Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Systematisk tilgang til identificering af nye antimikrobielle og antibiofilmmolekyler fra planternes ekstrakter og fraktioner for at forhindre caries

Published: March 31, 2021 doi: 10.3791/61773
Automatic Translation
*1, *1, *2, 2,3, 2, 1
1Department of Dental Materials and Prosthodontics, School of Dentistry, São Paulo State University (UNESP), 2Department of Organic Chemistry, Institute of Chemistry, São Paulo State University (UNESP), 3Faculty of Pharmaceutical Sciences of Ribeiraão Preto (FCFRP-USP), Department of Physics and Chemistry, University of São Paulo
* These authors contributed equally

Summary

Naturlige produkter udgør lovende udgangspunkter for udviklingen af nye lægemidler og terapeutiske midler. Men på grund af den høje kemiske mangfoldighed er det en udfordrende og tidskrævende opgave at finde nye terapeutiske forbindelser fra planter. Vi beskriver en forenklet tilgang til identifikation af antimikrobielle og antibiofilmmolekyler fra planteekstrakter og fraktioner.

Abstract

Naturlige produkter giver strukturelt forskellige stoffer med et utal af biologiske aktiviteter. Identifikation og isolering af aktive forbindelser fra planter er imidlertid udfordrende på grund af den komplekse plantematrix og tidskrævende isolations- og identifikationsprocedurer. Derfor præsenteres en trinvis tilgang til screening af naturlige forbindelser fra planter, herunder isolering og identifikation af potentielt aktive molekyler. Det omfatter indsamling af plantematerialet; tilberedning og fraktionering af råekstrakter; kromatografi og spektrometri (UHPLC-DAD-HRMS og NMR) metoder til analyse og identifikation af forbindelser bioassays (antimikrobielle og antibiofilmaktiviteter; bakteriel "vedhæftningsstyrke" til spyt pellicle og indledende glucanmatrix behandlet med udvalgte behandlinger) og dataanalyse. Modellen er enkel, reproducerbar og giver mulighed for screening med høj gennemløb af flere forbindelser, koncentrationer og behandlingstrin kan kontrolleres konsekvent. De opnåede data danner grundlag for fremtidige undersøgelser, herunder formuleringer med de mest aktive ekstrakter og/eller fraktioner, isolering af molekyler, modellering af molekyler til specifikke mål i mikrobielle celler og biofilm. For eksempel er et mål at kontrollere cariogen biofilm at hæmme aktiviteten af Streptococcus mutans glucosyltransferaser, der syntetiserer den ekstracellulære matrix 'glucaner. Hæmning af disse enzymer forhindrer ophobning af biofilm, hvilket reducerer dens virulens.

Introduction

De tidligste modeller af medicin, der anvendes i samfund, var baseret på naturlige produkter (NPs). Siden da har mennesker søgt efter nye kemikalier i naturen, der kan omdannes til stoffer1. Denne søgning medførte en løbende forbedring af teknologier og metoder til ethnobotanical screening1,2,3. NPs tilbyder en rig kilde til strukturelt forskellige stoffer, med en bred vifte af biologiske aktiviteter nyttige til udvikling af alternative eller adjuvans behandlinger. Den iboende komplekse plantematrix gør imidlertid isolering og identifikation af de aktive forbindelser til en udfordrende og tidskrævende opgave4.

NPs-baserede lægemidler eller formuleringer kan bruges til at forebygge og/eller behandle flere tilstande, der påvirker orale, herunder caries4. Caries, en af de mest udbredte kroniske sygdomme globalt, stammer fra samspillet mellem sukkerrig kost og mikrobielle biofilm (plak) dannet på tandoverfladen, der fører til demineralisering forårsaget af organiske syrer afledt af mikrobiel metabolisme, og hvis de ikke behandles, fører til tandtab5,6. Selv om andre mikroorganismer kan være forbundet7, Streptococcus mutans er en kritisk cariogen bakterie, fordi det er acidogen, aciduric, og en ekstracellulær matrix builder. Denne art koder flere exoenzymer (f.eks. glykosyltransferaser eller GTF'er), der bruger saccharose som substrat8 til at opbygge den ekstracellulære matrix, der er rig på exopolysaccharider, som er en virulensdeterminant9. Svampen Candida albicans kan også øge produktionen af den ekstracellulære matrix7. Selv om fluor, administreret i forskellige modaliteter, fortsat er grundlaget for at forebygge caries10, nye tilgange er nødvendige som adjuvanser for at øge dens effektivitet. Desuden er de tilgængelige antiplak-modaliteter baseret på brugen af bredspektret mikrobicidale midler (f.eks. chlorhexidin)11. Som et alternativ, NPs er potentielle behandlingsformer til kontrol af biofilm og forebyggelse af caries12,13.

Det yderligere fremskridt med opdagelsen af nye bioaktive forbindelser fra planter omfatter nødvendige skridt eller fremgangsmåder såsom: i) anvendelse af pålidelige og reproducerbare protokoller til prøveudtagning, idet planterne ofte udviser intraspecifik variation; ii) fremstilling af samlede ekstrakter og deres respektive fraktioner i lille målestok iii) karakteriseringen og/eller dereplicationen af deres kemiske profiler mente f.eks., at der var anskaffelse af flerdimensionale data såsom GC-MS, LC-DAD-MS eller NMR iv) anvendelse af levedygtige modeller med højt udbytte til vurdering af bioaktivitet v) udvælgelse af potentielle nye hits baseret på flerdimensional dataanalyse eller andre statistiske værktøjer vi) at foretage isolering og rensning af de målrettede forbindelser eller lovende kandidater og vii) validering af de tilsvarende biologiske aktiviteter ved hjælp af de isolerede forbindelser2,14.

Dereplication er processen med hurtigt at identificere kendte forbindelser i rå ekstrakt og giver mulighed for at skelne nye forbindelser fra dem, der allerede er blevet undersøgt. Desuden forhindrer denne proces isolation, når bioaktivitet allerede er beskrevet for visse forbindelser, og det er især nyttigt at opdage "hyppige hitters". Det har været brugt i forskellige ikke-målrettede arbejdsgange lige fra større sammensatte identifikation eller acceleration af aktivitetsstyret fraktionering op til den kemiske profilering af samlinger af ekstrakter. Det kan integreres fuldt ud med metabolomiske undersøgelser med henblik på ikke-målrettet kemisk profilering af CE eller målrettet identifikation af metabolitter. Alt dette fører i sidste ende til at prioritere uddrag før isolationsprocedurerne1,15,16,17.

Derfor beskriver vi i dette manuskript en systematisk tilgang til identifikation af antimikrobielle og antibiofilmmolekyler fra planteekstrakter og fraktioner. Det omfatter fire tværfaglige trin: 1) indsamling af plantemateriale; 2) fremstilling af råekstrakter (CE) og fraktioner (CEF) efterfulgt af deres kemiske profilanalyse 3) bioassays og 4) analyser af biologiske og kemiske data (figur 1). Således præsenterer vi den protokol, der er udviklet til at analysere casearia sylvestrisekstrakternes og fraktionernes antimikrobielle og antibiofilmaktiviteter mod Streptococcus mutans og Candida albicans13, samt procedurerne for den fytokemiske karakterisering og dataanalyse. For nemheds skyld er fokus her at demonstrere tilgangen til screening af naturlige forbindelser ved hjælp af bakterien.

Figure 1
Figur 1: Rutediagram over den systematiske metode til identifikation af aktive molekyler fra planteekstrakter og fraktioner. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Indsamling af plantemateriale

  1. Plantemateriale
    1. Registrer adgangen til plantematerialet på elektroniske platforme, der regulerer adgangen til genetisk arv i det land, hvor samlingen skal finde sted. For eksempel i Brasilien skal du registrere dig hos det nationale system til forvaltning af genetisk arv og tilknyttet traditionel viden - SisGen (websted https://sisgen.gov.br/paginas/login.aspx).
    2. Indsamle prøver af plantemateriale af interesse (f.eks blade, stilke, rødder, blomster, frugter). Registrer, om materialet er indsamlet i reproduktions- eller vegetativfasen.
    3. Registrer indsamlingsparametrene (dato, georeferencing, gennemsnitlig årlig temperatur og gennemsnitlig fugtighedsprocent).
    4. Identificer prøverne præcist, og en taksonom skal bekræfte ægtheden.
  2. Stabilisering og opbevaring af planteprøver
    1. Separate planteorganer i individuelle plastikposer eller kolber umiddelbart efter indsamlingen.
    2. Inaktivere potentielle enzymatiske reaktioner ved (i) øjeblikkelig frysning i flydende nitrogen, ii) dehydrering i en cirkulerende luftovn (40 °C) eller iii) frysetørring af prøverne ved lyofilisering.
    3. Det stabiliserede materiale opbevares i hermetisk lukkede poser ved stuetemperatur eller i en fryser, indtil det anvendes (-20 eller -80 °C, afhængigt af opbevaringsperioden eller den påtænkte anvendelse).
    4. Prøverne slibes i en analysemølle (kniv eller kugle, afhængigt af vævstypen eller tilgængeligheden) og partikelstørrelsen standardiseres ved hjælp af standardiserede sigte.
    5. Prøverne vejes enkeltvis for de efterfølgende udsugningstrin.

2. Forberedelse af råekstrakter (CE) og fraktioner (CEF) til kemisk profilanalyse og bioassays

  1. Fremstilling af råstofudvinding (CE)
    BEMÆRK: Trinnene er illustreret i rutediagrammet i Figur 2A.
    1. Forbered et ekstraktionsmiddel med en hydroalkoholisk blanding (f.eks. ethanol (EtOH) 70% eller ternære blandinger af vand, EtOH og andre modifikatorer, defineret ved eksperimentel udformning af ifølge tidligere rapporter).
    2. Forholdet mellem prøvevægten (tørvægt, mg)/ekstraktionsmiddel (mL) varierer fra 50 til 100 mg for hver mL opløsningsmiddel.
    3. Til hurtige og reproducerbare ekstraktioner anvendes batchudtræk ved hjælp af mikrorør.
      BEMÆRK: Der bør på nuværende tidspunkt anvendes mindst tre replikater til at muliggøre statistisk analyse.
    4. Udfør ultralydassisterede ekstraktioner (UAE) for at gøre det hurtigt, nemt og billigt.
    5. Gentag proceduren tre gange (15 min hver) for at opnå den bedste effektivitet.
    6. Efter hvert ekstraktionstrin dekanteres den faste rest ved centrifugering, og supernatanten fjernes.
    7. Kombiner supernatants individuelt, filtrere og gemme aliquots til samtidig kemisk analyse og bioassays. Fjern om nødvendigt ekstraktionsmidlerne under vakuum, nitrogenstrøm eller lyofilisering, og registrer veje og udbytte.
    8. Opbevares ved -20 °C beskyttet mod lys.
      BEMÆRK: Protokollen kan sættes på pause her for at screene CE og vælge dem, der præsenterer den ønskede aktivitet.
  2. Fraktionering af råekstrakter (CEF)
    BEMÆRK: Trinnene er illustreret i rutediagrammet i Figur 2B.
    1. Brug patroner med mindst 1 g adsorbent. Hvis alkaloider potentielt er til stede i CE, skal du anvende opløsningsmidler, der indeholder 0,1% myresyre (FA).
    2. Fortyndet prøve i den bedst egnede opløsningsmiddel (eller opløsningsmiddelblanding) for at opnå en prøveopløsning på 100 mg/mL. Derefter overføres 1 ml af prøveopløsningen til en forbetinget en massiv faseudtrækningspatroner - SPE (1 g adsorbent, 6 ml kapacitet).
    3. Fraktioneringen udføres ved hjælp af omkring tre døde volumener af hver ekstraktionsudledning (til en patron på 1 g svarer den til 2 mL af hvert opløsningsmiddel). Hvis alkaloider potentielt er til stede i CE, skal du bruge opløsningsmidler, der indeholder 0,1% af FA.
    4. Indsamle en brøkdel af eluent sammensætning og gemme aliquots til samtidig kemisk analyse og bioassays.
    5. Fjern opløsningsmidlet under vakuum, nitrogenstrøm eller lyofilisering, og registrer veje og udbytte.
      BEMÆRK: Hvis CE er vanskelig at opløse i den oprindelige elueringsblanding, skal CE'en spredes i en fast fase (f.eks. C18 eller celit) i 1:1 (w/w) proportion, før materialet lægges oven på patronen.
      ADVARSEL: Veje mikrorørene på forhånd for at beregne masseudbyttet af ekstrakter og fraktioner.
  3. Analyse af kemisk profilering
    BEMÆRK: I betragtning af at hver planteart kræver optimerede og specifikke metoder til sin kemiske analyse, beskriver vi i de følgende afsnit de mest almindelige analytiske metoder, der anvendes til at analysere plantematerialer. Som et praktisk eksempel blev der udviklet og valideret en omvendt fase flydende kromatografi til samtidig analyse af phenolforbindelser og clerodan-type diterpener differentieret biosyntese af to sorter af Casearia sylvestris Swartz (Salicaceae). UPLC-DAD-apparatet var udstyret med en afgasser, en kvartær pumpe, en automatisk prøvetager, en UV-Vis fotodiode array-detektor og en ovn (se detaljer i Bueno et al. 201518). Lignende metoder, der er beskrevet i følgende eksempler, kan optimeres i henhold til andre plantearter og/eller plantematerialer.
    1. Kromatografiske analyse- og orddelingsmuligheder
      1. Til separationer ved hjælp af ultrahøjydende væskekromatografi (UPLC) skal du bruge en C18-kromatografisk kolonne (f.eks. 150 × 2,1 mm, 2,6 μm, 100 Å), der er beskyttet af en kompatibel forkolonne.
        BEMÆRK: Andre søjlefaser eller kromatografiske tilstande kan anvendes afhængigt af plantearterne/-materialet. Konventionel HPLC kan også bruges; i så fald skal der vælges en passende kromatografisk kolonne. For at opnå fremragende separationer skal de kromatografiske forhold justeres i betragtning af strømningshastigheden (μL/min),kolonnetemperaturen (°C) og injektionsvolumen (μL). Den mobile fase består normalt af vand (A) og acetonitrile eller methanol (B) ved hjælp af lineære eller multistep elution gradienter eller isokratisk elution. Modifikatorer som buffere, syrer, baser eller andre kan også bruges.
      2. Udføre plantematerialeanalysen (CE og/eller CEF) og registrere alle relaterede data, f.eks. spektraldata (ved hjælp af UV-Vis og/eller fortrinsvis MS-detektorer), retentionstid (min) og andre, afhængigt af den tilgængelige orddeling.
        BEMÆRK: Flydende kromatografi (LC) er normalt bindestreg (kombineret) med høj opløsning massespektrometri (HRMS), som LC−HRMS, og er almindeligt anvendt til hurtig anmærkning af metabolit i CE ou CEF15.
      3. Hvis der kræves kvalitative data, og kvantitative data er nødvendige, skal du omhyggeligt forberede og injicere kalibreringskurver efter samme protokol.
        BEMÆRK: Udviklingen af de bedste kromatografiske forhold kan udføres ved hjælp af design af eksperimenter, som beskrevet af Bueno et al. 201518eller lignende litteratur. Det er vigtigt at overveje at medtage interne standarder under metodeudviklingen. De værdsættes meget, da de tillader korrekte tekniske afvigelser under prøveforberedelse og injektioner og yderligere normalisering til dataanalyse.
  4. Enkeltvariere og flerdimensionale dataanalyser
    1. De registrerede kromatogrammer eksporteres i et passende format (f .txt.eks .csv. En enkelt datamatrix kan indstilles ved at sammenføje og justere kromatogrammer, hvis flere prøver analyseres, og sammenligninger er påkrævet. De resulterende matricer skal normaliseres kromatogrammer i henhold til den anvendte interne standard.
    2. Analysere planten metabolomics data ved hjælp af multivariat og univariate metoder. Udforsk og visualiser metabolomics-datasæt gennem samtidig analyse af flere variabler ved hjælp af flerdimensionale statistiske metoder, herunder ikke-overvåget hovedkomponentanalyse (PCA) og hierarkisk klyngeanalyse (HCA) eller overvåget delvis mindst kvadratanalyse (såsom PLS, OPLS, PLS-DA). Univariate metoder, såsom ANOVA, Student's, Tukey og Welch's t-test, er særligt interessante for den præcise analyse af kvantitative forskelle mellem prøver19.
  5. Anmærkning af dereplication og forbindelser
    BEMÆRK: Formålet med dette trin er dedikeret til hurtig on-line identifikation af kendte NPs for at undgå kedelig isolation, der kan udføres samtidigt til uni- eller multivariate dataanalyse.
    1. Udfør identifikationsniveauerne for de fundne forbindelser eller målforbindelserne:
      1. Identificeret forbindelse, herunder fuld 3D-struktur og stereokemi (niveau 0);
      2. Identifikation opnået ved hjælp af to ortogonale parametre, såsom retentionstid og MS/MS-spektrum (niveau 1)
      3. Satativt kommenterede forbindelser og sammensatte klasser (niveau 2 og 3);
      4. Uidentificerede eller uklassificerede metabolitter , der kan differentieres på grundlag af analytiske data (niveau 4)19,20.
    2. Karakterisere de kendte forbindelser ved hjælp af de kommercielle eller offentlige databaser. Blandt de vigtigste databaser kan det fremhæves: NIST (https://www.nist.gov), Wiley (https://www.sisweb.com/software/ms/wiley.htm), MassBank (https://massbank.eu/MassBank/), GMD (http://gmd.mpimp-golm.mpg.de/), METLIN (https://metlin.scripps.edu) og Global Natural Products Social Molecular Networking – GNPS database (https://gnps.ucsd.edu)19.
      BEMÆRK: Der er forskellige niveauer af anmærkninger, og de afhænger af den bindestreg teknik, der anvendes i løbet af undersøgelsen og kan omfatte: bistand fra MS- (eller NMR) baserede spektrale databaser, og i silico spektral forudsigelse algoritmer.
    3. Isolation, rensning og fuldstændig identifikation af forbindelser
      BEMÆRK: Hvis en given forbindelse (hvis identitet var mistænkt af de statistiske metoder) har brug for fuldstændig strukturel identifikation, er det første skridt til at udføre denne opgave at isolere og rense de ønskede forbindelser i større skala. Det kan opnås ved at opskalere de allerede udviklede protokoller.
      1. Udfør den hurtige og direkte isolering af målforbindelsen(e) ved hjælp af præparative kromatografiske teknikker, der er veletablerede og optimerede. Semi-preparativ HPLC med tør belastning injektion kan bruges til at undgå de kompromiser, der generelt skal foretages mellem høj belastning og prøve opløselighed1.
      2. Opnå den komplette strukturelle karakterisering og identifikation af isolerede forbindelser. Dette kan gøres gennem en kombination af forskellige teknikker:
        1. Nuklear magnetisk resonans (NMR);
        2. Massespektrometri (MS);
        3. Spektrometriske teknikker i de ultraviolette (UV) og infrarøde (IR) regioner er også meget nyttige til karakterisering af de funktionelle grupper;
        4. Brugen af chiroptical spektroskopi såsom elektronisk og vibrationel cirkulær dikhroisme (henholdsvis ECD og VCD), Raman optisk aktivitet (ROA) og røntgenkrystallografi er vigtige teknikker til absolut konfigurationskarakterisering.

3. Bioassays

BEMÆRK: Biologisk screening: For hurtigt at vurdere CE og CEF's potentielle bioaktivitet bør den indledende screening af naturlige stoffer tilrettelægges og være ligetil.

  1. Forberedelse af CE- og CEF til bioassays
    1. Rekonstituer tøroffet med de bedst mulige opløsningsmidler (som kan bestemmes eksperimentelt). Forsøgsdesignet21,22 definerer stamopløsningen og koncentrationen af opløsningsmidler.
    2. Opløsningskoncentrationen af stamopløsningen beregnes. Det kan du gøre ved at anvende formlen: C1 x V1 = C2 x V2, hvor C1 repræsenterer CE's og/eller CEF's stamopløsning (mg); V1 repræsenterer mængden af opløsningsmiddel; C2 er vægten af CE og/eller CEF V2 er det endelige volumen (mL) af stamopløsningen.
      BEMÆRK: For eksempel valgte vi 84,15% EtOH og 15% dimethylsulfoxid (DMSO) som opløsningsmiddelkoncentrationen i stamopløsningen. Vi forberedte lagerkoncentrationen i CE til 6 mg/mL og CEF til 1 mg/mL13. Opløsningsmidlet til fortynding af CE og CEF vil afhænge af metoden til vurdering af den biologiske aktivitet. Det opløsningsmiddel, der anvendes som køretøj, må ikke forstyrre den biologiske og toksikologiske aktivitet. Typisk bruges vand, DMSO, EtOH eller et vandigt opløsningsmiddel baseret på EtOH til at opløse planteekstrakter eller plantederivater4,13.
  2. Forberedelse af testorganismer
    1. Genaktivere en mikrobiel stamme, for eksempel S. mutans UA159 på blod agar (48 timer, 37 °C, 5% CO2) og kultur det i flydende dyrkningsmedium (f.eks. tryptongærekstrakt bouillon [TYE: 2,5% (w/v) trypton med 1,5% (w/v) gærekstrakt] indeholdende 1% glukose (w/v) (TYEg) i 16 h, 37 ° C, 5% CO2.
    2. Udfør en 1:20 fortynding af mikroorganismens oprindelige kultur i samme kulturmedium (fortyndingsforholdet for den oprindelige kultur kan ændre sig i henhold til det eksperimentelle design).
    3. Inkuber, indtil den når mellemlogvækstfasen.
    4. Inoculumet forberedes til bioassays med en defineret population (f.eks. 2x106 kolonidannende enheder pr. milliliter - CFU/mL) i TYEg til antimikrobielle assays og TYE med 1% saccharose (w/v) (TYEs) til biofilmanalyser.
      BEMÆRK: Vækstbetingelserne afhænger af den testede mikroorganisme.
  3. Antimikrobiel aktivitet
    BEMÆRK: Trinene er illustreret i figur 3.
    1. I en 96-brønds plade tilsættes en aliquot (μL) af CE- og/eller CEF-stamopløsningen (behandlinger). Volumenet af aliquot defineres ved testkoncentrationen, som skal vælges på grundlag af tidligere undersøgelser. For at teste CE ved 0,5 mg/ml-testkoncentrationen skal der f.eks. Til denne beregning anvendes formlen: C1 x V1 = C2 x V2, hvor C1 er stamkoncentrationen, V1 er volumenet af stamopløsningen aliquot, C2 er testkoncentrationen, og V2 er volumenet af 96-brøndspladen (som svarer til 200 μL). I denne eksperimentelle tilstand vil testkoncentrationen af opløsningsmidlerne (køretøjet) være 7% EtOH og 1,25% DMSO.
    2. Medtag et sæt kontroller for hver plade: en kolonne med behandlinger uden inoculumet (blank kontrol pr. behandling hjælper med at differentiere uklarhed ved den anvendte behandling fra mikrobiel vækst); en kolonne med køretøj og inoculum (fortyndingsmiddel til CE- eller CEF- eller 0 mg/mL-kontrol) en kolonne med kun kulturmediet (kulturmediumkontrol) og en kolonne med kun inoculum (mikrobiel vækstkontrol).
    3. Brug TYEg til at justere lydstyrken til 100 μL. Dernæst inkuberes for eksempel 24 timer, 37 °C, 5% CO2 (afhængigt af den testede mikroorganisme).
    4. 100 μL mikroorganisme inoculum (1x 106 CFU/mL) i 96-brøndspladen.
    5. Analyser bakterievæksten i henhold til uklarhed ved visuel inspektion af brøndene (klar eller overskyet). Klar: betyder, at der ikke er nogen visuel vækst af mikroorganismen. Overskyet: betyder, at der er visuel vækst af mikroorganismen.
    6. Måling af absorbansen (optisk tæthed eller OP) af bakteriekulturen i hver brønd (ELISA-læser ved hjælp af 540 nm). Dernæst overføres 100 μL af kulturerne til mikrorør, der indeholder 900 μL saltvandsopløsning (0,89% NaCl), blandes godt ved hvirvelstrømning. Fortsæt derefter med at udføre en ti gange seriel fortynding indtil den ønskede værdi.
    7. Pod en aliquot af den ønskede fortynding i specifikke agarplader (i to eksemplarer). For eksempel 10 μL af en bestemt fortynding på blod agar plader.
    8. Inkuber. Forholdene kan ændre sig mellem mikroorganismer, for eksempel S. mutans: 48 h, 37 °C, 5% CO2.
    9. Udfør kolonitællinger på pladerne til senere omdannelse til CFU/mL som (Etantal kolonier x 10n)/q. I denne formel ern lig med den absolutte værdi af fortyndingen (0, 1, 2 eller 3), og q er lig med mængden i mL, pipetteret for hver fortynding, der er belagt på agarpladen. CFU/mL kan også konverteres til logværdier.
      BEMÆRK: Når der tilsættes planteekstrakter til dyrkningsmediet, kan der forekomme nedbør af partikler fra ekstrakterne. Denne kendsgerning kan gøre det vanskeligt at fortolke resultaterne. Det samme sker, når en mikropladelæser måler uklarheden, da celler i nogle tilfælde klumper sig fast i bunden af mikropladen. Derudover kan farven på plantebladekstrakter afhængigt af det anvendte ekstrakt gøre det vanskeligt at kvantificere uklarhed23,24. En alternativ metode bruger farvestoffer, der afslører, om mikrobielle celler er metabolisk aktive eller ej24.
  4. Antibiofilmaktivitet
    BEMÆRK: Trinene til vurdering af behandlingers indvirkning på biofilmdannelsen er illustreret i figur 4.
    1. Dannelse og forarbejdning af biofilm
      1. Fortynd behandlinger i dyrkningsmediet (TYEs) i en 96-brønds plade som beskrevet i trinene i antimikrobiel aktivitetsprotokollen.
      2. Inkuber pladen. I eksemplet med S. mutans udføres inkubationen i løbet af 24 timer ved 37 °C og 5% CO2.
      3. Efter inkubation skal pladerne anbringes på en orbital shaker (5 min,37 °C, 75 omdrejninger i minuttet) for at løsne de celler, der ikke klæber til biofilmen. Kassér derefter kulturmediet, der indeholder de ikke-klæbede celler, og vask de resterende biofilm tre gange med 0,89% NaCl for at fjerne ikke-klæbende celler.
    2. Kvantificering af biomasse fra behandlede biofilm
      BEMÆRK: Trinnene er illustreret i rutediagrammet i figur 4A.
      1. Biofilmene skal vaskes på pladen og tilsættes 50 μL 1% krystalviolet vandig opløsning til hver brønd.
      2. Inkubat pladen ved stuetemperatur i 35 min.
      3. Vask de farvede brønde med MilliQ vand (tre gange) og lufttørre dem derefter i 60-90 minutter.
      4. Krystalviolet elueres fra de farvede brønde med 200 μL på 99% EtOH ved at inkubere pladen i en orbital shaker (5 min, 37 °C, 75 omdrejninger i minuttet).
