Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

גישה שיטתית לזיהוי מולקולות אנטי-מיקרוביאליות ואנטיביופילם חדשניות מתמציות ושברים של צמחים למניעת עששת שיניים

Published: March 31, 2021 doi: 10.3791/61773
Automatic Translation
*1, *1, *2, 2,3, 2, 1
1Department of Dental Materials and Prosthodontics, School of Dentistry, São Paulo State University (UNESP), 2Department of Organic Chemistry, Institute of Chemistry, São Paulo State University (UNESP), 3Faculty of Pharmaceutical Sciences of Ribeiraão Preto (FCFRP-USP), Department of Physics and Chemistry, University of São Paulo
* These authors contributed equally

Summary

מוצרים טבעיים מייצגים נקודות התחלה מבטיחות לפיתוח תרופות חדשות וסוכנים טיפוליים. עם זאת, בשל המגוון הכימי הגבוה, מציאת תרכובות טיפוליות חדשות מצמחים היא משימה מאתגרת וגוזלת זמן. אנו מתארים גישה פשוטה לזיהוי מולקולות מיקרוביאלית ואנטיביופילם מתמציות צמחים ושברים.

Abstract

מוצרים טבעיים מספקים חומרים שונים מבחינה מבנית, עם מספר עצום של פעילויות ביולוגיות. עם זאת, הזיהוי והבידוד של תרכובות פעילות מצמחים מאתגרים בשל מטריצת הצמח המורכבת ונהלי הבידוד והזיהוי שגוזלים זמן רב. לכן, גישה צעד צעד לסינון תרכובות טבעיות מצמחים, כולל בידוד וזיהוי של מולקולות פעיל פוטנציאלי, מוצג. הוא כולל את האוסף של החומר הצמחי; הכנה ושבר של תמציות גולמיות; כרומטוגרפיה וספקטרומטריה (UHPLC-DAD-HRMS ו- NMR) גישות לניתוח וזיהוי תרכובות; bioassays (פעילויות מיקרוביאלית ואנטיביופילם; חיידקי "חוזק הידבקות" גלולה הרוק מטריצה גלוקן הראשונית שטופלו בטיפולים נבחרים); וניתוח נתונים. המודל הוא פשוט, לשחזור, ומאפשר סינון תפוקה גבוהה של תרכובות מרובות, ריכוזים, וצעדי טיפול ניתן לשלוט באופן עקבי. הנתונים המתקבלים מספקים את הבסיס למחקרים עתידיים, כולל ניסוחים עם התמציות ו/או השברים הפעילים ביותר, בידוד מולקולות, מידול מולקולות למטרות ספציפיות בתאים מיקרוביאליים וביופילמים. לדוגמה, מטרה אחת לשלוט בביופילם קריוגני היא לעכב את הפעילות של ריר סטרפטוקוקוס glucosyltransferases לסנתז את הגלוקנים של המטריצה החוץ תאית. העיכוב של אנזימים אלה מונע הצטברות ביופילם, הפחתת הארסיות שלה.

Introduction

המודלים המוקדמים ביותר של הרפואה המשמשים בחברות התבססו על מוצרים טבעיים (NPs). מאז, בני אדם מחפשים כימיקלים חדשים בטבע שניתן להפוך לסמים1. חיפוש זה גרם לשיפור מתמשך של טכנולוגיות ושיטות לסינון אתנובוטני1,2,3. NPs מציעים מקור עשיר של חומרים מגוונים מבחינה מבנית, עם מגוון רחב של פעילויות ביולוגיות שימושיות לפיתוח טיפולים חלופיים או אדג'ובנטיים. עם זאת, מטריצת הצמח המורכבת אינהרנטית הופכת את הבידוד והזיהוי של התרכובות הפעילות למשימה מאתגרת וגוזלת זמן4.

תרופות מבוססות NPs או ניסוחים ניתן להשתמש כדי למנוע ו / או לטפל במספר תנאים המשפיעים על הפה, כולל עששת שיניים4. עששת דנטלית, אחת המחלות הכרוניות הנפוצות ביותר בעולם, נובעת מהאינטראקציה של תזונה עשירה בסוכר וביופילמים מיקרוביאליים (פלאק דנטלי) הנוצרים על משטח השן שמוביל לדמינרליזציה הנגרמת על ידי חומצות אורגניות המופקות מחילוף חומרים מיקרוביאלי, ואם לא מטופלים, מובילה לאובדן שיניים5,6. למרות מיקרואורגניזמים אחרים עשויים להיות קשורים 7 , ריר סטרפטוקוקוס הואחיידקקריוגני קריטי כי זה אסידוגני, חומצי, ובונה מטריצה חוץ תאית. מין זה מקודד exoenzymes מרובים (למשל, glycosyltransferases או Gtfs) המשתמשים סוכרוז כמומצע 8 כדי לבנות את המטריצה חוץ תאית עשיר exopolysaccharides, שהם ארסית דטרמיננטי9. כמו כן, הפטרייה קנדידה אלביקנס יכול להגביר את הייצור של מטריצה חוץ תאית7. אמנם פלואוריד, מנוהל באופנים שונים, נשאר הבסיס למניעת עששת שיניים10, גישות חדשות נדרשות כמו אדג'ובאנטים כדי להגדיל את האפקטיביות שלה. בנוסף, אופני האנטי-פלאק הזמינים מבוססים על שימוש בסוכנים מיקרובידיאליים רחבי טווח (למשל, כלורהקסידין)11. כחלופה, NPs הם טיפולים פוטנציאליים לשליטה בביופילמים ומניעת עששת שיניים12,13.

ההתקדמות הנוספת בגילוי תרכובות ביו-אקטיביות חדשות מצמחים כוללת צעדים או גישות הכרחיים כגון: (i) שימוש בפרוטוקולים אמינים וניתנים לשחזור לדגימה, בהתחשב בכך שצמחים מראים לעתים קרובות שונות תוך-ספציפית; (ii) הכנת תמציות מקיפות והשברים שלהן בקנה מידה קטן; (iii) האפיון ו/או dereplication של הפרופילים הכימיים שלהם חשבו רכישת נתונים רב ממדיים כגון GC-MS, LC-DAD-MS, או NMR, למשל; (iv) שימוש במודלים בני קיימא ותפוקה גבוהה להערכת ביואקטיביות; (v) בחירת כניסות חדשות פוטנציאליות המבוססות על ניתוח נתונים רב-משתני או כלים סטטיסטיים אחרים; (ו) לבצע בידוד וטיהור של תרכובות ממוקדות או מועמדים מבטיחים; ו -(vii) אימות הפעילויות הביולוגיות המתאימות באמצעות התרכובות המבודדות2,14.

Dereplication הוא תהליך של זיהוי מהיר של תרכובות ידועות תמצית גולמית ומאפשר להבדיל תרכובות הרומן מאלה שכבר נחקרו. חוץ מזה, תהליך זה מונע בידוד כאשר ביואקטיביות כבר תוארה עבור תרכובות מסוימות, וזה מועיל במיוחד לזהות "חובטים תכופים". זה שימש בתהליכי עבודה שונים untargeted החל זיהוי תרכובת גדולה או האצה של שבר מונחה פעילות עד פרופיל כימי של אוספים של תמציות. זה יכול להיות משולב באופן מלא עם מחקרים metabolomic עבור פרופיל כימי untargeted של CE או זיהוי ממוקד של מטבוליטים. כל זה מוביל בסופו של דבר לתעדוף תמציות לפני הליכי הבידוד1,15,16,17.

לכן, בכתב היד הנוכחי, אנו מתארים גישה שיטתית לזיהוי מולקולות מיקרוביאלית ואנטיביופילם מתמציות צמחים ושברים. הוא כולל ארבעה שלבים רב תחומיים: (1) איסוף של חומר צמחי; (2) הכנת תמציות גולמיות (CE) ושברים (CEF), ואחריו ניתוח הפרופיל הכימי שלהם; (3) ביו-אסאי; ו-(4) ניתוחי נתונים ביולוגיים וכימיים (איור 1). לכן, אנו מציגים את הפרוטוקול שפותח כדי לנתח את הפעילויות מיקרוביות ואנטיביופילם של תמציות סילבסטריס קיסטריה שברים נגד ריר סטרפטוקוקוס קנדידה אלביקנס13, כמו גם את ההליכים עבור אפיון פיטוכימי וניתוח נתונים. לפשטות, המוקד כאן הוא להדגים את הגישה לסינון תרכובות טבעיות באמצעות החיידק.

Figure 1
איור 1: תרשים זרימה של הגישה השיטתית לזיהוי מולקולות פעילות מתמציות ושברים של צמחים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. איסוף חומר צמחי

  1. חומר צמחי
    1. רשום את הגישה לחומר הצמחי בפלטפורמות אלקטרוניות המסדירות את הגישה למורשת גנטית בארץ בה יתקיים האוסף. לדוגמה, בברזיל, להירשם עם המערכת הלאומית לניהול מורשת גנטית וידע מסורתי הקשורים – SisGen (אתר https://sisgen.gov.br/paginas/login.aspx).
    2. לאסוף דגימות של חומר הצמח של עניין (למשל, עלים, גבעולים, שורשים, פרחים, פירות). הירשם אם החומר נאסף במהלך הרבייה או השלב הצמחי.
    3. רשום את פרמטרי האיסוף (תאריך, הפניה גיאוגרפית, טמפרטורה שנתית ממוצעת ואחוז לחות ממוצע).
    4. זהה את הדגימות במדויק, ו טקסונום חייב לאשר את האותנטיות.
  2. ייצוב ואחסון דגימות צמחים
    1. יש להפריד איברי צמחים בשקיות פלסטיק או בבקבוקים בודדים מיד לאחר האוספים.
    2. להשבית תגובות אנזימטיות פוטנציאליות על ידי (i) הקפאה מיד חנקן נוזלי, (ii) התייבשות בתנור אוויר במחזור (40 °C), או (iii) להקפיא ייבוש הדגימות על ידי ליאופיליזציה.
    3. יש לאחסן את החומר המייצב בשקיות אטומות הרמטית בטמפרטורת החדר או במקפיא עד לשימוש (-20 או -80 מעלות צלזיוס, בהתאם לתקופת האחסון או לשימוש המיועד).
    4. טוחנים את הדגימות בטחנה אנליטית (סכין או כדור, בהתאם לסוג הרקמה או לזמינות) ומתקננים את גודל החלקיקים באמצעות סיבים סטנדרטיים.
    5. לשקול את הדגימות בנפרד עבור שלבי החילוץ הבאים.

2. הכנת תמציות גולמיות (CE) ושברים (CEF) לניתוח פרופיל כימי וביו-אסאי

  1. הכנת תמציות גולמיות (CE)
    הערה: השלבים מודגמים בתרשים הזרימה באיור 2A.
    1. הכן ממס מיצוי עם תערובת הידרואלקוהולית (למשל, אתנול (EtOH) 70% או תערובות טרנריות של מים, EtOH, ומכפילים אחרים, המוגדרים על ידי העיצוב הניסיוני של על פי דיווחים קודמים).
    2. השתמש במשקל מדגם היחס (משקל יבש, מ"ג)/ ממס מיצוי (מ"ל) משתנה בין 50 ל 100 מ"ג עבור כל מ"ל של ממס.
    3. עבור עקירות מהירות הניתנות לשחזור, השתמש עקירות אצווה באמצעות microtubes.
      הערה: יש להשתמש לפחות בשלושה שכפולים בשלב זה כדי לאפשר ניתוח סטטיסטי.
    4. בצע עקירות בסיוע אולטרסאונד (איחוד האמירויות הערביות) כדי להפוך אותו למהיר, קל וזול.
    5. חזור על ההליך שלוש פעמים (15 דקות כל אחד) לקבלת היעילות הטובה ביותר.
    6. לאחר כל שלב החילוץ, decant שאריות מוצק על ידי צנטריפוגה ולהסיר את supernatant.
    7. שלב את supernatants בנפרד, לסנן, ולשמור aliquots לניתוח כימי בו זמנית bioassays. במידת הצורך, להסיר את ממס חילוץ תחת ואקום, זרימת חנקן, או lyophilization, ולרשום את המשקל והתשואה.
    8. יש לאחסן ב-20°C מוגן מפני אור.
      הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן כדי לסנן את CE ולבחור את אלה המציגים את הפעילות הרצויה.
  2. שבר של תמציות גולמיות (CEF)
    הערה: השלבים מודגמים בתרשים הזרימה באיור 2B.
    1. השתמש במחסניות עם לפחות גרם אחד של ספיחה. אם אלקלואידים נמצאים פוטנציאליים ב- CE, השתמש בממסים המכילים 0.1% של חומצה פורמית (FA).
    2. לדלל מדגם בממס המתאים ביותר (או תערובת ממס) כדי לקבל פתרון מדגם 100 מ"ג / מ"ל. לאחר מכן, להעביר 1 מ"ל של הפתרון מדגם מותנה מראש מחסניות מיצוי שלב מוצק - SPE (1 גרם של ספיחה, 6 מ"ל של קיבולת).
    3. בצע את השבר באמצעות כשלושה כרכים מתים של כל מיצוי eluent (מחסנית של 1 גרם, זה יתאים 2 מ"ל של כל ממס). אם אלקלואידים נמצאים פוטנציאל ב- CE, להשתמש בממסים המכילים 0.1% של FA.
    4. לאסוף שבר אחד על ידי הרכב eluent ולשמור aliquots לניתוח כימי בו זמנית bioassays.
    5. הסר את הממס תחת ואקום, זרימת חנקן, או lyophilization ולרשום את המשקל ואת התשואה.
      הערה: אם קשה להתמוסס בתערובת ההתפוגגות הראשונית, פזר את CE בשלב מוצק (למשל, C18 או celite) בפרופורציה של 1:1 (w/w) לפני טעינת החומר בחלק העליון של המחסנית.
      אזהרה: לשקול את microtubes מראש כדי לחשב את התשואה ההמונית של תמציות שברים.
  3. ניתוח פרופיל כימי
    הערה: בהתחשב בכך שכל מין צמח דורש שיטות ממוטבות וספציפיות לניתוח הכימי שלו, בסעיפים הבאים, אנו מתארים את הגישות האנליטיות הנפוצות ביותר המשמשות לניתוח חומרים צמחיים. כדוגמה מעשית, כרומטוגרפיה נוזלית הפוכה פותחה ואמתה לניתוח בו זמנית של תרכובות פנוליות ודיטרפנים מסוג קלרודן באופן דיפרנציאלי שעברו ביוסינתזה על ידי שני סוגים של סילבסטריאס קסטריה שוורץ (Salicaceae). המנגנון UPLC-DAD היה מצויד degasser, משאבה quaternary, סמפלר אוטומטי, גלאי מערך UV-Vis photodiode, ותנור (ראה פרטים בבואנוס ואח '. 201518). גישות דומות המתוארות בדוגמאות הבאות יכולות להיות ממוטבות על פי מיני צמחים אחרים ו /או חומרים צמחיים.
    1. אפשרויות ניתוח ומיקוף כרומטוגרפיות
      1. להפרדות באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים במיוחד (UPLC), השתמש בעמודה כרומטוגרפית C18 (לדוגמה, 150 × 2.1 מ"מ, 2.6 מיקרומטר, 100 Å) המוגנת על-ידי עמודה תואמת לפני הטור.
        הערה: ניתן להשתמש בשלבי עמודה אחרים או במצבים כרומטוגרפיים בהתאם למין/חומר הצמחי. HPLC קונבנציונלי יכול לשמש גם; במקרה זה, יש לבחור עמודה כרומטוגרפית מתאימה. כדי להשיג הפרדות צבע מצוינות, התאם את התנאים הכרומטוגרפיים בהתחשב בקצב הזרימה (μL/min), טמפרטורת העמודה (°C) ונפח ההזרקה (μL). השלב הנייד מורכב בדרך כלל ממים (A) ואצטוניטריל או מתנול (B) באמצעות שיפוע elution ליניארי או רב צעדים או elution isocratic. ניתן להשתמש גם במגבילים כגון חוצצים, חומצות, בסיסים או אחרים.
      2. בצע את ניתוח החומר הצמחי (CE ו/או CEF) ורשום את כל הנתונים הקשורים, כגון נתונים ספקטרליים (באמצעות UV-Vis ו/או, באופן מועדף, גלאי MS), זמן שמירה (מינימום) ואחרים, בהתאם למיקוף הזמין.
        הערה: כרומטוגרפיה נוזלית (LC) היא בדרך כלל מקף (יחד) עם ספקטרומטריית מסה ברזולוציה גבוהה (HRMS), כמו LC-HRMS, והוא משמש בדרך כלל עבור ביאור מהיר של מטבוליט ב CE ou CEF15.
      3. אם נדרשים נתונים איכותיים ויש צורך בנתונים כמותיים, הכינו והזריקו בזהירות עקומות כיול, בהתאם לאותו פרוטוקול.
        הערה: הפיתוח של התנאים הכרומטוגרפיים הטובים ביותר יכול להתבצע בסיוע תכנון ניסויים, כפי שתואר על ידי בואנו ואח '. 201518, או ספרות דומה. חשוב לשקול הכללת סטנדרטים פנימיים במהלך פיתוח השיטה. הם מוערכים מאוד שכן הם מאפשרים סטיות טכניות נכונות במהלך הכנת מדגם וזריקות, ונורמליזציה נוספת לניתוח נתונים.
  4. ניתוח נתונים רב-משתני ובלתי-משתני
    1. יצא את הכרומטוגרמות הרשומות בתבנית מתאימה (למשל, ASCII, .txt או תבנית .csv). ניתן להגדיר מטריצת נתונים בודדת על-ידי צירוף ויישור הכרומטוגרמות אם מנתחים מספר דגימות ונדרשות השוואות. המטריצות המתקבלות חייבות להיות מנורמלות הכרומטוגרמות בהתאם לתקן הפנימי המשמש.
    2. לנתח את נתוני metabolomics הצמח באמצעות שיטות רב משתני ו univariate. גלה והצג באופן חזותי ערכות נתונים של metabolomics באמצעות ניתוח בו-זמני של משתנים מרובים באמצעות שיטות סטטיסטיות מרובות משתנים, כולל ניתוח רכיבים ראשיים (PCA) ללא השגחה וניתוח קיבוץ באשכולות הירארכי (HCA), או ניתוח ריבועים חלקיים מפוקחים (כגון PLS, OPLS, PLS-DA). שיטות univariate, כגון ANOVA, סטודנט, Tukey ו- t-test של וולש, מעניינים במיוחד לניתוח מדויק של הבדלים כמותיים בין דגימות19.
  5. ביאור דרפליציה ותרכובות
    הערה: מטרת שלב זה מוקדשת לזיהוי מקוון מהיר של NPs ידועים כדי למנוע בידוד מייגע שניתן לבצע בו-זמנית לניתוח הנתונים החד-משתני או הרב-משתני.
    1. בצע את רמות הזיהוי של התרכובות שזוהו או של תרכובות היעד:
      1. תרכובת מזוהה, כולל מבנה תלת-ממדי מלא וסטריאוכימיה (רמה 0);
      2. זיהוי שהושג על-ידי שני פרמטרים אורתוגונליים, כגון זמן שמירה וספקטרום MS/MS (רמה 1);
      3. תרכובות מבוארים בפוטיביות וכיתות מורכבות (רמות 2 ו -3);
      4. מטבוליטים לא מזוהים או לא מסווגים שניתן להבדיל ביניהם בהתבסס על נתונים אנליטיים (רמה 4)19,20.
    2. לאפיין את התרכובות הידועות באמצעות מסדי הנתונים המסחריים או הציבוריים. בין מסדי הנתונים החשובים ביותר, ניתן להדגיש אותו: NIST (https://www.nist.gov), ויילי (https://www.sisweb.com/software/ms/wiley.htm), MassBank (https://massbank.eu/MassBank/), GMD (http://gmd.mpimp-golm.mpg.de/), METLIN (https://metlin.scripps.edu), ואת גלובל מוצרים טבעיים רשתות מולקולריות חברתיות – מסד נתונים GNPS (https://gnps.ucsd.edu)19.
      הערה: ישנן רמות שונות של ביאורים והם תלויים בטכניקת המיקוף המשמשת במהלך המחקר ועשויים לכלול: סיוע של מסדי נתונים ספקטרליים מבוססי MS (או NMR), ובאלגוריתמים חיזוי ספקטרלי silico.
    3. בידוד, טיהור וזיהוי מורכב מלא
      הערה: אם תרכובת נתונה (שזהותה נחשדה בשיטות הסטטיסטיות) זקוקה לזיהוי מבני מלא, הצעד הראשון לביצוע משימה זו הוא לבודד ולטהר את התרכובות הרצויות בקנה מידה גדול יותר. ניתן להשיג זאת על-ידי שינוי קנה המידה של הפרוטוקולים שכבר פותחו.
      1. בצע את הבידוד המהיר והי ישיר של תרכובת היעד (ים) על ידי טכניקות כרומטוגרפיות הכנה מבוססות וממוטבות היטב. HPLC מוכן למחצה עם הזרקת עומס יבש יכול לשמש כדי למנוע את הפשרות כי בדרך כלל צריך להיעשות בין טעינה גבוהה מדגם solubilization1.
      2. השלם את האפיון המבני המלא וזיהוי של תרכובות מבודדות. זה יכול להתבצע באמצעות שילוב של טכניקות שונות:
        1. תהודה מגנטית גרעינית (NMR);
        2. ספקטרומטריית מסה (MS);
        3. טכניקות ספקטרומטריות באזורים אולטרה סגולים (UV) ואינפרא אדום (IR) שימושיות מאוד גם לאפיון הקבוצות הפונקציונליות;
        4. השימוש בספקטרוסקופיה כירופטית כגון דיכרואיזם מעגלי אלקטרוני ורטטי (ECD ו- VCD, בהתאמה), פעילות אופטית ראמאן (ROA) וקריסטלוגרפיה של קרני רנטגן הן טכניקות חשובות לאפיון תצורה מוחלט.

3. ביו-אסאי

הערה: סינון ביולוגי: כדי להעריך במהירות את הביואקטיביות הפוטנציאלית של CE ו- CEF, ההקרנה הראשונית של חומרים טבעיים צריכה להיות מאורגנת וישירה.

  1. הכנת CE ו- CEF לביו-אסאי
    1. לשקם את החומר היבש עם הממסים הטובים ביותר האפשריים (אשר ניתן לקבוע באופן ניסיוני). העיצוב הניסיוני21,22 מגדיר את פתרון המלאי ואת ריכוז הממסים.
    2. לחשב את ריכוז הממס של פתרון המניה. לשם כך, השתמש בנוסחה: C1 x V1 = C2 x V2, כאשר C1 מייצג את פתרון המניות (mg) של CE ו/ או CEF; V1 מייצג את נפח הממס; C2 הוא המשקל של CE ו / או CEF; V2 הוא הנפח הסופי (mL) של פתרון המניה.
      הערה: לדוגמה, בחרנו 84.15% EtOH ו 15% דימתיל סולפוקסיד (DMSO) כריכוז הממס של פתרון המניה. הכנו את ריכוז המלאי של CE ל 6 מ"ג / מ"ל ואת CEF ל 1 מ"ג / מ"ל13. הממס לדלל את CE ו- CEF יהיה תלוי בשיטת ההערכה של הפעילות הביולוגית. הממס המשמש כרכב אסור להפריע לפעילות ביולוגית וטוקסיקולוגית. בדרך כלל, מים, DMSO, EtOH, או ממס מימי המבוסס על EtOH משמש כדי solubilize תמציות צמחים או נגזרות צמח4,13.
  2. הכנת אורגניזמים מבחן
    1. להפעיל מחדש זן מיקרוביאלי, למשל S. mutans UA159 על אגר דם (48 שעות, 37 °C (77 °F, 5% CO2), ותרבות זה בינוני תרבות נוזלית (למשל, תמצית טריפטון שמרים מרק תמצית [TYE: 2.5% (w / v) טריפטון עם 1.5% (w / v) תמצית שמרים] המכיל 1% גלוקוז (w / v) (TYEg) עבור 16 שעות, 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2.
    2. בצע דילול של 1:20 של התרבות הראשונית של המיקרואורגניזם באותו מדיום תרבות (יחס הדילול של התרבות הראשונית עשוי להשתנות בהתאם לעיצוב הניסיוני).
    3. דגירה עד שהוא מגיע לשלב הצמיחה באמצע יומן.
    4. הכינו את האינוקולום לביו-אסאי עם אוכלוסייה מוגדרת (למשל, 2x106 יחידות יוצרות מושבה למיליליטר - CFU/mL) ב- TYEg למטענים מיקרוביאליים ו- TYE עם 1% סוכרוז (w/v) (TYEs) למטעני ביופילם.
      הערה: תנאי הגדילה יהיו תלויים במיקרואורגניזם שנבדק.
  3. פעילות מיקרוביאלית
    הערה: השלבים מאוירים באיור 3.
    1. בצלחת 96-באר, להוסיף aliquot (μL) של CE ו / או CEF פתרון מלאי (טיפולים). היקף העלייה מוגדר על ידי ריכוז הבחינה, שיש לבחור על סמך מחקרים קודמים. לדוגמה, כדי לבדוק CE בריכוז הבדיקה 0.5 מ"ג / מ"ל, להשתמש 16.67 μL aliquot של פתרון המניה ב 6 מ"ג / מ"ל. לחישוב זה, השתמש בנוסחה: C1 x V1 = C2 x V2, כאשר C1 הוא ריכוז המניה, V1 הוא הנפח של aliquot פתרון המניה, C2 הוא ריכוז הבדיקה, ו- V2 הוא הנפח של צלחת 96-well (אשר תואם 200 μL). במצב ניסיוני זה, ריכוז הבדיקה של הממסים (רכב) יהיה 7% EtOH ו 1.25% DMSO.
    2. כלול סט של פקדים עבור כל צלחת: עמודה עם טיפולים, ללא אינוקולום (שליטה ריקה לכל טיפול, לעזור להבדיל בין עכירות על ידי הטיפול המשמש את עצמו מצמיחה מיקרוביאלית); עמודה עם רכב אינקולום (דילול של CE או CEF או 0 מ"ג / מ"ל שליטה); עמודה עם מדיום התרבות בלבד (שליטה בינונית בתרבות) ועמודה עם inoculum בלבד (בקרת גדילה מיקרוביאלית).
    3. באמצעות TYEg, כוונן את עוצמת הקול ל- 100 μL. לאחר מכן, דגירה, למשל, 24 שעות, 37 °C (70 °F), 5% CO2 (בהתאם מיקרואורגניזם נבדק).
    4. לחסן 100 μL של מיקרואורגניזם inoculum (1x 106 CFU / מ"ל) לתוך צלחת 96-well.
    5. לנתח את הגידול החיידקי על פי עכירות על ידי בדיקה חזותית של בארות (ברור או מעונן). ברור: אומר שאין צמיחה חזותית של המיקרואורגניזם. מעונן: אומר שיש צמיחה חזותית של מיקרואורגניזם.
    6. מדידת הספיגה (צפיפות אופטית או O.D.) של תרבות החיידקים בכל באר (קורא ELISA באמצעות 540 ננומטר). לאחר מכן, להעביר 100 μL של התרבויות microtubes המכיל 900 μL של תמיסת מלח (0.89% NaCl), לערבב היטב על ידי מערבולת. לאחר מכן, המשך לבצע דילול טורי פי עשרה עד לערך הרצוי.
    7. לחסן aliquot של הדילול הרצוי בלוחות אגר ספציפיים (כפול). לדוגמה, 10 μL של דילול מסוים על צלחות אגר דם.
    8. דגירה, דגירה. התנאים יכולים להשתנות בין מיקרואורגניזמים, למשל, S. mutans: 48 שעות, 37 °C (69 °F), 5% CO2.
    9. בצע ספירת מושבות על הלוחות עבור טרנספורמציה מאוחרת יותר לתוך CFU / mL כמו(מספר מושבות x 10n)/q. בנוסחה זו,n שווה לערך המוחלט של הדילול (0, 1, 2 או 3), ו- q שווה לסכום, ב- mL, pipetted עבור כל דילול מצופה על צלחת אגר. כמו כן, ניתן להמיר את ה- CFU/mL לערכי יומן רישום.
      הערה: כאשר תמציות צמחים מתווספות למדיום התרבות, עלולים להתרחש משקעים של חלקיקים מהתמציות. עובדה זו עלולה להקשות על פירוש התוצאות. אותו הדבר מתרחש כאשר קורא microplate מודד את עכירות כמו, במקרים מסוימים, תאים להגוש על החלק התחתון של microplate. בנוסף, בהתאם לתמצית המשמשת, צבע תמציות עלה הצמח יכול להקשות על כימות עכירות23,24. שיטה חלופית משתמשת צבעים לחשוף אם התאים המיקרוביאליים פעילים מטבולית או לא24.
  4. פעילות אנטיביופילם
    הערה: השלבים להערכת השפעת הטיפולים על היווצרות הביופילם מודגמים באיור 4.
    1. היווצרות ועיבוד של ביופילמים
      1. לדלל טיפולים בתרבות בינונית (TYEs) בצלחת 96-באר כמתואר בשלבים של פרוטוקול פעילות מיקרוביאלית.
      2. דגירה את הצלחת. בדוגמה עם S. mutans, הדגירה מבוצעת במהלך 24 שעות, ב 37 °C (69 °F) ו 5% CO2.
      3. לאחר הדגירה, מניחים את הצלחות על שייקר מסלולית (5 דקות, 37 מעלות צלזיוס, 75 סל"ד) כדי לשחרר את התאים שאינם דבקים בביופילם. לאחר מכן, להשליך את מדיום התרבות המכיל את התאים שאינם דבקים, ולשטוף את הביופילמים הנותרים שלוש פעמים עם 0.89% NaCl כדי להסיר תאים שאינם חסידים.
    2. כימות ביומסה מביופילמים מטופלים
      הערה: השלבים מודגמים בתרשים הזרימה באיור 4A.
      1. שמור את biofilms שטף על הצלחת ולהוסיף 50 μL של 1% פתרון מימית סגול גביש לכל באר.
      2. דגירה את הצלחת בטמפרטורת החדר במשך 35 דקות.
      3. לשטוף את בארות מוכתם עם מים MilliQ (שלוש פעמים) ולאחר מכן אוויר לייבש אותם במשך 60-90 דקות.
      4. יש ללט את סגול הגביש מהבארות המוכתמות ב-200 μL של 99% EtOH על ידי דגירה של הצלחת בשייקר מסלולי (5 דקות, 37 מעלות צלזיוס, 75 סל"ד).
      5. להעביר aliquot 150 μL מכל באר עם צבע eluted לצלחת אחרת לכמת את ביומסה מדגם (קורא ELISA 570 ננומטר).
    3. כימות האוכלוסייה המיקרוביאלית בת קיימא (CFU/mL) של הביופילמים המטופלים
      הערה: השלבים מודגמים בתרשים הזרימה באיור 4B.
      1. הסר את הביופילמים שטופים מהצלחת עם פיפטה ו 200 μL של NaCl 0.89% ולהעביר את ההשעיה וכתוצאה מכך בנפרד כדי microtubes סטרילי.
      2. השתמש 200 μL נוספים של NaCl 0.89% לבאר ולהעביר אותו לצינור המתאים, כבר מכיל 200 μL של המתלה biofilm הראשונית. בצע תהליך זה עד להגעה להשעיה כוללת של 1 מ"ל biofilm לכל באר מקורית.
      3. השתמש aliquot מכל צינור לבצע דילול סדרתי פי עשרה.
      4. לחסן aliquot של הדילול הרצוי בלוחות אגר ספציפיים (כפול). לדוגמה, 10 μL של דילול מסוים על צלחות אגר דם.
      5. דגירה צלחות אגר (למשל, 48 שעות, 37 °C (77 °F), 5% CO2), ולאחר מכן לספור את המושבות כדי לקבוע את CFU / mL כמתואר לעיל.
  5. שלב אימות פעילות ביולוגית
    1. היווצרות גלולות רוק
      1. השתמש חרוזי הידרוקסיאפטיט (HA) (מקרו-Prep קרמיקה הידרוקסיאפטיט סוג I 80 מיקרומטר) כמשטח כדי ליצור את סרט הרוק25. החרוזים האלה מחקים אמייל דנטלי.
      2. שוקלים את חרוזי HA (למשל, 10 מ"ג) במיקרו-צינוריות וחטאו. לאחר מכן, השתמש במאגר ספיחה (מאגר AB: 50 mM KCl, 1 mM KPO4, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, ב dd-H2O, pH 6.5]25 המכיל 0.1 mM פנילמטילסולפוניל פלואוריד (PMSF) ו 0.02% נתרן אזיד (NaN3) לשטוף את החרוזים.
      3. לאסוף ולהכין רוק אנושי26. יש צורך באישור ועדת האתיקה המוסדית.
      4. הוסף 500 μL של רוק לתוך microtubes ודגרת (40 דקות, 37 °C (70 °F, 24 סל"ד).
      5. לאחר מכן, להסיר את הרוק supernatant ולשטוף את החרוזים (שלוש פעמים עם מאגר AB המכיל PMSF ו NaN3). חרוזי sHA (חרוז HA עם גלולות רוק) מוכנים כעת למבחנים במורד הזרם.
        הערה: הרוק נאסף ממתנדבים בריאים. לאחר האיסוף, לדלל את הרוק (1: 1 v / v) עם מאגר AB וצנטריפוגה (1699 x g, 20 דקות, 4 מעלות צלזיוס). לעקר על ידי סינון (מסנן קרום polyethersulfone עם כריכה נמוכה 0.22 μm חלבונים)26. ועדת האתיקה המוסדית חייבת לאשר את המחקר. במקרה שלנו, ועדת האתיקה של המוסד אישרה את המחקר (CAAE: 68161417.0.0000.5416).
    2. ניתוק של S. mutans לאחר הידבקות הרוק הסרט גלוקנים שטופלו תמציות נבחרות
      1. טפחו את המיקרואורגניזם עד לשלב הצמיחה באמצע היומן, כמתואר לעיל.
      2. כאשר תרבויות הגיעו O.D. הרצוי, צנטריפוגה (4000 × גרם במשך 20 דקות), לשטוף עם 0.89% פתרון NaCl ולהשעין מחדש את גלולה עם 0.89% NaCl באמצעות נפח ראשוני זהה של מדיום התרבות.
      3. אם משתמשים סטרפטוקוצ'י, כגון S. mutans, sonicate את התרבויות עם בדיקה כדי dechain (30 s, 7 W, שלוש פעמים). אם משתמשים באורגניזם של תא יחיד, ניתן לדלג על שלב זה.
      4. בדוק את O.D. (540 ננומטר) כדי להתאים את הריכוז ל 2 x 106 CFU / mL.
    3. הידבקות של S. mutans ל pellicle הרוק (sHA) וניתוק של תאים דבקים
      הערה: השלבים מודגמים בתרשים הזרימה באיור 5.
      1. השג את דגימות sHA כמתואר לעיל.
      2. הוסף aliquot (בדוגמה, אנו מוסיפים 500 μL) של טיפולים נבחרים (בריכוז הבדיקה; למשל, 0.5 מ"ג / מ"ל) או פקדים microtubes המכיל דגימות של sHA.
      3. דגירה דגימות sHA עם טיפולים או פקדים (30 דקות, 37 מעלות צלזיוס, 24 סל"ד); לאחר מכן, לשטוף את החרוזים שלוש פעמים עם מאגר AB (המכיל PMSF ו NaN3).
      4. הוסף את תרבות המיקרואורגניזם. בדוגמה, אנו מוסיפים 500 μL של S. mutans תרבות (2 x 106 CFU / mL) לכל microtube.
      5. דגירה (1 שעות, 37 °C (70 °F, 24 סל"ד) ולאחר מכן להסיר תאים לא מאוגדים על ידי כביסה שלוש פעמים עם מאגר AB.
      6. Resuspend כל מדגם עם aliquot (בדוגמה, אנו מוסיפים 1000 μL) של מאגר AB sonicate עם בדיקה (30 s, 7 W).
      7. השתמש aliquot של כל השעיה עבור דילול סדרתי פי עשרה כדי לקבוע את מספר המושבות קיימא על ידי ציפוי על לוחות אגר ספציפיים (48 שעות, 37 °C (70 °F), 5% CO2). לאחר מכן, לספור את המושבות כדי לקבוע את CFU / mL כמתואר לעיל.
        הערה: השלב של sonicate מבוצע כדי לנתק תאים דבק sHA.
    4. הידבקות של S. mutans למטריצה הגלוקנית הראשונית (gsHA) וניתוק של תאים דבקים
      הערה: השלבים מודגמים בתרשים הזרימה באיור 6. האנזים GTFB טוהר מתרבות סטרפטוקוקוס מילרי KSB8 שתוכננה לייצר GTFB. הטיהור בוצע עם עמוד כרומטוגרפיה המכיל חרוזי הידרוקסיאפטיט באמצעות מאגרים המכילים שני מעכבי פרוטאז (0.1 mM PMSF ו 0.02% NaN3)27,28. לאחר מכן, האנזים נבדק על ג'ל אקרילאמיד (SDS-PAGE) ומוכתם בחנקת כסף. Aliquots של האנזים אוחסנו ב -80 מעלות צלזיוס עד השימוש.
      1. השג את דגימות sHA כמתואר לעיל. לאחר מכן, להוסיף aliquot (בדוגמה, אנו מוסיפים 500 μL) של אנזים GTfB לכל צינור דגירה הומוגניזר (40 דקות, 37 °C (70 °F, 24 סל"ד). לאחר מכן, לשטוף שלוש פעמים עם מאגר AB (המכיל PMSF ו NaN3).
      2. הוסף aliquot (למשל, 500 μL) של מצע סוכרוז (100 mmol של סוכרוז) המכיל את הטיפולים (או שולט-בריכוז הבדיקה, למשל, 0.5 מ"ג / מ"ל) לכל microtube.
      3. דגירה הדגימות הומוגניזר (4 שעות, 37 °C (60 °F, 24 סל"ד). לאחר מכן, לבצע שלוש שטיפות עם חוצץ AB (עם PMSF ו NaN3) כדי להסיר את הטיפולים עודף של סוכרוז לא שולבו glucans מסונתז (דגימות של gsHA).
      4. הוסף aliquot (בדוגמה, אנו מוסיפים 500 μL) של S. mutans inoculum (2 x 106 CFU / mL) לכל microtube.
      5. דגירה ב הומוגניזר (1 שעות, 37 °C (70 °F, 24 סל"ד) ולשטוף שלוש פעמים עם מאגר AB (עם PMSF ו NaN3) כדי להסיר תאים לא מאוגדים.
      6. Resuspend כל מדגם עם aliquot (למשל, 1000 μL) של מאגר AB (עם PMSF ו NaN3) ו sonicate עם בדיקה כדי לנתק תאים דבק gsHA (30 s, 7 W).
      7. השתמש aliquot של כל השעיה עבור דילול סדרתי פי עשרה כדי לקבוע את מספר המושבות קיימא על ידי ציפוי על לוחות אגר ספציפיים (48 שעות, 37 °C (70 °F), 5% CO2). לאחר מכן, לספור את המושבות כדי לקבוע את CFU / mL כמתואר לעיל.

4. ניתוח נתונים ביולוגיים

  1. נתוני ביו-אסאייס
    1. הזן נתונים גולמיים עבור bioassays בגיליון אלקטרוני. לחשב את היומן של עיכוב צמיחה מיקרוביאלית על ידי כל טיפול כמו(CFU / mL של טיפולים + 1) x יומן10. לאחר מכן, לחשב את אחוז יומן של עיכוב צמיחה מיקרוביאלית, לעומת בקרת רכב באמצעות(יומן10 CFU / מ"ל של טיפול/ כלומריומן 10 CFU / מ"ל של בקרת רכב) x 100%.
    2. תיקון O.D. של תרבויות פלנקטוניות וביומסה שטופלו על ידי טיפולים (CE ו- CEF מטופלים קבוצות) ועל ידי בקרת רכב (שליטה שלילית). לתיקון, הפחת את ספיגת בארות מטופלות מזה המתקבל בבארות המכילות רק מדיום תרבות (Ablank) כמו(A קבוצות מטופלות בינוני /A אמצעי שליטה שלילית) x 100%.
    3. לאחר תיקון זה, לחשב את אחוז עיכוב ביומסה, לעומת בקרת רכב כמו(ביומסה מטופלת/ ממוצעבקרת רכב) x 100%.
    4. שלח את הנתונים הגולמיים שנוצרו לצורך ניתוח סטטיסטי של הנתונים באמצעות תוכנה ספציפית.
      הערה: הפרשנות של האפקטיביות של טיפול נתון נקבעת באמצעות נקודות עצירה, כגון IC50/IC90. ערכים אלה מוגדרים כריכוז המינימלי של טיפול המסוגל לעכב 50% ו -90%, בהתאמה, של צמיחת חיידקים או היווצרות ביופילם24. פרמטרים אלה יכולים לסייע בפירוש הנתונים ולספק בסיס לבחירת תרכובות עם פעילות טובה יותר13,29.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

אנו מספקים דוגמה לשימוש בגישה שיטתית כדי לסנן את הפעילות הביולוגית של תמציות צמחים ושברים כדי לזהות מולקולות פוטנציאליות פעילות לטיפולים אפשריים חדשים נגד מכוניות: פעילויות אנטי מיקרוביולוגיות ואנטיביופילם של תמציות סילבסטריס של קסריה מביומס ברזילאי מובהק נגד ריר סטרפטוקוקוס וקנדידה אלביקנס13.

רקע
אינטראקציות מורכבות בין מיקרואורגניזמים אוראליים ספציפיים-מארח גורמים-דיאטה עשירה סוכרוז עמילן יכול לווסת את היווצרות של biofilms פתוגניים ליזום תהליך קריוגני30,31. S. mutans מתזמר את הפתוגניות של biofilms הקשורים להתפתחות עששת שיניים כי זה מייצר GTFs אחראי על סינתזת exopolysaccharides, מלבד אסידוגניות שלה חומציות31. בנוסף, GTFS מאפשר הידבקות של קנדידה אלביקנס (ומיקרואורגניזמים אחרים), הגדלת הארסיות של הביופילם32,33. ערכנו הקרנה של פעילויות אנטי מיקרוביאלית ואנטיביופילם של C. תמציות עלה סילבסטריס שברים מן הביומים הברזילאים השונים, השייכים זנים לינגואה וסילבסטריס נגד S. mutans ו C. אלביקנס13. ג. סילבסטריאס (ב אנגלית: C. sylvestris) הוא חלק מהשימוש הפופולרי והמסורתי בברזיל, ובמדינות אחרות בדרום אמריקה ובאסיה34,35. צמח זה מצוטט "הרשימה הלאומית של צמחי מרפא עניין SUS" (RENISUS), אשר מכיל 71 מינים שיכולים לטפל במחלות עם שכיחות גבוהה בברזיל36. הפרופיל הכימי של תמציות עלים של var. sylvestris מציג הרכב פיטוכימי עשיר, עם דיטרפנים בשפע35, בעוד תרכובות פנוליות (בעיקר פלבנואידים) שולטים var. lingua18.

אנו משתמשים בגישה המתוארת בפרוטוקול כדי לזהות אילו תמציות ושברים של C. sylvetris הם הפעילים ביותר עבור מיקרואורגניזמים מוערך, ועל סמך התוצאות באמצעות מודלים פשטניים, אנו בוחרים אילו טיפולים ייבדקו בדגמים מורכבים במבחנה (דיסקים hydroxyapatite, מיקרוקוסמוס)37,38. כאן, אנו מציגים את תוצאות ההקרנה של שנים עשר לספירה נגד S. mutans. ההתמקדות היא להדגים את התועלת של גישה זו לסינון תרכובות טבעיות במקום לפרש ולדון בנתונים.

אספנו את העלים של יחידים משני הזנים של C. sylvestris משנים עשר אוכלוסיות שונות בברזיל, הכוללים תצורות שונות של ביומים ברזילאי (אנא, ראה פרטים Ribeiro et al. 201913). האוסף בוצע בין יוני לספטמבר 2012 ו-2013 (SisGen; רשום #A00892A). אנו ממליצים לאסוף דגימות מייצגות, כולל אנשים של כימותרפיות שונות וביומים שונים, כדי לטפל בשונות הכימית של מטבוליטים משניים. אם זמין, יש לאסוף לפחות 3 עד 5 אנשים. מידע קודם לגבי שונות כימית infraspecific הצמח צריך להיחשב גם כמתואר על ידי Ribeiro et al. 2019 ו בואנו ואח '. 201513,18. ההרכב הכימי של ה-CE נבדק על ידי הכרומטוגרפיה שצוטטה בשלב 2 ואנו מספקים את הפרופיל הכימי באיור 7. ניתוח הפרופיל הכימי חיוני כדי לשלב את הפרשנות של נתונים המתקבלים בהקרנה ביולוגית.

ה- CEs היו מופרדים בשברים הקסוס, AcOEt ו- MeOH. השבר של CE מאפשר פישוט של התערובת כדי להגדיל את הריכוז של תרכובות פעיל פוטנציאלי להקטין את האפשרויות של סינרגטיות ואנטגוניזם בין תרכובות. בנוסף, בתערובות פשוטות יותר (שברים), קל יותר להשיג נתונים ספקטרליים של התרכובות מאשר ב- CE ולבצע ניתוח dereplication2. בדרך כלל, שבר יכול להיעשות על ידי מיצוי נוזלי נוזלי או מחסניות מיצוי שלב מוצק (SPE) המכיל ספיחה הפוכה מועדפת כמו C18 (40 מיקרומטר, 100 Å). ספיחה או תערובות אחרות של adsorbents ניתן לבחור, בהתאם למטרות המחקר או אופי כימי של התרכובות הרצויות. אם הטכניקה שנבחרה היא SPE, המחסניות חייבות להיות מופעלות בעבר עם ממס אורגני טהור (למשל, EtOH) ומותנות באלהות הראשונית. פרוטוקולים סטנדרטיים זמינים. לכן, הקורא יכול להתייעץ ולהתאים אותם על פי המחקר המיועד חומר צמחי של עניין.

12 CE היו solubilized עם 84.15% EtOH ו 15% DMSO כדי להשיג 6 מ"ג / מ"ל (פתרון מלאי). לפני בדיקות המיון בדקנו את הריכוז הדילול (רכב) שאינו מפריע לצמיחה המיקרוביאלית. שלב זה חשוב משום שהוא מונע מהפעולות האנטי-מיקרוביאליות והאנטיביופילם של הממסים להשפיע על התוצאות בעת בדיקת טיפולים. הבדיקות יכולות להתבצע על צלחת של 96 באר על ידי טיפול בתרבות המיקרואורגניזם של עניין עם ריכוזים שונים של ממיסים (הקשורים ו / או מבודדים). לכן, התחלנו את ההקרנה שלנו עם CE ב 0.5 מ"ג / מ"ל ורכב בריכוז של 7% EtOH ו 1.25% DMSO.

לצורך הקרנת פעילות אנטי-מיקרוביאלית ואנטיביופילם, התייחסו לצלחות של 96 באר כמתואר לעיל. למטרה זו, נפח של 16.67 μL של פתרון מלאי CE (6 מ"ג / מ"ל) נוסף כדי לבדוק כל CE בריכוז של 0.5 מ"ג / מ"ל. הביופילמים שנוצרו עובדו כמתואר בשלב 3. התמציות היעילות נגד S. mutans (IC50 או 3 יומנים) שימשו כדי להעריך את "חוזק הידבקות" של חיידק זה כדי pellicle הרוק מטריצה גלוקנית ראשונית, כמתואר בשלב 3.

הנתונים הגולמיים שהתקבלו ממבחן ביולוגי אורגנו ב- Excel (כמתואר בשלב 4) ונותחו עם טיפול סטטיסטימתאים 13. נקודת הניתוק כדי לזהות את התמציות עם הפעילות הטובה ביותר היה עיכוב IC50 (3 יומנים). מפרמטר זה, ארבע תמציות הראו תגובה חיובית (איור 8). הנתונים הכרומטוגרפיים של ארבע תמציות אלה מראים את הנוכחות הסימולטנית של דיטרפנים מסוג קלרודן ופלבנואידים גליקוסיליים. בנוסף, הם כוללים את אותו biome (היער האטלנטי) ומגוון(סילבסטרי). כדי לעזור לפרש את הנתונים הביולוגיים, השווינו את הפרופיל הכרומטוגרפי של ארבע התמציות עם הפעילות הטובה ביותר עם תמציות מוקרן אחרות. בהשוואה לאחרים, תמציות עם הפעילות הטובה ביותר יש כמות גבוהה יותר של diterpenes מסוג clerodane ו, בו זמנית, פלבנואידים glycosylated. תצפית זו מצביעה על כך שסביר להניח כי האפקטיביות של תמציות אלה נובעת מאינטראקציה סינרגטית בין שני מטבוליטים משניים, ובכך להגדיל את הפעילות הביולוגית שלהם. כלומר, ההשפעה המשולבת של דיטרפנים מסוג קלרודן ופלבנואידים גליקוסיליים גדולה מסכום ההשפעות הנפרדות שלהם13.

כדי לאשר את הנתונים שהושגו בהקרנה, הערכנו את הניתוק של S. mutans לאחר הידבקות כדורי הרוק וגלוקנים שטופלו ב- CE שנבחר. הבדיקות משתמשות במודלים של ביופילם של מינים בודדים במבחנה כדי להעריך טוב יותר את הפעילות הביולוגית של התמציות הגולמיות שנבחרו ולזהות מטרות פעולה אפשריות. הניתוח הראשון מוודא אם הטיפולים המשמשים מסוגלים לעכב את הדבקות של S. mutans כדי pellicle הרוק, אבל בעיקר, אם התאים של מיקרואורגניזם כי דבקו pellicle שטופלו ניתן להסיר מפני השטח בקלות רבה יותר על ידי גירוי מכני, ובכך להפריע את השלב הראשון של היווצרות biofilm. התוספת של CE (עם פעילות טובה יותר) במהלך הסינתזה של גלוקנים לא לשנות את גלולת הרוק כי לא CE השפיע באופן משמעותי על הסרת תאים דבקים pellicle הרוק (איור 9A).

הדבקה של מטריצת הגלוקן הראשונית(gsHA)חוקרת אם הטיפולים יכולים לעכב את הדבקות של S. mutans למטריצה הגלוקנית הראשונית. עדיין, מתודולוגיה זו מאמתת אם תאי המיקרואורגניזם שדבקו בגלוקנים המטופלים ניתנים להסרה על ידי הגירוי המכני בקלות רבה יותר של פני השטח, ובכך להפריע להיווצרות הביופילם בשלב. שלושה CE השפיעו על איכות הגלוקנים שנוצרו על ידי GTFB ולכן החלישו את הדבקות של S. mutans למטריצה הגלוקנית הראשונית (רוב תאי S. mutans הוסרו לאחר הידבקות עבור גלוקנים; איור 9B). אנו מאמינים כי התנהגות זו קשורה לסינרגיה בין המטבוליטים המשניים13.

הגישה השיטתית סייעה לנו לזהות ולבחור תמציות גולמיות פעילות כדי לעצור את היווצרות הביופילמים המסרוגניים. לאחר שנבחר ומבוסס על הפרופיל הכרומטוגרפי, יש לנו את הבסיס להבהיר את המנגנונים המולקולריים של פעולה במודלים מורכבים.

Figure 2
איור 2: תרשים זרימה של מיצוי החומר הצמחי ושבר. האיור מראה את העיצוב הניסיוני להכנת התמציות הגולמיות (A) ושבר של תמציות גולמיות (B). איחוד האמירויות הערביות: מיצוי בסיוע אולטרסאונד; SPE: מיצוי פאזה מוצק. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: תכנון ניסיוני להערכת פעילות מיקרוביאלית בלוחות של 96 בארות. האיור מתאר טיפולים (תמציות גסות או שברים) ופקדים. להקרנה של טיפולים מרובים, להשתמש בריכוז יחיד (מ"ג / מ"ל) בכל באר. CFU / מ"ל: מושבה להרכיב יחידות למיליליטר. צפיפות אופטית. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: תכנון ניסיוני לבדיקת אנטיביופילם בלוחות של 96 בארות. האיור מציג טיפולים (תמציות גולמיות ושברים) ובקרות. להקרנה של טיפולים שונים, יש להשתמש בריכוז יחיד (מ"ג/מ"ל) בכל באר. ב- A, השלבים לכימות ביומסה של ביופילמים שטופלו מודגמים. ב- B, מוצגים השלבים לקביעת האוכלוסייה (CFU/mL) של הביופילמים המטופלים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: תכנון ניסיוני להערכת ההידבקות לכדור הרוק, ואחריו ניתוק התאים הנדבוקים. האיור מציג את השלבים שיש לבצע. טיפולים: נבחרו על סמך סינון ביולוגי. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6: תכנון ניסיוני להערכת ההידבקות במטריצת הגלוקן הראשונית(gsHA)ואחריה ניתוק התאים הדבקים. האיור מציג את השלבים שיש לבצע. טיפולים: נבחרו על סמך סינון ביולוגי. מצע סוכרוז: 100 מ"ל של סוכרוז. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 7
איור 7: כמות דיטרפנים מסוג קלרודן ופלבנואידים גליקוסיליים בתמציות C. sylvestris מביומס ברזילאי. האותיות S, I ו- L מציינות את הזנים סילבסטרי , ביניים, ו לינגואה, בהתאמה. תקשורת אישית מאת ד"ר פאולה קרולינה פירס בואנו. נתון זה שונה מ Ribeiro ואח'13. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 8
איור 8: פעילות אנטי-מיקרוביאלית ואנטיביופילם של C. sylvestris תמציות גולמיות מביומס ברזילאי נגד S. mutans.  א. % CFU (יומןרישום 10)של תאים פלנקטוניים שטופלו; ב. % ביומסה של ביופילמים מטופלים. ג. % CFU (יומן10)של ביופילם מטופל. הנתונים המתוארים הם חציוניים (עקבות) ואינטרקוורטיליים (תיבות). קווי השגיאה מייצגים את הערכים המרביים והמינימליים. כוכביות לציין הבדל מובהק סטטיסטית של תמצית ספציפית לעומת בקרת רכב (V), שם: ****p ≤ 0.0001; p ≤ 0.001; ** ≤ 0.01; ו *p ≤ 0.05 (מבחן קרוסקל-וואליס, ואחריו מבחן ההשוואות המרובות של דאן). כל מין בקרת גדילה (ללא טיפול) מיוצג כמו Sm עבור S. mutans. צבעי הפסים בכל גרף מייצגים את המגוון שאליו שייכות התמציות, בהיותן בצבע אפור כהה: var. sylvestris; אפור בהיר: var. בינוני ולבן: var. לינגואה. נתון זה שונה מ Ribeiro ואח'13. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 9
איור 9: ניתוק S. mutans לאחר הידבקות ב pellicle הרוק שטופלו מטריצה ראשונית של גלוקנים. נתונים שלאחר שחרורו של S. mutans כדי pellicle הרוק שטופלו גלוקנים מוצגים (A) ו (B), בהתאמה. לא היה הבדל בין רכב הבקרה (V), לבין התמציות שנבדקו עבור שני הניתוחים. אחוז CFU / mL הושג בהתחשב בבקרת הרכב (V) כמו 100%. הנתונים המתוארים הם חציוניים (עקבות) ואינטרקוורטיליים (תיבות). קווי השגיאה מייצגים את הערכים המרביים והמינימליים. כוכביות מציין הבדל מובהק סטטיסטית של תמצית ספציפית לעומת בקרת רכב (V), שבו ****p = 0.0001 ו **p < 0.0031 (מבחן Kruskal-Wallis, ואחריו מבחן השוואה מרובה של דאן). בקרת הצמיחה מיוצגת על ידי Sm עבור S. mutans. צבעי מייצגי הגרף מייצגים את המגוון שאליו שייכות התמציות, בהיותם הצבע אפור כהה ל- var. sylvestris. נתון זה שונה מ Ribeiro ואח'13. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

האתגרים העיקריים הקשורים לעבודה עם תמציות גולמיות טבעיות מרכיבים את הרכבם המורכב ואת הליקויים של מחקרי בידוד ביו-מונחים קלאסיים. למרות שתהליך זה איטי, הוא יעיל והוביל לממצאים משמעותיים במחקר NP. כדי לתרץ, דרושים מחקרים מונחי תעדוף כדי לתרץ. לכן, השימוש בגישות פרופיל כימי מודרני לניתוח CE ו dereplication לפני הבידוד חשובים לאפיין את החומר הנחקר שימושי במיוחד כדי למנוע בידוד מחדש של תרכובות ידועות עם פעילות ביולוגית המתוארת כבר2,15. חוץ מזה, רכישת נתונים רב ממדיים יש צורך לבצע ניתוח נתונים רב משתני נוסף כדי למצוא את המועמדים להיטים פוטנציאליים אחראי על הפעילות הביולוגית שנצפו. כתוצאה מכך, החוקר יכול להתמקד בבידוד (בקנה מידה גדול) של מועמדים פוטנציאליים אלה.

כאן, אנו מציגים גישה שיטתית לזיהוי מונחה bioassay (במבחנה) של תרכובות פעילות מתמציות צמחים ושברים. פרוטוקול זה מאפשר שיטת סינון וניתוח מרובת מטרות כך שניתן יהיה לסנן ולנתח רכיבים פעילים מרובים בו-זמנית. bioassays הם בקנה מידה קטן של תשואה גבוהה, הם מהירים, חסכוני, קל להתרבות, לצרוך פחות ריאגנטים מאשר שיטות מסורתיות (למשל, בידוד ראשוני של תרכובות עניין)39. עבור כל מחקר מוצר טבעי, הוא בעל חשיבות עליונה את הכלים האנליטיים (לדוגמה, HPLC-UV, HPLC-DAD, LC-MS). לאחרונה, הגישה מכוונת יותר מבנה (מבוסס כימיה) ניצול, במידה גבוהה יותר, את הכוח של פלטפורמות אנליטיות הבהרת (LC-HRMS ו HRMS /MS, NMR שדה גבוה) ואסטרטגיות dereplication, אשר מורכבים זיהוי מהיר של מולקולות ידועות כבר. שלב זה מסייע להבין את הקשר פרופיל כימי עם התגובה הביולוגית וכתוצאה מכך בידוד ממוקד יותר של מטבוליטים פעילים מועמד3. ישנן מספר שיטות מבוססות היטב לניתוח כרומטוגרפי. עבור NPs לא ידוע, ייתכן שלפעמים יהיה צורך לבצע טייסים כדי למצוא את השיטה הטובה ביותר האפשרית. לדוגמה, אנו משתמשים בשיטה אנליטית של כרומטוגרפיה מאומתת לניתוח בו זמנית של מטבוליטים משניים המיוצרים על ידי שני סוגים של C. sylvestris13,18. בעת בחירת שיטת כרומטוגרפיה, אנו מציעים לשקול פרוטוקול המבוסס על תרכובת היעד (s), ואת היתרונות והחסרונות של כל השיטות הזמינות, תוך התמקדות במיוחד על היעילות שלהם, וכמובן, העלות הכוללת מעורב40.

למרות שהגישה השיטתית הוכיחה את עצמה כיעילה לסינון וניתוח מהיר של מועמדים ביו-אקטיביים ב-NPs, נותרו מגבלות חשובות. לדוגמה, הקריאות החזותיות והתעודות של הביומסה והתרבויות הפלנקטוניות עשויות לשחזר תוצאות חיוביות כוזבות13,23,24. קביעת עכירות התרבויות עם קורא microplate עלול להיכשל בעת שימוש תרכובות טבעיות23,24. כשלים אלה מתרחשים כי (i) בכמה אורגניזמים בדיקה, התאים מקובצים בתחתית הבאר, ו, באורגניזמים אחרים, התאים נשארים בהשעיה; (ii) חלקיקים מוצקים הנמצאים ב- CE מזרזים וגורמים לטלטלה בבארות23,24. ה- pH של NPs הוא גורם שיש לקחת בחשבון גם. ה- pH של פתרון הטיפול קשור להרכב הכימי של המטבוליטים המשניים, ולכן משפיע על התגובה הביולוגית. למרות pH אינו מגבלה, זה צריך להיות מוערך בזהירות, בהתאם למטרת המחקר. לדוגמה, במודלים biofilm על משטחי אמייל השן, חומציות יכולה לגרום demineralization אמייל לא רצויים. במקרים אלה, יש צורך להתאים את ה- pH בעזרת מאגרים מתאימים. לכן, יש צורך לבצע בדיקות כדי לוודא אם התאמת ה- pH השפיעה על התגובה הביולוגית שנצפתה בעבר.

הבדיקות הקלאסיות להערכת הפעילות של תרכובות חדשות כוללות קביעת הריכוז המעכב המינימלי (MIC) ואת הריכוז החיידקי או הפטריות המינימלי (MBC או MFC)29,41. עם זאת, כאשר המטרה היא לסנן תמציות צמחים רבים שברים, הטכניקה הופכת ממצה. סינון ביולוגי יכול להתבצע עם ריכוז יחיד של טיפולים מרובים (למשל, תמציות צמחים ממקומות שונים)13,42,29. במצבים אלה, הגישה השיטתית היא שיטה עם ביצועים גבוהים המחזירה תוצאות עקביות בפחות זמן עבודה. ניתן להעריך את הטיפולים שנבחרו בהקרנה הביולוגית באמצעות מודלים מעודנים (רלוונטיים קלינית, בני קיימא וניתן לשחזור) כדי לאשר את הפעילות הביולוגית. לשליטה בביופילם קריוגני, מחקרי מעבדה צריכים להתמקד בעיקר בביופילמים הנוצרים בהידרוקסיאפטיט (תחליף אמייל השן) או במשטחי אמייל הממוקמים בתנוחה זקופה מצופה כדורי רוק37. זה גם מאפשר הקרנה של דגימות צמחים של זנים שונים ביומים בצורה לשחזור ומהיר. הכללת שני משתנים אלה (biome ומגוון) היא חיונית משום שהם משפיעים על השונות של ההרכב הכימי של מטבוליטים משניים18 לווסת את התגובה הביולוגית. גישה שיטתית זו יכולה להיות מותאמת / שונה עבור יישומים מחוץ למחקר ביופילם אוראלי. לדוגמה, זה יכול להיות שימושי במיוחד עבור תחומים אחרים הקשורים biofilm, באמצעות מינים אחרים של עניין.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

לא הוכרזו ניגודי אינטרסים.

Acknowledgments

אנו מביעים את תודתנו לנוקלו דה ביונסאיוס, Biossíntese e Ecofisiologia de Produtos Naturais (NuBBE) של המכון לכימיה של UNESP, Araraquara / SP לאספקת המעבדות להכנת חומר צמחי. אנו מודים גם למעבדה המיקרוביולוגית היישומית של המחלקה לחומרי שיניים ופרוסטודונטיה, UNESP, Araraquara / SP. מחקר זה נתמך על ידי מענק מחקר מקרן המחקר של סאו פאולו (FAPESP #2013/07600-3 ל- AJC) ומלגות בתוספת קרנות תקורה (FAPESP #2017/07408-6 ו- FAPESP #2019/23175-7 ל- SMR; #2011/21440–3 ו-#2012/21921–4 ל-PCPB). המועצה הלאומית לפיתוח מדעי וטכנולוגי בשיתוף עם FAPESP סיפקה תמיכה נוספת (INCT CNPq #465637/2014–0 ו FAPESP #2014/50926–0 ל- AJC).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well microplates  Kasvi Flat bottom
Activated carbon LABSYNTH Clean up and/or fractionation step
Analytical mill Ika LabortechniK Model A11 Basic
Blood agar plates Laborclin
Chromatographic column C18 Phenomenex Kinetex 150 × 2.1 mm, 2.6 µm, 100Â
Dimethyl sulfoxide  Sigma-Aldrich Vehicle solution
ELISA plate reader Biochrom Ez
Ethanol J. T. Baker For extraction and fractionation steps, and mobile phase composition
Ethanol Sigma-Aldrich Vehicle solution
Ethyl acetate J. T. Baker Fractionation step
GraphPad Software La Jolla GraphPad Prism7
Hexane J. T. Baker Fractionation step
Incubator Thermo Scientific
Isopropanol J. T. Baker For extraction step
Lyophilizer (a freeze dryer) Savant Modulyo
Nylon Millipore LAC 0.22 µm x 13 mm
Orbital shaker Quimis Model G816 M20
Polyamide solid phase extraction cartridge Macherey-Nagel Clean up and/or fractionation step
Silica gel Merck 40–63 μm, 60 Â
Sodium Chloride (NaCl) Synth 0,89% in water
Solid phase extraction cartridges (SPE) Macherey-Nagel Clean up and/or fractionation step
Tryptone Difco
UHPLC-DAD Dionex Ultimate 3000 RS
Ultrasonic bath UNIQUE Model USC 2800
Yeast extract Difco

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Newman, D. J., Cragg, G. M. Natural Products as Sources of New Drugs over the Nearly Four Decades from 01/1981 to 09/2019. Journal of Natural Products. 83 (3), 770-803 (2020).
  2. Wolfender, J. L., Litaudon, M., Touboul, D., Queiroz, E. F. Innovative omics-based approaches for prioritisation and targeted isolation of natural products – new strategies for drug discovery. Natural Product Report. 36 (6), 855-868 (2019).
  3. Michel, T., Halabalaki, M., Skaltsounis, A. New Concepts, Experimental Approaches, and Dereplication Strategies for the Discovery of Novel Phytoestrogens from Natural Sources. Planta Medica. 79 (7), 514-532 (2013).
  4. Jeon, J. G., Rosalen, P. L., Falsetta, M. L., Koo, H. Natural products in caries research: current (limited) knowledge, challenges and future perspective. Caries Research. 45 (3), 243-263 (2011).
  5. Tonetti, M. S., Jepsen, S., Jin, L., Otomo-Corgel, J. Impact of the global burden of periodontal diseases on health, nutrition and wellbeing of mankind: A call for global action. Journal of Clinical Periodontology. 44 (5), 456-462 (2017).
  6. Peres, M. A., et al. Oral diseases: a global public health challenge. Lancet. 394 (10194), 249-260 (2019).
  7. Bowen, W. H., Burne, R. A., Wu, H., Koo, H. Oral biofilms: pathogens, matrix, and polymicrobial interactions in microenvironments. Trends Microbiology. 26 (3), 229-242 (2018).
  8. Paes Leme, A. F., Koo, H., Bellato, C. M., Bedi, G., Cury, J. A. The role of sucrose in cariogenic dental biofilm formation--new insight. Journal of Dental Research. 85 (10), 878-887 (2006).
  9. Koo, H., Falsetta, M. L., Klein, M. I. The exopolysaccharide matrix: a virulence determinant of cariogenic biofilm. Journal of Dental Research. 92 (12), 1065-1073 (2013).
  10. Cury, J. A., de Oliveira, B. H., dos Santos, A. P., Tenuta, L. M. Are dental fluoride releasing materials clinically effective on caries control. Dental Materials. 32 (3), 323-333 (2016).
  11. Mattos-Graner, R. O., Klein, M. I., Smith, D. J. Lessons Learned from Clinical Studies: Roles of Mutans Streptococci in the Pathogenesis of Dental Caries. Current Oral Health Reports. 1, 70-78 (2014).
  12. Rocha, G. R., Florez Salamanca, E. J., de Barros, A. L., Lobo, C. I. V., Klein, M. I. Effect of tt-farnesol and myricetin on in vitro biofilm formed by Streptococcus mutans and Candida albicans. BMC Complementary and Alternative Medicine. 18 (1), 61 (2018).
  13. Ribeiro, S. M., et al. Antimicrobial and antibiofilm activities of Casearia sylvestris extracts from distinct Brazilian Biomes against Streptococcus mutans and Candida albicans. BMC Complementary and Alternative Medicine. 19 (1), 308 (2019).
  14. Pilon, A. C., et al. Metabolômica de plantas: métodos e desafios. Quimica Nova. 43 (3), 329-354 (2020).
  15. Wolfender, J. L., Nuzillard, J. M., Hooft, J. J. J., Renault, J. H., Bertrand, S. Accelerating Metabolite Identification in Natural Product Research: Toward an Ideal Combination of Liquid Chromatography-High-Resolution Tandem Mass Spectrometry and NMR Profiling, in Silico Databases, and Chemometrics. Analytical Chemistry. 91 (1), 704-742 (2019).
  16. Allard, P. M., et al. Pharmacognosy in the digital era: shifting to contextualized metabolomics. Current opinion in biotechnology. 54, 57-64 (2018).
  17. Hubert, J., Nuzillard, J., Renault, J. Dereplication strategies in natural product research: How many tools and methodologies behind the same concept. Phytochemistry Reviews. 16, 55-95 (2017).
  18. Bueno, P. C. P., Pereira, F. M. V., Torres, R. B., Cavalheiro, A. J. Development of a comprehensive method for analysing clerodane-type diterpenes and phenolic compounds from Casearia sylvestris Swartz (Salicaceae) based on ultra-high performance liquid chromatography combined with chemometric tools. Journal of separation science. 38 (10), 1649-1656 (2015).
  19. Bueno, P. C. P., Lopes, N. P. Metabolomics to Characterize Adaptive and Signaling Responses in Legume Crops under Abiotic Stresses. American Chemical Society omega. 5 (4), 1752-1763 (2020).
  20. Blaženović, I., Kind, T., Ji, J., Fiehn, O. Software tools and approaches for compound identification of LC-MS/MS data in metabolomics. Metabolites. 8 (2), 31 (2018).
  21. Eloff, J. N. Quantifying the bioactivity of plant extracts during screening and bioassay-guided fractionation. Phytomedicine: International Journal Of Phytotherapy And Phytopharmacology. 11 (4), 370-371 (2004).
  22. Rios, J. L., Recio, M. C. Medicinal plants and antimicrobial activity. Journal of Ethnopharmacology. 100 (1-2), 80-84 (2005).
  23. Eloff, J. N. A sensitive and quick microplate method to determine the minimal inhibitory concentration of plant extracts for bacteria. Planta Medica. 64, 711-714 (1998).
  24. Eloff, J. N. Avoiding pitfalls in determining antimicrobial activity of plant extracts and publishing the results. BMC Complementary and Alternative Medicine. 19 (1), 106 (2019).
  25. Klein, M. I., Xiao, J., Heydorn, A., Koo, H. An analytical tool-box for comprehensive biochemical, structural and transcriptome evaluation of oral biofilms mediated by mutans streptococci. Journal of Visualized Experiments. (47), e2512 (2011).
  26. Lemos, J. A., Abranches, J., Koo, H., Marquis, R. E., Burne, R. A. Protocols to study the physiology of oral biofilms. Methods in molecular biology. 666, 87-102 (2010).
  27. Venkitaraman, A. R., Vacca-Smith, A. M., Kopec, L. K., Bowen, W. H. Characterization of glucosyltransferase B, GtfC, and GtfD in solution and on the surface of hydroxyapatite. Journal of Dental Research. 74, 1695-1701 (1995).
  28. Vacca-Smith, A. M., Venkitaraman, A. R., Quivey, R. G. Jr, Bowen, W. H. Interactions of streptococcal glucosyltransferases with alpha-amylase and starch on the surface of saliva-coated hydroxyapatite. Archives of Oral Biology. 41, 291-298 (1996).
  29. Van Dijck, P., et al. Methodologies for in vitro and in vivo evaluation of efficacy of antifungal and antibiofilm agents and surface coatings against fungal biofilms. Microbial Cell. 5 (7), 300-326 (2018).
  30. Marsh, P. D. Are dental diseases examples of ecological catastrophes. Microbiology. 149 (2), 279-294 (2003).
  31. Bowen, W. H., Koo, H. Biology of Streptococcus mutans-derived glucosyltransferases: role in extracellular matrix formation of cariogenic biofilms. Caries Research. 45 (1), 69-86 (2011).
  32. Lobo, C. I. V., et al. Dual-species biofilms of Streptococcus mutans and Candida albicans exhibit more biomass and are mutually beneficial compared with single-species biofilms. Journal of Oral Microbioly. 11 (1), 1581520 (2019).
  33. Kim, D., et al. Candida albicans stimulates Streptococcus mutans microcolony development via crosskingdom biofilm-derived metabolites. Scientific reports. 7, 41332 (2017).
  34. Ferreira, P. M. Folk uses and pharmacological properties of Casearia sylvestris: a medicinal review. Anais da Academia Brasileira de Ciencias. 83 (4), 1373-1384 (2011).
  35. Xia, L., Guo, Q., Tu, P., Chai, X. The genus Casearia: a phytochemical and pharmacological overview. Phytochemistry Reviews. 14, 99-135 (2015).
  36. Ferreira, P. M. P., et al. Toxicological findings about an anticancer fraction with casearins described by traditional and alternative techniques as support to the Brazilian Unified Health System (SUS). Journal of Ethnopharmacol. 15, 241 (2019).
  37. Koo, H., Xiao, J., Klein, M. I., Jeon, J. G. Exopolysaccharides produced by Streptococcus mutans glucosyltransferases modulate the establishment of microcolonies within multispecies biofilms. Journal of Bacteriology. 192 (12), 3024-3032 (2010).
  38. Maske, T. T., van de Sande, F. H., Arthur, R. A., Huysmans, M. -C. D. N. J. M., Cenci, M. S. In vitro biofilm models to study dental caries: a systematic review. Biofouling. 33 (8), 661-675 (2017).
  39. Fu, Y., Luo, J., Qin, J., Yang, M. Screening techniques for the identification of bioactive compounds in natural products. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 168, 189-200 (2019).
  40. Sarker, S. D., Nahar, L. An introduction to natural products isolation. Methods in molecular biology. 864, 1-25 (2012).
  41. Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI). Performance standards for antimicrobial susceptibility testing; twenty-fifth informational supplement. Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI). , Wayne, PA. CLSI document M100-S25 (2015).
  42. Saputo, S., Faustoferri, R. C., Quivey, R. G. Jr A drug repositioning approach reveals that Streptococcus mutans is susceptible to a diverse range of established antimicrobials and nonantibiotics. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 62 (1), 01674 (2018).

Tags

ביולוגיה גיליון 169 מיקרוביולוגיה ביופילם מוצרים טבעיים מוטנס סטרפטוקוצ'י מיקרוביאלית עששת שיניים גילוי סמים גישות ביולוגיות
גישה שיטתית לזיהוי מולקולות אנטי-מיקרוביאליות ואנטיביופילם חדשניות מתמציות ושברים של צמחים למניעת עששת שיניים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ribeiro, S. M., Fratucelli, É. D.… More

Ribeiro, S. M., Fratucelli, É. D. O., Fernandes, J. M., Bueno, P. C. P., Cavalheiro, A. J., Klein, M. I. Systematic Approach to Identify Novel Antimicrobial and Antibiofilm Molecules from Plants' Extracts and Fractions to Prevent Dental Caries. J. Vis. Exp. (169), e61773, doi:10.3791/61773 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter