. Кроме того, этот процесс предотвращает изоляцию, когда биоактивность уже описана для некоторых соединений, и это особенно полезно для обнаружения "часто нападающих". Он использовался в различных нецелесооборотных рабочих процессах, начиная от идентификации основных соединений или ускорения фракционования, управляемого деятельностью, до химического профилирования коллекций экстрактов. Он может быть полностью интегрирован с метаболомическими исследованиями для нецелесофильного химического профилирования CE или целевой идентификации метаболитов. Все это в конечном итоге приводит к приоритизации экстрактов передпроцедурами изоляции 1,15,16,17.

Поэтому в настоящей рукописи мы описываем систематический подход к выявлению молекул противомикробных и антибиопленных из растительных экстрактов и фракций. Она включает в себя четыре междисциплинарных этапа: (1) сбор растительного материала; (2) подготовка сырых экстрактов (CE) и фракций (CEF), а затем их химический анализ профиля; (3) биоанализ; и (4) анализ биологических и химических данных(рисунок 1). Таким образом, мы представляем протокол, разработанный для анализа противомикробной и антибиопленной деятельности экстрактов и фракций Casearia sylvestris против стрептококковых мутанов и candida albicans13,а также процедуры фитохимической характеристики и анализа данных. Для простоты, основное внимание здесь, чтобы продемонстрировать подход к скринингу природных соединений с использованием бактерии.

Figure 1
Рисунок 1: Поток-график системного подхода к выявлению активных молекул из растительных экстрактов и фракций. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Коллекция растительного материала

  1. Растительный материал
    1. Запись доступа к растительному материалу на электронных платформах, которые регулируют доступ к генетическому наследию в стране, где будет проходить сбор. Например, в Бразилии зарегистрируйтесь в Национальной системе управления генетическим наследием и связанными с ним традиционными знаниями - SisGen (веб-сайт https://sisgen.gov.br/paginas/login.aspx).
    2. Сбор образцов растительного материала, представляющих интерес (например, листья, стебли, корни, цветы, фрукты). Зарегистрируйтесь, если материал был собран во время репродуктивной или вегетативной фазы.
    3. Запись параметров сбора (дата, геореференционирование, среднегодовая температура и средний процент влажности).
    4. Определите образцы точно, и таксономист должен подтвердить подлинность.
  2. Стабилизация и хранение образцов растений
    1. Отдельные органы растений в отдельных полиэтиленовых пакетах или колбы сразу после сбора.
    2. Инактивировать потенциальные энзиматические реакции путем i) замораживания непосредственно в жидком азоте, (ii) обезвоживания в циркулирующей воздушной печи (40 градусов по Цельсию), или (iii) замораживания сушки образцов путем лиофилизации.
    3. Храните стабилизированный материал в герметично запечатанных мешках при комнатной температуре или в морозильной камере до использования (-20 или -80 градусов по Цельсию, в зависимости от периода хранения или предполагаемого использования).
    4. Измельчить образцы в аналитической мельнице (нож или мяч, в зависимости от типа ткани или наличия) и стандартизировать размер частиц с помощью стандартизированных сито.
    5. Взвешивание образцов индивидуально для последующих этапов извлечения.

2. Подготовка экстрактов сырой нефти (CE) и фракций (CEF) к химическому анализу профиля и биоанализу

