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Biology

दंत क्षय को रोकने के लिए पौधों के अर्क और अंशों से उपन्यास एंटीमाइक्रोबियल और एंटीबायोफिल्म अणुओं की पहचान करने के लिए व्यवस्थित दृष्टिकोण

Published: March 31, 2021 doi: 10.3791/61773
Automatic Translation
*1, *1, *2, 2,3, 2, 1
1Department of Dental Materials and Prosthodontics, School of Dentistry, São Paulo State University (UNESP), 2Department of Organic Chemistry, Institute of Chemistry, São Paulo State University (UNESP), 3Faculty of Pharmaceutical Sciences of Ribeiraão Preto (FCFRP-USP), Department of Physics and Chemistry, University of São Paulo
* These authors contributed equally

Summary

प्राकृतिक उत्पाद नई दवाओं और चिकित्सीय एजेंटों के विकास के लिए आशाजनक शुरुआती बिंदुओं का प्रतिनिधित्व करते हैं। हालांकि, उच्च रासायनिक विविधता के कारण, पौधों से नए चिकित्सीय यौगिकों को ढूंढना एक चुनौतीपूर्ण और समय लेने वाला काम है। हम पौधे के अर्क और अंशों से एंटीमाइक्रोबियल और एंटीबायफिल्म अणुओं की पहचान करने के लिए एक सरलीकृत दृष्टिकोण का वर्णन करते हैं।

Abstract

प्राकृतिक उत्पाद संरचनात्मक रूप से विभिन्न पदार्थ प्रदान करते हैं, जिसमें असंख्य जैविक गतिविधियां होती हैं। हालांकि, जटिल पौधों के मैट्रिक्स और समय लेने वाले अलगाव और पहचान प्रक्रियाओं के कारण पौधों से सक्रिय यौगिकों की पहचान और अलगाव चुनौतीपूर्ण है। इसलिए, पौधों से प्राकृतिक यौगिकों की स्क्रीनिंग के लिए एक सौतेला दृष्टिकोण, जिसमें संभावित सक्रिय अणुओं के अलगाव और पहचान शामिल हैं, प्रस्तुत किया गया है । इसमें पौधे की सामग्री का संग्रह शामिल है; कच्चे तेल के अर्क की तैयारी और अंश; विश्लेषण और यौगिकों की पहचान के लिए क्रोमेटोग्राफी और स्पेक्ट्रोमेट्री (यूएचपीएलसी-डैड-एचआरएमएस और एनएमआर) दृष्टिकोण; बायोअसे कहते हैं (एंटीमाइक्रोबियल और एंटीबायोफिल्म गतिविधियां; लार के लिए बैक्टीरियल "आसंजन शक्ति" और चयनित उपचारों के साथ इलाज किए गए प्रारंभिक ग्लूकन मैट्रिक्स); और डेटा विश्लेषण। मॉडल सरल, प्रजनन योग्य है, और कई यौगिकों, सांद्रता और उपचार चरणों की उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग को लगातार नियंत्रित किया जा सकता है। प्राप्त किए गए आंकड़े भविष्य के अध्ययनों के लिए नींव प्रदान करते हैं, जिनमें सबसे सक्रिय अर्क और/या अंशों के साथ योग, अणुओं का अलगाव, माइक्रोबियल कोशिकाओं और बायोफिल्म्स में विशिष्ट लक्ष्यों के लिए अणुओं को मॉडलिंग करना शामिल है । उदाहरण के लिए, कैरियोजेनिक बायोफिल्म को नियंत्रित करने का एक लक्ष्य स्ट्रेप्टोकोकस म्यूटन ग्लूकोसिलट्रांसफेरेस की गतिविधि को रोकना है जो एक्सट्रासेलुलर मैट्रिक्स के ग्लूकन को संश्लेषित करता है। उन एंजाइमों का अवरोध बायोफिल्म बिल्ड-अप को रोकता है, इसकी उग्रता को कम करता है।

Introduction

सोसायटियों में इस्तेमाल होने वाली दवा के शुरुआती मॉडल प्राकृतिक उत्पादों (एनपीएस) पर आधारित थे। तब से इंसान प्रकृति में नए रसायनों की तलाश कर रहा है जिसे ड्रग्स में तब्दील किया जा सकता है1. इस खोज के कारण नृवंशविज्ञानी स्क्रीनिंग के लिए प्रौद्योगिकियों और तरीकों में निरंतर सुधारहुआ1 ,2,3. एनपीएस संरचनात्मक रूप से विविध पदार्थों का एक समृद्ध स्रोत प्रदान करते हैं, जिसमें वैकल्पिक या एडजुवेंट चिकित्सा विकसित करने के लिए उपयोगी जैविक गतिविधियों की एक विस्तृत श्रृंखला है। हालांकि, अंतर्निहित जटिल पौधे मैट्रिक्स सक्रिय यौगिकों के अलगाव और पहचान को एक चुनौतीपूर्ण और समय लेने वाला कार्य बनाता है4।

दंत क्षय4सहित मौखिक को प्रभावित करने वाली कई स्थितियों को रोकने और/या इलाज करने के लिए एनपीएस आधारित दवाओं या योगों का उपयोग किया जा सकता है । दंत क्षय, विश्व स्तर पर सबसे प्रचलित पुरानी बीमारियों में से एक, चीनी से भरपूर आहार और माइक्रोबियल बायोफिल्म्स (दंत पट्टिका) की बातचीत से निकला है जो दांतों की सतह पर बनता है जो माइक्रोबियल मेटाबोलिज्म से प्राप्त कार्बनिक एसिड के कारण होने वाले डिमिनेरलाइजेशन की ओर जाता है, और यदि इलाज नहीं किया जाता है, तो दांतों की हानि5,6हो जाती है। यद्यपि अन्य सूक्ष्मजीव7से जुड़े हो सकते हैं, स्ट्रेप्टोकोकस म्यूटन एक महत्वपूर्ण कैंसरजनक जीवाणु है क्योंकि यह एसिडोजेनिक, एसिडुरिक और एक बाह्य मैट्रिक्स बिल्डर है। यह प्रजाति कई एक्सोएंजाइम्स (जैसे, ग्लाइकोसाइलट्रांसफेरैसेस या जीटीएफएस) को एन्कोड करती है जो एक्सोपॉलिसाकाराइड्स में समृद्ध एक्सोसेलुलर मैट्रिक्स बनाने के लिए एक सब्सट्रेट8 के रूप में सुक्रोज का उपयोग करती है, जो एक उग्रता निर्धारक9है। इसके अलावा, कवक कैंडिडा एल्बिकान उस एक्सट्रासेलुलर मैट्रिक्स7के उत्पादन को बढ़ा सकते हैं। हालांकि फ्लोराइड, विभिन्न तौर-तरीकों में प्रशासित, दंत क्षय10को रोकने के लिए आधार बना हुआ है, इसकी प्रभावशीलता बढ़ाने के लिए एडजुवेंट के रूप में नए दृष्टिकोणों की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, उपलब्ध एंटी-प्लेक तौर-तरीके व्यापक स्पेक्ट्रम माइक्रोबिकिडल एजेंटों (जैसे, क्लोरहेक्सिडीन)11के उपयोग पर आधारित हैं। एक विकल्प के रूप में, एनपीए बायोफिल्म्स को नियंत्रित करने और दंत क्षय12, 13को रोकने के लिए संभावित उपचार हैं।

पौधों से नए बायोएक्टिव यौगिकों की खोज में आगे की अग्रिम में आवश्यक कदम या दृष्टिकोण शामिल हैं जैसे: (i) नमूने के लिए विश्वसनीय और प्रजनन योग्य प्रोटोकॉल का उपयोग, यह देखते हुए कि पौधे अक्सर अंतरविशिष्ट परिवर्तनशीलता दिखाते हैं; (ii) व्यापक अर्क और उनके संबंधित अंशों को छोटे पैमाने पर तैयार करना; (iii) उनके रासायनिक प्रोफाइल के लक्षण वर्णन और/या उपहास ने सोचा कि जीसी-एमएस, एलसी-डैड-एमएस या एनएमआर जैसे बहुआयामी डेटा का अधिग्रहण, उदाहरण के लिए; (iv) जैव सक्रियता का आकलन करने के लिए व्यवहार्य और उच्च उपज वाले मॉडलों का उपयोग; (v) बहुविभिरण डेटा विश्लेषण या अन्य सांख्यिकीय उपकरणों के आधार पर संभावित नई हिट का चयन; (vi) लक्षित यौगिकों या होनहार उम्मीदवारों के अलगाव और शुद्धि को करने के लिए; और (vii) अलग यौगिकों का उपयोग कर पत्राचार जैविक गतिविधियों का सत्यापन2,14.

Dereplication कच्चे तेल के अर्क में ज्ञात यौगिकों की तेजी से पहचान करने की प्रक्रिया है और उन है कि पहले से ही अध्ययन किया गया है से उपंयास यौगिकों अंतर की अनुमति देता है । इसके अलावा, यह प्रक्रिया अलगाव को रोकती है जब बायोएक्टिविटी पहले से ही कुछ यौगिकों के लिए वर्णित की गई है, और यह "लगातार हिटर्स" का पता लगाने के लिए विशेष रूप से उपयोगी है। इसका उपयोग प्रमुख यौगिक पहचान या अर्क के संग्रह के रासायनिक प्रोफाइलिंग तक गतिविधि-निर्देशित अंश के त्वरण से लेकर विभिन्न अलक्षित कार्यप्रवाहों में किया गया है। इसे सीई की अलक्षित रासायनिक प्रोफाइलिंग या मेटाबोलाइट्स की लक्षित पहचान के लिए मेटाबोलॉमिक अध्ययनों के साथ पूरी तरह से एकीकृत किया जा सकता है। यह सब अंततः अलगाव प्रक्रियाओं 1 ,15,16,17से पहले निकालने को प्राथमिकतादेताहै ।

इसलिए, वर्तमान पांडुलिपि में, हम पौधे के अर्क और अंशों से एंटीमाइक्रोबियल और एंटीबायफिल्म अणुओं की पहचान करने के लिए एक व्यवस्थित दृष्टिकोण का वर्णन करते हैं। इसमें चार बहुविषयक चरण शामिल हैं: (1) पौधे की सामग्री का संग्रह; (2) कच्चे तेल के अर्क (सीई) और अंशों (सीईएफ) की तैयारी, इसके बाद उनका रासायनिक प्रोफ़ाइल विश्लेषण; (3) बायोस कहते हैं; और (4) जैविक और रासायनिक डेटा विश्लेषण(चित्रा 1)। इस प्रकार, हम केकारिया सिल्वेस्ट्रिज अर्क और स्ट्रेप्टोकोकस म्यूटन और कैंडिडा एल्बिकान13के खिलाफ अंशों की एंटीमाइक्रोबियल और एंटीबायोफिल्म गतिविधियों का विश्लेषण करने के लिए विकसित प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं, साथ ही फाइटोकेमिकल लक्षण वर्णन और डेटा विश्लेषण के लिए प्रक्रियाएं भी प्रस्तुत करते हैं। सादगी के लिए, यहां ध्यान जीवाणु का उपयोग कर प्राकृतिक यौगिकों स्क्रीनिंग के लिए दृष्टिकोण प्रदर्शित करने के लिए है ।

Figure 1
चित्रा 1: पौधों के अर्क और अंशों से सक्रिय अणुओं की पहचान करने के लिए व्यवस्थित दृष्टिकोण का प्रवाह-चार्ट। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Protocol

1. पौधे सामग्री का संग्रह

  1. पौधे सामग्री
    1. इलेक्ट्रॉनिक प्लेटफार्मों पर संयंत्र सामग्री तक पहुंच रिकॉर्ड करें जो देश में आनुवंशिक विरासत तक पहुंच को विनियमित करता है जहां संग्रह होगा । उदाहरण के लिए, ब्राजील में, जेनेटिक हेरिटेज और एसोसिएटेड ट्रेडिशनल नॉलेज के प्रबंधन के लिए राष्ट्रीय प्रणाली के साथ रजिस्टर करें - सिजेन (वेबसाइट https://sisgen.gov.br/paginas/login.aspx)।
    2. ब्याज की पौधे सामग्री (जैसे, पत्तियां, उपजी, जड़ें, फूल, फल) के नमूने एकत्र करें। यदि प्रजनन या वनस्पति चरण के दौरान सामग्री एकत्र की गई थी तो पंजीकरण करें।
    3. संग्रह मापदंडों (तिथि, भू-विवरण, औसत वार्षिक तापमान, और मतलब आर्द्रता प्रतिशत) रिकॉर्ड करें।
    4. नमूनों की ठीक से पहचान करें, और एक वर्गीकरण को प्रामाणिकता की पुष्टि करनी चाहिए।
  2. पौधे के नमूने स्थिरीकरण और भंडारण
    1. संग्रह के तुरंत बाद अलग-अलग प्लास्टिक बैग या फ्लास्क में अलग-अलग पौधे के अंग।
    2. तरल नाइट्रोजन में तुरंत ठंड (i) ठंड से संभावित एंजाइमेटिक प्रतिक्रियाओं को निष्क्रिय करें, (ii) एक परिसंचारी वायु ओवन (40 डिग्री सेल्सियस) में निर्जलीकरण, या (iii) लिओफिलाइजेशन द्वारा नमूनों को फ्रीज-सुखाने।
    3. भंडारण अवधि या इच्छित उपयोग के आधार पर उपयोग (-20 या -80 डिग्री सेल्सियस) तक कमरे के तापमान पर या फ्रीजर में हर्मेटिकली सीलबंद बैग में स्थिर सामग्री स्टोर करें।
    4. नमूनों को एक विश्लेषणात्मक मिल (चाकू या गेंद, ऊतक प्रकार या उपलब्धता के आधार पर) में पीसें और मानकीकृत छलनी का उपयोग करके कण आकार को मानकीकृत करें।
    5. बाद के निष्कर्षण चरणों के लिए नमूनों को व्यक्तिगत रूप से तौलें।

2. रासायनिक प्रोफ़ाइल विश्लेषण और Bioassays के लिए क्रूड अर्क (सीई) और अंश (सीईएफ) की तैयारी

  1. क्रूड अर्क की तैयारी (सीई)
    नोट: कदम चित्रा 2Aमें प्रवाह चार्ट में सचित्र हैं ।
    1. पिछली रिपोर्टों के अनुसार प्रयोगात्मक डिजाइन द्वारा परिभाषित जलविज्ञानी मिश्रण (उदाहरण के लिए, इथेनॉल (एटोह) 70% या पानी, एटोह और अन्य संशोधकों के टर्नरी मिश्रण के साथ एक निष्कर्षण विलायक तैयार करें।)
    2. सॉल्वेंट के प्रत्येक एमएल के लिए अनुपात नमूना वजन (शुष्क वजन, मिलीग्राम)/निष्कर्षण सॉल्वेंट (एमएल) का उपयोग करें जो 50 से 100 मिलीग्राम तक भिन्न होते हैं।
    3. तेज और प्रजनन योग्य निष्कर्षों के लिए, माइक्रोट्यूब का उपयोग करके बैच एक्सट्रैक्लंस का उपयोग करें।
      नोट: सांख्यिकीय विश्लेषण की अनुमति देने के लिए इस बिंदु पर कम से कम तीन प्रतिकृति का उपयोग किया जाना चाहिए।
    4. इसे त्वरित, आसान और सस्ता बनाने के लिए अल्ट्रासाउंड-असिस्टेड एक्सट्रैक्ट्रैकेशन (यूएई) करें।
    5. सर्वोत्तम दक्षता के लिए प्रक्रिया को तीन बार (15 मिनट प्रत्येक) दोहराएं।
    6. प्रत्येक निष्कर्षण चरण के बाद, अपकेंद्रित्र द्वारा ठोस अवशेषों को डिकेंट करें और सुपरनेट को हटा दें।
    7. सुपरनेटैंट्स को व्यक्तिगत रूप से मिलाएं, फ़िल्टर करें, और एक साथ रासायनिक विश्लेषण और बायोएस कहते हैं के लिए एलिकोट्स को बचाएं। यदि आवश्यक हो, तो वैक्यूम, नाइट्रोजन प्रवाह, या लियोफिलाइजेशन के तहत निकालने वाले सॉल्वेंट को हटा दें, और वजन और उपज को पंजीकृत करें।
    8. प्रकाश से सुरक्षित -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
      नोट: प्रोटोकॉल को सीई को स्क्रीन करने और वांछित गतिविधि प्रस्तुत करने वाले लोगों का चयन करने के लिए यहां रोका जा सकता है।
  2. क्रूड अर्क का अंश (सीईएफ)
    नोट: कदम चित्रा 2Bमें प्रवाह चार्ट में सचित्र हैं ।
    1. कम से कम 1 ग्राम एसोरबेंट के साथ कारतूस का उपयोग करें। यदि क्षारीय सीई में संभावित रूप से मौजूद हैं, तो 0.1% फॉरमिक एसिड (एफए) वाले सॉल्वैंट्स का उपयोग करें।
    2. 100 मिलीग्राम / एमएल नमूना समाधान प्राप्त करने के लिए सबसे उपयुक्त सॉल्वेंट (या विलायक मिश्रण) में पतला नमूना। फिर, नमूना समाधान के 1 एमएल को पूर्व-वातानुकूलित एक ठोस चरण निष्कर्षण कारतूस में स्थानांतरित करें - एसपीई (1 ग्राम एसोरबेंट, क्षमता का 6 एमएल)।
    3. प्रत्येक निष्कर्षण एलूंट (1 ग्राम के कारतूस के लिए) के लगभग तीन मृत वॉल्यूम का उपयोग करके अंश का उपयोग करें, यह प्रत्येक विलायक के 2 एमएल के अनुरूप होगा। यदि क्षारीय सीई में संभावित रूप से मौजूद हैं, तो एफए के 0.1% वाले सॉल्वैंट्स का उपयोग करें।
    4. eluent संरचना द्वारा एक अंश ले लीजिए और एक साथ रासायनिक विश्लेषण और bioassays के लिए aliquots बचाने के लिए।
    5. वैक्यूम, नाइट्रोजन प्रवाह, या lyophilization के तहत विलायक निकालें और वजन और उपज रजिस्टर।
      नोट: यदि सीई को प्रारंभिक एल्यूशन मिश्रण में भंग करना मुश्किल है, तो कारतूस के शीर्ष पर सामग्री लोड करने से पहले1:1 (w/w) अनुपात में एक ठोस चरण (जैसे, सी 18 या सेलाइट) में सीई को तितर-बितर करें।
      सावधानी: अर्क और अंशों की बड़े पैमाने पर उपज की गणना करने के लिए माइक्रोट्यूब को पहले से तौलें।
  3. रासायनिक प्रोफाइलिंग विश्लेषण
    नोट: यह देखते हुए कि प्रत्येक पौधे की प्रजातियों को इसके रासायनिक विश्लेषण के लिए अनुकूलित और विशिष्ट तरीकों की आवश्यकता होती है, निम्नलिखित वर्गों में, हम पौधों की सामग्री का विश्लेषण करने के लिए उपयोग किए जाने वाले सबसे आम विश्लेषणात्मक दृष्टिकोणों का वर्णन करते हैं। एक व्यावहारिक उदाहरण के रूप में, एक रिवर्स-चरण तरल क्रोमेटोग्राफी को फेनोलिक यौगिकों और क्लेरोडेन-प्रकार के डिटरपेन्स के एक साथ विश्लेषण के लिए विकसित और मान्य किया गया था, जो केसरिया सिल्वेस्ट्रिस स्वार्ट्ज़ (सालिकासी) की दो किस्मों द्वारा अलग-अलग बायोसिंथेसाइज्ड होता है। यूपीएलसी-डैड उपकरण एक डेगासेर, एक क्वाटररी पंप, एक स्वचालित पारखी, एक यूवी-विस फोटोडियोड सरणी डिटेक्टर और एक ओवन से लैस था (ब्यूनो एट अल में विवरण देखें।2015 18)। निम्नलिखित उदाहरणों में वर्णित समान दृष्टिकोणों को अन्य पौधों की प्रजातियों और/या पौधों की सामग्री के अनुसार अनुकूलित किया जा सकता है ।
    1. क्रोमेग्राफिक विश्लेषण और हाइफेनेशन संभावनाएं
      1. अल्ट्रा-हाई-परफॉर्मेंस लिक्विड क्रोमेटोग्राफी (यूपीएलसी) का उपयोग करके अलगाव के लिए, एक संगत पूर्व-कॉलम द्वारा संरक्षित सी18 क्रोमेग्राफिक कॉलम (उदाहरण के लिए, 150 × 2.1 मिमी, 2.6 माइक्रोन, 100 Å) का उपयोग करें।
        नोट: अन्य स्तंभ चरणों या क्रोमेग्राफिक मोड का उपयोग पौधों की प्रजातियों/सामग्री के आधार पर किया जा सकता है। पारंपरिक एचपीएलसी का भी उपयोग किया जा सकता है; उस स्थिति में, एक उपयुक्त क्रोमेग्राफिक कॉलम चुना जाना चाहिए। उत्कृष्ट पृथक्करण प्राप्त करने के लिए, प्रवाह दर (μL/min), कॉलम तापमान (डिग्री सेल्सियस), और इंजेक्शन की मात्रा (μL) पर विचार करते हुए क्रोमेग्राफिक स्थितियों को समायोजित करें। मोबाइल चरण में आमतौर पर रैखिक या मल्टीस्टेप एल्यूशन ग्रेडिएंट या आइसोक्रैटिक एल्यूशन का उपयोग करके पानी (ए) और एसीटोनिट्रिल या मेथनॉल (बी) होते हैं। बफर, एसिड, कुर्सियां या अन्य जैसे संशोधकों का भी उपयोग किया जा सकता है।
      2. संयंत्र सामग्री विश्लेषण (सीई और/या सीईएफ) करें और उपलब्ध हाइफेनेशन के आधार पर सभी संबंधित डेटा, जैसे स्पेक्ट्रल डेटा (यूवी-विस और/या, अधिमानतः, एमएस डिटेक्टरों, प्रतिधारण समय (न्यूनतम) और अन्य का उपयोग करके पंजीकृत करें ।
        नोट: लिक्विड क्रोमेटोग्राफी (एलसी) आमतौर पर उच्च-रिज़ॉल्यूशन मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एचआरएमएस) के साथ हाइपेटेड (युग्मित) होता है, एलसी−एचआरएमएस के रूप में, और आमतौर पर सीई ou सीईएफ15में मेटाबोलाइट के तेजी से एनोटेशन के लिए उपयोग किया जाता है।
      3. यदि गुणात्मक डेटा की आवश्यकता है और मात्रात्मक डेटा आवश्यक है, तो एक ही प्रोटोकॉल का पालन करते हुए, सावधानीपूर्वक अंशांकन घटता तैयार करें और इंजेक्ट करें।
        नोट: सबसे अच्छा क्रोमेग्राफिक स्थितियों का विकास प्रयोगों के डिजाइन की सहायता से किया जा सकता है, जैसा कि ब्यूनो एट अल द्वारा वर्णित है। 201518,या इसी तरह का साहित्य। विधि विकास के दौरान आंतरिक मानकों को शामिल करने पर विचार करना महत्वपूर्ण है। वे बहुत सराहना कर रहे हैं क्योंकि वे नमूना तैयारी और इंजेक्शन के दौरान सही तकनीकी विचलन की अनुमति देते हैं, और डेटा विश्लेषण के लिए आगे सामान्यीकरण।
  4. यूनिवेरिएट और मल्टीवेरिएट डेटा विश्लेषण
    1. पंजीकृत क्रोमेटोग्राम को उपयुक्त प्रारूप (जैसे, एएससीआईआई, .txt या .csv प्रारूप) में निर्यात करें। यदि कई नमूनों का विश्लेषण किया जा रहा है, और तुलना की आवश्यकता है तो क्रोमाटोग्राम में शामिल होकर और संरेखित करके एक एकल डेटा मैट्रिक्स सेट किया जा सकता है। परिणामस्वरूप मैट्रिस को उपयोग किए गए आंतरिक मानक के अनुसार क्रोमेटोग्राम को सामान्य बनाया जाना चाहिए।
    2. मल्टीवेरिएट और यूनिवेरिएट तरीकों का उपयोग करके पौधे मेटाबोलोमिक्स डेटा का विश्लेषण करें। अपर्यवेक्षित प्रमुख घटक विश्लेषण (पीसीए) और पदानुक्रमित क्लस्टरिंग विश्लेषण (एचसीए) सहित बहुविध सांख्यिकीय तरीकों का उपयोग करके कई चरों के एक साथ विश्लेषण के माध्यम से मेटाबोलोमिक्स डेटासेट का अन्वेषण और कल्पना करें, या आंशिक कम से कम वर्ग विश्लेषण (जैसे पीएलएस, ओपीएलएलएस, पीएलएस-डीए) का पर्यवेक्षण करें। इस तरह के ANOVA, छात्र, Tukey और वेल्च टी परीक्षण के रूप में Univariate तरीकों, नमूनों19के बीच मात्रात्मक मतभेदों के सटीक विश्लेषण के लिए विशेष रूप से दिलचस्प हैं ।
  5. डेरेप्लेशन और यौगिक एनोटेशन
    नोट: इस कदम का उद्देश्य ज्ञात एनपीएस की तेजी से ऑन-लाइन पहचान के लिए समर्पित है ताकि थकाऊ अलगाव से बचा जा सके जिसे यूनी-या मल्टीवेरिएट डेटा विश्लेषण के साथ किया जा सकता है।
    1. पता लगाया या लक्षित यौगिकों की पहचान के स्तर को अंजाम:
      1. पूर्ण 3 डी संरचना और स्टीरियोकेमिस्ट्री (स्तर 0) सहित पहचाने गए यौगिक;
      2. दो ऑर्थोगोनल मापदंडों द्वारा हासिल की गई पहचान, जैसे कि प्रतिधारण समय और एमएस/एमएस स्पेक्ट्रम (स्तर 1);
      3. ख्यात रूप से एनोटेटेड यौगिक और यौगिक वर्ग (स्तर 2 और 3);
      4. अज्ञात या अवर्गीकृत मेटाबोलाइट्स जिन्हें विश्लेषणात्मक डेटा (स्तर 4)19,20के आधार पर विभेदित किया जा सकता है।
    2. वाणिज्यिक या सार्वजनिक डेटाबेस का उपयोग करके ज्ञात यौगिकों की विशेषता है। सबसे महत्वपूर्ण डेटाबेस में, इसे हाइलाइट किया जा सकता है: एनआईएसटी (https://www.nist.gov), विले (https://www.sisweb.com/software/ms/wiley.htm), मासबैंक (https://massbank.eu/MassBank/), जीएमडी (http://gmd.mpimp-golm.mpg.de/), मेटलिन (https://metlin.scripps.edu), और ग्लोबल नेचुरल प्रोडक्ट्स सोशल मॉलिक्यूलर नेटवर्किंग - जीएनपीएस डेटाबेस (https://gnps.ucsd.edu)19।
      नोट: एनोटेशन के विभिन्न स्तर हैं और वे अध्ययन के दौरान नियोजित हाइफेनेटेड तकनीक पर निर्भर करते हैं और इसमें शामिल हो सकते हैं: एमएस-(या एनएमआर) आधारित स्पेक्ट्रल डेटाबेस की सहायता, और सिलिको स्पेक्ट्रल भविष्यवाणियों एल्गोरिदम में।
    3. अलगाव, शुद्धि, और पूर्ण यौगिक पहचान
      नोट: यदि किसी दिए गए यौगिक (जिनकी पहचान सांख्यिकीय तरीकों से संदिग्ध थी) को पूर्ण संरचनात्मक पहचान की आवश्यकता है, तो इस कार्य को पूरा करने का पहला कदम वांछित यौगिकों को अधिक पैमाने पर अलग और शुद्ध करना है। इसे पहले से विकसित प्रोटोकॉल को स्केल करके पूरा किया जा सकता है।
      1. तैयारी क्रोमेग्राफिक तकनीकों द्वारा लक्ष्य यौगिक (एस) के तेजी से और प्रत्यक्ष अलगाव को अच्छी तरह से स्थापित और अनुकूलित करें। शुष्क भार इंजेक्शन के साथ अर्ध-तैयारी एचपीएलसी का उपयोग उन समझौतों से बचने के लिए किया जा सकता है जिन्हें आम तौर पर उच्च लोडिंग और नमूना घुलनशीलता1के बीच किए जाने की आवश्यकता होती है।
      2. अलग-थलग यौगिकों की पूर्ण संरचनात्मक लक्षण वर्णन और पहचान को पूरा करें। यह विभिन्न तकनीकों के संयोजन के माध्यम से बनाया जा सकता है:
        1. परमाणु चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर);
        2. मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस);
        3. पराबैंगनी (यूवी) और अवरक्त (आईआर) क्षेत्रों में स्पेक्ट्रोमेट्रिक तकनीकें कार्यात्मक समूहों के लक्षण वर्णन के लिए भी बहुत उपयोगी हैं;
        4. काइरोप्टिकल स्पेक्ट्रोस्कोपी जैसे इलेक्ट्रॉनिक और कंपन परिपत्र डिक्रोमिज्म (क्रमशः ईसीडी और वीसीडी), रमन ऑप्टिकल गतिविधि (आरओए), और एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी का उपयोग पूर्ण विन्यास लक्षण वर्णन के लिए महत्वपूर्ण तकनीक हैं।

3. बायोस कहते हैं

नोट: जैविक स्क्रीनिंग: जल्दी से सीई और सीईएफ की संभावित जैव सक्रियता का आकलन करने के लिए, प्राकृतिक पदार्थों की प्रारंभिक स्क्रीनिंग का आयोजन और सीधा किया जाना चाहिए।

  1. बायोस कहते हैं के लिए सीई और सीईएफ की तैयारी
    1. शुष्क पदार्थ को सर्वोत्तम संभव सॉल्वैंट्स (जो प्रयोगात्मक रूप से निर्धारित किया जा सकता है) के साथ पुनर्गठित करें। प्रायोगिक डिजाइन21,22 स्टॉक समाधान और सॉल्वैंट्स की एकाग्रता को परिभाषित करते हैं।
    2. स्टॉक समाधान की सॉल्वेंट एकाग्रता की गणना करें। ऐसा करने के लिए, सूत्र का उपयोग करें: सी1 x V1 = सी2 x V2,जहां सी1 सीई और/या सीईएफ के स्टॉक समाधान (मिलीग्राम) का प्रतिनिधित्व करता है; वी1 सॉल्वेंट की मात्रा का प्रतिनिधित्व करता है; C2 सीई और/या सीईएफ का वजन है; वी2 स्टॉक सॉल्यूशन का फाइनल वॉल्यूम (एमएल) है।
      नोट: उदाहरण के लिए, हमने स्टॉक समाधान की सॉल्वेंट एकाग्रता के रूप में 84.15% एटोह और 15% डिमेथाइल सल्फॉक्साइड (डीएमएसओ) का चयन किया। हमने सीई की स्टॉक सांद्रता को 6 मिलीग्राम/एमएल और सीईएफ को 1 मिलीग्राम/एमएल13तक तैयार किया । सीई और सीईएफ को पतला करने के लिए सॉल्वेंट जैविक गतिविधि के मूल्यांकन की विधि पर निर्भर करेगा। वाहन के रूप में उपयोग किए जाने वाले सॉल्वेंट को जैविक और विषविज्ञानी गतिविधि में हस्तक्षेप नहीं करना चाहिए। आमतौर पर, पानी, डीएमएसओ, एटोह, या एटोह पर आधारित एक जलीय सॉल्वेंट का उपयोग पौधे के अर्क या पौधे डेरिवेटिव4,13को घुलनशील करने के लिए किया जाता है।
  2. परीक्षण जीवों की तैयारी
    1. एक माइक्रोबियल तनाव को फिर से सक्रिय करें, उदाहरण के लिए एस म्यूटंस UA159 रक्त आगार पर (48 घंटे, 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2),और इसे तरल संस्कृति माध्यम में संस्कृति (उदाहरण के लिए, ट्राइप्टोन-यीस्ट एक्सट्रैक्ट शोरबा [टीवाईई: 2.5% (w/v) ट्राइप्टोन 1.5% (w/v) खमीर निकालने के साथ] जिसमें 1% ग्लूकोज (w/v) (TYEg) 16 घंटे, 37 डिग्री सेल्सियस, 5% CO2.
    2. एक ही संस्कृति माध्यम में सूक्ष्मजीव की प्रारंभिक संस्कृति का 1:20 कमजोर पड़ने का प्रदर्शन करें (प्रारंभिक संस्कृति का कमजोर पड़ने का अनुपात प्रयोगात्मक डिजाइन के अनुसार बदल सकता है)।
    3. जब तक यह मध्य लॉग विकास चरण तक नहीं पहुंचता है तब तक इनक्यूबेट करें।
    4. बायोफिल्म्स आसकां के लिए 1% सुक्रोज (डब्ल्यू/वी) (TYEs) के साथ एंटीमाइक्रोबियल परख और TYE के लिए TYEg में एक परिभाषित आबादी (उदाहरण के लिए, 2x106 कॉलोनी बनाने वाली इकाइयां प्रति मिलीलीटर-सीआईयू/एमएल) के साथ बायोस्कुलम तैयार करें।
      नोट: विकास की स्थिति सूक्ष्मजीव परीक्षण पर निर्भर करेगी।
  3. रोगाणुरोधी गतिविधि
    नोट: कदम चित्रा 3में सचित्र हैं ।
    1. एक ९६-अच्छी थाली में, सीई और/या सीईएफ स्टॉक समाधान (उपचार) का एक एलिकोट (μL) जोड़ें । एलिकोट की मात्रा परीक्षण एकाग्रता द्वारा परिभाषित की गई है, जिसे पिछले अध्ययनों के आधार पर चुना जाना चाहिए। उदाहरण के लिए, 0.5 मिलीग्राम/एमएल परीक्षण एकाग्रता पर सीई का परीक्षण करने के लिए, 6 मिलीग्राम/एमएल पर स्टॉक समाधान के 16.67 μL aliquot का उपयोग करें। इस गणना के लिए, सूत्र का उपयोग करें: सी1 x V1 = सी2 x V2,जहां सी1 स्टॉक एकाग्रता है, वी1 स्टॉक समाधान एलिकोट की मात्रा है, सी2 परीक्षण एकाग्रता है, और वी2 96-अच्छी प्लेट (जो 200 माइक्रोल से मेल खाती है) की मात्रा है। इस प्रायोगिक स्थिति में सॉल्वैंट्स (वाहन) की परीक्षा एकाग्रता 7% एटोह और सवा प्रतिशत डीएमएसओ होगी।
    2. प्रत्येक प्लेट के लिए नियंत्रण का एक सेट शामिल करें: उपचार के साथ एक कॉलम, इनोकुलम के बिना (उपचार के प्रति खाली नियंत्रण, माइक्रोबियल विकास से ही उपयोग किए गए उपचार द्वारा टर्बिडिटी को अलग करने में मदद करता है); वाहन और इनोकुलम (सीईईएफ या 0 मिलीग्राम/एमएल नियंत्रण का पतला) के साथ एक कॉलम; केवल संस्कृति माध्यम (संस्कृति माध्यम नियंत्रण) और केवल इनोकुलम (माइक्रोबियल विकास नियंत्रण) के साथ एक स्तंभ के साथ एक कॉलम।
    3. TYEg का उपयोग करके, वॉल्यूम को 100 माइक्रोल में समायोजित करें। इसके बाद, उदाहरण के लिए, 24 घंटे, 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 (सूक्ष्मजीव परीक्षण के आधार पर)।
    4. 96-वेल प्लेट में सूक्ष्मजीव इनोकुलम (1x 106 सीएलयू/एमएल) के 100 माइक्रोन टीका।
    5. कुओं के दृश्य निरीक्षण (स्पष्ट या बादल) द्वारा टर्बिडिटी के अनुसार बैक्टीरियल विकास का विश्लेषण करें। स्पष्ट: इसका मतलब है कि सूक्ष्मजीव का कोई दृश्य विकास नहीं है। बादल: इसका मतलब है कि सूक्ष्मजीव का दृश्य विकास है।
    6. प्रत्येक कुएं में बैक्टीरियल संस्कृति के अवशोषण (ऑप्टिकल घनत्व या O.D.) को मापने (एलिसा रीडर 540 एनएम का उपयोग कर)। इसके बाद, 900 माइक्रोल नमकीन समाधान (0.89% एनएसीएल) वाले माइक्रोट्यूब में संस्कृतियों के 100 माइक्रोल को स्थानांतरित करें, भंवर से अच्छी तरह से मिलाएं। इसके बाद, वांछित मूल्य तक दस गुना धारावाहिक कमजोर पड़ने का प्रदर्शन जारी रखें।
    7. विशिष्ट आगर प्लेटों (डुप्लिकेट में) में वांछित कमजोर पड़ने के एक एलिकोट का टीका लगाएं। उदाहरण के लिए, रक्त आगार प्लेटों पर एक विशिष्ट कमजोर पड़ने का 10 μL।
    8. इनक्यूबेट। सूक्ष्मजीवों के बीच स्थितियां बदल सकती हैं, उदाहरण के लिए, एस म्यूटन:48 एच, 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2।
    9. सीआईयू/एमएल में बाद में परिवर्तन के लिए प्लेटों पर कॉलोनी मायने रखता है(कालोनियों की एक संख्या x 10n)/q। इस सूत्र में,एन कमजोर पड़ने (0, 1, 2, या 3) के पूर्ण मूल्य के बराबर होता है, और क्यू राशि के बराबर होता है, एमएल में, आगर प्लेट पर चढ़ाया प्रत्येक कमजोर पड़ने के लिए पिपेट किया जाता है। साथ ही सीएलयू/एमएल को लॉग वैल्यूज में बदला जा सकता है ।
      नोट: जब पौधे के अर्क को संस्कृति माध्यम में जोड़ा जाता है, तो अर्क से कणों की वर्षा हो सकती है। इस तथ्य से परिणामों की व्याख्या करना मुश्किल हो सकता है । ऐसा ही तब होता है जब एक माइक्रोप्लेट रीडर टर्बिडिटी को मापता है, क्योंकि कुछ मामलों में कोशिकाएं माइक्रोप्लेट के तल पर झुरमुट होती हैं। इसके अलावा, उपयोग किए गए अर्क के आधार पर, पौधों के पत्ते के अर्क का रंग टर्बिडिटी23,24को निर्धारित करना मुश्किल बना सकता है। एक वैकल्पिक विधि में रंगों का उपयोग किया जाता है जिससे पता चलता है कि माइक्रोबियल कोशिकाएं चयापचय रूप से सक्रिय हैं यानहीं 24.
  4. एंटीबायोफिल्म गतिविधि
    नोट: बायोफिल्म गठन पर उपचार के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए कदम चित्र 4में सचित्र हैं ।
    1. बायोफिल्म्स का निर्माण और प्रसंस्करण
      1. एंटीमाइक्रोबियल गतिविधि प्रोटोकॉल के चरणों में वर्णित 96-अच्छी प्लेट में संस्कृति माध्यम (TYEs) में पतला उपचार।
      2. थाली को इनक्यूबेट करें। एस म्यूटन के साथ उदाहरण में, इनक्यूबेशन 24 घंटे के दौरान, 37 डिग्री सेल्सियस पर और 5% सीओ 2 पर कियाजाताहै।
      3. इनक्यूबेशन के बाद, बायोफिल्म का पालन नहीं करने वाली कोशिकाओं को ढीला करने के लिए प्लेटों को एक कक्षीय शेखर (5 मिनट, 37 डिग्री सेल्सियस, 75 आरपीएम) पर रखें। फिर, संस्कृति माध्यम को त्यागें जिसमें पालन नहीं की गई कोशिकाएं होती हैं, और गैर-अनुयायी कोशिकाओं को हटाने के लिए शेष बायोफिल्म्स को 0.89% एनएसीएल के साथ तीन बारधोएं।
    2. इलाज बायोफिल्मों से बायोमास का मात्राकरण
      नोट: कदम चित्रा 4Aमें प्रवाह चार्ट में सचित्र हैं ।
      1. बायोफिल्म्स को प्लेट पर धोए रखें और प्रत्येक अच्छी तरह से 1% क्रिस्टल वायलेट जलीय समाधान के 50 माइक्रोल जोड़ें।
      2. 35 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर थाली इनक्यूबेट।
      3. सना हुआ कुओं को मिल्लिक्यू पानी (तीन बार) से धोएं और फिर हवा उन्हें 60-90 मिनट के लिए सुखा लें।
      4. एक कक्षीय शेखर (5 मिनट, 37 डिग्री सेल्सियस, 75 आरपीएम) में प्लेट को इनक्यूबेट करके 99% एटोह के 200 माइक्रोन के साथ दाग वाले कुओं से क्रिस्टल वायलेट को एल्यूट करें।
      5. एक अच्छी तरह से एल्यूटेड डाई के साथ एक 150 μL aliquot को दूसरी प्लेट में स्थानांतरित करें और नमूना बायोमास (एलिसा रीडर 570 एनएम) की मात्रा निर्धारित करें।
    3. इलाज बायोफिल्म्स की व्यवहार्य माइक्रोबियल आबादी (सीआईएफयू/एमएल) का मात्राकरण
      नोट: कदम चित्रा 4Bमें प्रवाह चार्ट में सचित्र हैं ।
      1. प्लेट से धोए गए बायोफिल्म्स को एक पिपेट और 200 माइक्रोल के साथ निकालें नासीएल 0.89% और परिणामस्वरूप निलंबन को व्यक्तिगत रूप से बाँझ माइक्रोट्यूब में स्थानांतरित करें।
      2. एनएसीएल 0.89% प्रति अच्छी तरह से अतिरिक्त 200 माइक्रोन का उपयोग करें और इसे संबंधित ट्यूब में स्थानांतरित करें, जिसमें पहले से ही प्रारंभिक बायोफिल निलंबन का 200 माइक्रोन है। मूल रूप से 1 एमएल बायोफिल्म के कुल निलंबन तक पहुंचने तक इस प्रक्रिया को करें।
      3. दस गुना धारावाहिक कमजोर पड़ने का प्रदर्शन करने के लिए प्रत्येक ट्यूब से एक एलिकोट का उपयोग करें।
      4. विशिष्ट आगर प्लेटों (डुप्लिकेट में) में वांछित कमजोर पड़ने के एक एलिकोट का टीका लगाएं। उदाहरण के लिए, रक्त आगार प्लेटों पर एक विशिष्ट कमजोर पड़ने का 10 μL।
      5. इनक्यूबेट आगर प्लेटें (जैसे, 48 घंटे, 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2),फिर ऊपर वर्णित सीआईयू/एमएल निर्धारित करने के लिए उपनिवेशों की गणना करें।
  5. जैविक गतिविधि सत्यापन चरण
    1. लार पेलिकल गठन
      1. लार फिल्म25बनाने के लिए एक सतह के रूप में हाइड्रोक्सीपेटेट (एचए) मोतियों (मैक्रो-प्रेप सिरेमिक हाइड्रोक्सियापेटेट टाइप I 80 माइक्रोन) का उपयोग करें। ये मोती सतह दंत तामचीनी की नकल करते हैं।
      2. माइक्रोट्यूब में हा मोतियों (जैसे, 10 मिलीग्राम) का वजन करें और स्टरलाइज करें। फिर, सोखने बफर का उपयोग करें (एबी बफर: 50 mM KCl, मोतियों को धोने के लिए 1 एमएम केपीओ4,1 एमएम सीसीएल2,1 एमएमएम एमजीसीएल2,डीडी-एच2ओ में पीएच6.5] 25 युक्त 0.1 एमएम फिनाइलमिथाइलसुल्फोनिल फ्लोराइड (पीएमएसएफ) और 0.02% सोडियम एजाइड (एनएएन3)शामिल हैं।
      3. मानव लार26को इकट्ठा करें और तैयार करें । इसके लिए संस्थागत आचार समिति की मंजूरी जरूरी है।
      4. माइक्रोट्यूब और इनक्यूबेट (40 मिनट, 37 डिग्री सेल्सियस, 24 आरपीएम) में लार के 500 माइक्रोल जोड़ें।
      5. इसके बाद, लार सुपरनेट को हटा दें और मोतियों को धोएं (पीएमएसएफ और एनएएन3युक्त एबी बफर के साथ तीन बार)। SHA मोती (लार पेलिकल के साथ हा मनका) अब डाउनस्ट्रीम परख के लिए तैयार हैं।
        नोट: लार स्वस्थ स्वयंसेवकों से एकत्र किया जाता है । संग्रह के बाद, एबी बफर और सेंट्रलाइज (1699 x g, 20 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस) के साथ लार (1: 1 v/v) पतला करें। निस्पंदन द्वारा स्टरलाइज (पॉलीएथर्सल्फोन झिल्ली फिल्टर 0.22 माइक्रोन प्रोटीन के लिए कम बाध्यकारी के साथ)26। संस्थागत आचार समिति को अध्ययन को अनुमोदित करना चाहिए । हमारे मामले में, संस्था की आचार समिति ने अध्ययन को मंजूरी दी (CAAE: 68161417.0.0000.5416)।
    2. चयनित अर्क के साथ इलाज फिल्म लार और ग्लूकन के आसंजन के बाद एस mutans की टुकड़ी
      1. ऊपर वर्णित मध्य-लॉग विकास चरण तक सूक्ष्मजीव की खेती करें।
      2. जब संस्कृतियां वांछित O.D., अपकेंद्रित्र (20 मिनट के लिए 4000 × जी) तक पहुंच गईं, तो 0.89% एनएसीएल समाधान के साथ धोएं और संस्कृति माध्यम की एक ही प्रारंभिक मात्रा का उपयोग करके 0.89% एनएसीएल के साथ गोली को फिर से खर्च करें।
      3. यदि एस म्यूटनजैसे स्ट्रेप्टोकोसी का उपयोग कर रहे हैं, तो संस्कृतियों को डेचेन (30 एस, 7 डब्ल्यू, तीन बार) की जांच के साथ सोनिकेट करें। यदि एक एकल कोशिका जीव का उपयोग कर रहे हैं, तो इस चरण को छोड़ दिया जा सकता है।
      4. 2 x 106 सीएलयू/एमएल के लिए एकाग्रता को समायोजित करने के लिए O.D. (540 एनएम) की जांच करें।
    3. लार पेलिकल (एसएचए) और पालन कोशिकाओं की टुकड़ी के लिए एस म्यूटन का आसंजन
      नोट: कदम 5 चित्रामें प्रवाह चार्ट में सचित्र हैं ।
      1. ऊपर वर्णित sHA नमूनों को प्राप्त करें।
      2. एक एलिकोट जोड़ें (उदाहरण में, हम चयनित उपचारों के 500 माइक्रोन जोड़ें( परीक्षण एकाग्रता पर; उदाहरण के लिए, 0.5 मिलीग्राम/एमएल) या sHAके नमूनों वाले माइक्रोट्यूब में नियंत्रण।
      3. उपचार या नियंत्रण (30 मिनट, 37 डिग्री सेल्सियस, 24 आरपीएम) के साथ एसएचए नमूनों को इनक्यूबेट करें; फिर, एबी बफर (पीएमएसएफ और एनएएन 3 युक्त) के साथ तीन बार मोतियों कोधोएं।
      4. सूक्ष्मजीव संस्कृति जोड़ें। उदाहरण में, हम प्रत्येक माइक्रोट्यूब में एस म्यूटंस कल्चर (2 x 10 6 सीएलयू/एमएल) के500 माइक्रोल जोड़ते हैं।
      5. इनक्यूबेट (1 घंटे, 37 डिग्री सेल्सियस, 24 आरपीएम) और फिर एबी बफर के साथ तीन बार धोकर अनबाउंड सेल्स को हटा दें।
      6. प्रत्येक नमूने को एक एलिकोट के साथ पुनर्सुर्ण करें (उदाहरण में, हम एबी बफर के 1000 माइक्रोन जोड़ते हैं और जांच (30 एस, 7 डब्ल्यू) के साथ सोनिकेट करते हैं।
      7. विशिष्ट आगर प्लेटों (48 एच, 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2)पर चढ़ाना द्वारा व्यवहार्य कॉलोनियों की संख्या निर्धारित करने के लिए दस गुना धारावाहिक कमजोर पड़ने के लिए प्रत्येक निलंबन के एक aliquot का उपयोग करें। इसके बाद, ऊपर वर्णित सीआईयू/एमएल निर्धारित करने के लिए उपनिवेशों की गणना करें।
        नोट: सोनीकेट का कदम एसएचएका पालन करने वाली कोशिकाओं को अलग करने के लिए किया जाता है ।
    4. प्रारंभिक ग्लूकन मैट्रिक्स(जीएसएचए)और पालन कोशिकाओं की टुकड़ी के लिए एस म्यूटन का आसंजन
      नोट: कदम 6 चित्रामें प्रवाह चार्ट में सचित्र हैं । जीटीएफबी एंजाइम को जीटीएफबी का उत्पादन करने के लिए इंजीनियर संस्कृति सुपरनेट स्ट्रेप्टोकोकस मिलरी केएसबी8 से शुद्ध किया गया था। शुद्धिकरण एक क्रोमेटोग्राफी कॉलम के साथ किया गया था जिसमें हाइड्रोक्सियापेटिट मोतियों का उपयोग किया गया था जिसमें दो प्रोटीज अवरोधक (0.1 m M PM PMSF और 0.02% NaN3)27 , 28,28शामिल थे । फिर, एंजाइम को एक्रिलैमाइड जेल (एसडीएस-पेज) पर चेक किया गया और चांदी नाइट्रेट से सना हुआ था। एंजाइम के Aliquots -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया गया जब तक उपयोग करते हैं।
      1. ऊपर वर्णित sHA नमूनों को प्राप्त करें। इसके बाद, एक एलिकोट जोड़ें (उदाहरण में, हम प्रत्येक ट्यूब में जीटीएफबी एंजाइम के 500 माइक्रोन जोड़ते हैं और एक समरूप (40 मिनट, 37 डिग्री सेल्सियस, 24 आरपीएम) में इनक्यूबेट करते हैं। फिर, एबी बफर (पीएमएसएफ और एनएएन3युक्त) के साथ तीन बार धोएं।
      2. प्रत्येक माइक्रोट्यूब में एक एलिकोट (जैसे, 500 माइक्रोल) सुक्रोज सब्सट्रेट (सुक्रोज का 100 mmol) जोड़ें जिसमें उपचार (या नियंत्रण- परीक्षण एकाग्रता पर, उदाहरण के लिए, 0.5 मिलीग्राम/एमएल) शामिल हैं।
      3. एक समरूप (4 घंटे, 37 डिग्री सेल्सियस, 24 आरपीएम) में नमूनों को इनक्यूबेट करें। फिर, संश्लेषित ग्लूकन (जीएसएचएके नमूनों) में शामिल नहीं किए गए उपचार और सुक्रोज की अधिकता को हटाने के लिए एबी बफर (पीएमएसएफ और एनएएन3के साथ) के साथ तीन वॉश करें।
      4. प्रत्येक माइक्रोट्यूब में एक एलिकोट जोड़ें (उदाहरण में, हम प्रत्येक माइक्रोट्यूब में एस म्यूटन इनोकुलम (2 x 10 6 सीएलयू/एमएल) के 500माइक्रोएल जोड़ें।
      5. एक समरूप (1 घंटे, 37 डिग्री सेल्सियस, 24 आरपीएम) में इनक्यूबेट और अनबाउंड कोशिकाओं को हटाने के लिए एबी बफर (पीएमएसएफ और एनएएन3के साथ) के साथ तीन बार धोएं।
      6. एबी बफर (पीएमएसएफ और एनएएन 3 के साथ) के एक एलिकोट (उदाहरण के लिए, 1000 μL) के साथ प्रत्येक नमूने को फिर से रीस्बल्ब करें और जीएचएएचए (30एस, 7 डब्ल्यू) का पालन करने वाली कोशिकाओं को अलग करने की जांच के साथ सोनिकेट करें।
      7. विशिष्ट आगर प्लेटों (48 एच, 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2)पर चढ़ाना द्वारा व्यवहार्य कॉलोनियों की संख्या निर्धारित करने के लिए दस गुना धारावाहिक कमजोर पड़ने के लिए प्रत्येक निलंबन के एक aliquot का उपयोग करें। इसके बाद, ऊपर वर्णित सीआईयू/एमएल निर्धारित करने के लिए उपनिवेशों की गणना करें।

4. जैविक डेटा विश्लेषण

  1. बायोअस कहते हैं डेटा
    1. बायोस्नेकशीट में बायोएसक के लिए इनपुट रॉ डेटा। प्रत्येक उपचार द्वारा माइक्रोबियल विकास अवरोध के लॉग की गणना करें (उपचार का एकसीआईएफयू/एमएल + 1) एक्स लॉग10। फिर, वाहन नियंत्रण की तुलना में माइक्रोबियल विकास अवरोध के लॉग प्रतिशत की गणना करें (एकlog10 CFU/mL ऑफ ट्रीटमेंट/मतलबएकlog10 CFU/mL ऑफ व्हीकल कंट्रोल)x १००% ।
    2. उपचार (सीई और सीईएफ उपचार समूहों) और वाहन नियंत्रण (नकारात्मक नियंत्रण) द्वारा इलाज किए गए प्लैंक्टोनिक संस्कृतियों और बायोमास के सही O.D. सुधार के लिए, केवल संस्कृति माध्यम (Ablank) वाले कुओं में प्राप्त कुओं से उपचारित कुओं के अवशोषण को घटाना (एकइलाज समूह मध्यम/एक नकारात्मक नियंत्रण माध्यम)x १००% ।
    3. इस सुधार के बाद, बायोमास अवरोध के प्रतिशत की गणना करें, वाहन नियंत्रण की तुलना में (एकइलाज बायोमास/मतलबएक वाहन नियंत्रण)x 100%।
    4. विशिष्ट सॉफ्टवेयर का उपयोग कर डेटा के सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए उत्पन्न कच्चे डेटा सबमिट करें।
      नोट: दिए गए उपचार की प्रभावशीलता की व्याख्या ब्रेकपॉइंट का उपयोग करके निर्धारित कीजाती है, जैसेआईसी 50/ इन मूल्यों को बैक्टीरियल विकास या बायोफिल्म निर्माण24के क्रमशः 50% और 90% को बाधित करने में सक्षम उपचार की न्यूनतम एकाग्रता के रूप में परिभाषित किया गया है। ये पैरामीटर आंकड़ों की व्याख्या करने में मदद कर सकते हैं और बेहतर गतिविधि के साथ यौगिकों का चयन करने के लिए एक आधार प्रदान कर सकते हैं, 29।

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Representative Results

हम संभावित नए एंटी-कैरियों चिकित्सा के लिए संभावित सक्रिय अणुओं की पहचान करने के लिए पौधे के अर्क और अंशों की जैविक गतिविधि को स्क्रीन करने के लिए एक व्यवस्थित दृष्टिकोण का उपयोग करने का एक उदाहरण प्रदान करते हैं: स्ट्रेप्टोकोकस म्यूटन और कैंडिडा एल्बिकान13के खिलाफ अलग ब्राजील के बायोम से केसरिया सिल्वेस्ट्रिस की एंटीमाइक्रोबियल और एंटीबायोफिल्म गतिविधियां।

पृष्ठभूमि
विशिष्ट मौखिक सूक्ष्मजीवों-मेजबान कारकों-सुक्रोज और स्टार्च से समृद्ध आहार के बीच जटिल बातचीत रोगजनक बायोफिल्म्स के गठन को संशोधित कर सकती है और एक कैंसरजनक प्रक्रिया30,31शुरू कर सकती है। एस म्यूटन दंत क्षय के विकास से जुड़े बायोफिल्मों की रोगजनकता को व्यवस्थित करता है क्योंकि यह इसकी एसिडोजेनिकिटी और एसिडरीसिटी31के अलावा एक्सोपॉलिसाकराइड्स संश्लेषण के लिए जिम्मेदार जीटीएफएस का उत्पादन करता है। इसके अलावा, जीटीएफ कैंडिडा एल्बिकान (और अन्य सूक्ष्मजीवों) के आसंजन को सक्षम बनाता है, जिससे बायोफिल्म32, 33की उग्रता बढ़जातीहै। हमने एस म्यूटन और सी एल्बिकान13के खिलाफ लिंगुआ और सिल्वेस्ट्रिस किस्मों से संबंधित सी सिल्वेस्ट्रिस पत्ती के अर्क और विभिन्न ब्राजीली बायोम से अंशों की एंटीमाइक्रोबियल और एंटीबायोफिल्म गतिविधियों की स्क्रीनिंग आयोजित की। सी सिल्वेस्ट्रिस ("गुआकोंगा") ब्राजील में लोकप्रिय और पारंपरिक उपयोग का हिस्सा है, और दक्षिण अमेरिका और एशिया34, 35के अन्य देशों में। इस पौधे को "एसयूएस के लिए ब्याज के औषधीय पौधों की राष्ट्रीय सूची" (RENISUS) में उद्धृत किया गया है, जिसमें 71 प्रजातियां शामिल हैं जो ब्राजील36में उच्च घटना के साथ बीमारियों का इलाज कर सकती हैं। वीएआर सिल्वेस्ट्रिस के पत्ते के अर्क का रासायनिक प्रोफ़ाइल प्रचुर मात्रा में डिटरपेन35के साथ एक समृद्ध फाइटोकेमिकल संरचना प्रस्तुत करता है, जबकि फेनोलिक यौगिक (मुख्य रूप से फ्लेवोनॉइड) वीएआर में प्रबल होते हैं। भाषा18।

हम प्रोटोकॉल में वर्णित दृष्टिकोण का उपयोग यह पहचानने के लिए करते हैं कि सी सिल्वेट्रिस के कौन से अर्क और अंश मूल्यांकन किए गए सूक्ष्मजीवों के लिए सबसे अधिक सक्रिय हैं, और सरलीकृत मॉडलों का उपयोग करके परिणामों के आधार पर, हम चुनते हैं कि विट्रो जटिल मॉडल (हाइड्रोक्सियापेटिट डिस्क, माइक्रोकॉस्म्स)37,38में कौन से उपचार का परीक्षण किया जाएगा। यहां, हम एस म्यूटन के खिलाफ बारह सीई की स्क्रीनिंग के परिणाम प्रस्तुत करते हैं। ध्यान के लिए व्याख्या और डेटा पर चर्चा के बजाय प्राकृतिक यौगिकों स्क्रीनिंग के लिए इस दृष्टिकोण की उपयोगिता प्रदर्शित करने के लिए है ।

हमने ब्राजील में बारह विभिन्न आबादी से सी सिल्वेस्ट्रिस की दो किस्मों से व्यक्तियों की पत्तियों को एकत्र किया, जिसमें ब्राजील के बायोम के विभिन्न संरचनाओं को शामिल किया गया (कृपया, रिबेरो एट अल में विवरण देखें। 201913)। संग्रह जून और सितंबर 2012 और 2013 (सिजेन) के बीच किया गया था; रजिस्टर #A00892A) । हम माध्यमिक मेटाबोलाइट्स की रासायनिक परिवर्तनशीलता को संबोधित करने के लिए विभिन्न रसायनकार्य और विभिन्न बायोम के व्यक्तियों सहित प्रतिनिधि नमूने एकत्र करने की सलाह देते हैं। यदि उपलब्ध है, तो कम से कम 3 से 5 व्यक्तियों को एकत्र किया जाना चाहिए। संयंत्र से संबंधित पिछली जानकारी को रिबेरो एट अल 2019 और ब्यूनो एट अल 201513, 18द्वारा वर्णित माना जाना चाहिए। सीई की रासायनिक संरचना की जांच चरण 2 में वर्णित क्रोमेग्राफिक द्वारा की गई थी और हम चित्र 7 में रासायनिक प्रोफ़ाइल प्रदान करते हैं। जैविक स्क्रीनिंग में प्राप्त आंकड़ों की व्याख्या को एकीकृत करने के लिए रासायनिक प्रोफ़ाइल का विश्लेषण आवश्यक है।

एचई हेक्स, एकोएट और मेओएच अंशों में आंशिक थे। सीई का अंश मिश्रण के सरलीकरण को संभावित सक्रिय यौगिकों की एकाग्रता बढ़ाने और यौगिकों के बीच सहक्रियाओं और विरोध की संभावनाओं को कम करने की अनुमति देता है। इसके अतिरिक्त, अधिक सरल मिश्रण (अंश) में, सीई की तुलना में यौगिकों का स्पेक्ट्रल डेटा प्राप्त करना और डीरेप्लिकेशन विश्लेषण2करना आसान है। आमतौर पर, तरल-तरल निष्कर्षण या ठोस चरण निष्कर्षण कारतूस (एसपीई) द्वारा किया जा सकता है जिसमें सी18 (40 माइक्रोन, 100 Å) जैसे अधिमानतः उलट-फेर-चरण एसोरबेंट होते हैं। अध्ययन उद्देश्यों या वांछित यौगिकों की रासायनिक प्रकृति के आधार पर अन्य एसोरबेंट्स या एसोरबोल्ट के मिश्रण को चुना जा सकता है। यदि चुनी हुई तकनीक एसपीई है, तो कारतूस को पहले शुद्ध कार्बनिक सॉल्वेंट (जैसे, एटोह) के साथ सक्रिय किया जाना चाहिए और प्रारंभिक एल्यूंट के साथ वातानुकूलित होना चाहिए। मानकीकृत प्रोटोकॉल उपलब्ध हैं। इस प्रकार, पाठक परामर्श और ब्याज की इच्छित अध्ययन और संयंत्र सामग्री के अनुसार उन्हें अनुकूलित कर सकते हैं।

बारह सीई को 84.15% एटोह और 15% डीएमएसओ के साथ 6 मिलीग्राम/एमएल (स्टॉक सॉल्यूशन) प्राप्त करने के लिए घुलनशील किया गया था। स्क्रीनिंग परीक्षणों से पहले, हमने मंद एकाग्रता (वाहन) का परीक्षण किया जो माइक्रोबियल विकास में हस्तक्षेप नहीं करता है। यह कदम महत्वपूर्ण है क्योंकि यह सॉल्वैंट्स के एंटीमाइक्रोबियल और एंटीबायोफिल्म कार्यों को उपचार का परीक्षण करते समय परिणामों को प्रभावित करने से रोकता है। परीक्षण सॉल्वैंट्स (संबद्ध और/ इस प्रकार, हमने सीई के साथ 0.5 मिलीग्राम/एमएल और वाहन के साथ 7% एटोह और 1.25% डीएमएसओ की एकाग्रता पर हमारी स्क्रीनिंग शुरू की।

स्क्रीनिंग एंटीमाइक्रोबियल और एंटीबायोफिल्म गतिविधि के लिए, ९६-अच्छी प्लेटों को ऊपर वर्णित माना गया । इस उद्देश्य के लिए, 0.5 मिलीग्राम/एमएल की एकाग्रता पर प्रत्येक सीई का परीक्षण करने के लिए स्टॉक समाधान सीई (6 मिलीग्राम/एमएल) के 16.67 माइक्रोन की मात्रा जोड़ी गई थी। गठित बायोफिल्म्स को चरण 3 में वर्णित के रूप में संसाधित किया गया था। एस म्यूटन (आईसी50 या 3 लॉग) के खिलाफ प्रभावी अर्क का उपयोग इस जीवाणु की "आसंजन शक्ति" का मूल्यांकन लार पेलिकल और प्रारंभिक ग्लूकन मैट्रिक्स के लिए किया गया था, जैसा कि चरण 3 में वर्णित है।

जैविक परख से प्राप्त कच्चे डेटा एक्सेल में आयोजित किए गए थे (जैसा कि चरण 4 में वर्णित है) और उचित सांख्यिकीय उपचार13के साथ विश्लेषण किया गया था। सबसे अच्छी गतिविधि के साथ अर्क की पहचान करने के लिए कटऑफ बिंदु आईसी50 अवरोध (3 लॉग) था। इस पैरामीटर से, चार अर्क एक अनुकूल प्रतिक्रिया(चित्रा 8) दिखाया। इन चार अर्क के क्रोमेग्राफिक डेटा में क्लेरोडेन-प्रकार के डिटरपेन और ग्लाइकोसिलेटेड फ्लेवोनॉइड की एक साथ उपस्थिति दिखाई देती है। इसके अलावा, वे एक ही बायोम (अटलांटिक वन) और विविधता(सिल्वेस्ट्रिज)शामिल हैं । जैविक डेटा की व्याख्या करने में मदद करने के लिए, हमने चार अर्क के क्रोमेग्राफिक प्रोफाइल की तुलना अन्य जांच किए गए अर्क के साथ सर्वोत्तम गतिविधि के साथ की। दूसरों की तुलना में, सबसे अच्छी गतिविधि वाले अर्क में क्लेरोडेन-प्रकार के डिटरपेन की मात्रा अधिक होती है और साथ ही ग्लाइकोसिलेटेड फ्लेवोनॉइड होते हैं। यह अवलोकन इंगित करता है कि यह संभावना है कि इन अर्क की प्रभावशीलता दो माध्यमिक मेटाबोलाइट्स के बीच सहक्रियात्मक बातचीत के कारण है, इस प्रकार उनकी जैविक गतिविधि बढ़ रही है। यही है, क्लेरोडेन-प्रकार के डिटरपेन और ग्लाइकोसिलेटेड फ्लेवोनॉइड का संयुक्त प्रभाव उनके अलग-अलग प्रभावों के योग से अधिक है13।

स्क्रीनिंग में प्राप्त आंकड़ों की पुष्टि करने के लिए, हमने चयनित सीई के साथ इलाज किए गए लार पेलिकल और ग्लूकन के आसंजन के बाद एस म्यूटन की टुकड़ी का मूल्यांकन किया। परख चयनित कच्चे तेल के अर्क की जैविक गतिविधि का बेहतर मूल्यांकन करने और संभावित कार्रवाई लक्ष्यों की पहचान करने के लिए इन विट्रो एकल प्रजातियों के बायोफिल्म मॉडल का उपयोग करते हैं। पहला विश्लेषण इस बात की पुष्टि करता है कि क्या उपयोग किए गए उपचार लार पेलिकल में एस म्यूटन के पालन को बाधित करने में सक्षम हैं, लेकिन मुख्य रूप से, क्या सूक्ष्मजीव की कोशिकाओं ने इलाज पेलिकल का पालन किया है, यांत्रिक उत्तेजना द्वारा सतह से अधिक आसानी से हटाया जा सकता है, इस प्रकार बायोफिल्म गठन के पहले चरण में बाधा डालता है। ग्लूकन के संश्लेषण के दौरान सीई (बेहतर गतिविधि के साथ) के अलावा लार पेलिकल को संशोधित नहीं किया क्योंकि किसी भी सीई ने लार पेलिकल(चित्रा 9 ए)का पालन करने वाली कोशिकाओं को हटाने को काफी प्रभावित नहीं किया।

प्रारंभिक ग्लूकन मैट्रिक्स(जीएसएचए)का आसंजन यह जांच करता है कि क्या उपचार एस म्यूटन के आसंजन को प्रारंभिक ग्लूकन मैट्रिक्स में रोक सकते हैं। फिर भी, यह पद्धति सत्यापित करती है कि इलाज किए गए ग्लूकन का पालन करने वाली सूक्ष्मजीव कोशिकाओं को यांत्रिक उत्तेजना द्वारा सतह के अधिक आसानी से हटाया जा सकता है, इस प्रकार मंच बायोफिल्म गठन में बाधा डालता है। तीन सीई ने जीटीएफबी द्वारा गठित ग्लूकन की गुणवत्ता को प्रभावित किया और इसलिए एस म्यूटन के आसंजन को प्रारंभिक ग्लूकन मैट्रिक्स में कमजोर कर दिया (ग्लूकन के लिए आसंजन के बाद अधिकांश एस म्यूटन कोशिकाओं को हटा दिया गया; चित्रा 9B)। हमारा मानना है कि यह व्यवहार माध्यमिक मेटाबोलाइट्स13के बीच तालमेल से संबंधित है ।

व्यवस्थित दृष्टिकोण ने हमें कैंसरजनक बायोफिल्म्स के गठन को रोकने के लिए सक्रिय क्रूड अर्क की पहचान करने और चयन करने में मदद की है। एक बार चयनित और क्रोमेग्राफिक प्रोफ़ाइल के आधार पर, हमारे पास जटिल मॉडलों में कार्रवाई के आणविक तंत्र को स्पष्ट करने का आधार है।

Figure 2
चित्र 2: संयंत्र सामग्री निष्कर्षण और अंश का प्रवाह-चार्ट। उदाहरण कच्चे तेल के अर्क(ए)और कच्चे अर्क(बी)के अंश तैयार करने के लिए प्रयोगात्मक डिजाइन से पता चलता है । संयुक्त अरब अमीरात: अल्ट्रासाउंड असिस्टेड एक्सट्रेक्शन; एसपीई: ठोस चरण निष्कर्षण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: 96-वेल प्लेटों में रोगाणुरोधी गतिविधि का आकलन करने के लिए प्रायोगिक डिजाइन। उदाहरण उपचार (कच्चे तेल के अर्क या अंश) और नियंत्रण को दर्शाया गया है। कई उपचारों की स्क्रीनिंग के लिए, प्रत्येक कुएं में एक एकाग्रता (मिलीग्राम/एमएल) का उपयोग करें। सीएलयू/एमएल: मिलीलीटर प्रति इकाइयों का गठन कॉलोनी। O.D.: ऑप्टिकल घनत्व। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: 96-अच्छी प्लेटों में एंटीबायोफिल्म परख के लिए प्रायोगिक डिजाइन। उदाहरण उपचार (कच्चे तेल के अर्क और अंश) और नियंत्रण से पता चलता है । विभिन्न उपचारों की जांच के लिए, प्रत्येक कुएं में एक एकाग्रता (मिलीग्राम/एमएल) का उपयोग करें। एमें, इलाज बायोफिल्मों के बायोमास की मात्रा निर्धारित करने के लिए कदम सचित्र हैं। बीमें, इलाज बायोफिल्म्स की जनसंख्या (CFU/mL) निर्धारित करने के लिए कदम दिखाया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्र 5: लार पेलिकल के आसंजन का मूल्यांकन करने के लिए प्रायोगिक डिजाइन, पालन कोशिकाओं की टुकड़ी के बाद। उदाहरण से पता चलता है कि किए जाने वाले कदम। उपचार: जैविक स्क्रीनिंग के आधार पर चयनित। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6: प्रारंभिक ग्लूकन मैट्रिक्स(जीएसएचए)के आसंजन का मूल्यांकन करने के लिए प्रायोगिक डिजाइन और उसके बाद पालन कोशिकाओं की टुकड़ी। उदाहरण से पता चलता है कि किए जाने वाले कदम। उपचार: जैविक स्क्रीनिंग के आधार पर चयनित। सुक्रोज सब्सट्रेट: सुक्रोज का 100 mmol। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 7
चित्रा 7: सी सिल्वेस्ट्रिज में क्लेरोडेन-टाइप डिटरपेन और ग्लाइकोसिलेटेड फ्लेवोनॉइड की मात्रा ब्राजील के बायोम से अर्क। अक्षर एस,मैं, और एल क्रमशः किस्मों सिल्वेस्ट्रिज,मध्यवर्ती, और भाषाओं का संकेत देतेहैं। डॉ पाउला कैरोलिना आकांक्षा ब्यूनो द्वारा व्यक्तिगत संचार । इस आंकड़े को रिबेरो एट अल13से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 8
चित्रा 8: एस म्यूटनके खिलाफ ब्राजील के बायोम से सी सिल्वेस्ट्रिस क्रूड अर्क की एंटीमाइक्रोबियल और एंटीबायोफिल्म गतिविधि ।  A. इलाज प्लैंक्टोनिक कोशिकाओं के % सीएलयू (लॉग10); बी% इलाज बायोफिल्म्स के बायोमास। इलाज बायोफिल्म के C% CFU (लॉग10)। वर्णित डेटा औसत (निशान) और इंटरक्वार्टिकल (बक्से) हैं। त्रुटि सलाखों अधिकतम और न्यूनतम मूल्यों का प्रतिनिधित्व करते हैं। तारांकन वाहन नियंत्रण (वी) बनाम एक विशिष्ट उद्धरण के सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतर को दर्शाता है, जहां: ****पी ≤ 0.0001; पी ≤ 0.001; ** पी ≤ 0.01; और *पी ≤ ०.०५ (Kruskal-Wallis परीक्षण, डन के कई तुलना परीक्षण के बाद) । प्रत्येक प्रजाति के विकास नियंत्रण (उपचार के बिना) एस mutansके लिए एसएम के रूप में प्रतिनिधित्व किया है । प्रत्येक ग्राफ में सलाखों के रंग उस विविधता का प्रतिनिधित्व करते हैं जिससे अर्क होते हैं, गहरे भूरे रंग में: वर सिल्वेस्ट्रिस; लाइट ग्रे: var. मध्यवर्ती और सफेद: var. lingua. इस आंकड़े को रिबेरो एट अल13से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 9
चित्रा 9: एस म्यूटंस टुकड़ी इलाज लार पेलिकल और ग्लूकन के प्रारंभिक मैट्रिक्स के लिए आसंजन के बाद । इलाज लार पेलिकल और ग्लूकन को एस म्यूटन के पोस्ट-रिलीज डेटा क्रमशः (ए) और (बी)में दिखाए जाते हैं। नियंत्रण वाहन (वी) के बीच कोई अंतर नहीं था, और दोनों विश्लेषणों के लिए परीक्षण किए गए अर्क। सीएलयू/एमएल का प्रतिशत वाहन नियंत्रण (वी) को 100% के रूप में ध्यान में रखते हुए प्राप्त किया गया था। वर्णित डेटा औसत (निशान) और इंटरक्वार्टिकल (बक्से) हैं। त्रुटि सलाखों अधिकतम और न्यूनतम मूल्यों का प्रतिनिधित्व करते हैं। तारांकन वाहन नियंत्रण (वी) बनाम एक विशिष्ट अर्क के सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतर को दर्शाता है, जहां ****पी = 0.0001 और **पी <0.0031 (Kruskal-Wallis परीक्षण, डन के कई तुलना परीक्षण के बाद) । विकास नियंत्रण का प्रतिनिधित्व एस म्यूटन के लिए एसएम द्वारा किया जाता है। ग्राफ की सलाखों के रंग उस विविधता का प्रतिनिधित्व करते हैं जिससे अर्क होते हैं, जो रंग गहरे भूरे रंग के वर के लिए होते हैं। सिल्वेस्ट्रिज़। इस आंकड़े को रिबेरो एट अल13से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

प्राकृतिक कच्चे तेल के अर्क के साथ काम से संबंधित मुख्य चुनौतियों में उनकी जटिल संरचना और क्लासिक जैव-निर्देशित अलगाव अध्ययन की अपर्याप्तता शामिल है। हालांकि यह प्रक्रिया धीमी है, यह प्रभावी है और एनपी अनुसंधान में प्रमुख निष्कर्षों के लिए नेतृत्व किया गया है । युक्तिसंगत बनाने के लिए, युक्तियुक्तकरण-संचालित अध्ययनों की आवश्यकता है। इस प्रकार, अलगाव से पहले सीई और डेरेप्लेशन के विश्लेषण के लिए आधुनिक रासायनिक प्रोफाइलिंग दृष्टिकोणों का उपयोग अध्ययन की गई सामग्री को चित्रित करना महत्वपूर्ण है और विशेष रूप से ज्ञात यौगिकों के पुनः अलगाव से बचने के लिए उपयोगी हैजिसमेंपहले से वर्णित जैविक गतिविधि2,15हैं। इसके अलावा, देखे गए जैविक गतिविधियों के लिए जिम्मेदार संभावित हिट उम्मीदवारों को खोजने के लिए आगे बहुविध डेटा विश्लेषण करने के लिए बहुआयामी डेटा का अधिग्रहण आवश्यक है। नतीजतन, शोधकर्ता इन संभावित उम्मीदवारों के अलगाव (एक भव्य पैमाने पर) पर ध्यान केंद्रित कर सकते हैं ।

यहां, हम पौधे के अर्क और अंशों से सक्रिय यौगिकों के बायोसे-निर्देशित पहचान (इन विट्रो) के लिए एक व्यवस्थित दृष्टिकोण प्रस्तुत करते हैं। यह प्रोटोकॉल एक बहु-लक्ष्य स्क्रीनिंग और विश्लेषण विधि की अनुमति देता है ताकि कई सक्रिय घटकों की जांच और विश्लेषण एक साथ किया जा सके। बायोअसे कहते हैं कि छोटे पैमाने पर और उच्च उपज के हैं, तेज, लागत प्रभावी, पुन: पेश करने में आसान हैं, और पारंपरिक तरीकों (जैसे, ब्याज के यौगिकों के प्रारंभिक अलगाव)39की तुलना में कम अभिकर्दकों का उपभोग करते हैं। किसी भी प्राकृतिक उत्पाद अनुसंधान के लिए, यह विश्लेषणात्मक उपकरण (उदाहरण के लिए, एचपीएलसी-यूवी, एचपीएलसी-डैड, एलसी-एमएस) को सर्वोपरि है। हाल ही में, दृष्टिकोण अधिक संरचना उन्मुख (रसायन विज्ञान आधारित) का उपयोग, उच्च डिग्री के लिए, विश्लेषणात्मक और स्पष्टीकरण प्लेटफार्मों (एलसी-एचआरएमएस और एचआरएमएस/एमएस, उच्च क्षेत्र एनएमआर) और डेरेप्लिकेशन रणनीतियों की शक्ति है, जिसमें पहले से ज्ञात अणुओं की तेजी से पहचान शामिल है । यह कदम जैविक प्रतिक्रिया के साथ रासायनिक प्रोफ़ाइल संबंधों को समझने में मदद करता है जिसके परिणामस्वरूप उम्मीदवार सक्रिय मेटाबोलाइट्स 3 का अधिक केंद्रित अलगावहोताहै । क्रोमेग्राफिक विश्लेषण के लिए कई अच्छी तरह से स्थापित तरीके हैं। अज्ञात एनपीएस के लिए, कभी-कभी सर्वोत्तम संभव विधि खोजने के लिए पायलटों का प्रदर्शन करना आवश्यक हो सकता है। उदाहरण के लिए, हम सी सिल्वेस्ट्रिज13, 18की दो किस्मों द्वारा उत्पादित माध्यमिक मेटाबोलाइट्स के एक साथ विश्लेषण के लिए मान्य क्रोमेटोग्राफी की विश्लेषणात्मक विधि का उपयोग करते हैं। क्रोमेटोग्राफी विधि चुनते समय, हम लक्ष्य यौगिक (एस) के आधार पर एक प्रोटोकॉल पर विचार करने का सुझाव देते हैं, और सभी उपलब्ध तरीकों के फायदे और नुकसान, विशेष रूप से उनकी दक्षता पर ध्यान केंद्रित करते हैं और निश्चित रूप से, कुल लागतमें 40शामिल हैं।

हालांकि सुनियोजित दृष्टिकोण तेजी से स्क्रीनिंग और एनपीएस में बायोएक्टिव उम्मीदवारों का विश्लेषण करने के लिए उपयोगी साबित हुआ है, लेकिन महत्वपूर्ण सीमाएं बनी हुई हैं । उदाहरण के लिए, बायोमास और प्लैंक्टोनिक संस्कृतियों के दृश्य और O.D. रीडिंग झूठे सकारात्मक परिणाम13, 23,24पुन: पेश कर सकते हैं । 23 ,24के प्राकृतिक यौगिकों के लिए उपयोग किए जाने पर माइक्रोप्लेट रीडर के साथ संस्कृतियों की टर्बिडिटी का निर्धारण विफल हो सकता है । ये विफलताएं इसलिए होती हैं क्योंकि कुछ परीक्षण जीवों में कोशिकाओं को कुएं के तल पर संकुलित किया जाता है, और अन्य जीवों में कोशिकाएं निलंबन में रहती हैं; (ii) सीई में मौजूद ठोस कण23 , 24कुओं में टर्बिडिटी का कारणबनतेहैं । एनपीएस का पीएच एक ऐसा कारक है जिस पर भी विचार किया जाना चाहिए । उपचार समाधान का पीएच माध्यमिक मेटाबोलाइट्स की रासायनिक संरचना से संबंधित है और इसलिए, जैविक प्रतिक्रिया को प्रभावित करता है। हालांकि पीएच एक सीमा नहीं है, यह सावधानी के साथ मूल्यांकन किया जाना चाहिए, अध्ययन के उद्देश्य पर निर्भर करता है । उदाहरण के लिए, दांत तामचीनी सतहों पर बायोफिल्म मॉडल में, अम्लता अवांछित तामचीनी डिमिनरलाइजेशन का कारण बन सकती है। इन मामलों में, उपयुक्त बफ़र्स की सहायता से पीएच को समायोजित करना आवश्यक है। इसलिए, यह सत्यापित करने के लिए परीक्षण करना आवश्यक है कि पीएच समायोजन ने पहले देखी गई जैविक प्रतिक्रिया को प्रभावित किया या नहीं।

नए यौगिकों की गतिविधि का आकलन करने के लिए क्लासिक परीक्षणों में न्यूनतम निरोधात्मक एकाग्रता (एमआईसी) और न्यूनतम जीवाणु या कवकनाशक एकाग्रता (एमबीसी या एमएफसी)29,41का निर्धारण करना शामिल है। हालांकि, जब लक्ष्य कई पौधे के अर्क और अंशों को स्क्रीन करना होता है, तो तकनीक संपूर्ण हो जाती है। बायोस्क्रीनिंग कई उपचारों (जैसे, अलग-अलग स्थानों से पौधे के अर्क)13,42, 29की एक एकाग्रता के साथ किया जासकताहै। इन स्थितियों के लिए, व्यवस्थित दृष्टिकोण उच्च प्रदर्शन के साथ एक विधि है जो कम काम के समय में लगातार परिणाम देता है। जैविक स्क्रीनिंग में चयनित उपचार का मूल्यांकन जैविक गतिविधि की पुष्टि करने के लिए परिष्कृत मॉडल (चिकित्सकीय रूप से प्रासंगिक, व्यवहार्य और प्रजनन योग्य) का उपयोग करके किया जा सकता है। कैंसरजनक बायोफिल्म के नियंत्रण के लिए, प्रयोगशाला अध्ययनों को मुख्य रूप से हाइड्रोक्सियापेटाइट (दांत तामचीनी विकल्प) या तामचीनी सतहों पर गठित बायोफिल्म पर ध्यान केंद्रित करना चाहिए जो लार पेलिकल37के साथ लेपित एक ईमानदार स्थिति में रखा गया है। यह विभिन्न किस्मों और बायोम के पौधों के नमूनों की जांच को भी पुन: पेश करने योग्य और तेज तरीके से अनुमति देता है। इन दो चरों (बायोम और विविधता) का समावेश महत्वपूर्ण है क्योंकि वे माध्यमिक मेटाबोलाइट्स18 की रासायनिक संरचना की परिवर्तनशीलता को प्रभावित करते हैं और जैविक प्रतिक्रिया को संशोधित करते हैं। मौखिक बायोफिल्म अनुसंधान के बाहर के अनुप्रयोगों के लिए इस व्यवस्थित दृष्टिकोण को अनुकूलित/संशोधित किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, यह ब्याज की अन्य प्रजातियों का उपयोग करके बायोफिल्म से संबंधित अन्य क्षेत्रों के लिए विशेष रूप से उपयोगी हो सकता है।

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Disclosures

हितों का कोई टकराव घोषित नहीं किया गया ।

Acknowledgments

हम संयंत्र सामग्री तैयार करने के लिए प्रयोगशालाओं को उपलब्ध कराने के लिए UNESP, Araraquara/SP के रसायन विज्ञान संस्थान के Núcleo de Bioensaios, Biossíntese ई Ecofisiologia de Produtos Naturais (NuBBE) के लिए आभार व्यक्त करते हैं । हम दंत सामग्री और प्रोस्थोडोंटिक्स, यूएनईएसपी, अराक्वारा/एसपी विभाग की एप्लाइड माइक्रोबायोलॉजी प्रयोगशाला को भी धन्यवाद देते हैं । इस शोध को साओ पाउलो रिसर्च फाउंडेशन (एफएपीईएसपी #2013/07600-3 से एजेसी) और स्कॉलरशिप प्लस ओवरहेड फंड (एफएपीपी #2017/07408-6 और एफएपीईपी #2019/23175-7 से एसएमआर को एक रिसर्च ग्रांट द्वारा समर्थित किया गया था; #2011/21440-3 और #2012/21921-4 पीसीपीबी) । राष्ट्रीय वैज्ञानिक और तकनीकी विकास परिषद ने एफएपीएसपी के सहयोग से अतिरिक्त सहायता (INCT CNPq #465637/2014-0 और एफएपीएसपी #2014/50926-0 एजेसी को) प्रदान की ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well microplates  Kasvi Flat bottom
Activated carbon LABSYNTH Clean up and/or fractionation step
Analytical mill Ika LabortechniK Model A11 Basic
Blood agar plates Laborclin
Chromatographic column C18 Phenomenex Kinetex 150 × 2.1 mm, 2.6 µm, 100Â
Dimethyl sulfoxide  Sigma-Aldrich Vehicle solution
ELISA plate reader Biochrom Ez
Ethanol J. T. Baker For extraction and fractionation steps, and mobile phase composition
Ethanol Sigma-Aldrich Vehicle solution
Ethyl acetate J. T. Baker Fractionation step
GraphPad Software La Jolla GraphPad Prism7
Hexane J. T. Baker Fractionation step
Incubator Thermo Scientific
Isopropanol J. T. Baker For extraction step
Lyophilizer (a freeze dryer) Savant Modulyo
Nylon Millipore LAC 0.22 µm x 13 mm
Orbital shaker Quimis Model G816 M20
Polyamide solid phase extraction cartridge Macherey-Nagel Clean up and/or fractionation step
Silica gel Merck 40–63 μm, 60 Â
Sodium Chloride (NaCl) Synth 0,89% in water
Solid phase extraction cartridges (SPE) Macherey-Nagel Clean up and/or fractionation step
Tryptone Difco
UHPLC-DAD Dionex Ultimate 3000 RS
Ultrasonic bath UNIQUE Model USC 2800
Yeast extract Difco

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References

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Ribeiro, S. M., Fratucelli, É. D. O., Fernandes, J. M., Bueno, P. C. P., Cavalheiro, A. J., Klein, M. I. Systematic Approach to Identify Novel Antimicrobial and Antibiofilm Molecules from Plants' Extracts and Fractions to Prevent Dental Caries. J. Vis. Exp. (169), e61773, doi:10.3791/61773 (2021).

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