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Biology

Approccio sistematico per identificare nuove molecole antimicrobiche e antibiofilm dagli estratti e dalle frazioni delle piante per prevenire la carie dentale

Published: March 31, 2021 doi: 10.3791/61773
Automatic Translation
*1, *1, *2, 2,3, 2, 1
1Department of Dental Materials and Prosthodontics, School of Dentistry, São Paulo State University (UNESP), 2Department of Organic Chemistry, Institute of Chemistry, São Paulo State University (UNESP), 3Faculty of Pharmaceutical Sciences of Ribeiraão Preto (FCFRP-USP), Department of Physics and Chemistry, University of São Paulo
* These authors contributed equally

Summary

I prodotti naturali rappresentano punti di partenza promettenti per lo sviluppo di nuovi farmaci e agenti terapeutici. Tuttavia, a causa dell'elevata diversità chimica, trovare nuovi composti terapeutici dalle piante è un compito impegnativo e dispendioso in termini di tempo. Descriviamo un approccio semplificato per identificare molecole antimicrobiche e antibiofilm da estratti e frazioni vegetali.

Abstract

I prodotti naturali forniscono sostanze strutturalmente diverse, con una miriade di attività biologiche. Tuttavia, l'identificazione e l'isolamento dei composti attivi dalle piante sono impegnativi a causa della complessa matrice vegetale e delle lunghe procedure di isolamento e identificazione. Pertanto, viene presentato un approccio graduale per lo screening dei composti naturali dalle piante, incluso l'isolamento e l'identificazione di molecole potenzialmente attive. Comprende la raccolta del materiale vegetale; preparazione e frazionamento di estratti grezzi; approcci cromatografici e spettrometrici (UHPLC-DAD-HRMS e NMR) per l'analisi e l'identificazione dei composti; test biometrici (attività antimicrobiche e antibiofilm; "forza di adesione" batterica al pellicolo salivare e matrice di glucano iniziale trattata con trattamenti selezionati); analisi dei dati. Il modello è semplice, riproducibile e consente lo screening ad alta produttività di più composti, concentrazioni e fasi di trattamento che possono essere controllati in modo coerente. I dati ottenuti forniscono le basi per studi futuri, tra cui formulazioni con gli estratti e/o frazioni più attivi, isolamento delle molecole, modellazione di molecole a target specifici in cellule microbiche e biofilm. Ad esempio, un obiettivo per controllare il biofilm cariogenico è quello di inibire l'attività dello Streptococcus mutans glucosyltransferasi che sintetizzano i glucani della matrice extracellulare. L'inibizione di questi enzimi impedisce l'accumulo di biofilm, diminuendone la virulenza.

Introduction

I primi modelli di medicina utilizzati nelle società erano basati su prodotti naturali (NP). Da allora, gli esseri umani sono alla ricerca di nuove sostanze chimiche in natura che possono essere trasformate infarmaci 1. Questa ricerca ha causato un miglioramento continuo delle tecnologie e dei metodi per lo screening etnobotanico1,2,3. I PNP offrono una ricca fonte di sostanze strutturalmente diverse, con una vasta gamma di attività biologiche utili per lo sviluppo di terapie alternative o adiuvanti. Tuttavia, la matrice vegetale complessa intrinseca rende l'isolamento e l'identificazione dei composti attivi un compito impegnativo e dispendioso in termini di tempo4.

I farmaci o le formulazioni a base di PNP possono essere utilizzati per prevenire e/o trattare diverse condizioni che influenzano l'orale, compresa la carie dentale4. La carie dentale, una delle malattie croniche più diffuse a livello globale, deriva dall'interazione della dieta ricca di zucchero e dei biofilm microbici (placca dentale) formatisi sulla superficie dentale che porta alla demineralizzazione causata da acidi organici derivati dal metabolismo microbico e, se non trattati, porta alla perditadei denti 5,6. Sebbene altri microrganismi possano essere associati a7, Lo Streptococcus mutans è un batterio cariogenico critico perché acidogeno, acidurico e un generatore di matrici extracellulari. Questa specie codifica per esoenzimi multipli (ad esempio glicosiltransferasi o Gtfs) che usano il saccarosio come substrato8 per costruire la matrice extracellulare ricca di esopolisaccaridi, che sono un determinante della virulenza9. Inoltre, il fungo Candida albicans può aumentare la produzione di quella matrice extracellulare7. Sebbene il fluoruro, somministrato in varie modalità, rimanga la base per prevenire la carie dentale10, sono necessari nuovi approcci come coadiuvanti per aumentarne l'efficacia. Inoltre, le modalità anti-placca disponibili si basano sull'uso di agenti microbicidi ad ampio spettro (ad esempio, clorexidina)11. In alternativa, i PNP sono potenziali terapie per controllare i biofilm e prevenire la cariedentale 12,13.

L'ulteriore progresso nella scoperta di nuovi composti bioattivi dalle piante comprende misure o approcci necessari quali: i) l'uso di protocolli affidabili e riproducibili per il campionamento, considerando che le piante mostrano spesso variabilità intraspecifica; — la preparazione di estratti completi e delle rispettive frazioni su piccola scala; — la caratterizzazione e/o la dereplicazione dei loro profili chimici ha ritenuto che l'acquisizione di dati multidimensionali come GC-MS, LC-DAD-MS o NMR, per esempio; — l'uso di modelli validi e ad alto rendimento per valutare la bioattività; — la selezione di potenziali nuovi riscontri basati sull'analisi multivariata dei dati o su altri strumenti statistici; — effettuare l'isolamento e la purificazione dei composti mirati o dei candidati promettenti; e vii) la convalida delle attività biologiche corrispondenti utilizzando i composti isolati2,14.

La dereplicazione è il processo di identificazione rapida di composti noti nell'estratto grezzo e consente di differenziare nuovi composti da quelli che sono già stati studiati. Inoltre, questo processo previene l'isolamento quando la bioattività è già stata descritta per alcuni composti ed è particolarmente utile rilevare "battitori frequenti". È stato utilizzato in diversi flussi di lavoro non mirati che vanno dall'identificazione dei composti principali o all'accelerazione del frazionamento guidato dall'attività fino alla profilazione chimica delle raccolte di estratti. Può essere completamente integrato con studi metabolomici per la profilazione chimica non mirata di CE o l'identificazione mirata dei metaboliti. Tutto ciò alla fine porta a dare priorità alle estrazioni prima delle proceduredi isolamento 1,15,16,17.

Pertanto, nel presente manoscritto, descriviamo un approccio sistematico per identificare molecole antimicrobiche e antibiofilm da estratti e frazioni vegetali. Esso comprende quattro fasi multidisciplinari: (1) raccolta di materiale vegetale; 2) preparazione di estratti grezzi (CE) e frazioni (MCE), seguita dalla loro analisi del profilo chimico; 3) biosasay; e (4) analisi dei dati biologici e chimici(figura 1). Presentiamo così il protocollo sviluppato per analizzare le attività antimicrobiche e antibiofilmali degli estratti e frazioni di Casearia sylvestris contro Streptococcus mutans e Candida albicans13,nonché le procedure per la caratterizzazione fitochimica e l'analisi dei dati. Per semplicità, l'obiettivo qui è dimostrare l'approccio per lo screening dei composti naturali usando il batterio.

Figure 1
Figura 1: Diagramma di flusso dell'approccio sistematico per identificare molecole attive da estratti e frazioni vegetali. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Protocol

1. Raccolta di materiale vegetale

  1. Materiale vegetale
    1. Registrare l'accesso al materiale vegetale su piattaforme elettroniche che regolano l'accesso al patrimonio genetico nel paese in cui si svolgerà la raccolta. Ad esempio, in Brasile, registrati al Sistema Nazionale per la Gestione del Patrimonio Genetico e delle Conoscenze Tradizionali Associate - SisGen (sito web https://sisgen.gov.br/paginas/login.aspx).
    2. Raccogliere campioni del materiale vegetale di interesse (ad esempio, foglie, steli, radici, fiori, frutti). Registrare se il materiale è stato raccolto durante la fase riproduttiva o vegetativa.
    3. Registrare i parametri di raccolta (data, georeferenziazione, temperatura media annuale e percentuale di umidità media).
    4. Identificare i campioni con precisione e un tassonomista deve confermare l'autenticità.
  2. Stabilizzazione e stoccaggio dei campioni vegetali
    1. Separare gli organi vegetali in singoli sacchetti di plastica o fiasche immediatamente dopo le raccolte.
    2. Inattivare le potenziali reazioni enzimatiche mediante i) congelamento immediato in azoto liquido, ii) disidratazione in un forno ad aria circolante (40 °C) o (iii) liofilizzazione dei campioni per liofilizzazione.
    3. Conservare il materiale stabilizzato in sacchetti ermeticamente sigillati a temperatura ambiente o in un congelatore fino all'uso (-20 o -80 °C, a seconda del periodo di conservazione o dell'uso previsto).
    4. Macinare i campioni in un mulino analitico (coltello o sfera, a seconda del tipo di tessuto o della disponibilità) e standardizzare la dimensione delle particelle utilizzando setacci standardizzati.
    5. Pesare i campioni singolarmente per le successive fasi di estrazione.

2. Preparazione di estratti grezzi (CE) e frazioni (CEF) all'analisi del profilo chimico e ai bioacidi

  1. Preparazione di estratti grezzi (CE)
    NOTA: i passaggi sono illustrati nel diagramma di flusso nella figura 2A.
    1. Preparare un solvente da estrazione con una miscela idroalcolica (ad esempio, etanolo (EtOH) 70% o miscele ternarie di acqua, EtOH e altri modificatori, definiti dalla progettazione sperimentale secondo i rapporti precedenti).
    2. Utilizzare il rapporto peso campione (peso secco, mg)/ solvente da estrazione (mL) variabile da 50 a 100 mg per ogni mL di solvente.
    3. Per estrazioni veloci e riproducibili, utilizzare estrazioni batch utilizzando microtubi.
      NOTA: A questo punto devono essere utilizzate almeno tre repliche per consentire l'analisi statistica.
    4. Esegui estrazioni assistite da ultrasuoni (UAE) per renderlo rapido, facile ed economico.
    5. Ripetere la procedura tre volte (15 minuti ciascuna) per la migliore efficienza.
    6. Dopo ogni fase di estrazione, decantare il residuo solido mediante centrifugazione e rimuovere il supernatante.
    7. Combinare i supernatanti singolarmente, filtrare e salvare le aliquote per analisi chimiche simultanee e biosatti. Se necessario, rimuovere il solvente estratto sotto vuoto, il flusso di azoto o la lofilizzazione e registrare il peso e la resa.
    8. Conservare a -20 °C protetto dalla luce.
      NOTA: Il protocollo può essere messo in pausa qui per schermare il CE e selezionare quelli che presentano l'attività desiderata.
  2. Frazionamento degli estratti grezzi (MCE)
    NOTA: i passaggi sono illustrati nel diagramma di flusso nella figura 2B.
    1. Utilizzare cartucce con almeno 1 g di adsorbente. Se gli alcaloidi sono potenzialmente presenti nella CE, utilizzare solventi contenenti lo 0,1% di acido formico (FA).
    2. Diluire il campione nel solvente più adatto (o miscela di solventi) per ottenere una soluzione per campioni da 100 mg/mL. Quindi, trasferire 1 mL della soluzione campione in una cartuccia di estrazione in fase solida precondizione - SPE (1 g di adsorbente, 6 mL di capacità).
    3. Eseguire il frazionamento utilizzando circa tre volumi morti di ogni eluente di estrazione (ad una cartuccia di 1 g, corrisponderà a 2 mL di ogni solvente). Se gli alcaloidi sono potenzialmente presenti nella CE, utilizzare solventi contenenti lo 0,1% di FA.
    4. Raccogliere una frazione per composizione eluente e salvare le aliquote per l'analisi chimica simultanea e i biosatti.
    5. Rimuovere il solvente sotto vuoto, flusso di azoto o lyophilization e registrare il peso e la resa.
      NOTA: Se il CE è difficile da sciogliere nella miscela di eluizione iniziale, disperdere il CE in una fase solida (ad esempio, C18 o celite) in proporzione 1:1 (w/w) prima di caricare il materiale sulla parte superiore della cartuccia.
      ATTENZIONE: Pesare i microtubi in anticipo per calcolare la resa di massa di estratti e frazioni.
  3. Analisi della profilazione chimica
    NOTA: Considerando che ogni specie vegetale richiede metodi ottimizzati e specifici per la sua analisi chimica, nelle sezioni seguenti descriviamo gli approcci analitici più comuni utilizzati per analizzare i materiali vegetali. A titolo pratico, è stata sviluppata e convalidata una cromatografia liquida in fase inversa per l'analisi simultanea di composti fenolici e diterpeni di tipo cleronica biosintesi differenzialmente biosintesi da due varietà di Casearia sylvestris Swartz (Salicaceae). L'apparato UPLC-DAD era dotato di un degassatore, una pompa quaternaria, un campionatore automatico, un rivelatore di array di fotodiodi UV-Vis e un forno (vedi dettagli in Bueno et al. 201518). Approcci simili descritti nei seguenti esempi possono essere ottimizzati in base ad altre specie vegetali e/o materiali vegetali.
    1. Analisi cromatografica e possibilità di sillabazione
      1. Per le separazioni con cromatografia liquida ad altissime prestazioni (UPLC), utilizzare una colonna cromatografica C18 (ad esempio, 150 × 2,1 mm, 2,6 μm, 100 Å) protetta da una pre-colonna compatibile.
        NOTA: Altre fasi di colonna o modalità cromatografiche possono essere utilizzate a seconda della specie/materiale vegetale. L'HPLC convenzionale può anche essere utilizzato; in tal caso, deve essere scelta un'adeguata colonna cromatografica. Per ottenere separazioni eccellenti, regolare le condizioni cromatografiche considerando la portata (μL/min), la temperatura della colonna (°C) e il volume di iniezione (μL). La fase mobile di solito consiste di acqua (A) e acetonitrile o metanolo (B) usando gradienti di eluizione lineari o multistep o eluizione isocratica. È inoltre possibile utilizzare modificatori come buffer, acidi, basi o altri.
      2. Eseguire l'analisi del materiale vegetale (CE e/o CEF) e registrare tutti i dati correlati, come i dati spettrali (utilizzando un UV-Vis e/o, preferenzialmente, rivelatori MS), il tempo di ritenzione (min) e altri, a seconda della sillabazione disponibile.
        NOTA: La cromatografia liquida (LC) è solitamente sillabata (accoppiata) con spettrometria di massa ad alta risoluzione (HRMS), come LC−HRMS, ed è comunemente usata per la rapida annotazione del metabolita in CE ou CEF15.
      3. Se sono necessari dati qualitativi e sono necessari dati quantitativi, preparare e iniettare attentamente curve di calibrazione, seguendo lo stesso protocollo.
        NOTA: Lo sviluppo delle migliori condizioni cromatografiche può essere eseguito con l'assistenza della progettazione di esperimenti, come descritto da Bueno et al. È importante considerare l'inclusione di norme interne durante lo sviluppo del metodo. Sono molto apprezzati poiché consentono deviazioni tecniche corrette durante la preparazione e le iniezioni del campione e un'ulteriore normalizzazione per l'analisi dei dati.
  4. Analisi dei dati univariata e multivariata
    1. Esportare i cromatogrammi registrati in un formato adatto (ad esempio, ASCII, .txt. o .csv formato). È possibile impostare una singola matrice di dati unendo e allineando i cromatogrammi se vengono analizzati più campioni e sono necessari confronti. Le matrici risultanti devono essere normalizzate i cromatogrammi secondo lo standard interno utilizzato.
    2. Analizzare i dati della metabolomica dell'impianto utilizzando metodi multivariati e univariati. Esplorare e visualizzare i set di dati di metabolomica attraverso l'analisi simultanea di più variabili utilizzando metodi statistici multivariati, tra cui l'analisi dei componenti principali non supervisionati (PCA) e l'analisi del clustering gerarchico (HCA), o l'analisi dei meno quadrati parziali supervisionati (come PLS, OPLS, PLS-DA). I metodi univariati, come ANOVA, Student's, Tukey e Welch's t-test, sono particolarmente interessanti per l'analisi precisa delle differenze quantitative tra icampioni 19.
  5. Annotazione di dereplicazione e composti
    NOTA: L'obiettivo di questo passaggio è dedicato alla rapida identificazione on-line di NP noti per evitare noiosi isolamento che possono essere eseguiti contemporaneamente all'analisi dei dati uni- o multivariate.
    1. Eseguire i livelli di identificazione dei composti rilevati o bersaglio:
      1. Composto identificato, compresa la struttura 3D completa e la stereochimica (livello 0);
      2. Identificazione ottenuta da due parametri ortogonali, come il tempo di ritenzione e lo spettro MS/MS (livello 1);
      3. Composti e classi composte annotati putativamente (livelli 2 e 3);
      4. Metaboliti non identificati o non classificati che possono essere differenziati in base a dati analitici (livello 4)19,20.
    2. Caratterizzare i composti noti utilizzando i database commerciali o pubblici. Tra le banche dati più importanti, si possono evidenziare: NIST (https://www.nist.gov), Wiley (https://www.sisweb.com/software/ms/wiley.htm), MassBank (https://massbank.eu/MassBank/), GMD (http://gmd.mpimp-golm.mpg.de/), METLIN (https://metlin.scripps.edu) e il Global Natural Products Social Molecular Networking – database GNPS (https://gnps.ucsd.edu)19.
      NOTA: Ci sono diversi livelli di annotazioni e dipendono dalla tecnica sillabata utilizzata durante lo studio e possono includere: l'assistenza di database spettrali basati su MS- (o NMR) e negli algoritmi di previsione spettrale silico.
    3. Isolamento, purificazione e identificazione completa del composto
      NOTA: Se un dato composto (la cui identità è stata sospettata dai metodi statistici) necessita di un'identificazione strutturale completa, il primo passo per svolgere questo compito è isolare e purificare i composti desiderati su una scala maggiore. Può essere realizzato scalando i protocolli già sviluppati.
      1. Eseguire l'isolamento rapido e diretto del composto o dei composti bersaglio mediante tecniche cromatografiche preparatorie ben consolidate e ottimizzate. L'HPLC semi-preparativo con iniezione di carico a secco può essere utilizzato per evitare i compromessi che generalmente devono essere fatti tra carico elevato e solubilizzazione del campione1.
      2. Realizzare la caratterizzazione strutturale completa e l'identificazione di composti isolati. Questo può essere fatto attraverso la combinazione di diverse tecniche:
        1. Risonanza magnetica nucleare (NMR);
        2. Spettrometria di massa (MS);
        3. Le tecniche spettrometriche nelle regioni ultravioletta (UV) e infrarossa (IR) sono anche molto utili per la caratterizzazione dei gruppi funzionali;
        4. L'uso della spettroscopia chiropticale come il dicroismo circolare elettronico e vibrazionale (ECD e VCD, rispettivamente), l'attività ottica Raman (ROA) e la cristallografia a raggi X sono tecniche importanti per la caratterizzazione assoluta della configurazione.

3. Biosasay

NOTA: Screening biologico: Per valutare rapidamente la potenziale bioattività di CE e CEF, lo screening iniziale delle sostanze naturali dovrebbe essere organizzato e diretto.

  1. Preparazione di CE e CEF per i biosasay
    1. Ricostituire la sostanza secca con i migliori solventi possibili (che possono essere determinati sperimentalmente). Il progetto sperimentale21,22 definisce la soluzione stock e la concentrazione di solventi.
    2. Calcolare la concentrazione di solvente della soluzione stock. Per fare ciò, utilizzare la formula: C1 x V1 = C2 x V2, dove C1 rappresenta la soluzione stock (mg) di CE e/o CEF; V1 rappresenta il volume del solvente; C2 è il peso del CE e/o del CEF; V2 è il volume finale (mL) della soluzione stock.
      NOTA: Ad esempio, abbiamo selezionato l'84,15% di EtOH e il 15% di solfossido di dimetile (DMSO) come concentrazione di solvente della soluzione stock. Abbiamo preparato la concentrazione di ce a 6 mg/mL e il CEF a 1 mg/mL13. Il solvente per diluire il CE e il CEF dipenderà dal metodo di valutazione dell'attività biologica. Il solvente utilizzato come veicolo non deve interferire con l'attività biologica e tossicologica. Tipicamente, acqua, DMSO, EtOH o un solvente acquoso a base di EtOH viene utilizzato per solubilizzare estratti vegetali o derivati vegetali4,13.
  2. Preparazione di organismi di prova
    1. Riattivare un ceppo microbico, ad esempio S. mutans UA159 sull'agar del sangue (48 h, 37 °C, 5% CO2), e coltura in mezzo di coltura liquida (ad esempio, brodo estratto di lievito di tripptone [TYE: 2,5% (w/v) triptone con estratto di lievito 1,5% (w/v) contenente 1% di glucosio (w/v) (TYEg) per 16 h, 37 ° C, 5% CO2.
    2. Eseguire una diluizione 1:20 della coltura iniziale del microrganismo nello stesso mezzo di coltura (il rapporto di diluizione della coltura iniziale può cambiare in base al progetto sperimentale).
    3. Incubare fino a raggiungere la fase di crescita a metà log.
    4. Preparare l'inoculo per i bioacidi con una popolazione definita (ad esempio, 2x106 unità di formazione di colonie per millilitro - CFU/mL) in TYEg per saggi antimicrobici e TYE con 1% di saccarosio (w/v) (TYE) per saggi di biofilm.
      NOTA: Le condizioni di crescita dipenderanno dal microrganismo testato.
  3. Attività antimicrobica
    NOTA: I passaggi sono illustrati nella figura 3.
    1. In una piastra da 96 po', aggiungere un'aliquota (μL) della soluzione stock CE e/o CEF (trattamenti). Il volume dell'aliquota è definito dalla concentrazione di prova, che deve essere selezionata sulla base di studi precedenti. Ad esempio, per testare CE alla concentrazione di prova di 0,5 mg/mL, utilizzare un'aliquota di 16,67 μL della soluzione stock a 6 mg/mL. Per questo calcolo, utilizzare la formula: C1 x V1 = C2 x V2, dove C1 è la concentrazione del materiale, V 1 è il volume dell'aliquota dellasoluzione stock, C2 è la concentrazione di prova e V2 è il volume della piastra da 96 pozzi (che corrisponde a 200 μL). In questa condizione sperimentale, la concentrazione di prova dei solventi (veicolo) sarà del 7% EtOH e dell'1,25% DMSO.
    2. Includere una serie di controlli per ogni piastra: una colonna con trattamenti, senza l'inoculo (controllo vuoto per trattamento, aiuta a differenziare la torbidità dal trattamento utilizzato dalla crescita microbica); una colonna con veicolo e inoculo (diluente del controllo CE o CEF o 0 mg/mL); una colonna con solo il mezzo di coltura (controllo del mezzo di coltura) e una colonna con solo inoculo (controllo della crescita microbica).
    3. Utilizzando TYEg, regolare il volume a 100 μL. Successivamente, incubare, ad esempio, 24 ore, 37 °C, 5% CO2 (a seconda del microrganismo testato).
    4. Inoculare 100 μL di microrganismo inoculo (1x 106 CFU/mL) nella piastra a 96 porri.
    5. Analizzare la crescita batterica in base alla torbidità mediante ispezione visiva dei pozzi (chiari o torbidi). Chiaro: significa che non c'è crescita visiva del microrganismo. Nuvoloso: significa che c'è crescita visiva del microrganismo.
    6. Misurare l'assorbanza (densità ottica o O.D.) della coltura batterica in ogni pozzo (lettore ELISA utilizzando 540 nm). Successivamente, trasferire 100 μL delle colture su microtubi contenenti 900 μL di soluzione salina (0,89% NaCl), mescolare bene mediante vortice. Continuare quindi a eseguire una diluizione seriale dieci volte fino al valore desiderato.
    7. Inoculare un'aliquota della diluizione desiderata in specifiche piastre di agar (in duplicato). Ad esempio, 10 μL di una diluizione specifica sulle placche di agar del sangue.
    8. Incubare. Le condizioni possono cambiare tra i microrganismi, ad esempio S. mutans: 48 h, 37 °C, 5% CO2.
    9. Eseguire il conteggio delle colonie sulle piastre per la successiva trasformazione in CFU/mL come (Uncerto numero di colonie x 10n)/q. In questa formula,n è uguale al valore assoluto della diluizione (0, 1, 2 o 3), e q è uguale alla quantità, in mL, pipettata per ogni diluizione placcata sulla piastra di agar. Inoltre, il CFU/mL può essere convertito in valori di log.
      NOTA: Quando gli estratti vegetali vengono aggiunti al mezzo di coltura, può verificarsi la precipitazione di particelle dagli estratti. Questo fatto può rendere difficile l'interpretazione dei risultati. Lo stesso accade quando un lettore di micropiatte misura la torbidità come, in alcuni casi, le cellule si aggrappano sul fondo della micropiatta. Inoltre, a seconda dell'estratto utilizzato, il colore degli estratti di foglie vegetali può rendere difficile quantificare latorbidità 23,24. Un metodo alternativo utilizza coloranti che rivelano se le cellule microbiche sono metabolicamente attive o meno24.
  4. Attività antibiofilm
    NOTA: I passaggi per valutare l'effetto dei trattamenti sulla formazione di biofilm sono illustrati nella figura 4.
    1. Formazione ed elaborazione di biofilm
      1. Diluire i trattamenti in mezzo di coltura (TYE) in una piastra da 96 pozzetti come descritto nelle fasi del protocollo Di attività antimicrobica.
      2. Incubare il piatto. Nell'esempio con S. mutans, l'incubazione viene eseguita durante 24 ore, a 37 °C e 5% CO2.
      3. Dopo l'incubazione, posizionare le piastre su uno shaker orbitale (5 min, 37 °C, 75 giri/min) per allentare le cellule non aderenti al biofilm. Quindi, scartare il mezzo di coltura contenente le cellule non aderenti e lavare i biofilm rimanenti tre volte con lo 0,89% di NaCl per rimuovere le cellule non aderenti.
    2. Quantificazione della biomassa da biofilm trattati
      NOTA: i passaggi sono illustrati nel diagramma di flusso nella figura 4A.
      1. Mantenere i biofilm lavati sul piatto e aggiungere 50 μL di soluzione acquosa viola cristallo all'1% ad ogni pozzo.
      2. Incubare la piastra a temperatura ambiente per 35 minuti.
      3. Lavare i pozzi macchiati con acqua MilliQ (tre volte) e poi asciugarli all'aria per 60-90 minuti.
      4. Elute il viola cristallino dai pozzi macchiati con 200 μL di 99% EtOH incubando la piastra in uno shaker orbitale (5 min, 37 °C, 75 giri/min).
      5. Trasferire un'aliquota di 150 μL da ogni pozzo con il colorante eluitato su un'altra piastra e quantificare la biomassa del campione (lettore ELISA 570 nm).
    3. Quantificazione della popolazione microbica vitale (CFU/mL) dei biofilm trattati
      NOTA: i passaggi sono illustrati nel diagramma di flusso nella figura 4B.
      1. Rimuovere i biofilm lavati dalla piastra con una pipetta e 200 μL di NaCl 0,89% e trasferire la sospensione risultante singolarmente su microtubi sterili.
      2. Utilizzare altri 200 μL di NaCl 0,89% per pozzo e trasferirlo nel tubo corrispondente, contenente già 200 μL della sospensione iniziale del biofilm. Eseguire questo processo fino a raggiungere una sospensione totale di 1 mL di biofilm per pozzo originale.
      3. Utilizzare un'aliquota da ogni tubo per eseguire una diluizione seriale di dieci volte.
      4. Inoculare un'aliquota della diluizione desiderata in specifiche piastre di agar (in duplicato). Ad esempio, 10 μL di una diluizione specifica sulle placche di agar del sangue.
      5. Incubare le piastre di agar (ad esempio, 48 h, 37 °C, 5% CO2), quindi contare le colonie per determinare il CFU/mL come descritto sopra.
  5. Fase di convalida dell'attività biologica
    1. Formazione pellicle salivare
      1. Utilizzare perline idrossiapatite (HA) (Macro-Prep Ceramic Hydroxyapatite Type I 80 μm) come superficie per formare il film salivare25. Queste perline di superficie imitano lo smalto dentale.
      2. Pesare le perline ha (ad esempio, 10 mg) in microtubi e sterilizzare. Quindi, utilizzare il buffer di adsorbimento (buffer AB: 50 mM KCl, 1 mM KPO4, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, in dd-H2O, pH 6.5]25 contenente 0,1 mM di fluoruro di fenilmetilsulfonil (PMSF) e 0,02% di azide di sodio (NaN3)per lavare le perline.
      3. Raccogliere e preparare la salivaumana 26. È necessario ottenere l'approvazione del comitato etico istituzionale.
      4. Aggiungere 500 μL di saliva nei microtubi e incubare (40 min, 37 °C, 24 giri/min).
      5. Quindi, rimuovere il supernatante saliva e lavare le perline (tre volte con tampone AB contenente PMSF e NaN3). Le perle sHA (perline HA con pellicle salivare) sono ora pronte per i test a valle.
        NOTA: La saliva viene raccolta da volontari sani. Dopo la raccolta, diluire la saliva (1: 1 v/v) con tampone AB e centrifuga (1699 x g, 20 min, 4 °C). Sterilizzare mediante filtrazione (filtro a membrana in polieteresolfone a basso legame a 0,22 μm di proteine)26. Il Comitato Etico Istituzionale deve approvare lo studio. Nel nostro caso, il Comitato Etico dell'Istituzione ha approvato lo studio (CAAE: 68161417.0.0000.5416).
    2. Distacco di S. mutans dopo adesione al film salivare e glucani trattati con estratti selezionati
      1. Coltivare il microrganismo fino alla fase di crescita a metà log, come descritto sopra.
      2. Quando le colture hanno raggiunto l'O.D. desiderato, centrifuga (4000 × g per 20 min), lavare con soluzione nacl allo 0,89% e rimescolare il pellet con 0,89% NaCl utilizzando lo stesso volume iniziale del mezzo di coltura.
      3. Se si utilizza uno streptococchi, come S. mutans, sonicare le colture con una sonda da dechain (30 s, 7 W, tre volte). Se si utilizza un singolo organismo cellulare, questo passaggio può essere saltato.
      4. Controllare l'O.D. (540 nm) per regolare la concentrazione a 2 x 106 CFU/mL.
    3. Adesione di S. mutans al pellicolo salivare (sHA) e distacco delle cellule aderenti
      NOTA: i passaggi sono illustrati nel diagramma di flusso nella figura 5.
      1. Ottenere i campioni di sHA come descritto in precedenza.
      2. Aggiungere un'aliquota (nell'esempio, aggiungiamo 500 μL) di trattamenti selezionati (alla concentrazione di prova; ad esempio, 0,5 mg/mL) o controlli in microtubi contenenti campioni di sHA.
      3. Incubare i campioni di sHA con trattamenti o controlli (30 min, 37 °C, 24 giri/min); quindi, lavare le perline tre volte con tampone AB (contenente PMSF e NaN3).
      4. Aggiungere la cultura del microrganismo. Nell'esempio, aggiungiamo 500 μL di coltura di S. mutans (2 x 106 CFU/mL) a ogni microtubo.
      5. Incubare (1 h, 37 °C, 24 giri/min) e quindi rimuovere le celle non vincolate lavandosi tre volte con tampone AB.
      6. Rimospendare ogni campione con un'aliquota (nell'esempio, aggiungiamo 1000 μL) di buffer AB e sonicare con una sonda (30 s, 7 W).
      7. Utilizzare un'aliquota di ciascuna sospensione per una diluizione seriale di dieci volte per determinare il numero di colonie vitali placcando su piastre di agar specifiche (48 h, 37 °C, 5% CO2). Quindi, conta le colonie per determinare il CFU/mL come descritto sopra.
        NOTA: Il passaggio del sonicato viene eseguito per staccare le cellule aderenti a sHA.
    4. Adesione di S. mutans alla matrice glucano iniziale (gsHA) e distacco di cellule aderenti
      NOTA: i passaggi sono illustrati nel diagramma di flusso nella figura 6. L'enzima GtfB è stato purificato dal supernatante coltura Streptococcus milleri KSB8 progettato per produrre GtfB. La purificazione è stata eseguita con una colonna cromatografica contenente perline di idrossiapatite utilizzando tamponi contenenti due inibitori della proteasi (0,1 mM PMSF e 0,02% NaN3)27,28. Quindi, l'enzima è stato controllato su gel di acrilammide (SDS-PAGE) e macchiato con nitrato d'argento. Le aliquote dell'enzima sono state conservate a -80 °C fino all'uso.
      1. Ottenere i campioni di sHA come descritto in precedenza. Quindi, aggiungere un'aliquota (nell'esempio, aggiungiamo 500 μL) di enzima GtfB a ciascun tubo e incubare in un omogeneizzatore (40 min, 37 °C, 24 giri/min). Quindi, lavare tre volte con buffer AB (contenente PMSF e NaN3).
      2. Aggiungere ad ogni microtubo un'aliquota (ad esempio, 500 μL) di substrato di saccarosio (100 mmol di saccarosio) contenente i trattamenti (o i controlli alla concentrazione di prova, ad esempio 0,5 mg/mL).
      3. Incubare i campioni in un omogeneizzatore (4 h, 37 °C, 24 giri/min). Quindi, eseguire tre lavaggi con tampone AB (con PMSF e NaN3) per rimuovere i trattamenti e l'eccesso di saccarosio non incorporato nei glucani sintetizzati (campioni di gsHA).
      4. Aggiungere un'aliquota (nell'esempio, aggiungiamo 500 μL) di S. mutans inoculum (2 x 106 CFU/mL) a ciascun microtubo.
      5. Incubare in un omogeneizzatore (1 h, 37 °C, 24 giri/min) e lavare tre volte con tampone AB (con PMSF e NaN3)per rimuovere le cellule non vincolate.
      6. Resuspend ogni campione con un'aliquota (ad esempio, 1000 μL) di tampone AB (con PMSF e NaN3) e sonicare con una sonda per staccare le cellule aderenti al gsHA (30 s, 7 W).
      7. Utilizzare un'aliquota di ciascuna sospensione per una diluizione seriale di dieci volte per determinare il numero di colonie vitali placcando su piastre di agar specifiche (48 h, 37 °C, 5% CO2). Quindi, conta le colonie per determinare il CFU/mL come descritto sopra.