  1. Приготовление сырых экстрактов (CE)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги иллюстрируются на диаграмме потока на рисунке 2A.
    1. Подготовь растворитель экстракции с гидроалкогольной смесью (например, этанол (EtOH) 70% или тернарные смеси воды, EtOH и других модификаторов, определенных экспериментальной конструкцией в соответствии с предыдущими отчетами).
    2. Используйте вес образца соотношения (сухой вес, мг)/ растворитель экстракции (мл) в зависимости от 50 до 100 мг на каждый мл растворителя.
    3. Для быстрой и воспроизводимой добычи используйте пакетные извлечения с использованием микротрубок.
      ПРИМЕЧАНИЕ: По крайней мере три репликации должны быть использованы на данный момент, чтобы статистический анализ.
    4. Выполните ультразвуковое экстракции (UAE), чтобы сделать его быстрым, легким и дешевым.
    5. Повторите процедуру три раза (по 15 минут каждый) для лучшей эффективности.
    6. После каждого шага извлечения, декантировать твердых остатков центрифугации и удалить супернатант.
    7. Объедините supernatants индивидуально, фильтр, и сохранить aliquots для одновременного химического анализа и bioassays. При необходимости удалите извлекающий растворитель под вакуумом, потоком азота или лиофилизацией и зарегистрируйте вес и урожайность.
    8. Хранить при -20 градусов по Цельсию, защищенном от света.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приостановить здесь, чтобы экран CE и выбрать те, которые представляют желаемое действие.
  2. Фракция сырых экстрактов (CEF)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги иллюстрируются на диаграмме потока на рисунке 2B.
    1. Используйте картриджи с не менее 1 г адсорбента. Если алкалоиды потенциально присутствуют в СЕ, используйте растворители, содержащие 0,1% форминовой кислоты (ФА).
    2. Разбавить образец в наиболее подходящем растворителя (или растворитель смеси), чтобы получить 100 мг / мл образца раствора. Затем перенесите 1 мл пробного раствора на заранее условные картриджи для извлечения твердой фазы - SPE (1 г адсорбента, 6 мл емкости).
    3. Выполните фракционирование, используя около трех мертвых томов каждого элюента экстракции (к картриджу 1 г, он будет соответствовать 2 мл каждого растворителя). Если алкалоиды потенциально присутствуют в CE, используйте растворители, содержащие 0,1% FA.
    4. Соберите одну фракцию по составу элуента и сохраните алициты для одновременного химического анализа и биоанализа.
    5. Удалите растворитель под вакуумом, потоком азота или лиофилизацией и зарегистрируйте вес и урожайность.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если CE трудно растворить в начальной смеси элюции, разогнать CE в твердой фазе (например, C18 или celite) в 1:1 (w/w) пропорции перед загрузкой материала на верхней части картриджа.
      ВНИМАНИЕ: Взвешивайте микротрубки заранее, чтобы рассчитать урожайность экстрактов и фракций.
  3. Анализ химического профилирования
    ПРИМЕЧАНИЕ: Учитывая, что каждый вид растений требует оптимизированных и конкретных методов его химического анализа, в следующих разделах мы описываем наиболее распространенные аналитические подходы, используемые для анализа растительных материалов. В качестве практического примера была разработана и проверена жидко-хроматография обратной фазы для одновременного анализа фенольных соединений и дитерпенов типа клеродана, дифференцированно биосинтезированных двумя разновидностями Casearia sylvestris Swartz (Salicaceae). Аппарат UPLC-DAD был оснащен дегассером, четвертичных насосов, автоматическим сэмплером, детектором массива ФОТОдиод UV-Vis и духовкой (подробнее см. в Буэно и др. 2015г. 18). Аналогичные подходы, описанные в следующих примерах, могут быть оптимизированы в соответствии с другими видами растений и/или растительными материалами.
    1. Хроматографический анализ и возможности дефисации
      1. Для разъединения с использованием сверхвысокой жидкой хроматографии (UPLC) используйте хроматографическую колонку C18 (например, 150 × 2,1 мм, 2,6 мкм, 100 мк), защищенную совместимой предварительной колонкой.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Другие фазы столбца или хроматографические режимы могут быть использованы в зависимости от видов растений/материалов. Обычный HPLC также может быть использован; в этом случае необходимо выбрать подходящую хроматографическую колонку. Для достижения отличных разделений, отрегулируйте хроматографические условия с учетом скорости потока (йл/мин), температуры столбца (КК) и объема впрыска (ОЛ). Мобильная фаза обычно состоит из воды (A) и ацетонитрила или метанола (B) с использованием линейных или многоступенчатых градиентов элюции или изократического элюции. Модификаторы, такие как буферы, кислоты, базы или другие, также могут быть использованы.
      2. Выполните анализ растительного материала (CE и/или CEF) и зарегистрируйте все связанные с этим данные, такие как спектральные данные (с использованием УФ-vis и/или, преимущественно, детекторов MS), время хранения (мин) и другие, в зависимости от доступной дефиса.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Ликвидная хроматография (LC) обычно дефисируется (в сочетании) с масс-спектрометрией высокого разрешения (HRMS), как LC-HRMS, и обычно используется для быстрой аннотации метаболита в CE ou CEF15.
      3. Если требуются качественные данные и необходимы количественные данные, тщательно подготовьтесь и ввести кривые калибровки, следуя одному и тому же протоколу.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Разработка лучших хроматографических условий может быть выполнена с помощью разработки экспериментов, как описано Буэно и др. 201518, или аналогичной литературы. Важно учитывать включение внутренних стандартов при разработке метода. Они высоко ценятся, поскольку допускают правильные технические отклонения при подготовке и инъекциях выборки, а также дальнейшую нормализацию для анализа данных.
  4. Унивариатный и многовариантный анализ данных
    1. Экспорт зарегистрированных хроматограмм в подходящем формате (например, ASCII, .txt. или .csv формат). Единая матрица данных может быть установлена путем присоединения и выравнивания хроматограмм, если анализируются несколько образцов и требуются сравнения. Полученные матрицы должны быть нормализованы хроматограммы в соответствии с внутренним стандартом используется.
    2. Анализируйте данные метаболомики растений с помощью многовариантных и неориантативных методов. Изучение и визуализация наборов данных метаболомики путем одновременного анализа нескольких переменных с использованием многовариантных статистических методов, включая неконтролируемый анализ основных компонентов (PCA) и иерархический кластерный анализ (HCA), или контролируемый частичный анализ наименее квадратов (например, PLS, OPLS, PLS-DA). Унивариатные методы, такие как ANOVA, Student's, Tukey и Welch's t-test, особенно интересны для точного анализа количественных различий междуобразцами 19.
  5. Аннотация дерепликации и соединений
    ПРИМЕЧАНИЕ: Цель этого шага посвящена быстрой он-лайн идентификации известных NPs, чтобы избежать утомительной изоляции, которая может быть выполнена одновременно с одно- или многовариантным анализом данных.
    1. Выполните идентификационные уровни обнаруженных или целевых соединений:
      1. Выявлено соединение, включая полную 3D-структуру и стереохимию (уровень 0);
      2. Идентификация достигается двумя ортогональными параметрами, такими как время удержания и спектр MS/MS (уровень 1);
      3. Сшативо аннотированные соединения и классы соединений (уровни 2 и 3);
      4. Неопознанные или несекретные метаболиты, которые могут быть дифференцированы на основе аналитических данных(уровень 4) 19,20.
    2. Характеризовать известные соединения с использованием коммерческих или общедоступных баз данных. Среди наиболее важных баз данных, он может быть выделен: NIST (https://www.nist.gov), Wiley (https://www.sisweb.com/software/ms/wiley.htm), MassBank (https://massbank.eu/MassBank/), GMD (http://gmd.mpimp-golm.mpg.de/), METLIN (https://metlin.scripps.edu), и Глобальные природные продукты социальной молекулярной сети - GNPS базы данных (https://gnps.ucsd.edu)19.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Существуют различные уровни аннотации, и они зависят от дефисной техники, используемой в ходе исследования и может включать в себя: помощь MS- (или ЯМР) на основе спектральных баз данных, и в силико спектральных алгоритмов прогнозирования.
    3. Изоляция, очистка и полная идентификация соединений
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если данное соединение (личность которого подозревалась статистическими методами) нуждается в полной структурной идентификации, первым шагом для выполнения этой задачи является изоляция и очистка желаемых соединений в более широком масштабе. Это может быть достигнуто путем расширения уже разработанных протоколов.
      1. Выполните быструю и прямую изоляцию целевого соединения (ы) с помощью препаративных хроматографических методов, хорошо установленных и оптимизированных. Полуподготовительная HPLC с инъекцией сухой нагрузки может быть использована, чтобы избежать компромиссов, которые обычно должны быть сделаны между высокой загрузкой и солубилизациейобразца 1.
      2. Выполните полную структурную характеристику и идентификацию изолированных соединений. Это может быть сделано с помощью сочетания различных методов:
        1. ядерный магнитный резонанс (НМР);
        2. Масс-спектрометрия (МС);
        3. Спектрометрические методы в ультрафиолетовых (УФ) и инфракрасных (ИК) регионах также очень полезны для характеристик функциональных групп;
        4. Использование хироптической спектроскопии, такой как электронный и колебательно-круговой дихроизм (ECD и VCD, соответственно), оптическая активность Рамана (ROA) и рентгеновская кристаллография, являются важными методами абсолютной характеристики конфигурации.

3. Биоассайс

ПРИМЕЧАНИЕ: Биологический скрининг: Чтобы быстро оценить потенциальную биоактивность CE и CEF, первоначальный скрининг природных веществ должен быть организован и прост.

  1. Подготовка CE и CEF к биоанализу
    1. Восстановить сухое вещество с наилучшими растворителями (которые могут быть определены экспериментально). Экспериментальная конструкция21,22 определяет фондовый раствор и концентрацию растворителей.
    2. Рассчитайте концентрацию растворителя биржевого раствора. Для этого используйте формулу: C1 x V1 и C2 x V2, где C1 представляет решение для акций (мг) CE и/или CEF; V1 представляет объем растворителя; C2 является весом CE и/или CEF; V2 — это конечный объем (мл) биржевого раствора.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Например, мы выбрали 84,15% EtOH и 15% диметилсуфсид (DMSO) в качестве растворительной концентрации растворителя. Мы подготовили концентрацию запасов CE до 6 мг/мл и CEF до 1 мг/мл13. Растворитель для разбавления CE и CEF будет зависеть от метода оценки биологической активности. Растворитель, используемый в качестве транспортного средства, не должен вмешиваться в биологическую и токсикологическую деятельность. Как правило, вода, DMSO, EtOH, или aqueous растворителя на основе EtOH используется для solubilize растительных экстрактов илирастительных производных 4,13.
  2. Подготовка испытательных организмов
    1. Реактивировать микробный штамм, например S. mutans UA159 на агаре крови (48 ч, 37 КК, 5% CO 2 ),и культурыего в жидкой среде культуры (например, триптон-дрожжи экстракт бульона "TYE: 2,5% (w/v) триптон с 1,5% (w/v) дрожжевой экстракт", содержащий 1% глюкозы (w/v) (TYEg) для 16 ч, 37 С, 5% CO2.
    2. Выполните 1:20 разбавления начальной культуры микроорганизмов в той же среде культуры (коэффициент разбавления начальной культуры может измениться в соответствии с экспериментальным дизайном).
    3. Инкубировать до тех пор, пока он не достигнет фазы роста в середине журнала.
    4. Подготовка инокулума для биоанализа с определенной популяцией (например, 2x106 единиц колоний на миллилитр - CFU/mL) в TYEg для антимикробных анализов и TYE с 1% сахарозой (w/v) (TYEs) для анализа биопленок.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Условия роста будут зависеть от проверенных микроорганизмов.
  3. Антимикробная активность
    ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги иллюстрируются на рисунке 3.
    1. В 96-хорошо пластины, добавить aliquot (ОЛ) ce и / или CEF фондового раствора (лечения). Объем алицита определяется тестовой концентрацией, которая должна быть выбрана на основе предыдущих исследований. Например, для тестирования CE на концентрации теста 0,5 мг/мл используйте алицит акций на уровне 16,67 л при 6 мг/мл. Для этого расчета используйте формулу: C1 x V1 и C2 x V2, где C1 является концентрацией запасов, V1 — это объем акционерного раствора aliquot, C2 — тестовая концентрация, а V2 — объем пластины 96-й пластины (что соответствует 200 ОЛ). В этом экспериментальном состоянии испытательная концентрация растворителей (транспортных средств) будет 7% EtOH и 1,25% DMSO.
    2. Включите набор элементов управления для каждой пластины: столбец с лечением, без инокулума (пустой контроль за лечением, поможет дифференцировать мутность путем лечения используется сам от роста микробов); колонна с транспортным средством и inoculum (разъедание CE или CEF или 0 мг/мл управления); столбец только со средой культуры (культурный средний контроль) и столбец только с инокулем (контроль роста микробов).
    3. Используя TYEg, отрегулируйте громкость до 100 мл. Далее, инкубировать, например, 24 ч, 37 градусов по Цельсию, 5% CO2 (в зависимости от проверенных микроорганизмов).
    4. Привить 100 МКЛ инокулума микроорганизмов (1x 106 CFU/mL) в пластину 96-колодец.
    5. Анализ роста бактерий в зависимости от мутности путем визуального осмотра скважин (ясно или облачно). Ясно: означает, что нет визуального роста микроорганизмов. Облачно: означает, что есть визуальный рост микроорганизмов.
    6. Измерение абсорбтности (оптической плотности или O.D.) бактериальной культуры в каждой колодец (читатель ELISA с использованием 540 нм). Затем перенесите 100 МЛ культур на микротрубки, содержащие 900 МКЛ солевого раствора (0,89% NaCl), хорошо смешайте вихрем. Далее продолжайте выполнять десятикратное серийное разбавление до желаемого значения.
    7. Прививка алицита желаемого разбавления в конкретных агарных пластинах (в дубликате). Например, 10 МКЛ специфического разбавления на агарных пластинах крови.
    8. Инкубации. Условия могут меняться между микроорганизмами, например, S. mutans: 48 ч, 37 градусов по Цельсию, 5% CO2.
    9. Выполните количество колоний на пластинах для более поздней трансформации в CFU/mL как(ряд колоний x 10 n)/q. В этой формулеn равен абсолютному значению разбавления (0, 1, 2 или 3), а q равен сумме, в мл, трубе, по трубе для каждого разбавления, помытого на агарной пластине. Кроме того, CFU/mL может быть преобразован в значения журнала.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Когда растительные экстракты добавляются в культурную среду, может произойти выпадение частиц из экстрактов. Этот факт может сделать его трудным для интерпретации результатов. То же самое происходит, когда считыватель микропластиц измеряет мутность, как, в некоторых случаях, клетки слипаются на дне микроплюта. Кроме того, в зависимости от используемого экстракта, цвет экстрактов листьев растений может сделать его трудным для количественноймутности 23,24. Альтернативный метод использует красители, которые показывают, являются ли микробные клетки метаболически активными или нет24.
  4. Антибиофильмовая деятельность
    ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги по оценке влияния лечения на формирование биопленки иллюстрируются на рисунке 4.
    1. Формирование и обработка биопленок
      1. Разбавить лечения в среде культуры (TYEs) в 96-хорошо пластины, как описано в шагах протокола антимикробной активности.
      2. Инкубировать тарелку. В примере с S. mutans, инкубация выполняется в течение 24 ч, при 37 градусов по Цельсию и 5% CO2.
      3. После инкубации поместите пластины на орбитальный шейкер (5 мин, 37 градусов по Цельсию, 75 об/мин), чтобы ослабить клетки, не прилипаемые к биопленки. Затем отбросьте культурную среду, содержащую неприлипаемые клетки, и трижды промывьте оставшиеся биопленки 0,89% NaCl, чтобы удалить неприлиптныеклетки.
    2. Количественная оценка биомассы из обработанных биопленок
      ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги иллюстрируются на диаграмме потока на рисунке 4A.
      1. Держите биопленки промывают на пластине и добавить 50 йл 1% кристально фиолетовый aqueous решение для каждой хорошо.
      2. Инкубировать тарелку при комнатной температуре в течение 35 мин.
      3. Вымойте окрашенные колодцы водой Миллиз (три раза), а затем высушите их в течение 60-90 мин.
      4. Elute кристально фиолетовый из окрашенных скважин с 200 йл 99% EtOH путем инкубации пластины в орбитальной шейкер (5 мин, 37 градусов по Цельсию, 75 об / мин).
      5. Перенесите алицит 150 МКл из каждой пластины с элевируемой красителем на другую пластину и количественно оцените биомассу образца (elISA reader 570 nm).
    3. Количественная оценка жизнеспособной микробной популяции (CFU/mL) обработанных биопленок
      ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги иллюстрируются на диаграмме потока на рисунке 4B.
      1. Снимите промытые биопленки с пластины с помощью пипетки и 200 л NaCl 0,89% и перенесите полученную подвеску индивидуально на стерильные микротрубки.
      2. Используйте дополнительные 200 л NaCl 0,89% на колодец и перенесите его в соответствующую трубку, уже содержащую 200 МКЛ начальной биопленки подвески. Выполните этот процесс до достижения полной подвески 1 мл биопленки на оригинальную колодец.
      3. Используйте aliquot из каждой трубки для выполнения десятикратного серийного разбавления.
      4. Прививка алицита желаемого разбавления в конкретных агарных пластинах (в дубликате). Например, 10 МКЛ специфического разбавления на агарных пластинах крови.
      5. Инкубировать агар пластины (например, 48 ч, 37 градусов по Цельсию, 5% CO2), а затем рассчитывать колоний для определения CFU / МЛ, как описано выше.
  5. Фаза проверки биологической активности
    1. Формирование слюнных пелликулов
      1. Используйте гидроксиапатит (HA) бисер (Макро-Prep Керамический гидроксиапатит Тип I 80 мкм) в качестве поверхности для формирования слюннойпленки 25. Поверхность бисера имитирует зубную эмаль.
      2. Взвесь шарики HA (например, 10 мг) в микротрубках и стерилизовать. Затем используйте буфер adsorption (буфер AB: 50 mM KCl, 1 мММКПО 4, 1 мМ CaCl2, 1 мММгКл 2, в dd-H2O, рН 6,5"25, содержащий 0,1 мм фенилметилсульфонил фторид (PMSF) и 0,02% азасид натрия (NaN3) для мытья бисера.
      3. Сбор и подготовка человеческойслюны 26. Необходимо получить одобрение институционального комитета по этике.
      4. Добавьте 500 МКЛ слюны в микротрубки и инкубировать (40 мин, 37 градусов по Цельсию, 24 об/мин).
      5. Затем удалите супернатант слюны и вымойте бисер (три раза с буфером AB, содержащим PMSF и NaN3). SHA бисер (HA шарик со слюной pellicle) в настоящее время готовы к вниз по течению анализы.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Слюна собирается у здоровых добровольцев. После сбора разбавьте слюну (1: 1 v/v) буфером AB и центрифугой (1699 x g, 20 мин, 4 градуса по Цельсию). Стерилизовать путем фильтрации (фильтр полиэтерульфона мембраны с низким связыванием с 0,22 мкм белков)26. Институциональный комитет по этике должен одобрить исследование. В нашем случае Комитет по этике Института одобрил исследование (CAAE: 68161417.0.0000.5416).
    2. Отряд S. mutans после приклеить к пленке слюну и глюканы, обработанные отдельными экстрактами
      1. Культивировать микроорганизмы до середины фазы роста журнала, как описано выше.
      2. Когда культуры достигли желаемого O.D., центрифуга (4000 × г в течение 20 мин), мыть с 0,89% Раствор NaCl и повторно гранулы с 0,89% NaCl, используя тот же первоначальный объем среды культуры.
      3. При использовании стрептококков, таких как S. mutans, sonicate культур с зондом для dechain (30 s, 7 W, три раза). При использовании одноклеточного организма этот шаг можно пропустить.
      4. Проверьте O.D. (540 нм), чтобы настроить концентрацию до 2 х 106 CFU/mL.
    3. Присоединение S. mutans к слюнной пелликуле (sHA) и отслоение придерживающихся клеток
      ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги иллюстрируются на диаграмме потока на рисунке 5.
      1. Получить образцы sHA, как описано выше.
      2. Добавьте алицит (в примере мы добавляем 500 л) выбранных методов лечения (при тестовой концентрации; например, 0,5 мг/мл) или элементы управления в микротрубки, содержащие образцы sHA.
      3. Инкубация образцов sHA с помощью процедур или элементов управления (30 мин, 37 градусов по Цельсию, 24 об/мин); затем, мыть бисер три раза с буфером AB (содержащий PMSF и NaN3).
      4. Добавьте культуру микроорганизмов. В этом примере мы добавляем 500 МКЛ культуры S. mutans (2 x 106 CFU/mL) к каждому микротрубку.
      5. Инкубационный (1 ч, 37 градусов по Цельсию, 24 об/мин), а затем удалить неограниченные клетки, мыть три раза с буфером AB.
      6. Переусердуйте каждый образец с помощью алицита (в примере мы добавляем 1000 МКЛ) буфера AB и sonicate с помощью зонда (30 с, 7 Вт).
      7. Используйте алицит каждой подвески для десятикратного серийного разбавления, чтобы определить количество жизнеспособных колоний, потрогая на конкретных агарных пластинах (48 ч, 37 градусов по Цельсию, 5% CO2). Затем подсчитайте колонии, чтобы определить CFU/mL, как описано выше.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Шаг sonicate выполняется для отсоединеть клетки придерживаются sHA.
    4. Присоединение S. mutans к начальной глюканой матрице(gsHA)и отслоение придерживающихся клеток
      ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги иллюстрируются на диаграмме потока на рисунке 6. Фермент GtfB был очищен от культурного супернатанта Streptococcus milleri KSB8, разработанного для производства GtfB. Очистка проводилась с помощью хроматографического столбца, содержащего гидроксиапатитные бусы с использованием буферов, содержащих два ингибитора протеазы (0,1 мМ ПМФ и 0,02% NaN3)27,28. Затем фермент был проверен на акриламидный гель (SDS-PAGE) и окрашен нитратом серебра. Алициты фермента хранились при -80 градусов по Цельсию до их использования.
      1. Получить образцы sHA, как описано выше. Затем добавьте алицит (в примере, мы добавляем 500 МКЛ) фермента GtfB к каждой трубке и инкубируем в гомогенизаторе (40 мин, 37 градусов по Цельсию, 24 об/мин). Затем, мыть три раза с буфером AB (содержащий PMSF и NaN3).
      2. Добавьте алицит (например, 500 л) субстрата сахарозы (100 ммоль сахарозы), содержащего процедуры (или элементы контроля в тестовой концентрации, например, 0,5 мг/мл) к каждой микротрубки.
      3. Инкубировать образцы в гомогенизаторе (4 ч, 37 градусов по Цельсию, 24 об/мин). Затем выполните три моет с буфером AB (с PMSF и NaN 3 ), чтобы удалитьлеченияи избыток сахарозы не включены в синтезированных глюканов (образцы gsHA).
      4. Добавьте алицит (в примере, мы добавляем 500 МКЛ) Инокулума S. mutans (2 x 106 CFU/mL) к каждой микротрубочки.
      5. Инкубировать в гомогенизатор (1 ч, 37 градусов по Цельсию, 24 об / мин) и мыть три раза с буфером AB (с PMSF и NaN3), чтобы удалить несыхранные клетки.
      6. Переусердуем каждый образец с алицитом (например, 1000 МКЛ) буфера AB (с PMSF и NaN3) иsonicate с зондом, чтобы отделить клетки, придерживаемые gsHA (30 s, 7 W).
      7. Используйте алицит каждой подвески для десятикратного серийного разбавления, чтобы определить количество жизнеспособных колоний, потрогая на конкретных агарных пластинах (48 ч, 37 градусов по Цельсию, 5% CO2). Затем подсчитайте колонии, чтобы определить CFU/mL, как описано выше.