      5. Der overføres en 150 μL aliquot fra hver brønd med det rensede farvestof til en anden plade, og prøvebiomassen kvantificeres (ELISA-læser 570 nm).
    3. Kvantificering af den levedygtige mikrobielle population (CFU/mL) af de behandlede biofilm
      BEMÆRK: Trinnene er illustreret i rutediagrammet i figur 4B.
      1. De vaskede biofilm fjernes fra pladen med en pipette og 200 μL NaCl 0,89% og overføres den resulterende suspension individuelt til sterile mikrorør.
      2. Der anvendes yderligere 200 μL NaCl 0,89% pr. brønd, og det overføres til det tilsvarende rør, der allerede indeholder 200 μL af den oprindelige biofilmsuspension. Udfør denne proces, indtil du når en total suspension af 1 mL biofilm pr. Original brønd.
      3. Brug en aliquot fra hvert rør til at udføre en ti gange seriel fortynding.
      4. Pod en aliquot af den ønskede fortynding i specifikke agarplader (i to eksemplarer). For eksempel 10 μL af en bestemt fortynding på blod agar plader.
      5. Inkuber agarplader (f.eks. 48 timer, 37 °C, 5% CO2), og tæl derefter kolonierne for at bestemme CFU/mL som beskrevet ovenfor.
  5. Valideringsfase for biologisk aktivitet
    1. Spyt pellicle dannelse
      1. Hydroxyapatit (HA) perler (Macro-Prep Ceramic Hydroxyapatite Type I 80 μm) anvendes som overflade til fremstilling af spytfilmen25. Disse perler overflade efterligne tandemaljen.
      2. Ha-perlerne (f.eks. 10 mg) vejes i mikrorør og steriliseres. Brug derefter adsorptionsbuffer (AB-buffer: 50 mM KCl, 1 mM KPO4, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, i dd-H2O, pH 6.5]25 indeholdende 0,1 mM phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) og 0,02% natriumazide (NaN3) til vask af perlerne.
      3. Indsamle og forberede menneskelige spyt26. Det er nødvendigt at have en godkendelse fra den institutionelle etiske komité.
      4. Der tilsættes 500 μL spyt til mikrorør og inkuberes (40 min,37 °C, 24 omdrejninger i minuttet).
      5. Fjern derefter spyt-supernatanten og vask perlerne (tre gange med AB-buffer, der indeholder PMSF og NaN3). Den sHA perler (HA perle med spyt pellicle) er nu klar til nedstrøms assays.
        BEMÆRK: Spyt er indsamlet fra raske frivillige. Efter indsamling fortyndes spyt (1: 1 v/v) med AB-buffer og centrifuge (1699 x g, 20 min, 4 °C). Steriliseres ved filtrering (polyethersulfonmembranfilter med lav binding til 0,22 μm proteiner)26. Den institutionelle etiske komité skal godkende undersøgelsen. I vores tilfælde godkendte institutionens etiske komité undersøgelsen (CAAE: 68161417.0.0000.5416).
    2. Løsrivelse af S. mutans efter vedhæftning til filmen spyt og glucaner behandlet med udvalgte ekstrakter
      1. Dyrk mikroorganismen indtil mellem-log vækstfasen, som beskrevet ovenfor.
      2. Når kulturer nåede den ønskede O.D., centrifuge (4000 × g i 20 min), vask med 0,89% NaCl-opløsning og genbrug pellet med 0,89% NaCl ved hjælp af samme oprindelige volumen af kulturmediet.
      3. Hvis du bruger en streptokokker, såsom S. mutans, sonicate kulturerne med en sonde til dechain (30 s, 7 W, tre gange). Hvis du bruger en enkeltcelleorganisme, kan dette trin springes over.
      4. Kontroller O.D. (540 nm) for at justere koncentrationen til 2 x 106 CFU/mL.
    3. Vedhæftning af S. mutans til spyt pellicle (sHA) og løsrivelse af klæbende celler
      BEMÆRK: Trinnene er illustreret i rutediagrammet i figur 5.
      1. Få sHA-prøverne som beskrevet ovenfor.
      2. Tilføj en aliquot (i eksemplet tilføjer vi 500 μL) af udvalgte behandlinger (ved testkoncentrationen; for eksempel 0,5 mg / mL) eller kontroller i mikrorør, der indeholder prøver af sHA.
      3. SHA-prøverne inkuberes med behandlinger eller kontroller (30 min., 37 °C, 24 omdr./min.) derefter vaskes perlerne tre gange med AB-buffer (indeholdende PMSF og NaN3).
      4. Tilsæt mikroorganismekulturen. I eksemplet tilføjer vi 500 μL S. mutans kultur (2 x 106 CFU/mL) til hvert mikrorør.
      5. Inkuber (1 time, 37 °C, 24 omdrejninger) og fjern derefter ubundne celler ved at vaske tre gange med AB-buffer.
      6. Genbrug hver prøve med en aliquot (i eksemplet tilføjer vi 1000 μL) AB buffer og sonicate med en sonde (30 s, 7 W).
      7. Brug en aliquot af hver suspension til en ti gange seriel fortynding til at bestemme antallet af levedygtige kolonier ved at plating på specifikke agar plader (48 h, 37 °C, 5% CO2). Derefter tælle kolonierne for at bestemme CFU / mL som beskrevet ovenfor.
        BEMÆRK: Trinnet af sonikat udføres for at løsne celler, der er klæbet til sHA.
    4. Vedhæftning af S. mutans til den oprindelige glucanmatrix (gsHA) og løsrivelse af klæbende celler
      BEMÆRK: Trinnene er illustreret i rutediagrammet i figur 6. GtfB-enzymet blev renset fra kulturens supernatant Streptococcus milleri KSB8 konstrueret til at producere GtfB. Rensningen blev udført med en kromatografikolonne, der indeholder hydroxyapatitperler ved hjælp af buffere, der indeholder to proteasehæmmere (0,1 mM PMSF og 0,02% NaN3)27,28. Derefter blev enzymet kontrolleret på acrylamidgel (SDS-PAGE) og farvet med sølvnitrat. Aliquots af enzymet blev opbevaret ved -80 °C indtil brug.
      1. Få sHA-prøverne som beskrevet ovenfor. Dernæst tilsættes en aliquot (i eksemplet tilføjer vi 500 μL) GtfB-enzym til hvert rør og inkuberes i en homogenisator (40 minutter, 37 °C, 24 omdrejninger i minuttet). Vask derefter tre gange med AB buffer (indeholder PMSF og NaN3).
      2. Der tilsættes et aliquot (f.eks. 500 μL) saccharosesubstrat (100 mmol saccharose), der indeholder behandlingerne (eller kontrol ved testkoncentrationen, f.eks. 0,5 mg/mL) til hvert mikrorør.
      3. Prøverne inkuberes i en homogenisator (4 timer, 37 °C, 24 omdrejninger i minuttet). Udfør derefter tre vaske med AB-buffer (med PMSF og NaN3) for at fjerne behandlinger og overskydende saccharose, der ikke er indarbejdet i de syntetiserede glucaner (prøver af gsHA).
      4. Tilføj en aliquot (i eksemplet tilføjer vi 500 μL) S. mutans inoculum (2 x 106 CFU / mL) til hvert mikrorør.
      5. Inkuberes i en homogenisator (1 time, 37 °C, 24 omdrejninger) og vaskes tre gange med AB buffer (med PMSF og NaN3)for at fjerne ubundne celler.
      6. Hver prøve blev genbrugt med en aliquot (f.eks. 1000 μL) AB-buffer (med PMSF og NaN3)og soniskat med en sonde for at løsne celler, der var klæbet til gsHA (30 s, 7 W).
      7. Brug en aliquot af hver suspension til en ti gange seriel fortynding til at bestemme antallet af levedygtige kolonier ved at plating på specifikke agar plader (48 h, 37 °C, 5% CO2). Derefter tælle kolonierne for at bestemme CFU / mL som beskrevet ovenfor.

4. Analyse af biologiske data

  1. Bioassays-data
    1. Indtast rådata for bioassays i et regneark. Log af mikrobiel vækst hæmning ved hver behandling som (ACFU / mL af behandlinger + 1) x log10. Derefter beregne log procent af mikrobielle vækst hæmning, sammenlignet med køretøjets kontrol ved hjælp af (Alog10 CFU / mL af behandling/ gennemsnitlig Enlog10 CFU / mL af køretøjets kontrol) x 100%.
    2. Korrekt OP af planktoniske kulturer og biomasse behandlet ved behandlinger (CE og CEF behandlede grupper) og ved køretøjskontrol (negativ kontrol). Med henblik på korrektion trækkes absorbansen af behandlede brønde fra absorbansen fra den, der opnås i brønde, der kun indeholder dyrkningsmedium (Ablank) som(A-behandlede grupper medium /Anegativt kontrolmedium) x 100%.
    3. Efter denne korrektion beregnes procentdelen af biomassehæmmingen sammenlignet med køretøjets kontrol som(A-behandlet biomasse/middelværdiA-køretøjskontrol)x 100%.
    4. Indsend de rå data, der genereres til statistisk analyse af dataene ved hjælp af specifik software.
      BEMÆRK: Fortolkningen af effektiviteten af en given behandling bestemmes ved hjælp af brudpunkter, såsom IC50/IC90. Disse værdier defineres som minimumskoncentrationen af en behandling, der kan hæmme henholdsvis 50% og 90% bakterievækst eller biofilmdannelse24. Disse parametre kan hjælpe med at fortolke dataene og danne grundlag for valg af forbindelser med bedre aktivitet13,29.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi giver et eksempel på at bruge en systematisk tilgang til at screene den biologiske aktivitet af planteekstrakter og fraktioner for at identificere potentielt aktive molekyler til mulige nye anti-caries-behandlinger: antimikrobielle og antibiofilmaktiviteter i Casearia sylvestris-ekstrakter fra forskellige brasilianske biomer mod Streptococcus mutans og Candida albicans13.

Baggrund
Komplekse interaktioner mellem specifikke orale mikroorganismer-host faktorer-kost rig på saccharose og stivelse kan modulere dannelsen af patogene biofilm og indlede en kariogen proces30,31. S. Mutans orkestrerer den patogene mængde biofilm, der er forbundet med udviklingen af caries, fordi den producerer gtfs, der er ansvarlige for exopolysaccharidersyntese, ud over dens surhedsgrad og surhed31. Derudover muliggør Gtfs vedhæftning af Candida albicans (og andre mikroorganismer), hvilket øger virulensen af biofilmen32,33. Vi gennemførte en screening af antimikrobielle og antibiofilm aktiviteter C. sylvestris blade ekstrakter og fraktioner fra forskellige brasilianske biomer, der tilhører lingua og sylvestris sorter mod S. mutans og C. albicans13. C. sylvestris ("guaçatonga") er en del af populær og traditionel brug i Brasilien, og andre lande i Sydamerika og Asien34,35. Denne plante er citeret i "National List of Medicinal Plants of Interest to SUS" (RENISUS), som indeholder 71 arter, der kan behandle sygdommene med høj forekomst i Brasilien36. Den kemiske profil af bladekstrakter af var. sylvestris præsenterer en rig fytokemisk sammensætning med rigelige diterpener35, mens phenolforbindelser (hovedsagelig flavonoider) dominerer i var. lingua18.

Vi bruger den tilgang, der er beskrevet i protokollen, til at identificere, hvilke ekstrakter og fraktioner af C. sylvetris der er mest aktive for de evaluerede mikroorganismer, og baseret på resultaterne ved hjælp af forenklede modeller vælger vi, hvilke behandlinger der testes in vitro komplekse modeller (hydroxyapatit diske, mikrokosmer)37,38. Her præsenterer vi resultaterne af screeningen af de tolv CE mod S. mutans. Fokus er at demonstrere nytten af denne tilgang til screening af naturlige forbindelser i stedet for at fortolke og diskutere dataene.

Vi indsamlede bladene af individer fra de to sorter af C. sylvestris fra tolv forskellige populationer i Brasilien, bestående af forskellige formationer af brasilianske biomer (se detaljer i Ribeiro et al. 201913). Samlingen blev udført mellem juni og september 2012 og 2013 (SisGen; Tilmeld dig #A00892A). Vi anbefaler, at der indsamles repræsentative prøver, herunder personer af forskellige kemotyper og fra forskellige biomer, for at imødegå den kemiske variation af sekundære metabolitter. Hvis det er muligt, skal der indsamles mindst 3 til 5 personer. Tidligere oplysninger om anlæggets infraspecifikke kemiske variabilitet bør også betragtes som beskrevet af Ribeiro et al. 2019 og Bueno et al. 201513,18. CE's kemiske sammensætning blev undersøgt af den kromatografiske ovenfor citerede i trin 2, og vi leverer den kemiske profil i figur 7. Analysen af den kemiske profil er afgørende for at integrere fortolkningen af data, der er opnået ved biologisk screening.

CEs blev fraktioneret i Hex, AcOEt, og MeOH fraktioner. Fraktioneringen af CE gør det muligt at forenkle blandingen for at øge koncentrationen af de potentielt aktive forbindelser og mindske mulighederne for synergismer og modsætninger mellem forbindelser. Derudover er det i mere enkle blandinger (fraktioner) lettere at opnå spektraldata for forbindelserne end i CE og at udføre dereplication analyse2. Normalt kan fraktionering ske ved væske-væske ekstraktion eller fastfaset ekstraktion patroner (SPE), der indeholder fortrinsvis vendt fase adsorbent som C18 (40 μm, 100 Å). Andre adsorbenter eller blandinger af adsorbenter kan vælges, afhængigt af de ønskede forbindelsers undersøgelsesformål eller kemiske karakter. Hvis den valgte teknik er SPE, skal patronerne tidligere aktiveres med rent organisk opløsningsmiddel (f.eks. EtOH) og konditioneres med den oprindelige elueringsmiddel. Standardiserede protokoller er tilgængelige. Læseren kan således konsultere og tilpasse dem i henhold til den påtænkte undersøgelse og plantemateriale af interesse.

De tolv CE blev opløseet med 84,15% EtOH og 15% DMSO for at opnå 6 mg/mL (stamopløsning). Før screeningstestene testede vi den fortyndingsmiddelkoncentration (køretøj), der ikke forstyrrer mikrobiel vækst. Dette trin er vigtigt, fordi det forhindrer opløsningsmidlernes antimikrobielle og antibiofilmiske handlinger i at påvirke resultaterne ved test af behandlinger. Testene kan udføres på en 96-brønds plade ved at behandle kulturen i mikroorganismen af interesse med forskellige koncentrationer af opløsningsmidler (tilknyttet og / eller isoleret). Således begyndte vi vores screening med CE på 0,5 mg / mL og køretøj i en koncentration på 7% EtOH og 1,25% DMSO.

Til screening af antimikrobiel og antibiofilmaktivitet blev 96-brøndsplader behandlet som beskrevet ovenfor. Til dette formål blev volumenet på 16,67 μL stamopløsning CE (6 mg/mL) tilsat for at teste hver CE ved koncentrationen på 0,5 mg/mL. De dannede biofilm blev behandlet som beskrevet i trin 3. Ekstrakterne, der var effektive mod S. mutans (IC50 eller 3 logs), blev brugt til at evaluere "vedhæftningsstyrken" af denne bakterie til spyt pellicle og indledende glucanmatrix, som beskrevet i trin 3.

De rå data fra biologiske analyser blev organiseret i Excel (som beskrevet i trin 4) og analyseret med passende statistisk behandling13. Skæringspunktet for at identificere ekstrakterne med den bedste aktivitet var IC50-hæmningen (3 logs). Ud fra denne parameter viste fire uddrag en positiv respons (figur 8). Kromatografiske data for disse fire ekstrakter viser samtidig tilstedeværelse af clerodane-type diterpener og glycosylerede flavonoider. Desuden omfatter de samme biome (Atlantic Forest) og sort (sylvestris). For at hjælpe med at fortolke de biologiske data sammenlignede vi den kromatografiske profil af de fire ekstrakter med den bedste aktivitet med de andre screenede ekstrakter. Sammenlignet med de andre har ekstrakterne med den bedste aktivitet en højere mængde clerodane-type diterpener og samtidig glykosylerede flavonoider. Denne observation tyder på, at det er sandsynligt, at effektiviteten af disse ekstrakter skyldes et synergistisk samspil mellem de to sekundære metabolitter, hvilket øger deres biologiske aktivitet. Det vil sige, at den kombinerede effekt af clerodane-type diterpener og glycosylerede flavonoider er større end summen af deres separate virkninger13.

For at bekræfte de data, der blev opnået i screeningen, vurderede vi løsrivelsen af S. mutans efter vedhæftning til spyt pellicle og glucaner behandlet med udvalgte CE. Assays bruger biofilmmodeller af in vitro enkeltarter til bedre at evaluere den biologiske aktivitet af de udvalgte råekstrakter og identificere mulige handlingsmål. Den første analyse kontrollerer, om de anvendte behandlinger er i stand til at hæmme overholdelsen af S. mutans til spyt pellicle, men først og fremmest, om cellerne i mikroorganismen, der har overholdt den behandlede pellicle, lettere kan fjernes fra overfladen af den mekaniske stimulus og dermed afbryde den første fase af biofilmdannelse. Tilsætningen af CE (med bedre aktivitet) under syntesen af glucaner ændrede ikke spyt pellicleen, fordi ingen CE væsentligt påvirkede fjernelsen af celler, der klæbede til spyt pellicle (Figur 9A).

Vedhæftning af den oprindelige glucanmatrix (gsHA) undersøges det, om behandlingerne kan hæmme vedhæftning af S. mutans til den oprindelige glucanmatrix. Alligevel kontrollerer denne metode, om de mikroorganismeceller, der har klæbet til de behandlede glucaner, lettere kan fjernes ved den mekaniske stimulus af overfladen og dermed afbryde fasebiofilmdannelsen. Tre CE påvirkede kvaliteten af glucaner dannet af GtfB og svækkede derfor vedhæftning af S. mutans til den oprindelige glucanmatrix (de fleste S. mutanceller blev fjernet efter vedhæftning til glucaner; Figur 9B). Vi mener, at denne adfærd er relateret til synergisme mellem de sekundære metabolitter13.

Den systematiske tilgang har hjulpet os med at identificere og vælge aktive råekstrakter for at stoppe dannelsen af kariogene biofilm. Når vi er valgt og baseret på den kromatografiske profil, har vi grundlaget for at belyse de molekylære virkningsmekanismer i komplekse modeller.

Figure 2
Figur 2: Strømningsdiagram over udvinding og fraktionering af plantematerialer. Illustrationen viser det eksperimentelle design til fremstilling af de rå ekstrakter (A) og fraktionering af rå ekstrakter (B). UAE: Ultralyd assisteret ekstraktion; SPE: Ekstraktion af fast fase. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Eksperimentelt design til vurdering af antimikrobiel aktivitet i 96-brøndsplader. Illustrationen viser behandlinger (rå ekstrakter eller fraktioner) og kontrol. Til screening af flere behandlinger skal du bruge en enkelt koncentration (mg/mL) i hver brønd. CFU/mL: kolonidannende enheder pr. milliliter. O.D.: optisk tæthed. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Eksperimentelt design til antibiofilmanalyse i 96-brøndsplader. Illustrationen viser behandlinger (rå ekstrakter og fraktioner) og kontrol. Til screening af forskellige behandlinger skal du bruge en enkelt koncentration (mg/mL) i hver brønd. I Aillustreres trinene til kvantificering af biomasse af behandlede biofilm. I Bvises trinene til bestemmelse af populationen (CFU/mL) af de behandlede biofilm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Eksperimentelt design til evaluering af vedhæftningen til spyt pellicle, efterfulgt af løsrivelse af klæbende celler. Illustrationen viser de trin, der skal udføres. Behandlinger: udvalgt på baggrund af biologisk screening. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: Eksperimentelt design til vurdering af vedhæftningen til den oprindelige glucanmatrix (gsHA) efterfulgt af løsrivelse af klæbende celler. Illustrationen viser de trin, der skal udføres. Behandlinger: udvalgt på baggrund af biologisk screening. Saccharosesubstrat: 100 mmol saccharose. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7: Mængde clerodane-type diterpener og glykosylerede flavonoider i C. sylvestrisekstrakter fra brasilianske biomer. Bogstaverne S, I og L angiver sorterne sylvestris, mellemliggende og lingua. Personlig kommunikation af Dr. Paula Carolina Pires Bueno. Dette tal er blevet ændret fra Ribeiro et al.13. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 8
Figur 8: Antimikrobiel og antibiofilm aktivitet C. sylvestris rå ekstrakter fra brasilianske biomer mod S. mutans.  A. % CFU (log10) af behandlede planktoniske celler B. % biomasse af behandlede biofilm. C. % CFU (log10) behandlet biofilm. De beskrevne data er median (spor) og interkvartil (kasser). Fejllinjerne repræsenterer maksimum- og minimumværdierne. Stjernerne angiver en statistisk signifikant forskel mellem et bestemt ekstrakt og køretøjskontrol (V), hvor: ****p ≤ 0,0001; ≤ 0,001; ** p ≤ 0,01; og *p ≤ 0,05 (Kruskal-Wallis test, efterfulgt af Dunn's flere sammenligninger test). Hver art vækstkontrol (uden behandling) er repræsenteret som Sm for S. mutans. Farverne på søjlerne i hver graf repræsenterer den sort, som ekstrakterne tilhører, idet de er i mørkegrå farve: var. sylvestris; lysegrå: var. mellemliggende og hvid: var. lingua. Dette tal er blevet ændret fra Ribeiro et al.13. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 9
Figur 9: S. mutans løsrivelse efter vedhæftning til den behandlede spyt pellicle og indledende matrix af glucaner. Data efter frigivelsen af S. mutans til den behandlede spyt pellicle og glucaner er vist i henholdsvis (A) og (B). Der var ingen forskel mellem kontrolkøretøjet (V) og de ekstrakter, der blev testet for begge analyser. Procentdelen af CFU/mL blev opnået under hensyntagen til køretøjets kontrol (V) som 100%. De beskrevne data er median (spor) og interkvartil (kasser). Fejllinjerne repræsenterer maksimum- og minimumværdierne. Stjernerne angiver en statistisk signifikant forskel mellem et bestemt ekstrakt og køretøjskontrol (V), hvor ****p = 0,0001 og **p < 0,0031 (Kruskal-Wallis-testen efterfulgt af den multiple sammenligningstest af Dunn). Vækstkontrollen er repræsenteret ved Sm for S. mutans. Farverne på grafens søjler repræsenterer den sort, som ekstrakterne tilhører, idet farven er mørkegrå til var. sylvestris. Dette tal er blevet ændret fra Ribeiro et al.13. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De største udfordringer i forbindelse med arbejdet med naturlige råekstrakter omfatter deres komplekse sammensætning og utilstrækkeligheden af klassiske biostyrede isolationsstudier. Selv om denne proces er langsom, er den effektiv og har ført til store resultater inden for NP-forskning. For at rationalisere er prioriteringsdrevne undersøgelser nødvendige for at rationalisere. Således er brugen af moderne kemiske profileringsmetoder til analyse af CE og dereplication før isolation vigtig for at karakterisere det undersøgte materiale og især nyttigt for at undgå re-isolation af kendte forbindelser med allerede beskrevet biologisk aktivitet2,15. Desuden er det nødvendigt at anskaffe flerdimensionelle data for at udføre yderligere multivariat dataanalyse for at finde de potentielle hits kandidater, der er ansvarlige for de observerede biologiske aktiviteter. Forskeren kan derfor fokusere på disse potentielle kandidaters isolation (i stor skala).

Her præsenterer vi en systematisk tilgang til bioassay-guidet identifikation (in vitro) af aktive forbindelser fra planteekstrakter og fraktioner. Denne protokol giver mulighed for en multi-target screening og analyse metode, så flere aktive komponenter kan screenes og analyseres samtidigt. Bioassays er i lille skala og med højt udbytte, er hurtige, omkostningseffektive, nemme at reproducere og forbruger færre reagenser end traditionelle metoder (f.eks. indledende isolering af interesseforbindelser)39. For enhver forskning i naturlige produkter er det altafgørende de analytiske værktøjer (for eksempel HPLC-UV, HPLC-DAD, LC-MS). For nylig er tilgangen mere strukturorienteret (kemibaseret) ved hjælp af i højere grad kraften i analytiske og belysningsplatforme (LC-HRMS og HRMS / MS, high-field NMR) og dereplication-strategier, som består i hurtig identifikation af allerede kendte molekyler. Dette trin hjælper med at forstå det kemiske profilforhold med den biologiske respons, hvilket resulterer i mere fokuseret isolation af kandidataktive metabolitter3. Der findes flere veletablerede metoder til kromatografisk analyse. For ukendte NPs, kan det undertiden være nødvendigt at udføre piloter for at finde den bedst mulige metode. For eksempel bruger vi en analytisk metode til kromatografi valideret til samtidig analyse af sekundære metabolitter produceret af to sorter af C. sylvestris13,18. Når vi vælger en kromatografimetode, foreslår vi at overveje en protokol baseret på målforbindelsen (erne) og fordele og ulemper ved alle tilgængelige metoder, der især fokuserer på deres effektivitet og selvfølgelig de samlede omkostninger, der er involveret40.

Selv om den systematiske tilgang har vist sig nyttig til hurtig screening og analyse af bioaktive kandidater i nationale konkurrenceprogrammer, er der stadig betydelige begrænsninger. For eksempel kan de visuelle og O.D. aflæsninger af biomasse og planktoniske kulturer reproducere falsk-positive resultater13,23,24. Bestemmelse af turbiditeten af kulturerne med en mikropladelæser kan svigte, når den bruges til naturlige forbindelser23,24. Disse fejl opstår, fordi (i) i nogle testorganismer er cellerne grupperet i bunden af brønden, og i andre organismer forbliver cellerne i suspension; ii) faste partikler i CE-bundfaldet og forårsager uklarhed i brøndene23,24. De nationale konkurrenceprogrammers pH-spørgsmål er en faktor, der også skal tages i betragtning. Behandlingsopløsningens pH-mængde er relateret til den kemiske sammensætning af de sekundære metabolitter og påvirker derfor den biologiske respons. Selv om pH ikke er en begrænsning, bør det vurderes med forsigtighed, afhængigt af formålet med undersøgelsen. For eksempel i biofilmmodeller på tandemaljenoverflader kan surhedsgrad forårsage uønsket emaljedemineralisering. I disse tilfælde er det nødvendigt at justere pH ved hjælp af egnede buffere. Det er derfor nødvendigt at gennemføre test for at kontrollere, om pH-justeringen påvirkede den biologiske respons, der tidligere er observeret.

De klassiske test til vurdering af nye forbindelsers aktivitet omfatter bestemmelse af den minimale hæmmende koncentration (MIC) og den mindste baktericide eller svampedræbende koncentration (MBC eller MFC)29,41. Men når målet er at screene mange planteekstrakter og fraktioner, bliver teknikken udtømmende. Bioscreening kan udføres med en enkelt koncentration af flere behandlinger (f.eks. planteekstrakter fra forskellige steder)13,42,29. I disse situationer er den systematiske tilgang en metode med høj ydeevne, der returnerer ensartede resultater på kortere arbejdstid. De behandlinger, der er valgt i den biologiske screening, kan evalueres ved hjælp af raffinerede modeller (klinisk relevante, levedygtige og reproducerbare) for at bekræfte den biologiske aktivitet. Til kontrol af cariogene biofilm bør laboratorieundersøgelser hovedsagelig fokusere på biofilm dannet på hydroxyapatit (tandemaljeerstatning) eller emaljeoverflader placeret i opretstående stilling belagt med spytspyt pellicle37. Det giver også mulighed for screening af planteprøver af forskellige sorter og biomer på en reproducerbar og hurtig måde. Medtagelsen af disse to variabler (biome og sort) er afgørende, fordi de påvirker variationen i den kemiske sammensætning af sekundære metabolitter18 og modulerer den biologiske respons. Denne systematiske tilgang kan tilpasses/ændres til anvendelser uden for oral biofilmforskning. For eksempel kan det være særligt nyttigt for andre områder relateret til biofilm ved hjælp af andre arter af interesse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklæret.

Acknowledgments

Vi udtrykker vores taknemmelighed over for Núcleo de Bioensaios, Biossíntese e Ecofisiologia de Produtos Naturais (NuBBE) fra Kemiinstituttet for UNESP, Araraquara/SP for at stille laboratorier til rådighed til udarbejdelse af plantemateriale. Vi takker også anvendt mikrobiologilaboratorium ved Institut for Dental Materials and Prosthodontics, UNESP, Araraquara/SP. Denne forskning blev støttet af et forskningstilskud fra São Paulo Research Foundation (FAPESP #2013/07600-3 til AJC) og stipendier plus faste midler (FAPESP #2017/07408-6 og FAPESP #2019/23175-7 til SMR; #2011/21440-3 og #2012/21921-4 til PCPB). Det nationale råd for videnskabelig og teknologisk udvikling ydede i samarbejde med FAPESP yderligere støtte (INCT CNPq #465637/2014-0 og FAPESP #2014/50926-0 til AJC).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well microplates  Kasvi Flat bottom
Activated carbon LABSYNTH Clean up and/or fractionation step
Analytical mill Ika LabortechniK Model A11 Basic
Blood agar plates Laborclin
Chromatographic column C18 Phenomenex Kinetex 150 × 2.1 mm, 2.6 µm, 100Â
Dimethyl sulfoxide  Sigma-Aldrich Vehicle solution
ELISA plate reader Biochrom Ez
Ethanol J. T. Baker For extraction and fractionation steps, and mobile phase composition
Ethanol Sigma-Aldrich Vehicle solution
Ethyl acetate J. T. Baker Fractionation step
GraphPad Software La Jolla GraphPad Prism7
Hexane J. T. Baker Fractionation step
Incubator Thermo Scientific
Isopropanol J. T. Baker For extraction step
Lyophilizer (a freeze dryer) Savant Modulyo
Nylon Millipore LAC 0.22 µm x 13 mm
Orbital shaker Quimis Model G816 M20
Polyamide solid phase extraction cartridge Macherey-Nagel Clean up and/or fractionation step
Silica gel Merck 40–63 μm, 60 Â
Sodium Chloride (NaCl) Synth 0,89% in water
Solid phase extraction cartridges (SPE) Macherey-Nagel Clean up and/or fractionation step
Tryptone Difco
UHPLC-DAD Dionex Ultimate 3000 RS
Ultrasonic bath UNIQUE Model USC 2800
Yeast extract Difco

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Newman, D. J., Cragg, G. M. Natural Products as Sources of New Drugs over the Nearly Four Decades from 01/1981 to 09/2019. Journal of Natural Products. 83 (3), 770-803 (2020).
  2. Wolfender, J. L., Litaudon, M., Touboul, D., Queiroz, E. F. Innovative omics-based approaches for prioritisation and targeted isolation of natural products – new strategies for drug discovery. Natural Product Report. 36 (6), 855-868 (2019).
  3. Michel, T., Halabalaki, M., Skaltsounis, A. New Concepts, Experimental Approaches, and Dereplication Strategies for the Discovery of Novel Phytoestrogens from Natural Sources. Planta Medica. 79 (7), 514-532 (2013).
  4. Jeon, J. G., Rosalen, P. L., Falsetta, M. L., Koo, H. Natural products in caries research: current (limited) knowledge, challenges and future perspective. Caries Research. 45 (3), 243-263 (2011).
  5. Tonetti, M. S., Jepsen, S., Jin, L., Otomo-Corgel, J. Impact of the global burden of periodontal diseases on health, nutrition and wellbeing of mankind: A call for global action. Journal of Clinical Periodontology. 44 (5), 456-462 (2017).
  6. Peres, M. A., et al. Oral diseases: a global public health challenge. Lancet. 394 (10194), 249-260 (2019).
  7. Bowen, W. H., Burne, R. A., Wu, H., Koo, H. Oral biofilms: pathogens, matrix, and polymicrobial interactions in microenvironments. Trends Microbiology. 26 (3), 229-242 (2018).
  8. Paes Leme, A. F., Koo, H., Bellato, C. M., Bedi, G., Cury, J. A. The role of sucrose in cariogenic dental biofilm formation--new insight. Journal of Dental Research. 85 (10), 878-887 (2006).
  9. Koo, H., Falsetta, M. L., Klein, M. I. The exopolysaccharide matrix: a virulence determinant of cariogenic biofilm. Journal of Dental Research. 92 (12), 1065-1073 (2013).
  10. Cury, J. A., de Oliveira, B. H., dos Santos, A. P., Tenuta, L. M. Are dental fluoride releasing materials clinically effective on caries control. Dental Materials. 32 (3), 323-333 (2016).
  11. Mattos-Graner, R. O., Klein, M. I., Smith, D. J. Lessons Learned from Clinical Studies: Roles of Mutans Streptococci in the Pathogenesis of Dental Caries. Current Oral Health Reports. 1, 70-78 (2014).
  12. Rocha, G. R., Florez Salamanca, E. J., de Barros, A. L., Lobo, C. I. V., Klein, M. I. Effect of tt-farnesol and myricetin on in vitro biofilm formed by Streptococcus mutans and Candida albicans. BMC Complementary and Alternative Medicine. 18 (1), 61 (2018).
  13. Ribeiro, S. M., et al. Antimicrobial and antibiofilm activities of Casearia sylvestris extracts from distinct Brazilian Biomes against Streptococcus mutans and Candida albicans. BMC Complementary and Alternative Medicine. 19 (1), 308 (2019).
  14. Pilon, A. C., et al. Metabolômica de plantas: métodos e desafios. Quimica Nova. 43 (3), 329-354 (2020).
  15. Wolfender, J. L., Nuzillard, J. M., Hooft, J. J. J., Renault, J. H., Bertrand, S. Accelerating Metabolite Identification in Natural Product Research: Toward an Ideal Combination of Liquid Chromatography-High-Resolution Tandem Mass Spectrometry and NMR Profiling, in Silico Databases, and Chemometrics. Analytical Chemistry. 91 (1), 704-742 (2019).
  16. Allard, P. M., et al. Pharmacognosy in the digital era: shifting to contextualized metabolomics. Current opinion in biotechnology. 54, 57-64 (2018).
  17. Hubert, J., Nuzillard, J., Renault, J. Dereplication strategies in natural product research: How many tools and methodologies behind the same concept. Phytochemistry Reviews. 16, 55-95 (2017).
  18. Bueno, P. C. P., Pereira, F. M. V., Torres, R. B., Cavalheiro, A. J. Development of a comprehensive method for analysing clerodane-type diterpenes and phenolic compounds from Casearia sylvestris Swartz (Salicaceae) based on ultra-high performance liquid chromatography combined with chemometric tools. Journal of separation science. 38 (10), 1649-1656 (2015).
  19. Bueno, P. C. P., Lopes, N. P. Metabolomics to Characterize Adaptive and Signaling Responses in Legume Crops under Abiotic Stresses. American Chemical Society omega. 5 (4), 1752-1763 (2020).
  20. Blaženović, I., Kind, T., Ji, J., Fiehn, O. Software tools and approaches for compound identification of LC-MS/MS data in metabolomics. Metabolites. 8 (2), 31 (2018).
  21. Eloff, J. N. Quantifying the bioactivity of plant extracts during screening and bioassay-guided fractionation. Phytomedicine: International Journal Of Phytotherapy And Phytopharmacology. 11 (4), 370-371 (2004).
  22. Rios, J. L., Recio, M. C. Medicinal plants and antimicrobial activity. Journal of Ethnopharmacology. 100 (1-2), 80-84 (2005).
  23. Eloff, J. N. A sensitive and quick microplate method to determine the minimal inhibitory concentration of plant extracts for bacteria. Planta Medica. 64, 711-714 (1998).
  24. Eloff, J. N. Avoiding pitfalls in determining antimicrobial activity of plant extracts and publishing the results. BMC Complementary and Alternative Medicine. 19 (1), 106 (2019).
  25. Klein, M. I., Xiao, J., Heydorn, A., Koo, H. An analytical tool-box for comprehensive biochemical, structural and transcriptome evaluation of oral biofilms mediated by mutans streptococci. Journal of Visualized Experiments. (47), e2512 (2011).
  26. Lemos, J. A., Abranches, J., Koo, H., Marquis, R. E., Burne, R. A. Protocols to study the physiology of oral biofilms. Methods in molecular biology. 666, 87-102 (2010).
  27. Venkitaraman, A. R., Vacca-Smith, A. M., Kopec, L. K., Bowen, W. H. Characterization of glucosyltransferase B, GtfC, and GtfD in solution and on the surface of hydroxyapatite. Journal of Dental Research. 74, 1695-1701 (1995).
  28. Vacca-Smith, A. M., Venkitaraman, A. R., Quivey, R. G. Jr, Bowen, W. H. Interactions of streptococcal glucosyltransferases with alpha-amylase and starch on the surface of saliva-coated hydroxyapatite. Archives of Oral Biology. 41, 291-298 (1996).
  29. Van Dijck, P., et al. Methodologies for in vitro and in vivo evaluation of efficacy of antifungal and antibiofilm agents and surface coatings against fungal biofilms. Microbial Cell. 5 (7), 300-326 (2018).
  30. Marsh, P. D. Are dental diseases examples of ecological catastrophes. Microbiology. 149 (2), 279-294 (2003).
  31. Bowen, W. H., Koo, H. Biology of Streptococcus mutans-derived glucosyltransferases: role in extracellular matrix formation of cariogenic biofilms. Caries Research. 45 (1), 69-86 (2011).
  32. Lobo, C. I. V., et al. Dual-species biofilms of Streptococcus mutans and Candida albicans exhibit more biomass and are mutually beneficial compared with single-species biofilms. Journal of Oral Microbioly. 11 (1), 1581520 (2019).
  33. Kim, D., et al. Candida albicans stimulates Streptococcus mutans microcolony development via crosskingdom biofilm-derived metabolites. Scientific reports. 7, 41332 (2017).
  34. Ferreira, P. M. Folk uses and pharmacological properties of Casearia sylvestris: a medicinal review. Anais da Academia Brasileira de Ciencias. 83 (4), 1373-1384 (2011).
  35. Xia, L., Guo, Q., Tu, P., Chai, X. The genus Casearia: a phytochemical and pharmacological overview. Phytochemistry Reviews. 14, 99-135 (2015).
  36. Ferreira, P. M. P., et al. Toxicological findings about an anticancer fraction with casearins described by traditional and alternative techniques as support to the Brazilian Unified Health System (SUS). Journal of Ethnopharmacol. 15, 241 (2019).
  37. Koo, H., Xiao, J., Klein, M. I., Jeon, J. G. Exopolysaccharides produced by Streptococcus mutans glucosyltransferases modulate the establishment of microcolonies within multispecies biofilms. Journal of Bacteriology. 192 (12), 3024-3032 (2010).
  38. Maske, T. T., van de Sande, F. H., Arthur, R. A., Huysmans, M. -C. D. N. J. M., Cenci, M. S. In vitro biofilm models to study dental caries: a systematic review. Biofouling. 33 (8), 661-675 (2017).
  39. Fu, Y., Luo, J., Qin, J., Yang, M. Screening techniques for the identification of bioactive compounds in natural products. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 168, 189-200 (2019).
  40. Sarker, S. D., Nahar, L. An introduction to natural products isolation. Methods in molecular biology. 864, 1-25 (2012).
  41. Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI). Performance standards for antimicrobial susceptibility testing; twenty-fifth informational supplement. Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI). , Wayne, PA. CLSI document M100-S25 (2015).
  42. Saputo, S., Faustoferri, R. C., Quivey, R. G. Jr A drug repositioning approach reveals that Streptococcus mutans is susceptible to a diverse range of established antimicrobials and nonantibiotics. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 62 (1), 01674 (2018).

Tags

Biologi Mikrobiologi biofilm naturlige produkter mutans streptokokker antimikrobielle stoffer caries lægemiddelforskning biologiske tilgange
Systematisk tilgang til identificering af nye antimikrobielle og antibiofilmmolekyler fra planternes ekstrakter og fraktioner for at forhindre caries
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ribeiro, S. M., Fratucelli, É. D.… More

Ribeiro, S. M., Fratucelli, É. D. O., Fernandes, J. M., Bueno, P. C. P., Cavalheiro, A. J., Klein, M. I. Systematic Approach to Identify Novel Antimicrobial and Antibiofilm Molecules from Plants' Extracts and Fractions to Prevent Dental Caries. J. Vis. Exp. (169), e61773, doi:10.3791/61773 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter