Summary
天然物は、新薬および治療薬の開発の有望な出発点を表しています。しかし、化学的多様性が高いため、植物から新しい治療化合物を見つけることは困難で時間のかかる作業です。植物抽出物および分画から抗菌分子および抗バイオフィルム分子を同定するための簡便なアプローチを説明する。
Abstract
天然物は、構造的に異なる物質を提供し、無数の生物学的活動を提供します。しかし、植物からの活性化合物の同定と分離は、複雑な植物マトリックスと時間のかかる分離および同定手順のために困難です。そこで、潜在的に活性な分子の単離および同定を含む植物由来の天然化合物をスクリーニングするための段階的アプローチが提示される。それは植物材料のコレクションを含みます。粗抽出物の調製と分画;クロマトグラフィーおよび分光法(UHPLC-DAD-HRMSおよびNMR)の分析および化合物同定のためのアプローチ;バイオアッセイ(抗菌および抗バイオフィルム活性;選択された治療で治療された唾液ペリクルおよび初期グルカンマトリックスへの細菌の「接着強度」);データ分析を行います。モデルは簡単で、再生可能で、複数の化合物、濃度および処置ステップのハイスループットスクリーニングを一貫して制御することができる。得られたデータは、最も活性な抽出物および/または画分を含む製剤、分子の単離、微生物細胞およびバイオフィルム内の特定の標的への分子のモデリングを含む、将来の研究のための基礎を提供する。例えば、齲蝕原性バイオフィルムを制御する1つの標的は、細胞外マトリックスのグルカンを合成する レンサ球菌変異体 グルコシルトランスファーーゼの活性を阻害するものである。これらの酵素の阻害は、バイオフィルムの蓄積を防ぎ、その毒性を低下させる。
Introduction
社会で使用される医学の最も初期のモデルは、天然物(NP)に基づいていました。それ以来、人間は、薬物1に変換することができる自然界の新しい化学物質を探しています。この探索は、民族植物スクリーニング1、2、3の技術と方法の継続的な改善を引き起こした。NPは構造的に多様な物質の豊富な供給源を提供し、代替療法やアジュバント療法の開発に役立つ幅広い生物学的活動を提供しています。しかし、固有の複雑な植物マトリックスは、活性化合物の分離と同定を困難で時間のかかる作業4にします。
NPsベースの薬物または製剤は、口腔に影響を与えるいくつかの状態を予防および/または治療するために使用することができます, 歯科用虫歯を含む4.世界的に最も流行している慢性疾患の一つである齲蝕は、糖が豊富な食生活と微生物のバイオフィルム(歯垢)の相互作用に由来し、歯面に形成され、微生物代謝に由来する有機酸によって生じる脱灰化につながり、治療しなければ、歯の損失5,6を引き起こす。他の微生物は7を関連付けてもよいが、ストレプトコッカス変異体は、酸性、酸尿、および細胞外マトリックスビルダーであるため、重要な発膜性細菌である。本種は、ショ糖を基質8として使用する複数のエキソ酵素(例えば、グリコシルトランスファーゼまたはGtfs)をコードし、細胞外多糖を豊富に含む細胞外マトリックスを構築し、これは毒性決定基9である。また、カンディダ・アルビカンス菌は、その細胞外マトリックス7の産生を促進することができる。フッ化物は、様々なモダリティで投与されるが、齲蝕10を予防するための基礎であり続け、その有効性を高めるために補助剤として新しいアプローチが必要である。また、利用可能な抗プラークモダクティビティは、広域スペクトル微小bicidal剤(例えば、クロルヘキシジン)11の使用に基づいている。代替として、NPはバイオフィルムを制御し、歯の齲蝕12、13を防ぐための潜在的な治療法です。
植物からの新しい生理活性化合物の発見のさらなる進歩には、(i)植物がしばしば特異性の内在性を示すことを考慮して、サンプリングのための信頼性の高い再現可能なプロトコルの使用のような必要なステップまたはアプローチが含まれます。(ii) 小規模での包括的抽出物およびそれぞれの分画の調製。(iii) それらの化学プロファイルの特性評価および/または非複製は、GC-MS、LC-DAD-MS、またはNMRなどの多次元データの取得を考えた。(iv) 生物活性を評価するための実行可能で高収率モデルの使用。(v) 多変量データ分析またはその他の統計ツールに基づく潜在的な新しいヒットの選択。(vi)標的化合物または有望な候補の単離および精製を行う。(vii)単離化合物2,14を用いた対応した生物学的活性の検証。
デレプリケーションは、粗抽出物中の既知の化合物を迅速に同定するプロセスであり、既に研究されているものとは新しい化合物を区別することを可能にする。また、このプロセスは、生物活性が特定の化合物について既に記述されている場合の単離を防ぎ、「頻繁な打者」を検出するのに特に有用である。これは、主要な化合物同定または活動誘導分画の加速から抽出物のコレクションの化学プロファイリングまで、さまざまなターゲットを絞られていないワークフローで使用されています。CEの非標的化学プロファイリングまたは代謝産物の標的同定のためのメタボロミック研究と完全に統合することができる。このすべては、最終的に分離手順1、15、16、17の前に抽出物の優先順位付けにつながります。
そこで本稿では、植物抽出物および画分から抗菌分子および抗菌膜分子を同定するための体系的なアプローチを述べる。それは4つの学際的なステップを含んでいる:(1)植物材料のコレクション;(2)粗抽出物(CE)および分数(CEF)の調製、その後の化学プロファイル分析;(3) バイオアッセイ(4)生物・化学データ分析(図1)。そこで、ストレプトコッカス・ミュータンスおよびカンジダ・アルビカンス13に対するカゼリアシルヴェストリス抽出物および画分の抗菌・抗バイオフィルム活動を分析するために開発されたプロトコルと、植物化学的特性解析とデータ分析の手順を提示する。簡単にするために、ここでの焦点は、細菌を使用して天然化合物をスクリーニングするためのアプローチを実証することです。
図1:植物抽出物と分画から活性分子を同定する系統的アプローチのフローチャート。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Protocol
1. 植物材料の回収
- 植物材料
- コレクションが行われる国の遺伝的遺産へのアクセスを規制する電子プラットフォーム上の植物材料へのアクセスを記録します。例えば、ブラジルでは、遺伝的遺産と関連する伝統的知識の管理のための国家システムに登録する - SisGen (ウェブサイト https://sisgen.gov.br/paginas/login.aspx)。
- 目的の植物材料(例えば、葉、茎、根、花、果実)のサンプルを収集します。物質が生殖または栄養段階で収集された場合に登録します。
- 収集パラメータ(日付、ジオリファレンス、年間平均気温、平均湿度率)を記録します。
- サンプルを正確に特定し、分類学者は真正性を確認する必要があります。
- 植物サンプル安定化および貯蔵
- コレクションの直後に、個々のビニール袋またはフラスコに植物器官を分ける。
- (i)液体窒素中で直ちに凍結し、(ii)循環式エアーオーブン(40°C)で脱水するか、または(iii)凍結乾燥により試料を凍結乾燥させることにより、潜在的な酵素反応を不活性化する。
- 安定した材料は、室温または冷凍庫で密閉された袋に保管し、使用するまで(-20または-80°C、保管期間または使用目的に応じて) 保管してください。
- 分析用ミル(組織の種類や入手可能性に応じてナイフまたはボール)でサンプルを研削し、標準化されたふるいを使用して粒子サイズを標準化します。
- 以降の抽出手順に応じて、サンプルの重量を個別に測定します。
2. 化学プロファイル分析およびバイオアッセイへの粗抽出物(CE)および分数(CEF)の調製
- 粗抽出物の調製(CE)
注: 手順は図 2Aのフローチャートに示されています。- 水性アルコール混合液(例えば、エタノール(EtOH)70%または水、EtOH、および他の修飾剤の三元混合物を含む抽出溶媒を調製し、これまでの報告に従っての実験計画によって定義される。
- 溶媒の各mLに対して50〜100mgの範囲の比率サンプル重量(乾燥重量、mg)/抽出溶媒(mL)を使用してください。
- 迅速かつ再現性のある抽出には、マイクロチューブを使用してバッチ抽出を使用します。
注: 統計分析を行うためには、この時点で少なくとも 3 つの反復を使用する必要があります。 - 超音波支援抽出(UAE)を実行して、迅速かつ簡単に、安価にします。
- 最適な効率を得る場合は、この手順を 3 回(それぞれ 15 分)繰り返します。
- 各抽出工程の後、遠心分離により固形残渣をデカントし、上清を除去する。
- 上清を個別に組み合わせ、フィルター処理し、同時に化学分析とバイオアッセイのためのアリコートを保存します。必要に応じて、真空、窒素流、または凍結乾燥の下で抽出溶媒を除去し、計量と収率を登録します。
- 光から保護された-20°Cで保管してください。
注: ここでプロトコルを一時停止して CE をスクリーニングし、目的のアクティビティを提示するものを選択できます。
- 粗抽出物の分画(CEF)
注: これらの手順は図 2Bのフローチャートに示されています。- 吸着剤の少なくとも1 gとカートリッジを使用してください。アルカロイドがCEに存在する可能性がある場合は、0.1%のギ酸(FA)を含む溶媒を使用してください。
- 最も適した溶媒(または溶媒混合物)でサンプルを希釈し、100mg/mLのサンプル溶液を得る。次いで、サンプル溶液の1mLを固相抽出カートリッジ-SPE(1gの吸着剤、6 mLの容量)をあらかじめ調整した固相抽出カートリッジに移す。
- 各抽出溶出液の約3つのデッドボリュームを用いて分別を行う(1gのカートリッジに、各溶媒の2mLに相当する)。アルカロイドがCEに存在する可能性がある場合は、FAの0.1%を含む溶媒を使用してください。
- 溶出組成物によって1つの分数を収集し、同時に化学分析とバイオアッセイのためのアリコートを保存します。
- 真空、窒素流、または凍結乾燥の下で溶媒を除去し、計量と収率を登録します。
注: CE が初期溶出混合物に溶解しにくい場合は、カートリッジの上部に材料をロードする前に、固体相(例えば、C 18 またはc18 または celite)の比率で CE を分散させます。
注意: マイクロチューブを事前に計量して、抽出物と分数の質量収率を計算します。
- 化学プロファイリング分析
注:各植物種は、その化学分析のために最適化された特定の方法を必要とすることを考慮して、次のセクションでは、植物材料を分析するために使用される最も一般的な分析アプローチを説明します。実際の例として、逆相液体クロマトグラフィーを開発し、2種類の カゼリアシルヴェストリス ・スワルツ(サリカーセ)によって異なる生合成したフェノール化合物とクレロダン型ジテルペン類の同時分析のために検証されました。UPLC-DAD装置には、デガッサー、第4次ポンプ、自動サンプラー、UV-Visフォトダイオードアレイ検出器、およびオーブン(ブエノら201518.00を参照)を装備していました。以下の例に記載されている同様のアプローチは、他の植物種および/または植物材料に応じて最適化することができる。- クロマトグラフィー分析とハイフネーションの可能性
- 超高性能液体クロマトグラフィー(UPLC)を使用した分離には、互換性のある事前カラムで保護されたC18 クロマトグラフィーカラム(例えば、150×2.1mm、2.6 μm、100 Å)を使用してください。
注:他のカラムフェーズやクロマトグラフィーモードは、植物種/材料に応じて使用することができます。従来のHPLCも使用できます。その場合、適切なクロマトグラフィーカラムを選択する必要があります。優れた分離を実現するには、流量(μL/min)、カラム温度(°C)、射出量(μL)を考慮してクロマトグラフィー条件を調整します。移動相は通常、水(A)とアセトニトリルまたはメタノール(B)から成り、線形または多段階溶出勾配またはイソクラティック溶出を使用する。バッファー、酸、塩基、その他の修飾剤も使用できます。 - 植物材料分析(CEおよび/またはCEF)を実行し、利用可能なハイフネーションに応じて、スペクトルデータ(UV-Visおよび/またはMS検出器を使用)、保持時間(分)などの関連データをすべて登録します。
注: 液体クロマトグラフィー (LC) は、通常、LC-HRMS として高解像度質量分析 (HRMS) とハイフン (結合) され、CE OU CEF15で代謝産物の迅速な注釈に使用されます。 - 定性的なデータが必要で、定量的なデータが必要な場合は、同じプロトコルに従って、慎重にキャリブレーションカーブを準備し、注入します。
注:最良のクロマトグラフィー条件の開発は、Buenoら 201518、または同様の文献で記述されているように、実験の設計の助けを借りて行うことができます。メソッド開発の際には、内部標準を含めることを考慮することが重要です。サンプル調製と注入の間に正しい技術的な偏差を可能にし、データ分析のためのさらに正規化を可能にするので、彼らは非常に高く評価されています。
- 超高性能液体クロマトグラフィー(UPLC)を使用した分離には、互換性のある事前カラムで保護されたC18 クロマトグラフィーカラム(例えば、150×2.1mm、2.6 μm、100 Å)を使用してください。
- クロマトグラフィー分析とハイフネーションの可能性
- 1変量および多変量データ分析
- 登録されたクロマトグラムを適切な形式(例えば、ASCII、.txt、または.csv形式)でエクスポートします。複数のサンプルを分析する場合、クロマトグラムを結合して整列することで、1 つのデータマトリックスを設定でき、比較が必要です。得られたマトリックスは、使用される内部標準に従ってクロマトグラムを正規化する必要があります。
- 多変量および1変量法を用いて、植物のメタボロミクスデータを分析します。教師なし主成分分析 (PCA) や階層クラスター分析 (HCA) や教師付き部分最小二乗解析 (PLS、OPLS、PLS-DA など) を含む多変量統計手法を使用した複数の変数の同時分析を通じて、メタボロミクスデータセットを探索し、視覚化します。ANOVA、学生、チューキー、ウェルチのt検定などの一変量法は、サンプル19の定量的な違いを正確に分析する上で特に興味深いものです。
- レプリケーションのデレプリケーションとコンパウンドアノテーション
注: このステップの目的は、ユニまたは多変量データ分析に同時に実行できる退屈な分離を避けるために、既知のNPsの迅速なオンライン識別に専念することです。- 検出された化合物またはターゲット化合物の識別レベルを実行します。
- 完全な3D構造と立体化学(レベル0)を含む同定された化合物、
- 保持時間と MS/MS スペクトル (レベル 1) などの 2 つの直交パラメーターによって実現される識別;
- 推定アクロウンド化合物と化合物クラス(レベル2および3);
- 分析データに基づいて区別できる未確認または未分類の代謝物 (レベル 4)19,20.
- 商用データベースまたはパブリックデータベースを使用して既知のコンパウンドを特徴付けます。最も重要なデータベースの中で、それは強調することができます:NIST(https://www.nist.gov)、ワイリー(https://www.sisweb.com/software/ms/wiley.htm)、マスバンク(https://massbank.eu/MassBank/)、GMD(http://gmd.mpimp-golm.mpg.de/)、METLIN(https://metlin.scripps.edu)、および世界天然物社会分子ネットワーキング - GNPSデータベース(https://gnps.ucsd.edu)19.
注: 注釈にはさまざまなレベルがあり、研究中に採用されたハイフネーション化された手法に依存し、MS-(またはNMR)ベースのスペクトルデータベースの支援と、インリコスペクトル予測アルゴリズムが含まれる場合があります。 - 単離、精製、完全な化合物同定
注: 特定の化合物(統計的手法によって身元が疑われる)が完全な構造識別を必要とする場合、このタスクを実行する最初のステップは、より大きなスケールで目的の化合物を分離して精製することです。既に開発されたプロトコルをスケールアップすることで実現できます。- 適切に確立され、最適化された分量クロマトグラフィー技術によって、標的化合物(複数可)の迅速かつ直接的な分離を行う。乾式負荷注入による半調製HPLCは、高負荷とサンプル可溶化1の間で一般的に行う必要がある妥協を避けるために使用することができる。
- 分離された化合物の完全な構造特性と同定を行います。これは、異なる手法の組み合わせを介して行うことができます。
- 核磁気共鳴(NMR);
- 質量分析 (MS);
- 紫外線(UV)および赤外線(IR)領域における分光技術は、機能群の特性評価にも非常に有用である。
- 電子・振動循環二色(ECDおよびVCD)、ラマン光学活性(ROA)、X線結晶学などのカイ光学分光法の使用は、絶対構成特性評価のための重要な技術である。
- 検出された化合物またはターゲット化合物の識別レベルを実行します。
3. バイオアッセイ
注:生物学的スクリーニング:CEおよびCEFの潜在的な生物活性を迅速に評価するために、天然物質の初期スクリーニングを整理し、簡単にする必要があります。
- バイオアッセイのためのCEおよびCEFの調製
- 可能な限り最良の溶媒(実験的に決定することができる)で乾燥物質を再構成する。実験計画21,22は、ストック溶液および溶媒の濃度を定義する。
- ストック溶液の溶媒濃度を計算します。これを行うには、C 1 x V1 = C 2 x V2の式を使用します。 V1は溶媒の体積を表します。C2は CE および/または CEF の重みです。V2は、ストックソリューションの最終容積 (mL) です。
注:例えば、ストック溶液の溶媒濃度として84.15%のEtOHと15%のジメチルスルホキシド(DMSO)を選択しました。CEのストック濃度を6mg/mL、CEFを1mg/mL13に準備しました。CEおよびCEFを希釈する溶媒は、生物学的活性の評価方法に依存する。車両として使用される溶媒は、生物学的および毒物学的活性を妨げてはならない。典型的には、水、DMSO、EtOH、またはEtOHに基づく水性溶媒が、植物抽出物または植物誘導体4、13を可溶化するために使用される。
- 試験生物の調製
- 微生物株を再活性化する、例えばS.ミュータンスUA159血液寒天(48時間、 37°C、5%CO2)、および液体培養培地(例えば、トリプトン酵母エキスブロス[TYE:2.5%(w/v)トリプドン1.5%(w/v)酵母エキス)1%のグルコース(w/v)(TYEg)を16時間、37°C、5%CO2で培養する。
- 同じ培養培地で微生物の初期培養液の1:20希釈を行う(初期培養の希釈比は、実験計画に応じて変化してもよい)。
- 中ログ成長段階に達するまでインキュベートします。
- 抗菌アッセイ用のTYEgの定義された集団(例えば、ミリリットル当たり2x106 コロニー形成単位- CFU/mL)を有するバイオアッセイの接種を準備し、バイオフィルムアッセイの場合は1%スクロース(TYE)を用いたTYEを準備する。
注:成長条件は、試験した微生物によって異なります。
- 抗菌活性
注 : 手順は図 3に示します。- 96ウェルプレートに、CEおよび/またはCEFストック溶液(治療)のアリコート(μL)を加えます。アリコートの体積は、試験濃度によって定義され、以前の研究に基づいて選択する必要があります。例えば、0.5 mg/mL試験濃度でCEを試験するには、6mg/mLで16.67 μLのストック溶液のアリコートを使用します。この計算では、C1 x V1 = C2 x V2の式を使用し、C1 はストック濃度、V1 はストック溶液アリコートの体積、C2 はテスト濃度、V2 は 96 ウェル プレートの体積(200 μL に相当)を使用します。この実験条件では、溶媒(車両)の試験濃度は7%EtOHおよび1.25%DMSOになります。
- 各プレートのコントロールのセットを含める:治療を伴うカラム、接種なし(治療当たりのブランクコントロール、微生物の成長からそれ自体を使用する治療によって濁りを区別するのに役立ちます)。車両と接種物(CEまたはCEFまたは0 mg/mLコントロールの希釈剤)を有するカラム。培養培地のみを有するカラム(培養培地制御)と、接種物(微生物増殖制御)のみを有するカラム。
- TYEgを使用して、音量を100 μLに調整します。次に、インキュベートは、例えば、24時間、37°C、5%CO2(試験した微生物に依存する)である。
- 微生物の100 μL(1x 106 CFU/mL)を96ウェルプレートに接種します。
- ウェルの目視検査(透明または曇り)によって濁りに応じて細菌の成長を分析します。クリア:微生物の目視的な成長がないことを意味する。曇り:微生物の視覚的な成長があることを意味する。
- 各ウェル(540nmを用いたELISAリーダー)における細菌培養物の吸光度(光学密度またはO.D.)を測定する。次に、900 μL の生理液(0.89% NaCl)を含むマイクロチューブに培養物を 100 μL 転送し、ボルテックスでよく混合します。次に、目的の値になるまで10倍のシリアル希釈を続けます。
- 特定の寒天プレート(重複)で所望の希釈のアリコートを接種する。例えば、血液寒天プレート上の特定希釈液の10 μL。
- インキュベート。微生物の間で条件が変化する可能性があります, 例えば, S. ミュータンス: 48 h, 37 °C, 5%CO2.
- 後でCFU/mLに変質するためにプレート上のコロニーカウントを行う(コロニー数x10 n)/q。この式において、nは希釈の絶対値(0、1、2、または3)に等しく、qは、寒天板にメッキされた希釈液ごとにmLで、ピペット化された量に等しい。また、CFU/mL をログ値に変換することもできます。
注:植物抽出物を培養液に添加すると、抽出物からの粒子の沈殿が起こることがあります。この事実は結果を解釈するのを困難にする可能性があります。マイクロプレートリーダーが、場合によってはマイクロプレートの底に細胞が集まるように濁度を測定する場合にも同じことが起こります。また、使用する抽出物によっては、植物葉エキスの色が濁度23,24を定量することが困難になる場合がある。別の方法は、微生物細胞が代謝活性であるかどうかを明らかにする染料を使用します24.
- 抗バイオフィルム活性
注: バイオフィルム形成に対する治療の効果を評価する手順を図 4に示します。- バイオフィルムの形成と加工
- 抗菌活性プロトコルのステップに記載されているように、96ウェルプレート中の培養培地(TYE)における希薄化処理。
- プレートをインキュベートします。S.ミュータンを使用した例では、インキュベーションは24時間、37°C、および5%CO2で行われる。
- インキュベーション後、プレートを軌道シェーカー(5分、37°C、75rpm)に置き、バイオフィルムに付着していない細胞を緩めます。次いで、接着していない細胞を含む培養培地を廃棄し、残りのバイオフィルムを0.89%NaClで3回洗浄して非接着細胞を除去する。
- 処理されたバイオフィルムからのバイオマスの定量
注: 手順は図 4Aのフローチャートに示されています。- バイオフィルムをプレートに洗浄し、1%の水溶液を50μLずつ加えます。
- プレートを室温で35分間インキュベートします。
- 汚れた井戸をMilliQ水(3回)で洗い、60〜90分間空気乾燥します。
- プレートを軌道シェーカー(5分、37°C、75rpm)にインキュベートすることにより、99%EtOHの200 μLで染色されたウェルから結晶を溶出させます。
- 溶出した色素を用いて各ウェルから150μLのアリコートを別のプレートに移し、サンプルバイオマス(ELISAリーダー570nm)を定量化します。
- 処理したバイオフィルムの生菌性微生物集団(CFU/mL)の定量化
注 : この手順は、 図 4Bのフローチャートに示されています。- 洗浄したバイオフィルムをピペットと200 μLのNaCl 0.89%でプレートから取り出し、得られた懸濁液を個別に無菌マイクロチューブに移します。
- NaCl 0.89%の追加200 μLをウェルあたりに使用し、すでに初期バイオフィルムサスペンションの200 μLを含む対応するチューブに移します。このプロセスは、元のウェルあたり1 mLバイオフィルムの総懸濁液に達するまで行います。
- 各チューブからアリコートを使用して、10倍の連続希釈を行います。
- 特定の寒天プレート(重複)で所望の希釈のアリコートを接種する。例えば、血液寒天プレート上の特定希釈液の10 μL。
- 寒天プレート(例えば、48時間、37°C、5%CO2)をインキュベートし、コロニーを数えて上記のようにCFU/mLを決定する。
- バイオフィルムの形成と加工
- 生物活性検証段階
- 唾液ペリクル形成
- ヒドロキシアパタイト(HA)ビーズ(マクロ準備セラミックハイドロキシアパタイトI型I型80μm)を表面として用い、唾液膜25を形成する。これらのビーズ表面は歯科エナメル質を模倣する。
- マイクロチューブでHAビーズ(例えば、10mg)を秤量し、殺菌します。次いで、吸着バッファー(ABバッファー:50mM KCl、1 mM KPO4、1mM CaCl2、1mM MgCl2、dd-H2O、pH6.5]0.1 mMフェニルメチルスルホニルフッ化物(PMSF)および0.02%アミドナトリウム(NaN3)を使用して洗浄する。
- 収集し、人間の唾液26を準備します。制度倫理委員会の承認が必要です。
- マイクロチューブに500μLの唾液を加え、インキュベート(40分、37°C、24rpm)します。
- 次に、唾液上清を取り出し、ビーズを洗浄する(PMSF及びNaN3を含むAB緩衝液で3回)。 sHA ビーズ(唾液ペリクル付きHAビーズ)は、下流アッセイの準備が整いました。
注:唾液は健康なボランティアから収集されます。採取後、唾液(1:1 v/v)をAB緩衝液と遠心分離機(1699 x g、20分、4°C)で希釈します。濾過による滅菌(ポリエーテルサルホン膜フィルター、0.22 μmタンパク質への低結合)26.制度倫理委員会は調査を承認しなければならない。我々の場合、機関の倫理委員会は調査を承認しました(CAAE:68161417.0.0000.5416)。
- 選択した抽出物で処理されたフィルム唾液およびグルカンへの接着後の S.ミュータン の剥離
- 上記のように、中対成長期まで微生物を培養する。
- 培養物が所望のO.D.に達すると、遠心分離機(4000×g20分間)、0.89%NaCl溶液で洗浄し、同じ初期量の培養液を使用してペレットを0.89%NaClで再懸濁する。
- S.ミュータンスなどのレンサ球菌を使用する場合は、デチェインするプローブで培養物を超音波処理します(30、7 W、3回)。単一の細胞生物を使用する場合、このステップはスキップできます。
- 2 x 106 CFU/mL に濃度を調整するには、O.D. (540 nm) を確認します。
- S. ミュータン の唾液ペリクル (sHA) への付着および接着された細胞の剥離
注 : この手順は、 図 5のフローチャートに示されています。- 上記のとおり にsHA サンプルを入手する。
- 選択した処理(試験濃度で0.5 mg/mLなど)のアリコート(例では500 μLを追加)、または sHAのサンプルを含むマイクロチューブ内のコントロールを追加します。
- sHAサンプルを処理またはコントロール(30分、37°C、24 rpm)でインキュベートします。次に、ビーズをABバッファ(PMSFおよびNaN3を含む)で3回洗浄します。
- 微生物培養物を加える。この例では、各マイクロチューブに500 μLの S.ミュータンス 培養物(2 x 106 CFU/mL)を加えます。
- インキュベート(1時間、37°C、24rpm)を、ABバッファーで3回洗浄して非結合細胞を除去する。
- 各サンプルをアリコート(例では1000 μL)のABバッファと超音波処理をプローブ(30 s,7 W)で再中断します。
- 各懸濁液のアリコートを使用して、10倍の連続希釈液を使用して、特定の寒天プレート上でめっきすることによって生存可能なコロニーの数を決定する(48時間、37°C、5%CO2)。次に、上記のようにCFU/mLを決定するためにコロニーを数えます。
注:超音波処理のステップは 、sHAに付着した細胞を取り外すために行われます。
- 初期グルカンマトリックス(gsHA)へのS.ミュータンの接着と接着細胞の剥離
注 : この手順は、図 6のフローチャートに示されています。GtfB酵素を、GtfBを製造するように設計されたレンサプトコッカス・ミラーリKSB8の培養上清から精製した。精製は、2つのプロテアーゼ阻害剤(0.1 mM PMSFおよび0.02%NaN3)27,28を含有する緩衝剤を用いてヒドロキシアパタイトビーズを含むクロマトグラフィーカラムで行った。次いで、酵素をアクリルアミドゲル(SDS-PAGE)でチェックし、硝酸銀で染色した。酵素のアリコートは使用するまで−80°Cで保存した。- 上記のとおり にsHA サンプルを入手する。次に、各チューブにGtfB酵素のアリコート(例では500 μLを加える)を加え、ホモジナイザー(40分、37°C、24rpm)でインキュベートします。次いで、ABバッファ(PMSFおよびNaN3を含む)で3回洗浄する。
- 各マイクロチューブに、治療(または試験濃度でコントロール-コントロール)を含むスクロース基質(例えば、500 μL)のアリコート(例えば、500 μL)を加えます。
- ホモジナイザー(4時間、37°C、24rpm)でサンプルをインキュベートします。次いで、ABバッファ(PMSFおよびNaN3)で3回のスリングを行い、合成されたグルカンに組み込まれていないスクロースの治療および過剰量 (gsHAのサンプル)を除去する。
- 各マイクロチューブに 、S.ミュータン ズ接種(2 x 106 CFU/mL)のアリコート(例では500 μLを追加)を加えます。
- ホモジナイザー(1時間、37°C、24rpm)でインキュベートし、ABバッファー(PMSFおよびNaN3)で3回洗浄し、非結合細胞を除去する。
- 各サンプルをABバッファ(PMSFおよびNaN3)のアリコート(例えば1000 μL)で再懸濁し、プローブで超音波処理し 、gsHA(30 s,7 W)に付着した細胞を取り外します。
- 各懸濁液のアリコートを使用して、10倍の連続希釈液を使用して、特定の寒天プレート上でめっきすることによって生存可能なコロニーの数を決定する(48時間、37°C、5%CO2)。次に、上記のようにCFU/mLを決定するためにコロニーを数えます。
- 唾液ペリクル形成
4. 生物データ解析
- バイオアッセイデータ
- スプレッドシートにバイオアッセイの生データを入力します。各処理による微生物増殖阻害のログを計算する(A CFU/mLの治療 + 1)x log10。次いで、微生物増殖阻害の対数割合を算出し、(Alog10 CFU/mLの処置/平均Alog10 CFU/mLの車両制御)x 100%を用いた車両制御と比較した。
- 治療(CEおよびCEF処理群)および車両制御(陰性対照)によって処理されたプランクトニック培養およびバイオマスの正しいO.D.。補正のために、培養培地(Ablank)のみを含むウェル(A処置群培地 /A陰性対照培地)x 100%から得られたものから処理されたウェルの吸光度を差し引く。
- この補正後、バイオマス阻害の割合を算出し、車両制御と比較して(A処理したバイオマス/平均A車種制御)x100%とする。
- 特定のソフトウェアを使用してデータの統計分析のために生成された生データを送信します。
メモ: 特定の処理の有効性の解釈は、IC50/IC90などのブレークポイントを使用して決定されます。これらの値は、細菌の増殖またはバイオフィルム形成24の50%および90%をそれぞれ阻害し得る治療の最小濃度として定義される。これらのパラメータは、データを解釈するのに役立ち、より良い活性を持つ化合物を選択するための基礎を提供します13,29.
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Representative Results
我々は、植物抽出物および分画の生物学的活性をスクリーニングする体系的なアプローチを用いて、新しい抗齲虫療法の可能性のある活性分子を同定する例を提供する:ストレプトコッカス・ミュータンスおよびカンジダ・アルビカンス13に対するブラジルの異なるバイオームからのカゼリアシルベストリス抽出物の抗菌および抗バイオフィルム活性。
背景
スクロースとデンプンが豊富な特定の経口微生物宿主因子と食生活との間の複雑な相互作用は、病原性バイオフィルムの形成を調節し、齲蝕原形成プロセス30,31を開始することができる。S.ミュータンは、その酸性原性および酸性度31に加えて、エキソ多糖類合成を担うGtfsを産生するので、齲蝕の発達に関連するバイオフィルムの病原性を調整する。さらに、Gtfsはカンジダ・アルビカンス(および他の微生物)の接着を可能にし、バイオフィルム32、33の病原性を増加させる。我々は、異なるブラジルのバイオームからのC.シルヴェストリス葉抽出物および画分の抗菌および抗バイオフィルム活動のスクリーニングを行った。 C. シルヴェストリス(「グアサトンガ」) ブラジル、南米、アジアの他の国々で人気のある伝統的な使用の一部です34,35.この植物は、ブラジルで高い発生率で病気を治療することができる71種を含む「SUSに関心のある薬用植物の全国リスト」(RENISUS)に引用されています36.シルヴェストリスの葉抽出物の化学的プロファイルは、豊富なジテルペン35を有する豊富な植物化学的組成を提示し、一方、フェノール化合物(主にフラボノイド)はvar.lingua18で優勢である。
プロトコルに記載されているアプローチを用いて、評価された微生物に最も有効なC.シルベトリスの抽出物と分画を特定し、単純モデルを用いた結果に基づいて、どの治療法がインビトロ複雑モデル(ヒドロキシアパタイトディスク、ミクロコミクス)37,38で試験されるか選択する。ここでは、12CEのS.ミュータンに対するスクリーニングの結果を紹介します。データを解釈して議論するのではなく、天然化合物をスクリーニングするためのこのアプローチの有用性を実証することに焦点を当てています。
ブラジルの12種類の集団から、ブラジルのバイオームの異なる形成から、2種類のC.シルヴェストリスから個体の葉を集めました(Ribeiroら 201913.コレクションは2012年6月から9月、2013年(SisGen)の間に実施されました。登録#A00892A)。二次代謝産物の化学的変動に対処するために、異なる化学型の個体や異なるバイオームからの代表的なサンプルを収集することをお勧めします。可能な場合は、少なくとも3〜5人を収集する必要があります。植物インフラの化学的変動に関する以前の情報も、Ribeiroら 2019およびBuenoら201513,18で説明されているように考慮されるべきである。CEの化学組成は、ステップ2で引用したクロマトグラフィーによって調べられ、図7の化学プロファイルを提供する。生物学的スクリーニングで得られたデータの解釈を統合するためには、化学的プロファイルの分析が不可欠です。
この場合、16 進数、AcOEt、および MeOH の分数での分数が示されました。CEの分画は混合物の単純化が潜在的に活性な化合物の集中を増加させ、化合物間の相乗および拮抗の可能性を減少させる。さらに、より単純な混合物(分数)では、CEよりも化合物のスペクトルデータを取得し、デレプリケーション分析2を実行する方が簡単です。通常、分画は、C18(40 μm、100 Å)のような優先的に逆転相吸着剤を含む液体-液体抽出または固相抽出カートリッジ(SPE)によって行うことができる。他の吸着剤または吸着剤の混合物は、所望の化合物の研究目的または化学的性質に応じて、選択することができる。選択した技術がSPEである場合、カートリッジは、純粋な有機溶媒(例えば、EtOH)で活性化され、初期溶出物で条件付けされなければなりません。標準化されたプロトコルが利用可能です。したがって、読者は、意図した研究や興味のある植物材料に従ってそれらを相談し、適応させることができます。
12 CEは、6 mg/mL(ストック溶液)を達成するために84.15%のEtOHと15%のDMSOで可溶化しました。スクリーニング試験の前に、微生物の増殖を妨げない希釈濃度(車両)を試験した。このステップは、治療をテストする際に、溶剤の抗菌作用および抗バイオフィルム作用が結果に影響を及ぼすのを防ぐため重要です。テストは、目的の微生物の培養物を異なる濃度の溶媒(関連および/または単離)で処理することによって、96ウェルプレート上で行うことができる。そこで、CEを0.5 mg/mL、7%EtOHと1.25%のDMSOの濃度でスクリーニングを開始しました。
抗菌および抗バイオフィルム活性をスクリーニングするために、96ウェルプレートは、上記のように処理した。この目的のために、16.67 μLのストック溶液CE(6 mg/mL)の体積を添加し、0.5mg/mLの濃度で各CEを試験しました。形成されたバイオフィルムは、ステップ3に記載されたとおりに処理した。 S.ミュータン (IC50 または3ログ)に対して有効な抽出物を、工程3に記載されているように唾液ペリクルおよび初期グルカンマトリックスに対するこの細菌の「接着強度」を評価するために使用した。
生物学的アッセイから得られた生データをExcel(ステップ4に記載)で組織し、適切な統計処理13で分析した。最良の活性を有する抽出物を同定するためのカットオフ点は、IC50 阻害(3ログ)であった。このパラメータから、4つの抽出物が好ましい反応を示した(図8)。これら4つの抽出物のクロマトグラフィーデータは、クレロダン型ジテルペンとグリコシル化フラボノイドの同時存在を示す。さらに、それらは同じバイオーム(大西洋の森)と品種(シルヴェストリス)を含みます。生物学的データを解釈するために、我々は、他のスクリーニングされた抽出物と最良の活性を有する4つの抽出物のクロマトグラフィープロファイルを比較した。他の抽出物と比較して、最良の活性を有する抽出物は、クレロダン型ジテルペンの量が多く、同時にグリコシル化フラボノイドを有する。この観察は、これらの抽出物の有効性が2つの二次代謝産物間の相乗的相互作用によるものである可能性が高いことを示し、したがってそれらの生物学的活性を増加させる。すなわち、クレロダン型ジテルペンとグリコシル化フラボノイドの併用効果は、それらの別個の効果13の合計よりも大きい。
スクリーニングで得られたデータを確認するために、選択したCEで処理した唾液ペリクルおよびグルカンへの接着後のS.ミュータンスの剥離を評価した。このアッセイは、in vitro単一種のバイオフィルムモデルを使用して、選択された粗抽出物の生物学的活性をより良く評価し、可能な作用標的を同定する。最初の分析は、使用される治療が唾液ペリクルへのS.ミュータンの付着を阻害することができるかどうかを検証するが、主に、処理されたペリクルに付着した微生物の細胞が機械的刺激によって表面からより容易に除去することができるかどうか、したがってバイオフィルム形成の第1段階を中断する。グルカンの合成中にCE(より良い活性を有する)を添加した場合、唾液ペリクルに付着した細胞の除去に有意に影響を与えたCEがなかったため、唾液ペリクルを改変しなかった(図9A)。
初期グルカンマトリックス(gsHA)の接着は、治療が初期グルカンマトリックスへの S.ミュータン の接着を阻害できるかどうかを調査する。それでも、この方法論は、処理されたグルカンに付着した微生物細胞が表面の機械的刺激によってより容易に除去され、ステージバイオフィルム形成を中断できるかどうかを検証する。3つのCEはGtfBによって形成されたグルカンの質に影響を与え、したがって、最初のグルカンマトリックスへの S.ミュータン の接着を弱めた(ほとんどの S.ミュータンス 細胞はグルカンの接着後に除去された。 図 9B)。この行動は二次代謝産物間の相乗効果に関連していると考えています 13.
システマティックアプローチは、カリオジェニックバイオフィルムの形成を止めるために活性粗抽出物を同定し、選択するのに役立ちました。クロマトグラフィープロファイルに基づいて選択されると、複雑なモデルにおける作用の分子メカニズムを解明するための基礎を持っています。
図2:植物材料抽出と分画のフローチャート。図は、粗抽出物(A)と粗抽出物の分画(B)を調製するための実験計画を示しています。アラブ首長国連邦:超音波支援抽出;SPE: 固相抽出。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:96ウェルプレートにおける抗菌活性を評価するための実験計画。この図は、処理(粗抽出物または分数)とコントロールを示しています。複数の治療のスクリーニングには、各ウェルに1つの濃度(mg/mL)を使用してください。CFU/mL:1ミリリットル当たりのコロニー形成単位。O.D.:光学密度。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:96ウェルプレートにおける抗バイオフィルムアッセイの実験設計図は、処理(粗抽出物と分数)とコントロールを示しています。各種治療のスクリーニングには、各ウェルに1濃度(mg/mL)を使用してください。 Aでは、処理されたバイオフィルムのバイオマスを定量化するステップが示されている。 Bにおいて、処理されたバイオフィルムの集団(CFU/mL)を決定するステップを示す。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:唾液ペリクルへの接着を評価する実験計画、続いて接着した細胞の剥離を行った。次の図は、実行する手順を示しています。治療:生物学的スクリーニングに基づいて選択される。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図6:初期グルカンマトリックス(gsHA)への接着を評価し、続いて接着した細胞の剥離を評価する実験計画。次の図は、実行する手順を示しています。治療:生物学的スクリーニングに基づいて選択される。スクロース基質:100ミリモルのショ糖。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図7:ブラジルのバイオームからのC.シルヴェストリス抽出物におけるクレロダン型ジテルペンおよびグリコシル化フラボノイドの量。文字S、I、およびLはそれぞれ、品種シルヴェストリス、中間、および言語を示します。ポーラ・カロライナ・ピレス・ブエノ博士による個人的なコミュニケーション。この図は、リベイロら13から変更されています。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図8: S.ミュータンに対するブラジルのバイオームからのC.シルヴェストリス粗抽出物の抗菌および抗バイオフィルム活性. A.% CFU (ログ10) の処理されたプランクニック細胞;B.処理されたバイオフィルムのバイオマスC. % CFU (ログ10) の処理されたバイオフィルム。説明されるデータは、中央値 (トレース) と四分位 (ボックス) です。誤差範囲は、最大値と最小値を表します。アスタリスクは、特定の抽出と車両制御(V)の統計的に有意な差を示し、ここで:****pは0.0001≤。p ≤ 0.001;** p ≤ 0.01;そして*p ≤ 0.05 (クルスカル-ウォリス検定、続いてダンの多重比較検定)。各種の成長制御(処理なし)は、S.ミュータンのSmとして表される。各グラフのバーの色は、抽出が属する多様性を表し、濃い灰色で:var. sylvestris;ライトグレー: var. 中間と白: var. lingua.この図は、リベイロら13から変更されています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図9:S.ミュータンは、処置された唾液ペリクルおよびグルカンの初期マトリックスへの接着後に剥離する。処理された唾液ペリクルおよびグルカンに対するS.ミュータンスの放出後のデータは、それぞれ(A)および(B)に示されている。制御車両(V)と、両方の分析で試験した抽出物との間に違いはなかった。CFU/mLの割合は、車両制御(V)を100%と考えて得られた。説明されるデータは、中央値 (トレース) と四分位 (ボックス) です。誤差範囲は、最大値と最小値を表します。アスタリスクは、特定の抽出と車両制御(V)の統計的に有意な差を示し、****p = 0.0001および**p<0.0031(Kruskal-Wallis検定、ダンの複数比較試験)を示します。成長制御は S.ミュータンの Smで表されます。グラフのバーの色は、抽出が属する多様性を表し、色は濃い灰色からvar.sylvestrisになります。この図は、リベイロら13から変更されています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
天然の粗抽出物の研究に関連する主な課題は、その複雑な組成と古典的な生体誘導分離研究の不十分さから成り立っています。このプロセスは遅いですが,効果的であり,NP研究における主要な知見につながっています。合理化には、優先順位付け主導型の研究が必要です。したがって、分離前のCEおよび非複製の分析のための現代の化学プロファイリングアプローチの使用は、研究された材料を特徴付けるために重要であり、特に既に記述された生物学的活性を有する既知の化合物の再単離を避けるために有用である2、15。また、多次元データの取得は、観察された生物学的活動の原因となる潜在的なヒット候補を見つけるために、更なる多変量データ分析を行う必要がある。その結果、研究者は、これらの潜在的な候補者の孤立(壮大なスケール)に焦点を当てることができます。
ここでは、植物抽出物および分画からの活性化合物のバイオアッセイ誘導同定(in vitro)に関する体系的なアプローチを提示する。このプロトコルは、複数のアクティブなコンポーネントを同時にスクリーニングし、分析することができるように、マルチターゲットスクリーニングと分析方法を可能にします。バイオアッセイは、小規模で高収率であり、速く、費用対効果が高く、再現が容易で、従来の方法(例えば、目的の化合物の初期単離)よりも少ない試薬を消費する39。天然物研究では、分析ツール(HPLC-UV、HPLC-DAD、LC-MSなど)が最も重要です。最近では、このアプローチは、分析および解明プラットフォーム(LC-HRMSおよびHRMS/MS、高磁場NMR)の力を利用して、より構造指向(化学ベース)であり、既に知られている分子の迅速な同定に構成される逆複製戦略である。このステップは、生物学的応答との化学的プロファイル関係を理解するのに役立ち、その結果、候補活性代謝産物の分離がより集中した結果3.クロマトグラフィー分析には、いくつかの確立された方法があります。不明な NP の場合、パイロットを実行して最適な方法を見つける必要がある場合があります。例えば、我々は、C.シルヴェストリス13、18の2つの品種によって産生される二次代謝産物の同時分析のために検証されたクロマトグラフィーの分析方法を使用する。クロマトグラフィー法を選択する際には、標的化合物(複数可)に基づくプロトコルを検討し、利用可能なすべての方法の長所と短所を検討することを提案し、特にそれらの効率に焦点を当て、もちろん、総コストは40を伴う。
体系的なアプローチは、NPの生理活性候補を迅速にスクリーニングおよび分析するのに有用であることが証明されていますが、依然として重要な制限があります。例えば、バイオマスおよびプランクニクス培養物の視覚およびO.D.の測定値は、偽陽性の結果を13、23、24に再現し得る。天然化合物23,24に使用すると、マイクロプレートリーダーで培養物の濁度を決定することは失敗する可能性がある。これらの障害は、(i)いくつかの試験生物において、細胞がウェルの底部に集まり、他の生物では細胞が懸濁状態にとどまるために起こる。(ii)CEに存在する固体粒子が沈殿し、ウェル23,24に濁度を引き起こす。また、NP の pH も考慮する必要がある要因です。処理溶液のpHは二次代謝産物の化学組成に関連しており、したがって、生物学的応答に影響を及ぼす。pHは制限ではありませんが、研究の目的に応じて注意して評価する必要があります。例えば、歯のエナメル質表面のバイオフィルムモデルでは、酸性度は不要なエナメル質脱塩を引き起こす可能性があります。これらの場合、適切なバッファーの助けを借りてpHを調整する必要があります。したがって、pH調整が以前に観察された生物学的応答に影響を与えたかどうかを検証するための試験を行う必要がある。
新しい化合物の活性を評価するための古典的な試験は、最小阻害濃度(MIC)および最小殺菌濃度または殺菌濃度(MBCまたはMFC)29、41を決定することを含む。しかし、目標は、多くの植物抽出物や分数をスクリーニングすることである場合、技術は網羅的になります。バイオスクリーニングは、単一濃度の複数の処理(例えば、異なる場所からの植物抽出物)13、42、29で行うことができる。このような状況では、体系的なアプローチは、一貫性のある結果を返す、作業時間が短い高い方法です。生物学的スクリーニングで選択された治療法は、生物学的活性を確認するために、精製されたモデル(臨床的に関連性、生存性、再現性)を用いて評価することができる。齲蝕原性バイオフィルムの制御のために、実験室研究は主にヒドロキシアパタイト(歯エナメル置換)または唾液ペリクル37でコーティングされた直立した位置に置かれたエナメル質表面上に形成されたバイオフィルムに焦点を当てるべきである。また、再生可能かつ迅速な方法で異なる品種やバイオームの植物サンプルのスクリーニングを可能にします。これら2つの変数(バイオームおよび多様性)を含めることは、二次代謝産物18の化学組成の変動性に影響を及ぼし、生物学的応答を調節するので極めて重要である。この体系的なアプローチは、経口バイオフィルム研究以外の用途に適応/変更することができます。例えば、他の目的種を用いて、バイオフィルムに関連する他の分野に特に有用であり得る。
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Disclosures
利益相反は宣言されていません。
Acknowledgments
植物材料の製造研究所を提供してくれたアララクアラ/SPのUNESP化学研究所のヌクレオ・デ・バイオレジオジオス、バイオスシンテーゼ・エ・エコフィシオロジア・デ・プロドゥトス・ナチュラワ(NuBBE)に感謝の意を表します。また、アララクアラ/SPの歯学・補生学科応用微生物学研究室に感謝します。この研究は、サンパウロ研究財団(FAPESP #2013/07600-3からAJC)の研究助成金と、奨学金に加えてオーバーヘッド資金(FAPESP #2017/07408-6およびFAPESP #2019/23175-7からSMR #2012 #2011への研究助成金によって支えられました。FAPESPに関連する国家科学技術開発評議会は追加の支援を提供しました(INCT CNPq #465637/2014-0およびFAPESP #2014/50926-0をAJCに)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well microplates | Kasvi | Flat bottom | |
| Activated carbon | LABSYNTH | Clean up and/or fractionation step | |
| Analytical mill | Ika LabortechniK | Model A11 Basic | |
| Blood agar plates | Laborclin | ||
| Chromatographic column C18 | Phenomenex Kinetex | 150 × 2.1 mm, 2.6 µm, 100Â | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | Vehicle solution | |
| ELISA plate reader | Biochrom Ez | ||
| Ethanol | J. T. Baker | For extraction and fractionation steps, and mobile phase composition | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | Vehicle solution | |
| Ethyl acetate | J. T. Baker | Fractionation step | |
| GraphPad Software | La Jolla | GraphPad Prism7 | |
| Hexane | J. T. Baker | Fractionation step | |
| Incubator | Thermo Scientific | ||
| Isopropanol | J. T. Baker | For extraction step | |
| Lyophilizer (a freeze dryer) | Savant | Modulyo | |
| Nylon Millipore | LAC | 0.22 µm x 13 mm | |
| Orbital shaker | Quimis | Model G816 M20 | |
| Polyamide solid phase extraction cartridge | Macherey-Nagel | Clean up and/or fractionation step | |
| Silica gel | Merck | 40–63 μm, 60 Â | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Synth | 0,89% in water | |
| Solid phase extraction cartridges (SPE) | Macherey-Nagel | Clean up and/or fractionation step | |
| Tryptone | Difco | ||
| UHPLC-DAD | Dionex | Ultimate 3000 RS | |
| Ultrasonic bath | UNIQUE | Model USC 2800 | |
| Yeast extract | Difco |
References
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