4. Анализ биологических данных

  1. Данные о биоанализе
    1. Ввод необработанных данных для биоанализа в электронной таблице. Рассчитайте журнал ингибирования роста микробов при каждом лечении как (ACFU/mL процедур No 1) x журнал10. Затем рассчитайте процент регистрации ингибирования роста микробов, по сравнению с управлением транспортным средством с использованием(журнал10 CFU/mLлечения/средний журнал 10 CFU/mL управления транспортным средством)x 100%.
    2. Правильное О.Д. планктонных культур и биомассы, обработанных лечебными процедурами (группы, обработанные CE и CEF) и контролем за транспортным средством (отрицательный контроль). Для коррекции вычесть абсорбции обработанных скважин из того, что получено в скважинах, содержащих только культуру среды (Ablank) как(обработанные группы средних /отрицательный контрольсреды ) х 100%.
    3. После этой коррекции, рассчитать процент ингибирования биомассы, по сравнению с управлением транспортным средством, как(обработанная биомасса/ среднее управление транспортнымсредством) х 100%.
    4. Отправка необработанных данных, полученных для статистического анализа данных с использованием конкретного программного обеспечения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Интерпретация эффективности данного лечения определяется с помощью брейк-пойнтов, таких как IC50/IC90. Эти значения определяются как минимальная концентрация лечения, способного ингибировать 50% и 90%, соответственно, роста бактерий или формированиябиопленки 24. Эти параметры могут помочь интерпретировать данные и обеспечить основу для выбора соединений с лучшейактивностью 13,29.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Мы предоставляем пример использования систематического подхода для проверки биологической активности растительных экстрактов и фракций для выявления потенциально активных молекул для возможных новых анти-кари терапии: противомикробные и антибиопленные деятельности Экстракты Casearia sylvestris из различных бразильских биомов против стрептококков мутанов и Candida albicans13.