4. Analisi biologica dei dati

  1. Dati sui biosasay
    1. Inserire dati grezzi per i biosasay in un foglio di calcolo. Calcolare il registro dell'inibizione della crescita microbica per ogni trattamento come (ACFU/mL di trattamenti + 1) x log10. Quindi, calcolare la percentuale di log dell'inibizione della crescita microbica, rispetto al controllo del veicolo utilizzando (Alog10 CFU/mLdi trattamento /media Alog10 CFU/mL del controllo del veicolo) x 100%.
    2. O.D. corretto delle colture planctoniche e della biomassa trattate da trattamenti (gruppi trattati ce e CEF) e dal controllo del veicolo (controllo negativo). Per la correzione, sottrarre l'assorbanza dei pozzi trattati da quella ottenuta in pozzi contenenti solo mezzi di coltura (Ablank) come (Agruppi trattati medio /Un mezzo dicontrollonegativo ) x 100%.
    3. Dopo questa correzione, calcolare la percentuale di inibizione della biomassa, rispetto al controllo del veicolo come(biomassa trattata/controllo medio delveicoloA ) x 100%.
    4. Inviare i dati grezzi generati per l'analisi statistica dei dati utilizzando software specifico.
      NOTA: L'interpretazione dell'efficacia di un determinato trattamento è determinata utilizzando punti di interruzione, come l'IC50/IC90. Questi valori sono definiti come la concentrazione minima di un trattamento in grado di inibire rispettivamente il 50% e il 90%, della crescita batterica o della formazione di biofilm24. Questi parametri possono aiutare a interpretare i dati e fornire una base per la selezione di composti con unamigliore attività 13,29.

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Representative Results

Forniamo un esempio di utilizzo di un approccio sistematico per migliorare l'attività biologica degli estratti vegetali e delle frazioni per identificare molecole potenzialmente attive per possibili nuove terapie anti-carie: attività antimicrobiche e antibiofilm degli estratti di Casearia sylvestris da distinti biomi brasiliani contro Streptococcus mutans e Candida albicans13.

Priorità bassa
Interazioni complesse tra specifici microrganismi orali-fattori ospiti-dieta ricca di saccarosio e amido possono modulare la formazione di biofilm patogeni e avviare un processo cariogenico30,31. S. mutans orchestra la patogenicità dei biofilm associati allo sviluppo della carie dentale perché produce Gtfs responsabili della sintesi degli esopolisaccaridi, oltre alla sua acidogenicità e acidità31. Inoltre, Gtfs consente l'adesione di Candida albicans (e di altri microrganismi), aumentando la virulenza del biofilm32,33. Abbiamo condotto uno screening delle attività antimicrobiche e antibiofilm di estratti fogliari C. sylvestris e frazioni di diversi biomi brasiliani, appartenenti alle varietà lingua e sylvestris contro S. mutans e C. albicans13. C. sylvestris ("guaçatonga") fa parte dell'uso popolare e tradizionale in Brasile, e in altri paesi del Sud America e dell'Asia34,35. Questa pianta è citata nella "Lista nazionale delle piante medicinali di interesse per SUS" (RENISUS), che contiene 71 specie che potrebbero trattare le malattie con un'alta incidenza in Brasile36. Il profilo chimico degli estratti fogliari del var.

Utilizziamo l'approccio descritto nel protocollo per identificare quali estratti e frazioni di C. sylvetris sono più attivi per i microrganismi valutati e, sulla base dei risultati utilizzando modelli semplicistici, selezioniamo quali trattamenti saranno testati modelli complessi in vitro (dischi di idrossiapatite, microcosmi)37,38. Qui presentiamo i risultati dello screening dei dodici CE contro S. mutans. L'obiettivo è dimostrare l'utilità di questo approccio per lo screening dei composti naturali invece di interpretare e discutere i dati.

Abbiamo raccolto le foglie di individui dalle due varietà di C. sylvestris di dodici diverse popolazioni in Brasile, comprendenti diverse formazioni di biomi brasiliani (si prega di vedere i dettagli in Ribeiro et al. 201913). La collezione è stata effettuata tra giugno e settembre 2012 e 2013 (SisGen; Registrare #A00892A). Si consiglia di raccogliere campioni rappresentativi, compresi individui di chemiotipi diversi e di diversi biomi, per affrontare la variabilità chimica dei metaboliti secondari. Se disponibile, devono essere raccolte almeno da 3 a 5 persone. Le informazioni precedenti riguardanti la variabilità chimica infraspecifica degli impianti dovrebbero essere considerate anche come descritte da Ribeiro et al. La composizione chimica del CE è stata esaminata dal cromatografico citato nella fase 2 e forniamo il profilo chimico nella figura 7. L'analisi del profilo chimico è essenziale per integrare l'interpretazione dei dati ottenuti nello screening biologico.

Le CE erano frazionate in frazioni di Esagono, AcOEt e MeOH. Il frazionamento di CE consente la semplificazione della miscela per aumentare la concentrazione dei composti potenzialmente attivi e diminuire le possibilità di sinergismi e antagonismi tra composti. Inoltre, nelle miscele più semplici (frazioni), è più facile ottenere dati spettrali dei composti che in CE ed eseguire l'analisi di dereplicazione2. Di solito, il frazionamento può essere effettuato mediante estrazione liquido-liquido o cartucce di estrazione in fase solida (SPE) contenenti adsorbente a fase preferenzialmente invertita come C18 (40 μm, 100 Å). Altri adsorbenti o miscele di adsorbenti possono essere scelti, a seconda degli scopi di studio o della natura chimica dei composti desiderati. Se la tecnica scelta è spe, le cartucce devono essere precedentemente attivate con solvente organico puro (ad esempio, EtOH) e condizionate con l'eluente iniziale. Sono disponibili protocolli standardizzati. Pertanto, il lettore può consultarli e adattarli in base allo studio previsto e al materiale vegetale di interesse.

I dodici CE sono stati solubilizzati con l'84,15% di EtOH e il 15% di DMSO per ottenere 6 mg/mL (soluzione stock). Prima dei test di screening, abbiamo testato la concentrazione diluita (veicolo) che non interferisce con la crescita microbica. Questo passaggio è importante perché impedisce alle azioni antimicrobiche e antibiofilm dei solventi di influenzare i risultati durante il test dei trattamenti. Le prove possono essere eseguite su una piastra da 96 po', trattando la coltura del microrganismo di interesse con diverse concentrazioni di solventi (associati e/o isolati). Così, abbiamo iniziato il nostro screening con CE a 0,5 mg / mL e veicolo con una concentrazione del 7% etOH e dell'1,25% DMSO.

Per lo screening dell'attività antimicrobica e antibiofilmale, le piastre a 96 pozzi sono state trattate come descritto sopra. A tal fine, è stato aggiunto il volume di 16,67 μL di soluzione di magazzino CE (6 mg/mL) per testare ogni CE alla concentrazione di 0,5 mg/mL. I biofilm formati sono stati elaborati come descritto nella fase 3. Gli estratti efficaci contro S. mutans (IC50 o 3 tronchi) sono stati utilizzati per valutare la "forza di adesione" di questo batterio alla pellicolo salivare e alla matrice glucano iniziale, come descritto nella fase 3.

I dati grezzi ottenuti da saggi biologici sono stati organizzati in Excel (come descritto nella fase 4) e analizzati con un adeguato trattamentostatistico 13. Il punto di taglio per identificare gli estratti con la migliore attività è stata l'inibizione IC50 (3 tronchi). Da questo parametro, quattro estratti hanno mostrato una risposta favorevole (Figura 8). I dati cromatografici di questi quattro estratti mostrano la presenza simultanea di diterpeni di tipo clerodane e flavonoidi glicosilati. Inoltre, includono lo stesso bioma (Foresta Atlantica) e varietà (sylvestris). Per aiutare a interpretare i dati biologici, abbiamo confrontato il profilo cromatografico dei quattro estratti con la migliore attività con gli altri estratti schermati. Rispetto agli altri, gli estratti con la migliore attività hanno una maggiore quantità di diterpeni di tipo cleronico e, contemporaneamente, flavonoidi glicosilati. Questa osservazione indica che è probabile che l'efficacia di questi estratti sia dovuta ad un'interazione sinergica tra i due metaboliti secondari, aumentando così la loro attività biologica. Cioè, l'effetto combinato dei diterpeni di tipo clerodane e dei flavonoidi glicosilati è maggiore della somma dei loro effetti separati13.

Per confermare i dati ottenuti nello screening, abbiamo valutato il distacco di S. mutans dopo l'adesione al pellicolo salivare e ai glucani trattati con CE selezionato. I saggi utilizzano modelli di biofilm di singole specie in vitro per valutare meglio l'attività biologica degli estratti grezzi selezionati e identificare possibili obiettivi d'azione. La prima analisi verifica se i trattamenti utilizzati sono in grado di inibire l'aderenza di S. mutans al pellicolo salivare, ma soprattutto se le cellule del microrganismo che hanno aderito al pellicolo trattato possono essere rimosse dalla superficie più facilmente dallo stimolo meccanico, interrompendo così la prima fase di formazione del biofilm. L'aggiunta di CE (con migliore attività) durante la sintesi dei glucani non ha modificato il pellicolo salivare perché nessun CE ha influenzato significativamente la rimozione delle cellule aderenti al pellicolo salivare (Figura 9A).

L'adesione della matrice glucano iniziale (gsHA) indaga se i trattamenti possono inibire l'adesione di S. mutans alla matrice glucano iniziale. Tuttavia, questa metodologia verifica se le cellule di microrganismo che hanno aderito ai glucani trattati possono essere rimosse dallo stimolo meccanico più facilmente della superficie, interrompendo così la formazione del biofilm di stadio. Tre CE hanno influenzato la qualità dei glucani formati da GtfB e hanno quindi indebolito l'adesione di S. mutans alla matrice glucano iniziale (la maggior parte delle cellule S. mutans sono state rimosse dopo l'adesione per i glucani; Figura 9B). Crediamo che questo comportamento sia correlato al sinergismo tra i metaboliti secondari13.

L'approccio sistematico ci ha aiutato a identificare e selezionare estratti grezzi attivi per fermare la formazione di biofilm cariogenici. Una volta selezionati e basati sul profilo cromatografico, abbiamo le basi per chiarire i meccanismi molecolari di azione in modelli complessi.

Figure 2
Figura 2: Diagramma di flusso dell'estrazione e del frazionamento del materiale vegetale. L'illustrazione mostra il progetto sperimentale di preparazione degli estratti grezzi (A) e il frazionamento degli estratti grezzi (B). Emirati Arabi Uniti: Estrazione assistita da ultrasuoni; SPE: Estrazione in fase solida. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Progettazione sperimentale per la valutazione dell'attività antimicrobica in piastre a 96 pozzi. L'illustrazione raffigura trattamenti (estratti grezzi o frazioni) e controlli. Per lo screening di più trattamenti, utilizzare una singola concentrazione (mg/mL) in ogni pozzo. CFU/mL: unità di formazione colonie per millilitro. O.D.: densità ottica. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Progettazione sperimentale per il test antibiofilm in lastre da 96 pozzi. L'illustrazione mostra trattamenti (estratti grezzi e frazioni) e controlli. Per lo screening di vari trattamenti, utilizzare una singola concentrazione (mg/mL) in ogni pozzo. In Avengono illustrati i passaggi per quantificare la biomassa dei biofilm trattati. In B, vengono mostrati i passaggi per determinare la popolazione (CFU/mL) dei biofilm trattati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Progetto sperimentale per valutare l'adesione al pellicolo salivare, seguito dal distacco delle cellule aderenti. L'illustrazione mostra i passaggi da eseguire. Trattamenti: selezionati in base allo screening biologico. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6: Progetto sperimentale per valutare l'adesione alla matrice glucano iniziale (gsHA) seguita dal distacco delle cellule aderenti. L'illustrazione mostra i passaggi da eseguire. Trattamenti: selezionati in base allo screening biologico. Substrato di saccarosio: 100 mmol di saccarosio. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 7
Figura 7: Quantità di diterpeni di tipo clerodane e flavonoidi glicosilati negli estratti di C. sylvestris dai biomi brasiliani. Le lettere S, I e L indicano rispettivamente le varietà sylvestris, intermediate e lingua. Comunicazione personale della Dott.ssa Paula Carolina Pires Bueno. Questa cifra è stata modificata da Ribeiro etal. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 8
Figura 8: Attività antimicrobica e antibiofilmale degli estratti grezzi di C. sylvestris dai biomi brasiliani contro S. mutans.  A. % CFU (log10) di cellule planctoniche trattate; B. % biomassa di biofilm trattati. C. % CFU (log10) del biofilm trattato. I dati descritti sono mediana (tracce) e interquartile (caselle). Le barre di errore rappresentano i valori massimo e minimo. Gli asterischi denotano una differenza statisticamente significativa di un estratto specifico rispetto al controllo del veicolo (V), dove: ****p ≤ 0,0001; p ≤ 0,001; ** p ≤ 0,01; e *p ≤ 0,05 (test di Kruskal-Wallis, seguito dal test di confronto multiplo di Dunn). Ogni controllo della crescita delle specie (senza trattamento) è rappresentato come Sm per S. mutans. I colori delle barre in ogni grafico rappresentano la varietà a cui appartengono gli estratti, essendo, in colore grigio scuro: var. grigio chiaro: var. intermedio e bianco: var. lingua. Questa cifra è stata modificata da Ribeiro etal. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 9
Figura 9: Distacco di S. mutans dopo adesione al pellicolo salivare trattato e matrice iniziale dei glucani. I dati post-rilascio di S. mutans al pellicolo salivare trattato e ai glucani sono riportati rispettivamente in (A) e (B). Non vi era alcuna differenza tra il veicolo di controllo (V) e gli estratti testati per entrambe le analisi. La percentuale di CFU/mL è stata ottenuta considerando il controllo del veicolo (V) al 100%. I dati descritti sono mediana (tracce) e interquartile (caselle). Le barre di errore rappresentano i valori massimo e minimo. Gli asterischi denotano una differenza statisticamente significativa di un estratto specifico rispetto al controllo del veicolo (V), dove ****p = 0,0001 e **p < 0,0031 (test di Kruskal-Wallis, seguito dal test di confronto multiplo di Dunn). Il controllo della crescita è rappresentato da Sm per S. mutans. I colori delle barre del grafico rappresentano la varietà a cui appartengono gli estratti, essendo il colore grigio scuro al var. Questa cifra è stata modificata da Ribeiro etal. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Le principali sfide legate al lavoro con estratti grezzi naturali comprendono la loro composizione complessa e le inadeguatezze dei classici studi di isolamento bioguidato. Sebbene questo processo sia lento, è efficace e ha portato a importanti risultati nella ricerca NP. Per razionalizzare, sono necessari studi basati sulla definizione delle priorità per razionalizzare. Pertanto, l'uso di moderni approcci di profilazione chimica per l'analisi del CE e della dereplicazione prima dell'isolamento è importante per caratterizzare il materiale studiato e particolarmente utile per evitare il reisolamento di composti noti con attività biologicagià descritta 2,15. Inoltre, l'acquisizione di dati multidimensionali è necessaria per eseguire ulteriori analisi multivariate dei dati per trovare i potenziali candidati di successo responsabili delle attività biologiche osservate. Di conseguenza, il ricercatore può concentrarsi sull'isolamento (su larga scala) di questi potenziali candidati.

Qui presentiamo un approccio sistematico per l'identificazione guidata dal test biologico (in vitro) di composti attivi da estratti e frazioni vegetali. Questo protocollo consente un metodo di screening e analisi multi-target in modo che più componenti attivi possano essere schermati e analizzati contemporaneamente. I test biologici sono su piccola scala e ad alto rendimento, sono veloci, convenienti, facili da riprodurre e consumano meno reagenti rispetto ai metodi tradizionali (ad esempio, isolamento iniziale dei composti di interesse)39. Per qualsiasi ricerca di prodotti naturali, è fondamentale gli strumenti analitici (ad esempio, HPLC-UV, HPLC-DAD, LC-MS). Recentemente, l'approccio è più orientato alla struttura (basato sulla chimica) utilizzando, in misura più elevata, il potere delle piattaforme analitiche e di spiegazione (LC-HRMS e HRMS/MS, NMR ad alto campo) e strategie di dereplicazione, che consistono nella rapida identificazione di molecole già note. Questo passaggio aiuta a comprendere la relazione del profilo chimico con la risposta biologica con conseguente isolamento più mirato dei metaboliti attivi candidati3. Esistono diversi metodi consolidati per l'analisi cromatografica. Per i PNP sconosciuti, a volte può essere necessario eseguire i piloti per trovare il miglior metodo possibile. Ad esempio, utilizziamo un metodo analitico di cromatografia convalidato per l'analisi simultanea di metaboliti secondari prodotti da due varietà di C. sylvestris13,18. Quando si sceglie un metodo cromatografico, si consiglia di prendere in considerazione un protocollo basato sul composto o sui composti target e sui vantaggi e gli svantaggi di tutti i metodi disponibili, concentrandosi in particolare sulla loro efficienza e, naturalmente, sul costo totalecoinvolto 40.

Sebbene l'approccio sistematico si sia rivelato utile per lo screening rapido e l'analisi dei candidati bioattivi nei PNP, rimangono importanti limitazioni. Ad esempio, le letture visive e O.D. della biomassa e delle colture planctoniche possono riprodurre risultati falsi positivi13,23,24. Determinare la torbidità delle colture con un lettore di micropiatte può fallire se utilizzato per compostinaturali 23,24. Questi guasti si verificano perché (i) in alcuni organismi di prova, le cellule sono raggruppate nella parte inferiore del pozzo e, in altri organismi, le cellule rimangono in sospensione; — particelle solide presenti nel precipitato CE e causano torbidità nei pozzi23,24. Anche il pH dei PPS è un fattore che deve essere considerato. Il pH della soluzione di trattamento è correlato alla composizione chimica dei metaboliti secondari e, quindi, influenza la risposta biologica. Sebbene il pH non sia una limitazione, dovrebbe essere valutato con cautela, a seconda dello scopo dello studio. Ad esempio, nei modelli di biofilm sulle superfici dello smalto dei denti, l'acidità può causare demineralizzazione dello smalto indesiderata. In questi casi, è necessario regolare il pH con l'aiuto di tamponi adeguati. Pertanto, è necessario condurre test per verificare se la regolazione del pH ha influenzato la risposta biologica osservata in precedenza.

I test classici per valutare l'attività di nuovi composti includono la determinazione della concentrazione inibitoria minima (MIC) e della concentrazione battericida o fungicida minima (MBC o MFC)29,41. Tuttavia, quando l'obiettivo è quello di migliorare molti estratti e frazioni vegetali, la tecnica diventa esaustiva. Il bioscreening può essere eseguito con una singola concentrazione di trattamenti multipli (ad esempio, estratti vegetali da luoghi distinti)13,42,29. Per queste situazioni, l'approccio sistematico è un metodo con prestazioni elevate che restituisce risultati coerenti in meno tempo di lavoro. I trattamenti selezionati nello screening biologico possono essere valutati utilizzando modelli raffinati (clinicamente rilevanti, vitali e riproducibili) per confermare l'attività biologica. Per il controllo del biofilm cariogenico, gli studi di laboratorio dovrebbero concentrarsi principalmente sui biofilm formati su idrossiapatite (sostituto dello smalto dei denti) o superfici smaltate poste in posizione verticale rivestite con un pellicolo salivare37. Consente inoltre lo screening di campioni vegetali di diverse varietà e biomi in modo riproducibile e veloce. L'inclusione di queste due variabili (bioma e varietà) è vitale perché influenzano la variabilità della composizione chimica dei metaboliti secondari18 e modulano la risposta biologica. Questo approccio sistematico può essere adattato/modificato per applicazioni al di fuori della ricerca orale sul biofilm. Ad esempio, può essere particolarmente utile per altri campi legati al biofilm, utilizzando altre specie di interesse.

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Disclosures

Nessun conflitto di interessi dichiarato.

Acknowledgments

Esprimiamo la nostra gratitudine a Núcleo de Bioensaios, Biossíntese ed Ecofisiologia de Produtos Naturais (NuBBE) dell'Istituto di Chimica dell'UNESP, Araraquara/SP per aver fornito i laboratori per la preparazione del materiale vegetale. Ringraziamo anche il Laboratorio di Microbiologia Applicata del Dipartimento di Materiali Dentali e Protesi, UNESP, Araraquara/SP. Questa ricerca è stata sostenuta da una sovvenzione di ricerca della São Paulo Research Foundation (FAPESP #2013/07600-3 all'AJC) e da borse di studio più fondi generali (FAPESP #2017/07408-6 e FAPESP #2019/23175-7 alla SMR; #2011/21440-3 e #2012/21921-4 al PCPB). Il Consiglio nazionale per lo sviluppo scientifico e tecnologico in collaborazione con fapesp ha fornito ulteriore sostegno (INCT CNPq #465637/2014-0 e FAPESP #2014/50926–0 all'AJC).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well microplates  Kasvi Flat bottom
Activated carbon LABSYNTH Clean up and/or fractionation step
Analytical mill Ika LabortechniK Model A11 Basic
Blood agar plates Laborclin
Chromatographic column C18 Phenomenex Kinetex 150 × 2.1 mm, 2.6 µm, 100Â
Dimethyl sulfoxide  Sigma-Aldrich Vehicle solution
ELISA plate reader Biochrom Ez
Ethanol J. T. Baker For extraction and fractionation steps, and mobile phase composition
Ethanol Sigma-Aldrich Vehicle solution
Ethyl acetate J. T. Baker Fractionation step
GraphPad Software La Jolla GraphPad Prism7
Hexane J. T. Baker Fractionation step
Incubator Thermo Scientific
Isopropanol J. T. Baker For extraction step
Lyophilizer (a freeze dryer) Savant Modulyo
Nylon Millipore LAC 0.22 µm x 13 mm
Orbital shaker Quimis Model G816 M20
Polyamide solid phase extraction cartridge Macherey-Nagel Clean up and/or fractionation step
Silica gel Merck 40–63 μm, 60 Â
Sodium Chloride (NaCl) Synth 0,89% in water
Solid phase extraction cartridges (SPE) Macherey-Nagel Clean up and/or fractionation step
Tryptone Difco
UHPLC-DAD Dionex Ultimate 3000 RS
Ultrasonic bath UNIQUE Model USC 2800
Yeast extract Difco

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Newman, D. J., Cragg, G. M. Natural Products as Sources of New Drugs over the Nearly Four Decades from 01/1981 to 09/2019. Journal of Natural Products. 83 (3), 770-803 (2020).
  2. Wolfender, J. L., Litaudon, M., Touboul, D., Queiroz, E. F. Innovative omics-based approaches for prioritisation and targeted isolation of natural products – new strategies for drug discovery. Natural Product Report. 36 (6), 855-868 (2019).
  3. Michel, T., Halabalaki, M., Skaltsounis, A. New Concepts, Experimental Approaches, and Dereplication Strategies for the Discovery of Novel Phytoestrogens from Natural Sources. Planta Medica. 79 (7), 514-532 (2013).
  4. Jeon, J. G., Rosalen, P. L., Falsetta, M. L., Koo, H. Natural products in caries research: current (limited) knowledge, challenges and future perspective. Caries Research. 45 (3), 243-263 (2011).
  5. Tonetti, M. S., Jepsen, S., Jin, L., Otomo-Corgel, J. Impact of the global burden of periodontal diseases on health, nutrition and wellbeing of mankind: A call for global action. Journal of Clinical Periodontology. 44 (5), 456-462 (2017).
  6. Peres, M. A., et al. Oral diseases: a global public health challenge. Lancet. 394 (10194), 249-260 (2019).
  7. Bowen, W. H., Burne, R. A., Wu, H., Koo, H. Oral biofilms: pathogens, matrix, and polymicrobial interactions in microenvironments. Trends Microbiology. 26 (3), 229-242 (2018).
  8. Paes Leme, A. F., Koo, H., Bellato, C. M., Bedi, G., Cury, J. A. The role of sucrose in cariogenic dental biofilm formation--new insight. Journal of Dental Research. 85 (10), 878-887 (2006).
  9. Koo, H., Falsetta, M. L., Klein, M. I. The exopolysaccharide matrix: a virulence determinant of cariogenic biofilm. Journal of Dental Research. 92 (12), 1065-1073 (2013).
  10. Cury, J. A., de Oliveira, B. H., dos Santos, A. P., Tenuta, L. M. Are dental fluoride releasing materials clinically effective on caries control. Dental Materials. 32 (3), 323-333 (2016).
  11. Mattos-Graner, R. O., Klein, M. I., Smith, D. J. Lessons Learned from Clinical Studies: Roles of Mutans Streptococci in the Pathogenesis of Dental Caries. Current Oral Health Reports. 1, 70-78 (2014).
  12. Rocha, G. R., Florez Salamanca, E. J., de Barros, A. L., Lobo, C. I. V., Klein, M. I. Effect of tt-farnesol and myricetin on in vitro biofilm formed by Streptococcus mutans and Candida albicans. BMC Complementary and Alternative Medicine. 18 (1), 61 (2018).
  13. Ribeiro, S. M., et al. Antimicrobial and antibiofilm activities of Casearia sylvestris extracts from distinct Brazilian Biomes against Streptococcus mutans and Candida albicans. BMC Complementary and Alternative Medicine. 19 (1), 308 (2019).
  14. Pilon, A. C., et al. Metabolômica de plantas: métodos e desafios. Quimica Nova. 43 (3), 329-354 (2020).
  15. Wolfender, J. L., Nuzillard, J. M., Hooft, J. J. J., Renault, J. H., Bertrand, S. Accelerating Metabolite Identification in Natural Product Research: Toward an Ideal Combination of Liquid Chromatography-High-Resolution Tandem Mass Spectrometry and NMR Profiling, in Silico Databases, and Chemometrics. Analytical Chemistry. 91 (1), 704-742 (2019).
  16. Allard, P. M., et al. Pharmacognosy in the digital era: shifting to contextualized metabolomics. Current opinion in biotechnology. 54, 57-64 (2018).
  17. Hubert, J., Nuzillard, J., Renault, J. Dereplication strategies in natural product research: How many tools and methodologies behind the same concept. Phytochemistry Reviews. 16, 55-95 (2017).
  18. Bueno, P. C. P., Pereira, F. M. V., Torres, R. B., Cavalheiro, A. J. Development of a comprehensive method for analysing clerodane-type diterpenes and phenolic compounds from Casearia sylvestris Swartz (Salicaceae) based on ultra-high performance liquid chromatography combined with chemometric tools. Journal of separation science. 38 (10), 1649-1656 (2015).
  19. Bueno, P. C. P., Lopes, N. P. Metabolomics to Characterize Adaptive and Signaling Responses in Legume Crops under Abiotic Stresses. American Chemical Society omega. 5 (4), 1752-1763 (2020).
  20. Blaženović, I., Kind, T., Ji, J., Fiehn, O. Software tools and approaches for compound identification of LC-MS/MS data in metabolomics. Metabolites. 8 (2), 31 (2018).
  21. Eloff, J. N. Quantifying the bioactivity of plant extracts during screening and bioassay-guided fractionation. Phytomedicine: International Journal Of Phytotherapy And Phytopharmacology. 11 (4), 370-371 (2004).
  22. Rios, J. L., Recio, M. C. Medicinal plants and antimicrobial activity. Journal of Ethnopharmacology. 100 (1-2), 80-84 (2005).
  23. Eloff, J. N. A sensitive and quick microplate method to determine the minimal inhibitory concentration of plant extracts for bacteria. Planta Medica. 64, 711-714 (1998).
  24. Eloff, J. N. Avoiding pitfalls in determining antimicrobial activity of plant extracts and publishing the results. BMC Complementary and Alternative Medicine. 19 (1), 106 (2019).
  25. Klein, M. I., Xiao, J., Heydorn, A., Koo, H. An analytical tool-box for comprehensive biochemical, structural and transcriptome evaluation of oral biofilms mediated by mutans streptococci. Journal of Visualized Experiments. (47), e2512 (2011).
  26. Lemos, J. A., Abranches, J., Koo, H., Marquis, R. E., Burne, R. A. Protocols to study the physiology of oral biofilms. Methods in molecular biology. 666, 87-102 (2010).
  27. Venkitaraman, A. R., Vacca-Smith, A. M., Kopec, L. K., Bowen, W. H. Characterization of glucosyltransferase B, GtfC, and GtfD in solution and on the surface of hydroxyapatite. Journal of Dental Research. 74, 1695-1701 (1995).
  28. Vacca-Smith, A. M., Venkitaraman, A. R., Quivey, R. G. Jr, Bowen, W. H. Interactions of streptococcal glucosyltransferases with alpha-amylase and starch on the surface of saliva-coated hydroxyapatite. Archives of Oral Biology. 41, 291-298 (1996).
  29. Van Dijck, P., et al. Methodologies for in vitro and in vivo evaluation of efficacy of antifungal and antibiofilm agents and surface coatings against fungal biofilms. Microbial Cell. 5 (7), 300-326 (2018).
  30. Marsh, P. D. Are dental diseases examples of ecological catastrophes. Microbiology. 149 (2), 279-294 (2003).
  31. Bowen, W. H., Koo, H. Biology of Streptococcus mutans-derived glucosyltransferases: role in extracellular matrix formation of cariogenic biofilms. Caries Research. 45 (1), 69-86 (2011).
  32. Lobo, C. I. V., et al. Dual-species biofilms of Streptococcus mutans and Candida albicans exhibit more biomass and are mutually beneficial compared with single-species biofilms. Journal of Oral Microbioly. 11 (1), 1581520 (2019).
  33. Kim, D., et al. Candida albicans stimulates Streptococcus mutans microcolony development via crosskingdom biofilm-derived metabolites. Scientific reports. 7, 41332 (2017).
  34. Ferreira, P. M. Folk uses and pharmacological properties of Casearia sylvestris: a medicinal review. Anais da Academia Brasileira de Ciencias. 83 (4), 1373-1384 (2011).
  35. Xia, L., Guo, Q., Tu, P., Chai, X. The genus Casearia: a phytochemical and pharmacological overview. Phytochemistry Reviews. 14, 99-135 (2015).
  36. Ferreira, P. M. P., et al. Toxicological findings about an anticancer fraction with casearins described by traditional and alternative techniques as support to the Brazilian Unified Health System (SUS). Journal of Ethnopharmacol. 15, 241 (2019).
  37. Koo, H., Xiao, J., Klein, M. I., Jeon, J. G. Exopolysaccharides produced by Streptococcus mutans glucosyltransferases modulate the establishment of microcolonies within multispecies biofilms. Journal of Bacteriology. 192 (12), 3024-3032 (2010).
  38. Maske, T. T., van de Sande, F. H., Arthur, R. A., Huysmans, M. -C. D. N. J. M., Cenci, M. S. In vitro biofilm models to study dental caries: a systematic review. Biofouling. 33 (8), 661-675 (2017).
  39. Fu, Y., Luo, J., Qin, J., Yang, M. Screening techniques for the identification of bioactive compounds in natural products. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 168, 189-200 (2019).
  40. Sarker, S. D., Nahar, L. An introduction to natural products isolation. Methods in molecular biology. 864, 1-25 (2012).
  41. Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI). Performance standards for antimicrobial susceptibility testing; twenty-fifth informational supplement. Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI). , Wayne, PA. CLSI document M100-S25 (2015).
  42. Saputo, S., Faustoferri, R. C., Quivey, R. G. Jr A drug repositioning approach reveals that Streptococcus mutans is susceptible to a diverse range of established antimicrobials and nonantibiotics. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 62 (1), 01674 (2018).

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Approccio sistematico per identificare nuove molecole antimicrobiche e antibiofilm dagli estratti e dalle frazioni delle piante per prevenire la carie dentale
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Ribeiro, S. M., Fratucelli, É. D.… More

Ribeiro, S. M., Fratucelli, É. D. O., Fernandes, J. M., Bueno, P. C. P., Cavalheiro, A. J., Klein, M. I. Systematic Approach to Identify Novel Antimicrobial and Antibiofilm Molecules from Plants' Extracts and Fractions to Prevent Dental Caries. J. Vis. Exp. (169), e61773, doi:10.3791/61773 (2021).

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