Фон
Сложные взаимодействия между специфическими пероральными микроорганизмами-принимающими факторами-диетой, богатыми сахарозой и крахмалом, могут модулировать образование патогенных биопленок и инициироватькариогенный процесс 30,31. S. mutans организует патогенность биопленок, связанных с развитием кариеса зубов, потому что он производит Gtfs отвечает за синтез экзополисахаридов, помимо его кислотности и кислотности31. Кроме того, Gtfs позволяет адгезии Candida albicans (и других микроорганизмов), увеличивая вирулентностьбиопленки 32,33. Мы провели скрининг антимикробной и антибиопленной деятельности экстрактов листьев C. sylvestris и фракций из различных бразильских биомов, принадлежащих к сортам лингва и сильвестриса против S. mutans и C. albicans13. C. sylvestris («гуасатонга») является частью популярного и традиционного использования в Бразилии и других странах южнойАмерики и Азии 34,35. Это растение цитируется в "Национальный список лекарственных растений, представляющих интерес для SUS" (RENISUS), который содержит 71 видов, которые могли бы лечить заболевания с высокой заболеваемостьюв Бразилии 36. Химический профиль экстрактов листьев var. sylvestris представляет богатый фитохимический состав, с обильными дитерпенами35, в то время как фенольные соединения (в основном флавоноиды) преобладают в var. lingua18.

Мы используем подход, описанный в протоколе, чтобы определить, какие экстракты и фракции C. sylvetris являются наиболее активными для оцениваемых микроорганизмов, и, основываясь на результатах с использованием упрощенных моделей, мы выбираем, какие методы лечения будут протестированы в пробирке сложных моделей (гидроксиапатит диски,микрокосмы) 37,38. Здесь мы представляем результаты скрининга двенадцати н.э. против S. mutans. Основное внимание уделяется демонстрации полезности этого подхода для скрининга природных соединений вместо интерпретации и обсуждения данных.

Мы собрали листья особей из двух разновидностей C. sylvestris из двенадцати различных популяций в Бразилии, включающих различные образования бразильских биомов (пожалуйста, см. подробности в Ribeiro et al. 201913). Коллекция была проведена в период с июня по сентябрь 2012 и 2013 (SisGen; Зарегистрируйте #A00892A). Мы рекомендуем собирать репрезентативные образцы, в том числе лиц различных химиотипов и из различных биомов, для решения химической изменчивости вторичных метаболитов. При наличии, по крайней мере от 3 до 5 человек должны быть собраны. Предыдущая информация о инфраспецифической химической изменчивости растений также должна быть рассмотрена, как описано Ribeiro et al. 2019 и Bueno et al. 201513,18. Химический состав СЕ был исследован хроматографическим цитируется в шаге 2, и мы предоставляем химический профиль на рисунке 7. Анализ химического профиля имеет важное значение для интеграции интерпретации данных, полученных в ходе биологического скрининга.

CEs были дробированы в Hex, AcOEt, и MeOH фракций. Фракционирование СЕ позволяет упрощению смеси увеличить концентрацию потенциально активных соединений и уменьшить возможности синергизма и антагонизма между соединениями. Кроме того, в более простых смесях (фракциях) легче получить спектральные данные соединений, чем в CE, и выполнить анализ дереплиции2. Как правило, фракциотация может быть выполнена путем экстракции жидкости жидкости или картриджей для извлечения твердой фазы (SPE), содержащих преимущественно обратный фазный адсорбент, такой как C18 (40 мкм, 100 евро). Другие адсорбенты или смеси адсорбентов могут быть выбраны, в зависимости от целей исследования или химического характера желаемых соединений. Если выбранной техникой является SPE, картриджи должны быть предварительно активированы с чистым органическим растворителем (например, EtOH) и обусловлены первоначальным элюентом. Доступны стандартизированные протоколы. Таким образом, читатель может проконсультироваться и адаптировать их в соответствии с намеченной исследования и растительного материала, представляющих интерес.

Двенадцать CE были solubilized с 84,15% EtOH и 15% DMSO для достижения 6 мг / мл (решение запасов). Перед скрининг-тестами мы проверили разбомбовую концентрацию (транспортное средство), которая не мешает росту микробов. Этот шаг имеет важное значение, поскольку он предотвращает противомикробные и антибиопленные действия растворителей от влияния на результаты при тестировании лечения. Испытания могут быть выполнены на пластине 96-колодец путем лечения культуры микроорганизмов, представляющих интерес с различными концентрациями растворителей (связанных и / или изолированных). Таким образом, мы начали наш скрининг с CE на 0,5 мг/мл и транспортного средства в концентрации 7% EtOH и 1,25% DMSO.

Для скрининга противомикробной и антибиопленной активности, 96-хорошо пластины были обработаны, как описано выше. Для этого был добавлен объем 16,67 мл стокового раствора CE (6 мг/мл) для тестирования каждого CE при концентрации 0,5 мг/мл. Сформированные биопленки были обработаны, как описано в шаге 3. Экстракты, эффективные против S. mutans (IC50 или 3 журнала), были использованы для оценки «силы адгезии» этой бактерии к слюнной пелликуле и начальной глюканой матрице, как описано в шаге 3.

Необработанные данные, полученные в результате биологических анализов, были организованы в Excel (как описано в шаге 4) и проанализированы с соответствующей статистическойобработкой 13. Точкой отсечения для определения экстрактов с лучшей активностью было ингибирование IC50 (3 журнала). Из этого параметра четыре выдержки показали благоприятный ответ(рисунок 8). Хроматографические данные этих четырех экстрактов показывают одновременное наличие дитерпенов типа клеродана и гликозилированных флавоноидов. Кроме того, они включают в себя тот же биом (Атлантический лес) и разнообразие( sylvestris). Чтобы помочь интерпретировать биологические данные, мы сравнили хроматографический профиль четырех экстрактов с лучшей активностью с другими экранированными экстрактами. По сравнению с другими, экстракты с лучшей активностью имеют большее количество дитерпенов клероданового типа и, одновременно, гликозилированные флавоноиды. Это наблюдение показывает, что вполне вероятно, что эффективность этих экстрактов связано с синергетическим взаимодействием между двумя вторичными метаболитами, тем самым увеличивая их биологическую активность. То есть, комбинированный эффект дитерпенов клероданского типа и гликозилированных флавоноидов больше, чем сумма их отдельных эффектов13.

Чтобы подтвердить данные, полученные в результате скрининга, мы оценили отслоение S. mutans после присадения к слюнной пелликуле и глюканам, обработанным выбранным CE. В анализах используются биопленопленоные модели одно вида in vitro для лучшей оценки биологической активности отобранных сырых экстрактов и определения возможных целей действий. Первый анализ проверяет, способны ли используемые методы лечения препятствовать присоединению S. mutans к слюнной пелликуле, но главным образом, могут ли клетки микроорганизма, которые придерживались обработанного пелликула, быть удалены с поверхности более легко механическим стимулом, тем самым прерывая первую стадию формирования биопленки. Добавление CE (с лучшей активностью) во время синтеза глюканов не изменять слюнные pellicle, потому что не CE значительно повлияло на удаление клеток, придерживающихся слюнного пелликула (Рисунок 9A).

Приклеение начальной глюканой матрицы(gsHA)исследует, может ли лечение ингибировать приклеить S. mutans к исходной глюканой матрице. Тем не менее, эта методология проверяет, если клетки микроорганизмов, которые придерживались обработанных глюканов могут быть удалены механическим стимулом легче поверхности, тем самым прерывая этап формирования биопленки. Три CE повлияли на качество глюканов, образованных GtfB и, следовательно, ослабили приклеить S. mutans к первоначальной глюканой матрице (большинство клеток S. mutans были удалены после адгезии для глюканов; Рисунок 9B). Мы считаем, что такое поведение связано с синергизмом между вторичными метаболитами13.

Систематический подход помог нам выявить и отобрать активные экстракты сырой нефти, чтобы остановить образование кариогенных биопленок. После выбора и на основе хроматографического профиля, у нас есть основа для выяснения молекулярных механизмов действия в сложных моделях.

Figure 2
Рисунок 2: Поток-график добычи и фракции растительного материала. На иллюстрации показана экспериментальная конструкция для подготовки сырых экстрактов(A)и фракционирование сырых экстрактов(B). ОАЭ: ультразвуковая вспомогательная экстракция; SPE: Твердая фаза извлечения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3: Экспериментальный дизайн для оценки антимикробной активности в 96-колодец пластин. На иллюстрации изображены процедуры (сырые экстракты или фракции) и элементы управления. Для скрининга нескольких методов лечения используйте одну концентрацию (мг/мл) в каждом хорошо. CFU/mL: единицы формирования колонии на миллилитр. О.Д.: оптическая плотность. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 4
Рисунок 4: Экспериментальный дизайн для антибиопленного анализа в 96-хорошо пластин. На иллюстрации показаны процедуры (сырые экстракты и фракции) и элементы управления. Для скрининга различных методов лечения, используйте одну концентрацию (мг/мл) в каждом хорошо. В A,шаги по количественной оценке биомассы обработанных биопленок иллюстрируются. В B, показаны шаги по определению популяции (CFU/mL) обработанных биопленок. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 5
Рисунок 5: Экспериментальный дизайн для оценки прилипание к слюнной пелликулы, а затем отряд придерживающихся клеток. На иллюстрации показаны шаги, которые необходимо вы выполнили. Лечение: отобрано на основе биологического скрининга. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 6
Рисунок 6: Экспериментальная конструкция для оценки прилипание к начальной глюканой матрице(gsHA), а затем отряд придерживающихся клеток. На иллюстрации показаны шаги, которые необходимо вы выполнили. Лечение: отобрано на основе биологического скрининга. Субстрат сахарозы: 100 ммоль сахарозы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 7
Рисунок 7: Количество дитерпенов клероданского типа и гликозилированных флавоноидов в экстрактах C. sylvestris из бразильских биомов. Буквы S, I и L указывают на сорта sylvestris, промежуточные, и лингва, соответственно. Личное общение д-ра Паулы Каролины Пирес Буэно. Эта цифра была изменена из Рибейро и др.13. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 8
Рисунок 8: Антимикробная и антибиопленная активность сырых экстрактов C. sylvestris из бразильских биомов против S. mutans.  A. % CFU (журнал10) обработанных планктонных клеток; B. % биомасса обработанных биопленок. C. % CFU (журнал10) обработанной биопленки. Описанные данные являются средними (следами) и межквартилями (коробки). Бары ошибок представляют максимальные и минимальные значения. Звездочки обозначают статистически значимую разницу конкретного экстракта по сравнению с управлением транспортным средством (V), где:p ≤ 0.0001; р ≤ 0.001; р-≤ 0,01; иp ≤ 0,05 (тест Крускаль-Уоллис, а затем тест Данна на множественные сравнения). Каждый вид контроля роста (без лечения) представлен как Sm для S. mutans. Цвета баров на каждом графике представляют разнообразие, к которому относятся экстракты, будучи, в темно-сером цвете: var. sylvestris; светло-серый: var. промежуточный и белый: var. lingua. Эта цифра была изменена из Рибейро и др.13. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 9
Рисунок 9: S. mutans отряд после присадения к обработанной слюнной пелликулы и начальной матрицы глюканов. После выпуска данные S. mutans к обработанной слюнной пелликуле и глюканам показаны в (A) и (B), соответственно. Не было никакой разницы между машиной управления (V) и выдержками, проверенными для обоих анализов. Процент CFU/mL был получен с учетом управления транспортным средством (V) как 100%. Описанные данные являются средними (следами) и межквартилями (коробки). Бары ошибок представляют максимальные и минимальные значения. Звездочки обозначают статистически значимую разницу в конкретном экстракте по сравнению с управлением транспортным средством (V), где тест «Крускаль-Уоллис», за которым следует многократный сравнительный тест Данна. Контроль роста представлен Sm для S. mutans. Цвета баров графика представляют разнообразие, к которому принадлежат экстракты, будучи цветом темно-серого до var. sylvestris. Эта цифра была изменена из Рибейро и др.13. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Основными проблемами, связанными с работой с натуральными экстрактами сырой нефти, являются их сложный состав и недостатки классических исследований биоуместной изоляции. Хотя этот процесс идет медленно, он эффективен и привел к крупным выводам в исследованиях NP. Для рационализации необходимы исследования, ориентированные на приоритеты, для рационализации. Таким образом, использование современных подходов к химическому профилированию для анализа СЕ и дереплиции перед изоляцией важно охарактеризовать изученный материал и особенно полезно, чтобы избежать повторной изоляции известных соединений с уже описаннойбиологической активностью 2,15. Кроме того, приобретение многомерных данных необходимо для проведения дальнейшего многовариантного анализа данных, чтобы найти потенциальных кандидатов, ответственных за наблюдаемую биологическую деятельность. Следовательно, исследователь может сосредоточиться на изоляции (в большом масштабе) этих потенциальных кандидатов.

Здесь мы представляем систематический подход к биоассай-управляемой идентификации (in vitro) активных соединений из растительных экстрактов и фракций. Этот протокол позволяет использовать многоцелевой метод скрининга и анализа, с тем чтобы одновременно можно было проверять и анализировать несколько активных компонентов. Биоассаи в небольших масштабах и с высокой урожайностью, являются быстрыми, экономически эффективными, легко размножаются и потребляют меньше реагентов, чем традиционные методы (например, первоначальная изоляция соединений, представляющих интерес)39. Для любого исследования натуральных продуктов, это имеет первостепенное значение аналитических инструментов (например, HPLC-UV, HPLC-DAD, LC-MS). В последнее время этот подход в большей степени ориентирован на структуру (на основе химии) с использованием, в большей степени, возможности аналитических и разъясненных платформ (LC-HRMS и HRMS/MS, высокопробных НМР) и стратегий де репликации, которые заключаются в быстрой идентификации уже известных молекул. Этот шаг помогает понять химическую связь профиля с биологической реакцией, что приводит к более целенаправленной изоляции активных метаболитовкандидата 3. Существует несколько устоявшихся методов хроматографического анализа. Для неизвестных NPs, иногда может быть необходимо выполнить пилотов, чтобы найти наилучший метод. Например, мы используем аналитический метод хроматографии, проверенный для одновременного анализа вторичных метаболитов, производимых двумя разновидностями C. sylvestris13,18. При выборе метода хроматографии мы предлагаем рассмотреть протокол, основанный на целевом соединении (ы), а также преимущества и недостатки всех доступных методов, в частности, с упором на их эффективность и, конечно же, общуюстоимость 40.

Хотя систематический подход оказался полезным для быстрого отбора и анализа биологически активных кандидатов в НС, по-прежнему существуют важные ограничения. Например, визуальные и O.D. показания биомассы и планктонных культур могут воспроизводить ложноположимыерезультаты13,23,24. Определение мутности культур с помощью микроплюса читатель может потерпеть неудачу при использовании для природныхсоединений 23,24. Эти сбои происходят потому, что i) в некоторых испытательных организмах клетки группируются на дне колодец, а в других организмах клетки остаются в суспензии; ii) твердые частицы, присутствующие в ЦВ, осаждаются и вызывают мутность вскважинах 23,24. РН NPs является фактором, который также должен быть рассмотрен. РН раствора лечения связан с химическим составом вторичных метаболитов и, следовательно, влияет на биологическую реакцию. Хотя рН не является ограничением, его следует оценивать с осторожностью, в зависимости от цели исследования. Например, в моделях биопленок на поверхностях зубной эмали кислотность может вызвать нежелательную деминерализации эмали. В этих случаях необходимо регулировать рН с помощью подходящих буферов. Поэтому необходимо провести испытания для проверки того, повлияла ли корректировка рН на наблюдаемую ранее биологическую реакцию.

Классические тесты для оценки активности новых соединений включают определение минимальной ингибирующей концентрации (MIC) и минимальной бактерицидной или фунгицидной концентрации (MBC или MFC)29,41. Однако, когда цель состоит в том, чтобы экран многих растительных экстрактов и фракций, техника становится исчерпывающим. Биоэкранирование может быть выполнено с одной концентрацией нескольких процедур (например, растительных экстрактов изразных мест) 13,42,29. В таких ситуациях систематический подход является методом с высокой производительностью, который возвращает последовательные результаты за меньшее время работы. Процедуры, отобранные в биологическом скрининге, могут быть оценены с использованием усовершенствованные модели (клинически значимые, жизнеспособные и воспроизводимые) для подтверждения биологической активности. Для контроля кариогенной биопленки лабораторные исследования должны быть сосредоточены главным образом на биопленки, образоваваемые на гидроксиапатите (заменителе зубной эмали) или эмали поверхностей, помещенных в вертикальное положение, покрытое слюннымпелликулом 37. Это также позволяет скрининга образцов растений различных сортов и биомов в воспроизводимых и быстрым способом. Включение этих двух переменных (биом и разнообразие) имеет жизненно важное значение, поскольку они влияют на изменчивость химического состававторичных метаболитов 18 и модулируют биологическую реакцию. Этот систематический подход может быть адаптирован/модифицирован для применения за пределами устных исследований биопленки. Например, он может быть особенно полезен для других областей, связанных с биопленкой, с использованием других видов, представляющих интерес.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Конфликтов интересов не объявлено.

Acknowledgments

Мы выражаем нашу благодарность Нуклео де Биоэнсайос, Биоссюнте e Ecofisiologia de Produtos Naturais (NuBBE) Из Института химии UNESP, Araraquara/SP за предоставление лабораторий для подготовки растительного материала. Мы также благодарим Лабораторию прикладной микробиологии Департамента стоматологических материалов и протезов, UNESP, Araraquara/SP. Это исследование было поддержано научно-исследовательский грант от Сан-Паулу научно-исследовательский фонд (FAPESP #2013/07600-3 для AJC) и стипендии плюс накладные средства (FAPESP #2017/07408-6 и FAPESP #2019/23175-7 для СМР; #2011/21440-3 и #2012/21921-4 к PCPB). Национальный совет по научно-техническому развитию в сотрудничестве с ФАПЕСП оказал дополнительную поддержку (INCT CNPq #465637/2014-0 и FAPESP #2014/50926-0 к AJC).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well microplates  Kasvi Flat bottom
Activated carbon LABSYNTH Clean up and/or fractionation step
Analytical mill Ika LabortechniK Model A11 Basic
Blood agar plates Laborclin
Chromatographic column C18 Phenomenex Kinetex 150 × 2.1 mm, 2.6 µm, 100Â
Dimethyl sulfoxide  Sigma-Aldrich Vehicle solution
ELISA plate reader Biochrom Ez
Ethanol J. T. Baker For extraction and fractionation steps, and mobile phase composition
Ethanol Sigma-Aldrich Vehicle solution
Ethyl acetate J. T. Baker Fractionation step
GraphPad Software La Jolla GraphPad Prism7
Hexane J. T. Baker Fractionation step
Incubator Thermo Scientific
Isopropanol J. T. Baker For extraction step
Lyophilizer (a freeze dryer) Savant Modulyo
Nylon Millipore LAC 0.22 µm x 13 mm
Orbital shaker Quimis Model G816 M20
Polyamide solid phase extraction cartridge Macherey-Nagel Clean up and/or fractionation step
Silica gel Merck 40–63 μm, 60 Â
Sodium Chloride (NaCl) Synth 0,89% in water
Solid phase extraction cartridges (SPE) Macherey-Nagel Clean up and/or fractionation step
Tryptone Difco
UHPLC-DAD Dionex Ultimate 3000 RS
Ultrasonic bath UNIQUE Model USC 2800
Yeast extract Difco

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Newman, D. J., Cragg, G. M. Natural Products as Sources of New Drugs over the Nearly Four Decades from 01/1981 to 09/2019. Journal of Natural Products. 83 (3), 770-803 (2020).
  2. Wolfender, J. L., Litaudon, M., Touboul, D., Queiroz, E. F. Innovative omics-based approaches for prioritisation and targeted isolation of natural products – new strategies for drug discovery. Natural Product Report. 36 (6), 855-868 (2019).
  3. Michel, T., Halabalaki, M., Skaltsounis, A. New Concepts, Experimental Approaches, and Dereplication Strategies for the Discovery of Novel Phytoestrogens from Natural Sources. Planta Medica. 79 (7), 514-532 (2013).
  4. Jeon, J. G., Rosalen, P. L., Falsetta, M. L., Koo, H. Natural products in caries research: current (limited) knowledge, challenges and future perspective. Caries Research. 45 (3), 243-263 (2011).
  5. Tonetti, M. S., Jepsen, S., Jin, L., Otomo-Corgel, J. Impact of the global burden of periodontal diseases on health, nutrition and wellbeing of mankind: A call for global action. Journal of Clinical Periodontology. 44 (5), 456-462 (2017).
  6. Peres, M. A., et al. Oral diseases: a global public health challenge. Lancet. 394 (10194), 249-260 (2019).
  7. Bowen, W. H., Burne, R. A., Wu, H., Koo, H. Oral biofilms: pathogens, matrix, and polymicrobial interactions in microenvironments. Trends Microbiology. 26 (3), 229-242 (2018).
  8. Paes Leme, A. F., Koo, H., Bellato, C. M., Bedi, G., Cury, J. A. The role of sucrose in cariogenic dental biofilm formation--new insight. Journal of Dental Research. 85 (10), 878-887 (2006).
  9. Koo, H., Falsetta, M. L., Klein, M. I. The exopolysaccharide matrix: a virulence determinant of cariogenic biofilm. Journal of Dental Research. 92 (12), 1065-1073 (2013).
  10. Cury, J. A., de Oliveira, B. H., dos Santos, A. P., Tenuta, L. M. Are dental fluoride releasing materials clinically effective on caries control. Dental Materials. 32 (3), 323-333 (2016).
  11. Mattos-Graner, R. O., Klein, M. I., Smith, D. J. Lessons Learned from Clinical Studies: Roles of Mutans Streptococci in the Pathogenesis of Dental Caries. Current Oral Health Reports. 1, 70-78 (2014).
  12. Rocha, G. R., Florez Salamanca, E. J., de Barros, A. L., Lobo, C. I. V., Klein, M. I. Effect of tt-farnesol and myricetin on in vitro biofilm formed by Streptococcus mutans and Candida albicans. BMC Complementary and Alternative Medicine. 18 (1), 61 (2018).
  13. Ribeiro, S. M., et al. Antimicrobial and antibiofilm activities of Casearia sylvestris extracts from distinct Brazilian Biomes against Streptococcus mutans and Candida albicans. BMC Complementary and Alternative Medicine. 19 (1), 308 (2019).
  14. Pilon, A. C., et al. Metabolômica de plantas: métodos e desafios. Quimica Nova. 43 (3), 329-354 (2020).
  15. Wolfender, J. L., Nuzillard, J. M., Hooft, J. J. J., Renault, J. H., Bertrand, S. Accelerating Metabolite Identification in Natural Product Research: Toward an Ideal Combination of Liquid Chromatography-High-Resolution Tandem Mass Spectrometry and NMR Profiling, in Silico Databases, and Chemometrics. Analytical Chemistry. 91 (1), 704-742 (2019).
  16. Allard, P. M., et al. Pharmacognosy in the digital era: shifting to contextualized metabolomics. Current opinion in biotechnology. 54, 57-64 (2018).
  17. Hubert, J., Nuzillard, J., Renault, J. Dereplication strategies in natural product research: How many tools and methodologies behind the same concept. Phytochemistry Reviews. 16, 55-95 (2017).
  18. Bueno, P. C. P., Pereira, F. M. V., Torres, R. B., Cavalheiro, A. J. Development of a comprehensive method for analysing clerodane-type diterpenes and phenolic compounds from Casearia sylvestris Swartz (Salicaceae) based on ultra-high performance liquid chromatography combined with chemometric tools. Journal of separation science. 38 (10), 1649-1656 (2015).
  19. Bueno, P. C. P., Lopes, N. P. Metabolomics to Characterize Adaptive and Signaling Responses in Legume Crops under Abiotic Stresses. American Chemical Society omega. 5 (4), 1752-1763 (2020).
  20. Blaženović, I., Kind, T., Ji, J., Fiehn, O. Software tools and approaches for compound identification of LC-MS/MS data in metabolomics. Metabolites. 8 (2), 31 (2018).
  21. Eloff, J. N. Quantifying the bioactivity of plant extracts during screening and bioassay-guided fractionation. Phytomedicine: International Journal Of Phytotherapy And Phytopharmacology. 11 (4), 370-371 (2004).
  22. Rios, J. L., Recio, M. C. Medicinal plants and antimicrobial activity. Journal of Ethnopharmacology. 100 (1-2), 80-84 (2005).
  23. Eloff, J. N. A sensitive and quick microplate method to determine the minimal inhibitory concentration of plant extracts for bacteria. Planta Medica. 64, 711-714 (1998).
  24. Eloff, J. N. Avoiding pitfalls in determining antimicrobial activity of plant extracts and publishing the results. BMC Complementary and Alternative Medicine. 19 (1), 106 (2019).
  25. Klein, M. I., Xiao, J., Heydorn, A., Koo, H. An analytical tool-box for comprehensive biochemical, structural and transcriptome evaluation of oral biofilms mediated by mutans streptococci. Journal of Visualized Experiments. (47), e2512 (2011).
  26. Lemos, J. A., Abranches, J., Koo, H., Marquis, R. E., Burne, R. A. Protocols to study the physiology of oral biofilms. Methods in molecular biology. 666, 87-102 (2010).
  27. Venkitaraman, A. R., Vacca-Smith, A. M., Kopec, L. K., Bowen, W. H. Characterization of glucosyltransferase B, GtfC, and GtfD in solution and on the surface of hydroxyapatite. Journal of Dental Research. 74, 1695-1701 (1995).
  28. Vacca-Smith, A. M., Venkitaraman, A. R., Quivey, R. G. Jr, Bowen, W. H. Interactions of streptococcal glucosyltransferases with alpha-amylase and starch on the surface of saliva-coated hydroxyapatite. Archives of Oral Biology. 41, 291-298 (1996).
  29. Van Dijck, P., et al. Methodologies for in vitro and in vivo evaluation of efficacy of antifungal and antibiofilm agents and surface coatings against fungal biofilms. Microbial Cell. 5 (7), 300-326 (2018).
  30. Marsh, P. D. Are dental diseases examples of ecological catastrophes. Microbiology. 149 (2), 279-294 (2003).
  31. Bowen, W. H., Koo, H. Biology of Streptococcus mutans-derived glucosyltransferases: role in extracellular matrix formation of cariogenic biofilms. Caries Research. 45 (1), 69-86 (2011).
  32. Lobo, C. I. V., et al. Dual-species biofilms of Streptococcus mutans and Candida albicans exhibit more biomass and are mutually beneficial compared with single-species biofilms. Journal of Oral Microbioly. 11 (1), 1581520 (2019).
  33. Kim, D., et al. Candida albicans stimulates Streptococcus mutans microcolony development via crosskingdom biofilm-derived metabolites. Scientific reports. 7, 41332 (2017).
  34. Ferreira, P. M. Folk uses and pharmacological properties of Casearia sylvestris: a medicinal review. Anais da Academia Brasileira de Ciencias. 83 (4), 1373-1384 (2011).
  35. Xia, L., Guo, Q., Tu, P., Chai, X. The genus Casearia: a phytochemical and pharmacological overview. Phytochemistry Reviews. 14, 99-135 (2015).
  36. Ferreira, P. M. P., et al. Toxicological findings about an anticancer fraction with casearins described by traditional and alternative techniques as support to the Brazilian Unified Health System (SUS). Journal of Ethnopharmacol. 15, 241 (2019).
  37. Koo, H., Xiao, J., Klein, M. I., Jeon, J. G. Exopolysaccharides produced by Streptococcus mutans glucosyltransferases modulate the establishment of microcolonies within multispecies biofilms. Journal of Bacteriology. 192 (12), 3024-3032 (2010).
  38. Maske, T. T., van de Sande, F. H., Arthur, R. A., Huysmans, M. -C. D. N. J. M., Cenci, M. S. In vitro biofilm models to study dental caries: a systematic review. Biofouling. 33 (8), 661-675 (2017).
  39. Fu, Y., Luo, J., Qin, J., Yang, M. Screening techniques for the identification of bioactive compounds in natural products. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 168, 189-200 (2019).
  40. Sarker, S. D., Nahar, L. An introduction to natural products isolation. Methods in molecular biology. 864, 1-25 (2012).
  41. Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI). Performance standards for antimicrobial susceptibility testing; twenty-fifth informational supplement. Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI). , Wayne, PA. CLSI document M100-S25 (2015).
  42. Saputo, S., Faustoferri, R. C., Quivey, R. G. Jr A drug repositioning approach reveals that Streptococcus mutans is susceptible to a diverse range of established antimicrobials and nonantibiotics. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 62 (1), 01674 (2018).

Tags

Биология выпуск 169 Микробиология биопленка натуральные продукты мутан стрептококки противомикробные препараты кариес зубов открытие лекарств биологические подходы
Систематический подход к выявлению новых противомикробных и антибиопленных молекул из экстрактов растений и фракций для предотвращения кариеса зубов
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ribeiro, S. M., Fratucelli, É. D.… More

Ribeiro, S. M., Fratucelli, É. D. O., Fernandes, J. M., Bueno, P. C. P., Cavalheiro, A. J., Klein, M. I. Systematic Approach to Identify Novel Antimicrobial and Antibiofilm Molecules from Plants' Extracts and Fractions to Prevent Dental Caries. J. Vis. Exp. (169), e61773, doi:10.3791/61773 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter