Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Systematische aanpak om nieuwe antimicrobiële en antibiofilmmoleculen uit plantenextracten en -fracties te identificeren om tandheelkundige cariës te voorkomen

Published: March 31, 2021 doi: 10.3791/61773
Automatic Translation
*1, *1, *2, 2,3, 2, 1
1Department of Dental Materials and Prosthodontics, School of Dentistry, São Paulo State University (UNESP), 2Department of Organic Chemistry, Institute of Chemistry, São Paulo State University (UNESP), 3Faculty of Pharmaceutical Sciences of Ribeiraão Preto (FCFRP-USP), Department of Physics and Chemistry, University of São Paulo
* These authors contributed equally

Summary

Natuurlijke producten vormen veelbelovende uitgangspunten voor de ontwikkeling van nieuwe geneesmiddelen en therapeutische middelen. Vanwege de grote chemische diversiteit is het vinden van nieuwe therapeutische verbindingen van planten echter een uitdagende en tijdrovende taak. We beschrijven een vereenvoudigde aanpak om antimicrobiële en antibiofilmmoleculen te identificeren uit plantenextracten en fracties.

Abstract

Natuurlijke producten leveren structureel verschillende stoffen, met een groot aantal biologische activiteiten. De identificatie en isolatie van actieve verbindingen van planten zijn echter een uitdaging vanwege de complexe plantenmatrix en tijdrovende isolatie- en identificatieprocedures. Daarom wordt een stapsgewijze aanpak gepresenteerd voor het screenen van natuurlijke verbindingen uit planten, inclusief de isolatie en identificatie van potentieel actieve moleculen. Het omvat de verzameling van het plantmateriaal; bereiding en fractionering van ruwe extracten; chromatografie en spectrometriebenaderingen (UHPLC-DAD-HRMS en NMR) voor analyse en identificatie van verbindingen; bioassays (antimicrobiële en antibiofilmactiviteiten; bacteriële "hechtingssterkte" aan de speeksel pellicle en initiële glucanmatrix behandeld met geselecteerde behandelingen); en gegevensanalyse. Het model is eenvoudig, reproduceerbaar en maakt het mogelijk om meerdere verbindingen, concentraties en behandelingsstappen consistent te controleren. De verkregen gegevens vormen de basis voor toekomstige studies, waaronder formuleringen met de meest actieve extracten en/of breuken, isolatie van moleculen, modellering van moleculen tot specifieke doelen in microbiële cellen en biofilms. Een doel om cariogene biofilm te beheersen, is bijvoorbeeld het remmen van de activiteit van Streptococcus mutans glucosyltransferases die de glucanen van de extracellulaire matrix synthetiseren. De remming van die enzymen voorkomt de biofilmopbouw, waardoor de virulentie afneemt.

Introduction

De vroegste modellen van geneeskunde die in samenlevingen worden gebruikt waren gebaseerd op natuurlijke producten (NPs). Sindsdien zijn mensen op zoek naar nieuwe chemicaliën in de natuur die kunnen worden omgezet in medicijnen1. Deze zoektocht veroorzaakte een voortdurende verbetering van technologieën en methoden voor etnobotanische screening1,2,3. NPs bieden een rijke bron van structureel diverse stoffen, met een breed scala aan biologische activiteiten die nuttig zijn voor het ontwikkelen van alternatieve of adjuvante therapieën. De inherente complexe plantenmatrix maakt de isolatie en identificatie van de actieve verbindingen echter tot een uitdagende en tijdrovende taak4.

Geneesmiddelen of formuleringen op basis van NPs kunnen worden gebruikt om verschillende aandoeningen die van invloed zijn op orale aandoeningen te voorkomen en/of te behandelen, waaronder tandcariës4. Tandcariës, een van de meest voorkomende chronische ziekten wereldwijd, komt voort uit de interactie van suikerrijke voeding en microbiële biofilms (tandplak) gevormd op het tandoppervlak dat leidt tot demineralisatie veroorzaakt door organische zuren afkomstig van microbiële stofwisseling, en indien niet behandeld, leidt tot tandverlies5,6. Hoewel andere micro-organismen geassocieerd kunnen wordenmet 7,is Streptococcus mutans een kritische cariogene bacterie omdat het acidogene, zure en een extracellulaire matrixbouwer is. Deze soort codeert meerdere exo-enzymen (bijv. glycosyltransferases of Gtfs) die sacharose gebruiken als substraat8 om de extracellulaire matrix te bouwen die rijk is aan exopolysachariden, die een virulentiedeterminant zijn9. Ook kan de schimmel Candida albicans de productie van die extracellulaire matrixstimuleren 7. Hoewel fluoride, toegediend in verschillende modaliteiten, de basis blijft voor het voorkomen van tandheelkundige cariës10, zijn nieuwe benaderingen nodig als hulpstoffen om de effectiviteit ervan te vergroten. Bovendien zijn de beschikbare antiplaquemodaliteiten gebaseerd op het gebruik van breedspectrummicrocidemiddelen (bv. chloorhexidine)11. Als alternatief zijn NPs potentiële therapieën voor het beheersen van biofilms en het voorkomen van tandheelkundige cariës12,13.

De verdere vooruitgang bij de ontdekking van nieuwe bioactieve verbindingen uit planten omvat noodzakelijke stappen of benaderingen zoals: i) het gebruik van betrouwbare en reproduceerbare protocollen voor bemonstering, aangezien planten vaak intraspecifieke variabiliteit vertonen; ii) de bereiding van uitgebreide extracten en hun respectieve fracties op kleine schaal; iii) de karakterisering en/of dereplicatie van hun chemische profielen dacht dat de verwerving van multidimensionale gegevens zoals GC-MS, LC-DAD-MS of NMR, bijvoorbeeld; iv) het gebruik van levensvatbare en hoogrenderende modellen om de bioactiviteit te beoordelen; v) de selectie van potentiële nieuwe treffers op basis van multivariate data-analyse of andere statistische instrumenten; vi) de isolatie en zuivering van de beoogde verbindingen of veelbelovende kandidaten uit te voeren; en vii) de validering van de gecorrespondeerde biologische activiteiten met behulp van de geïsoleerde verbindingen2,14.

Dereplicatie is het proces van het snel identificeren van bekende verbindingen in ruw extract en maakt het mogelijk om nieuwe verbindingen te onderscheiden van die welke al zijn bestudeerd. Bovendien voorkomt dit proces isolatie wanneer bioactiviteit al is beschreven voor bepaalde verbindingen, en het is vooral nuttig om "frequent hitters" te detecteren. Het is gebruikt in verschillende niet-getargeteerde workflows, variërend van belangrijke samengestelde identificatie of de versnelling van activiteitsgestuurde fractionering tot de chemische profilering van verzamelingen extracten. Het kan volledig worden geïntegreerd met metabolomische studies voor de niet-gerichte chemische profilering van CE of de gerichte identificatie van metabolieten. Dit alles leidt uiteindelijk tot het prioriteren van uittreksels vóór de isolatieprocedures1,15,16,17.

Daarom beschrijven we in dit manuscript een systematische benadering om antimicrobiële en antibiofilmmoleculen uit plantenextracten en breuken te identificeren. Het omvat vier multidisciplinaire stappen: (1) verzameling van plantaardig materiaal; (2) bereiding van ruwe extracten (CE) en fracties (CEF), gevolgd door hun analyse van het chemische profiel; 3. bioassays; en (4) biologische en chemische gegevensanalyses (figuur 1). Zo presenteren we het protocol dat is ontwikkeld om de antimicrobiële en antibiofilmactiviteiten van Casearia sylvestris-extracten en -fracties tegen Streptococcus mutans en Candida albicans13te analyseren, evenals de procedures voor de fytochemische karakterisering en gegevensanalyse. Voor de eenvoud ligt de focus hier op het demonstreren van de aanpak voor het screenen van natuurlijke verbindingen met behulp van de bacterie.

Figure 1
Figuur 1: Stroomdiagram van de Systematische Aanpak om actieve moleculen uit plantenextracten en breuken te identificeren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Inzameling van plantaardig materiaal

  1. Plantaardig materiaal
    1. Noteer de toegang tot het plantmateriaal op elektronische platforms die de toegang tot genetisch erfgoed regelen in het land waar de collectie zal plaatsvinden. Registreer u bijvoorbeeld in Brazilië bij het nationale systeem voor het beheer van genetisch erfgoed en bijbehorende traditionele kennis - SisGen (website https://sisgen.gov.br/paginas/login.aspx).
    2. Verzamel monsters van het plantenmateriaal dat van belang is (bijv. bladeren, stengels, wortels, bloemen, vruchten). Registreer of het materiaal is verzameld tijdens de reproductieve of vegetatieve fase.
    3. Noteer de verzamelingsparameters (datum, georeferencing, gemiddelde jaarlijkse temperatuur en gemiddeld vochtigheidspercentage).
    4. Identificeer de monsters nauwkeurig en een taxonomenist moet de authenticiteit bevestigen.
  2. Stabilisatie en opslag van plantenmonsters
    1. Scheid plantenorganen onmiddellijk na het innen in afzonderlijke plastic zakken of kolven.
    2. Activeer potentiële enzymatische reacties door (i) onmiddellijk in vloeibare stikstof in te vriezen, (ii) uit te drogen in een circulerende luchtoven (40 °C), of (iii) de monsters te bevriezen door lyophilisatie.
    3. Bewaar het gestabiliseerde materiaal in hermetisch afgesloten zakken bij kamertemperatuur of in een vriezer tot gebruik (-20 of -80 °C, afhankelijk van de bewaarperiode of het beoogde gebruik).
    4. Maal de monsters in een analytische molen (mes of bal, afhankelijk van het weefseltype of de beschikbaarheid) en standaardiseer de deeltjesgrootte met behulp van gestandaardiseerde zeven.
    5. Weeg de monsters afzonderlijk af voor de daaropvolgende extractiestappen.

2. Bereiding van ruwe extracten (CE) en breuken (CEF) tot chemische profielanalyse en bioassays

  1. Bereiding van ruwe extracten (CE)
    OPMERKING: De stappen worden geïllustreerd in het stroomdiagram in figuur 2A.
    1. Bereid een extractieoplosmiddel met een hydroalcoholisch mengsel (bijv. ethanol (EtOH) 70% of ternaire mengsels van water, EtOH en andere modifiers, gedefinieerd door het experimentele ontwerp van volgens eerdere rapporten).
    2. Gebruik de verhouding monstergewicht (droog gewicht, mg)/extractieoplosmiddel (ml) variërend van 50 tot 100 mg voor elke ml oplosmiddel.
    3. Gebruik batchextracties met behulp van microbuisjes voor snelle en reproduceerbare extracties.
      OPMERKING: Ten minste drie duplo's moeten op dit punt worden gebruikt om statistische analyse mogelijk te maken.
    4. Voer ultrasone extracties (VAE) uit om het snel, gemakkelijk en goedkoop te maken.
    5. Herhaal de procedure drie keer (elk 15 minuten) voor de beste efficiëntie.
    6. Decanteer na elke extractiestap het vaste residu door centrifugeren en verwijder het supernatant.
    7. Combineer de supernatanten individueel, filter en bewaar aliquots voor gelijktijdige chemische analyse en bioassays. Verwijder indien nodig het extraherend oplosmiddel onder vacuüm, stikstofstroom of lyofielisatie en registreer de weging en opbrengst.
    8. Bewaren bij -20 °C beschermd tegen licht.
      OPMERKING: Het protocol kan hier worden gepauzeerd om de CE te screenen en degenen te selecteren die de gewenste activiteit presenteren.
  2. Fractionering van ruwe extracten (CEF)
    OPMERKING: De stappen worden geïllustreerd in het stroomdiagram in figuur 2B.
    1. Gebruik cartridges met ten minste 1 g adsorbens. Als alkaloïden mogelijk aanwezig zijn in de CE, gebruik dan oplosmiddelen die 0,1% mierenzuur (FA) bevatten.
    2. Verdun het monster in het meest geschikte oplosmiddel (of oplosmiddelmengsel) om een monsteroplossing van 100 mg/ml te verkrijgen. Breng vervolgens 1 ml van de monsteroplossing over naar een vooraf geconditioneerde extractiepatronen met vaste fase - SPE (1 g adsorbens, 6 ml capaciteit).
    3. Voer de fractionering uit met behulp van ongeveer drie dode volumes van elke extractie-eluent (met een patroon van 1 g komt deze overeen met 2 ml van elk oplosmiddel). Als alkaloïden mogelijk aanwezig zijn in de CE, gebruik dan oplosmiddelen die 0,1% VAN de FA bevatten.
    4. Verzamel één fractie op eluent-samenstelling en bewaar aliquots voor gelijktijdige chemische analyse en bioassays.
    5. Verwijder het oplosmiddel onder vacuüm, stikstofstroom of lyophilisatie en registreer de weging en opbrengst.
      OPMERKING: Als de CE moeilijk op te lossen is in het oorspronkelijke elutiemengsel, verspreidt u de CE in een vaste fase (bijv. C18 of celiet) in verhouding 1:1 (w/w) voordat u het materiaal op de bovenkant van de patroon laadt.
      LET OP: Weeg de microbuisjes van tevoren af om de massaopbrengst van extracten en breuken te berekenen.
  3. Analyse van chemische profilering
    OPMERKING: Aangezien elke plantensoort geoptimaliseerde en specifieke methoden nodig heeft voor zijn chemische analyse, beschrijven we in de volgende secties de meest voorkomende analytische benaderingen die worden gebruikt om plantmaterialen te analyseren. Als praktisch voorbeeld werd een omgekeerde fase vloeibare chromatografie ontwikkeld en gevalideerd voor de gelijktijdige analyse van fenolverbindingen en clerodane-achtige diterpenen die differentieel biosynthetiseerd zijn door twee variëteiten van Casearia sylvestris Swartz (Salicaceae). Het UPLC-DAD apparaat was uitgerust met een degasser, een quaternaire pomp, een automatische sampler, een UV-Vis fotodiode array detector en een oven (zie details in Bueno et al. 201518). Vergelijkbare benaderingen die in de volgende voorbeelden worden beschreven, kunnen worden geoptimaliseerd op basis van andere plantensoorten en/of plantaardige materialen.
    1. Chromatografische analyse- en afbrekingsmogelijkheden
      1. Gebruik voor scheidingen met behulp van ultra-high-performance vloeistofchromatografie (UPLC) een C18 chromatografische kolom (bijv. 150 × 2,1 mm, 2,6 μm, 100 Å) die wordt beschermd door een compatibele voorkolom.
        OPMERKING: Afhankelijk van de plantensoort/het materiaal kunnen andere kolomfasen of chromatografische modi worden gebruikt. Conventionele HPLC kan ook worden gebruikt; in dat geval moet een geschikte chromatografische kolom worden gekozen. Om uitstekende scheidingen te bereiken, past u de chromatografische omstandigheden aan, rekening houdend met het debiet (μL/min), kolomtemperatuur (°C) en injectievolume (μL). De mobiele fase bestaat meestal uit water (A) en acetonitril of methanol (B) met behulp van lineaire of multistep-elutiegradiënten of isocratische elutie. Modifiers zoals buffers, zuren, basen of andere kunnen ook worden gebruikt.
      2. Voer de analyse van plantmateriaal (CE en/of CEF) uit en registreer alle gerelateerde gegevens, zoals spectrale gegevens (met behulp van een UV-Vis en/of, bij voorkeur, MS-detectoren), bewaartijd (min) en andere, afhankelijk van de beschikbare afbreking.
        OPMERKING: Vloeibare chromatografie (LC) wordt meestal afgebroken (gekoppeld) aan hoge resolutie massaspectrometrie (HRMS), als LC−HRMS, en wordt vaak gebruikt voor de snelle annotatie van metaboliet in CE ou CEF15.
      3. Als kwalitatieve gegevens nodig zijn en kwantitatieve gegevens nodig zijn, bereidt u kalibratiecurven zorgvuldig voor en injecteert u deze volgens hetzelfde protocol.
        OPMERKING: De ontwikkeling van de beste chromatografische omstandigheden kan worden uitgevoerd met behulp van het ontwerp van experimenten, zoals beschreven door Bueno et al. 201518, of vergelijkbare literatuur. Het is belangrijk om rekening te houden met de opname van interne normen tijdens de ontwikkeling van de methode. Ze worden zeer gewaardeerd omdat ze correcte technische afwijkingen mogelijk maken tijdens monstervoorbereiding en injecties, en verdere normalisatie voor gegevensanalyse.
  4. Univariate en multivariate data analyse
    1. Exporteer de geregistreerde chromatogrammen in een geschikt formaat (bijv. ASCII, .txt. of .csv formaat). Eén gegevensmatrix kan worden ingesteld door de chromatogrammen samen te voegen en uit te lijnen als er meerdere monsters worden geanalyseerd en vergelijkingen vereist zijn. De resulterende matrices moeten worden genormaliseerd de chromatogrammen volgens de interne standaard gebruikt.
    2. Analyseer de metabolomics-gegevens van de plant met behulp van multivariaat- en univariaatmethoden. Verken en visualiseer metabolomics-datasets door middel van de gelijktijdige analyse van meerdere variabelen met behulp van multivariate statistische methoden, waaronder niet-gecontroleerde principal component analysis (PCA) en hiërarchische clusteranalyse (HCA), of begeleide gedeeltelijke kleinste kwadratenanalyse (zoals PLS, OPLS, PLS-DA). Univariate methoden, zoals ANOVA, Student's, Tukey en Welch's t-test, zijn vooral interessant voor de nauwkeurige analyse van kwantitatieve verschillen tussen monsters19.
  5. Dereplicatie en verbindingen annotatie
    OPMERKING: Het doel van deze stap is gericht op snelle online identificatie van bekende NPs om vervelende isolatie te voorkomen die tegelijkertijd kan worden uitgevoerd naar de uni- of multivariate gegevensanalyse.
    1. Voer de identificatieniveaus van de gedetecteerde of doelverbindingen uit:
      1. Geïdentificeerde verbinding, inclusief volledige 3D-structuur en stereochemie (niveau 0);
      2. Identificatie bereikt door twee orthogonale parameters, zoals retentietijd en MS/MS-spectrum (niveau 1);
      3. Putatief geannoteerde verbindingen en samengestelde klassen (niveaus 2 en 3);
      4. Niet-geïdentificeerde of niet-geclassificeerde metabolieten die kunnen worden onderscheiden op basis van analytische gegevens (niveau 4)19,20.
    2. Karakteriseer de bekende verbindingen met behulp van de commerciële of openbare databases. Een van de belangrijkste databases kan worden benadrukt: NIST (https://www.nist.gov), Wiley (https://www.sisweb.com/software/ms/wiley.htm), MassBank (https://massbank.eu/MassBank/), GMD (http://gmd.mpimp-golm.mpg.de/), METLIN (https://metlin.scripps.edu) en de Global Natural Products Social Molecular Networking – GNPS database (https://gnps.ucsd.edu)19.
      OPMERKING: Er zijn verschillende niveaus van annotaties en ze zijn afhankelijk van de afbrekingstechniek die tijdens het onderzoek wordt gebruikt en kunnen omvatten: de hulp van op MS (of NMR) gebaseerde spectrale databases en in silico spectrale voorspellingsalgoritmen.
    3. Isolatie, zuivering en volledige identificatie van verbindingen
      OPMERKING: Als een bepaalde verbinding (waarvan de identiteit werd vermoed door de statistische methoden) volledige structurele identificatie nodig heeft, is de eerste stap om deze taak uit te voeren het isoleren en zuiveren van de gewenste verbindingen op grotere schaal. Dit kan worden bereikt door de reeds ontwikkelde protocollen op te schalen.
      1. Voer de snelle en directe isolatie van de doelverbinding(en) uit door preparatieve chromatografische technieken goed ingeburgerd en geoptimaliseerd. Semi-preparatieve HPLC met injectie met droge belasting kan worden gebruikt om de compromissen te vermijden die over het algemeen moeten worden gemaakt tussen hoge belasting en monsteroplosbaarheid1.
      2. Voltooi de volledige structurele karakterisering en identificatie van geïsoleerde verbindingen. Dit kan door de combinatie van verschillende technieken:
        1. Nucleaire magnetische resonantie (NMR);
        2. Massaspectrometrie (MS);
        3. Spectrometrische technieken in de gebieden ultraviolet (UV) en infrarood (IR) zijn ook zeer nuttig voor de karakterisering van de functionele groepen;
        4. Het gebruik van chiroptische spectroscopie zoals elektronisch en vibrationeel circulair dichroïsme (respectievelijk ECD en VCD), Raman optische activiteit (ROA) en röntgenkristallografie zijn belangrijke technieken voor absolute configuratiekarakterisering.

3. Bioassays

OPMERKING: Biologische screening: Om de potentiële bioactiviteit van CE en CEF snel te beoordelen, moet de eerste screening van natuurlijke stoffen georganiseerd en eenvoudig zijn.

  1. Voorbereiding van CE en CEF voor bioassays
    1. Reconstitueer de droge stof met de best mogelijke oplosmiddelen (die experimenteel kunnen worden bepaald). Het experimentele ontwerp21,22 definieert de voorraadoplossing en de concentratie van oplosmiddelen.
    2. Bereken de oplosmiddelconcentratie van de voorraadoplossing. Gebruik hiervoor de formule: C1 x V1 = C2 x V2, waarbij C1 de stamoplossing (mg) van CE en/of CEF vertegenwoordigt; V1 vertegenwoordigt het volume oplosmiddel; C2 is het gewicht van de CE en/of CEF; V2 is het uiteindelijke volume (ml) van de voorraadoplossing.
      OPMERKING: We hebben bijvoorbeeld 84,15% EtOH en 15% dimethylsulfoxide (DMSO) geselecteerd als oplosmiddelconcentratie van de voorraadoplossing. We bereidde de voorraadconcentratie van de CE tot 6 mg/ml en de CEF tot 1 mg/ml13. Het oplosmiddel om de CE en CEF te verdunnen hangt af van de evaluatiemethode van de biologische activiteit. Het oplosmiddel dat als voertuig wordt gebruikt, mag de biologische en toxicologische activiteit niet verstoren. Doorgaans wordt water, DMSO, EtOH of een waterig oplosmiddel op basis van EtOH gebruikt om plantenextracten of plantaardigederivatente kalmeren 4,13.
  2. Bereiding van testorganismen
    1. Reactiveren van een microbiële stam, bijvoorbeeld S. mutans UA159 op bloedagar (48 uur, 37 °C, 5% CO2), en kweek het in vloeibaar kweekmedium (bijv. tryptone-gistextract bouillon [TYE: 2,5% (w/v) tryptone met 1,5% (w/v) gistextract] met 1% glucose (w/v) (TYEg) gedurende 16 uur, 37 ° C, 5% CO2.
    2. Voer een verdunning van 1:20 uit van de initiële cultuur van het micro-organisme in hetzelfde kweekmedium (de verdunningsverhouding van de oorspronkelijke cultuur kan veranderen volgens het experimentele ontwerp).
    3. Incubeer tot het de groeifase van het midden van het logboek bereikt.
    4. Bereid het entmateriaal voor op bioassays met een gedefinieerde populatie (bijv. 2x106 kolonievormende eenheden per milliliter - CFU/ml) in TYEg voor antimicrobiële tests en TYE met 1% sacharose (w/v) (TYE's) voor biofilmstests.
      OPMERKING: De groeiomstandigheden zijn afhankelijk van het geteste micro-organisme.
  3. Antimicrobiële activiteit
    OPMERKING: De stappen zijn geïllustreerd in figuur 3.
    1. Voeg in een plaat van 96 putten een aliquot (μL) van de CE- en/of CEF-voorraadoplossing (behandelingen) toe. Het volume van de aliquot wordt bepaald door de testconcentratie, die moet worden geselecteerd op basis van eerdere studies. Gebruik bijvoorbeeld een aliquot van 16,67 μL van de stamoplossing bij 6 mg/ml om ce te testen bij de testconcentratie van 0,5 mg/ml. Gebruik voor deze berekening de formule: C1 x V1 = C2 x V2, waarbij C1 de voorraadconcentratie is, V1 het volume van de voorraadoplossing aliquot, C2 de testconcentratie en V2 het volume van de 96-putplaat (wat overeenkomt met 200 μL). In deze experimentele toestand zal de testconcentratie van de oplosmiddelen (voertuig) 7% EtOH en 1,25% DMSO bedragen.
    2. Voeg een reeks controles toe voor elke plaat: een kolom met behandelingen, zonder het entmateriaal (blanco controle per behandeling, helpen troebelheid te onderscheiden door de behandeling die zelf wordt gebruikt van microbiële groei); een kolom met voertuig en entmateriaal (verdunningsmiddel van CE of CEF of 0 mg/ml controle); een kolom met alleen het kweekmedium (kweekmediumcontrole) en een kolom met alleen entmateriaal (microbiële groeicontrole).
    3. Stel met TYEg het volume in op 100 μL. Incubeert vervolgens bijvoorbeeld 24 uur, 37 °C, 5% CO2 (afhankelijk van het geteste micro-organisme).
    4. Ent 100 μL micro-organisme-entmateriaal (1x 106 KVE/ml) in de 96-putplaat.
    5. Analyseer de bacteriegroei op troebelheid door visuele inspectie van de putten (helder of troebel). Duidelijk: betekent dat er geen visuele groei van het micro-organisme is. Troebel: betekent dat er visuele groei is van het micro-organisme.
    6. Meten van de absorptie (optische dichtheid of O.D.) van de bacteriecultuur in elke put (ELISA-lezer met 540 nm). Breng vervolgens 100 μL van de culturen over naar microbuizen die 900 μL zoutoplossing (0,89% NaCl) bevatten, meng goed door vortexing. Ga vervolgens verder met het uitvoeren van een tienvoudige seriële verdunning tot de gewenste waarde.
    7. Ent een aliquot van de gewenste verdunning in specifieke agarplaten (in tweevoud). Bijvoorbeeld 10 μL van een specifieke verdunning op bloedagarplaten.
    8. Incubeer. De omstandigheden kunnen veranderen tussen micro-organismen, bijvoorbeeld S. mutans: 48 uur, 37 °C, 5% CO2.
    9. Voer kolonietellingen uit op de platen voor latere transformatie in CFU/ml als (Eenaantal kolonies x 10n)/q. In deze formule isn gelijk aan de absolute waarde van de verdunning (0, 1, 2 of 3) en is q gelijk aan de hoeveelheid, in ml, gepijpt voor elke verdunning die op de agarplaat is geplateerd. Ook kan de CFU/ml worden geconverteerd naar logboekwaarden.
      OPMERKING: Wanneer plantenextracten aan het kweekmedium worden toegevoegd, kan neerslag van deeltjes uit de extracten optreden. Dit feit kan het moeilijk maken om de resultaten te interpreteren. Hetzelfde gebeurt wanneer een microplaatlezer de troebelheid meet, omdat in sommige gevallen cellen op de bodem van de microplaat klonteren. Bovendien kan, afhankelijk van het gebruikte extract, de kleur van plantenbladextracten het moeilijk maken om troebelheid te kwantificeren23,24. Een alternatieve methode maakt gebruik van kleurstoffen die onthullen of de microbiële cellen metabolisch actief zijn of niet24.
  4. Antibiofilm activiteit
    OPMERKING: De stappen om het effect van behandelingen op biofilmvorming te evalueren, worden geïllustreerd in figuur 4.
    1. Vorming en verwerking van biofilms
      1. Verdun behandelingen in kweekmedium (TYE's) in een plaat van 96 putten zoals beschreven in de stappen van het Antimicrobiële Activiteitsprotocol.
      2. Incubeer de plaat. In het voorbeeld met S. mutans wordt de incubatie uitgevoerd gedurende 24 uur, bij 37 °C en 5% CO2.
      3. Plaats na incubatie de platen op een orbitale shaker (5 min, 37 °C, 75 tpm) om de cellen los te maken die niet aan de biofilm zijn hecht. Gooi vervolgens het kweekmedium met de niet-aangehende cellen weg en was de resterende biofilms drie keer met 0,89% NaCl om niet-hechtende cellen teverwijderen.
    2. Kwantificering van biomassa uit behandelde biofilms
      OPMERKING: De stappen worden geïllustreerd in het stroomdiagram in figuur 4A.
      1. Houd de biofilms gewassen op de plaat en voeg 50 μL van 1% kristal violet waterige oplossing toe aan elke put.
      2. Incubeer de plaat gedurende 35 minuten op kamertemperatuur.
      3. Was de bevlekte putten met MilliQ-water (drie keer) en droog ze vervolgens 60-90 minuten aan de lucht.
      4. Eluteer het kristalviooltje uit de bevlekte putten met 200 μL van 99% EtOH door de plaat te incuberen in een orbitale shaker (5 min, 37 °C, 75 tpm).
      5. Breng een aliquot van 150 μL van elke put met de geëuteerde kleurstof over op een andere plaat en kwantificeer de monsterbiomassa (ELISA-lezer 570 nm).
    3. Kwantificering van de levensvatbare microbiële populatie (CFU/ml) van de behandelde biofilms
      OPMERKING: De stappen worden geïllustreerd in het stroomdiagram in figuur 4B.
      1. Verwijder de gewassen biofilms van de plaat met een pipet en 200 μL NaCl 0,89% en breng de resulterende suspensie afzonderlijk over op steriele microbuisjes.
      2. Gebruik een extra 200 μL NaCl 0,89% per put en breng deze over naar de bijbehorende buis, die al 200 μL van de initiële biofilmsuspensie bevat. Voer dit proces uit totdat u een totale suspensie van 1 ml biofilm per originele put bereikt.
      3. Gebruik een aliquot van elke buis om een tienvoudige seriële verdunning uit te voeren.
      4. Ent een aliquot van de gewenste verdunning in specifieke agarplaten (in tweevoud). Bijvoorbeeld 10 μL van een specifieke verdunning op bloedagarplaten.
      5. Incubeer agarplaten (bijv. 48 uur, 37 °C, 5% CO2)en tel vervolgens de kolonies om de KVE/ml te bepalen zoals hierboven beschreven.
  5. Validatiefase biologische activiteit
    1. Speeksel pellicle formatie
      1. Gebruik Hydroxyapatiet (HA) kralen (Macro-Prep Ceramic Hydroxyapatite Type I 80 μm) als oppervlak om de speekselfilm te vormen25. Deze kralen oppervlak nabootsen tandglazuur.
      2. Weeg de HA-kralen (bijv. 10 mg) in microbuisjes en steriliseer. Gebruik vervolgens adsorptiebuffer (AB-buffer: 50 mM KCl, 1 mM KPO4, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, in dd-H2O, pH 6,5]25 met 0,1 mM fenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) en 0,02% natrium azide (NaN3) om de kralen te wassen.
      3. Verzamel en bereid menselijk speeksel26. Er moet goedkeuring worden verleend aan de institutionele ethische commissie.
      4. Voeg 500 μL speeksel toe aan microbuisjes en incubeert (40 min, 37 °C, 24 tpm).
      5. Verwijder vervolgens het speekselsupernatant en was de kralen (drie keer met AB-buffer met PMSF en NaN3). De sHA kralen (HA kraal met speeksel pellicle) zijn nu klaar voor downstream testen.
        OPMERKING: Speeksel wordt verzameld bij gezonde vrijwilligers. Verdun na het verzamelen het speeksel (1: 1 v/v) met AB-buffer en centrifuge (1699 x g, 20 min, 4 °C). Steriliseren door filtratie (polyethersulfonmembraanfilter met lage binding aan 0,22 μm eiwitten)26. De Institutionele Ethische Commissie moet de studie goedkeuren. In ons geval keurde de ethische commissie van de instelling de studie goed (CAAE: 68161417.0.0000.5416).
    2. Loslating van S. mutans na hechting aan de film speeksel en glucanen behandeld met geselecteerde extracten
      1. Cultiveer het micro-organisme tot de mid-log groeifase, zoals hierboven beschreven.
      2. Wanneer culturen de gewenste O.D. bereikten, centrifuge (4000 × g gedurende 20 minuten), wassen met 0,89% NaCl-oplossing en de pellet opnieuw met 0,89% NaCl met hetzelfde beginvolume van het kweekmedium.
      3. Als u een streptokokken gebruikt, zoals S. mutans,soniceer dan de culturen met een sonde om te dechainen (30 s, 7 W, drie keer). Als u een eencellig organisme gebruikt, kan deze stap worden overgeslagen.
      4. Controleer de O.D. (540 nm) om de concentratie aan te passen op 2 x 106 KVE/ml.
    3. Hechting van S. mutans aan de speeksel pellicle (sHA) en loslating van aanhechtingscellen
      OPMERKING: De stappen worden geïllustreerd in het stroomdiagram in figuur 5.
      1. Verkrijg de sHA-monsters zoals hierboven beschreven.
      2. Voeg een aliquot toe (in het voorbeeld voegen we 500 μL toe) van geselecteerde behandelingen (bij de testconcentratie; bijvoorbeeld 0,5 mg/ml) of controles in microbuisjes die monsters van sHAbevatten .
      3. Incubeer de sHA-monsters met behandelingen of controles (30 min, 37 °C, 24 tpm); was vervolgens de kralen drie keer met AB-buffer (met PMSF en NaN3).
      4. Voeg de micro-organismencultuur toe. In het voorbeeld voegen we 500 μL S. mutans cultuur (2 x 106 CFU/ml) toe aan elke microbuis.
      5. Incubeer (1 uur, 37 °C, 24 tpm) en verwijder vervolgens niet-gebonden cellen door drie keer te wassen met AB-buffer.
      6. Resuspend elk monster met een aliquot (in het voorbeeld voegen we 1000 μL toe) ab-buffer en soniceren met een sonde (30 s, 7 W).
      7. Gebruik een aliquot van elke suspensie voor een tienvoudige seriële verdunning om het aantal levensvatbare kolonies te bepalen door op specifieke agarplaten (48 uur, 37 °C, 5% CO2) te beplaten. Tel vervolgens de kolonies om de CFU/ml te bepalen zoals hierboven beschreven.
        OPMERKING: De stap van sonicaat wordt uitgevoerd om cellen los te maken die aan sHAzijn hecht.
    4. Hechting van S. mutans aan de initiële glucanmatrix (gsHA) en onthechting van aangehechte cellen
      OPMERKING: De stappen worden geïllustreerd in het stroomdiagram in figuur 6. Het GtfB-enzym werd gezuiverd uit het kweeksupernatant Streptococcus milleri KSB8, ontworpen om GtfB te produceren. De zuivering werd uitgevoerd met een chromatografiekolom die hydroxyapatiete kralen bevat met behulp van buffers die twee proteaseremmers bevatten (0,1 mM PMSF en 0,02% NaN3)27,28. Vervolgens werd het enzym gecontroleerd op acrylamidegel (SDS-PAGE) en gekleurd met zilvernitraat. Aliquots van het enzym werden bewaard bij -80 °C tot gebruik.
      1. Verkrijg de sHA-monsters zoals hierboven beschreven. Voeg vervolgens een aliquot (in het voorbeeld voegen we 500 μL) GtfB-enzym toe aan elke buis en incubeer in een homogenisator (40 min, 37 °C, 24 tpm). Was vervolgens drie keer met AB-buffer (met PMSF en NaN3).
      2. Voeg een aliquot (bijv. 500 μL) sacharosesubstraat (100 mmol sacharose) met de behandelingen (of controles bij de testconcentratie, bijv. 0,5 mg/ml) toe aan elke microbuis.
      3. Incubeer de monsters in een homogenisator (4 uur, 37 °C, 24 tpm). Voer vervolgens drie wasbeurten uit met AB-buffer (met PMSF en NaN3) om de behandelingen en het teveel aan sacharose te verwijderen dat niet in de gesynthetiseerde glucanen is verwerkt (monsters van gsHA).
      4. Voeg aan elke microbuis een aliquot toe (in het voorbeeld voegen we 500 μL) S. mutans entmateriaal (2 x 106 KVE/ml) toe.
      5. Incubeer in een homogenisator (1 uur, 37 °C, 24 tpm) en was drie keer met AB-buffer (met PMSF en NaN3)om niet-gebonden cellen te verwijderen.
      6. Resuspendeer elk monster met een aliquot (bijv. 1000 μL) AB-buffer (met PMSF en NaN3) en soniceer met een sonde om cellen los te maken die aan gsHA (30 s, 7 W) zijn hecht.
      7. Gebruik een aliquot van elke suspensie voor een tienvoudige seriële verdunning om het aantal levensvatbare kolonies te bepalen door op specifieke agarplaten (48 uur, 37 °C, 5% CO2) te beplaten. Tel vervolgens de kolonies om de CFU/ml te bepalen zoals hierboven beschreven.

4. Biologische data-analyse

  1. Bioassays Data
    1. Voer onbewerkte gegevens voor de bioassays in een spreadsheet in. Bereken het logboek van microbiële groeiremming door elke behandeling als (eenCFU/ml behandelingen + 1) x log10. Bereken vervolgens het logpercentage van microbiële groeiremming, in vergelijking met voertuigcontrole met behulp van (Alog10 CFU/ml behandeling/gemiddelde Alog10 CFU/ml voertuigcontrole)x 100%.
    2. Correcte O.D. van planktonische culturen en biomassa behandeld door behandelingen (CE en CEF behandelde groepen) en door voertuigcontrole (negatieve controle). Voor correctie, trek de absorptie van behandelde putten af van die verkregen in putten die alleen kweekmedium (Ablank) bevatten als (Atreated groups medium /A negative controlmedium) x 100%.
    3. Bereken na deze correctie het percentage van de biomassaremming, in vergelijking met voertuigbesturing als (Abehandelde biomassa/gemiddelde Avoertuigbesturing)x 100%.
    4. Dien de onbewerkte gegevens in die zijn gegenereerd voor statistische analyse van de gegevens met behulp van specifieke software.
      OPMERKING: De interpretatie van de effectiviteit van een bepaalde behandeling wordt bepaald aan de hand van breekpunten, zoals de IC50/IC90. Deze waarden worden gedefinieerd als de minimumconcentratie van een behandeling die respectievelijk 50% en 90% van de bacteriegroei of biofilmvorming kan remmen24. Deze parameters kunnen helpen bij het interpreteren van de gegevens en een basis bieden voor het selecteren van verbindingen met betere activiteit13,29.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

We geven een voorbeeld van het gebruik van een systematische aanpak om de biologische activiteit van plantenextracten en fracties te screenen om potentieel actieve moleculen te identificeren voor mogelijke nieuwe anticariëstherapieën: antimicrobiële en antibiofilmactiviteiten van Casearia sylvestris-extracten uit verschillende Braziliaanse biomen tegen Streptococcus mutans en Candida albicans13.

Achtergrond
Complexe interacties tussen specifieke orale micro-organismen-gastheerfactoren-dieet rijk aan sacharose en zetmeel kunnen de vorming van pathogene biofilms moduleren en een cariogeen proces initiëren30,31. S. mutans orkestreert de pathogeniteit van biofilms geassocieerd met de ontwikkeling van tandheelkundige cariës omdat het Gtfs produceert die verantwoordelijk zijn voor exopolysaccharidensynthese, naast zijn acidogeniteit en aciduricity31. Bovendien maakt Gtfs de hechting van Candida albicans (en andere micro-organismen) mogelijk, waardoor de virulentie van de biofilm32,33toeneemt. We hebben een screening uitgevoerd van de antimicrobiële en antibiofilmactiviteiten van C. sylvestris bladextracten en fracties uit verschillende Braziliaanse biomen, behorend tot de lingua- en sylvestrisvariëteiten tegen S. mutans en C. albicans13. C. sylvestris ("guaçatonga") maakt deel uit van populair en traditioneel gebruik in Brazilië, en andere landen van Zuid-Amerika en Azië34,35. Deze plant wordt geciteerd in de "National List of Medicinal Plants of Interest to SUS" (RENISUS), die 71 soorten bevat die de ziekten met een hoge incidentie in Brazilië kunnen behandelen36. Het chemische profiel van bladextracten van var. sylvestris presenteert een rijke fytochemische samenstelling, met overvloedige diterpenen35, terwijl fenolverbindingen (voornamelijk flavonoïden) overheersen in var. lingua18.

We gebruiken de aanpak die in het protocol wordt beschreven om te bepalen welke extracten en fracties van C. sylvetris het meest actief zijn voor de geëvalueerde micro-organismen, en op basis van de resultaten met behulp van simplistische modellen selecteren we welke behandelingen in vitro complexe modellen (hydroxyapatietschijven, microkosmos)37,38zullen worden getest. Hier presenteren we de resultaten van de screening van de twaalf CE tegen S. mutans. De focus ligt op het aantonen van het nut van deze aanpak voor het screenen van natuurlijke verbindingen in plaats van het interpreteren en bespreken van de gegevens.

We verzamelden de bladeren van individuen uit de twee variëteiten van C. sylvestris uit twaalf verschillende populaties in Brazilië, bestaande uit verschillende formaties van Braziliaanse biomen (zie details in Ribeiro et al. 201913). De inzameling vond plaats tussen juni en september 2012 en 2013 (SisGen; Registreer #A00892A). We raden aan representatieve monsters te verzamelen, waaronder personen van verschillende chemotypen en uit verschillende biomen, om de chemische variabiliteit van secundaire metabolieten aan te pakken. Indien beschikbaar, moeten ten minste 3 tot 5 personen worden verzameld. Eerdere informatie over de specifieke chemische variabiliteit van installaties moet ook worden overwogen zoals beschreven door Ribeiro et al. 2019 en Bueno et al. 201513,18. De chemische samenstelling van de CE is onderzocht door de chromatografische geciteerd in stap 2 en we geven het chemische profiel in figuur 7. De analyse van het chemische profiel is essentieel om de interpretatie van de verkregen gegevens in biologische screening te integreren.

De CE's werden gefractioneerd in Hex-, AcOEt- en MeOH-fracties. De fractionering van CE maakt de vereenvoudiging van het mengsel mogelijk om de concentratie van de potentieel actieve verbindingen te verhogen en de mogelijkheden van synergismen en antagonismen tussen verbindingen te verminderen. Bovendien is het in eenvoudigere mengsels (fracties) gemakkelijker om spectrale gegevens van de verbindingen te verkrijgen dan in CE en om dereplicatieanalyse uit te voeren2. Meestal kan fractionering worden gedaan door vloeistof-vloeistofextractie of vaste-fase extractiepatronen (SPE) die bij voorkeur omgekeerd-fase adsorbens zoals C18 (40 μm, 100 Å) bevatten. Afhankelijk van de studiedoeleinden of de chemische aard van de gewenste verbindingen kan worden gekozen voor andere adsorbenten of mengsels van adsorbenten. Als de gekozen techniek de SPE is, moeten de cartridges eerder worden geactiveerd met zuiver organisch oplosmiddel (bijv. EtOH) en worden geconditioneerd met het oorspronkelijke eluent. Gestandaardiseerde protocollen zijn beschikbaar. Zo kan de lezer ze raadplegen en aanpassen aan de beoogde studie en plantaardig materiaal dat van belang is.

De twaalf CE werden oplosbaar gemaakt met 84,15% EtOH en 15% DMSO om 6 mg/ml (voorraadoplossing) te bereiken. Voorafgaand aan de screeningstests hebben we de verdunningsconcentratie (voertuig) getest die de microbiële groei niet verstoort. Deze stap is belangrijk omdat het voorkomt dat de antimicrobiële en antibiofilmacties van de oplosmiddelen de resultaten beïnvloeden bij het testen van behandelingen. De tests kunnen worden uitgevoerd op een plaat met 96 putten door de cultuur van het micro-organisme van belang te behandelen met verschillende concentraties oplosmiddelen (geassocieerd en/of geïsoleerd). Zo zijn we begonnen met onze screening met CE bij 0,5 mg/ml en voertuig bij een concentratie van 7% EtOH en 1,25% DMSO.

Voor het screenen van antimicrobiële en antibiofilmactiviteit werden 96-putplaten behandeld zoals hierboven beschreven. Hiertoe werd het volume van 16,67 μL stamoplossing CE (6 mg/ml) toegevoegd om elke CE te testen bij een concentratie van 0,5 mg/ml. De gevormde biofilms werden verwerkt zoals beschreven in stap 3. De extracten effectief tegen S. mutans (IC50 of 3 logs) werden gebruikt om de "hechtingssterkte" van deze bacterie te evalueren op de speeksel pellicle en initiële glucan matrix, zoals beschreven in Stap 3.

De ruwe gegevens verkregen uit biologische tests werden georganiseerd in Excel (zoals beschreven in stap 4) en geanalyseerd met de juiste statistische behandeling13. Het cutoff-punt om de extracten met de beste activiteit te identificeren was de IC50-remming (3 logboeken). Uit deze parameter toonden vier extracten een gunstige respons (figuur 8). De chromatografische gegevens van deze vier extracten tonen de gelijktijdige aanwezigheid van clerodane-achtige diterpenen en geglycosyleerde flavonoïden. Daarnaast bevatten ze hetzelfde bioom (Atlantic Forest) en variëteit(sylvestris). Om de biologische gegevens te helpen interpreteren, vergeleken we het chromatografische profiel van de vier extracten met de beste activiteit met de andere gescreende extracten. In vergelijking met de andere hebben de extracten met de beste activiteit een hogere hoeveelheid clerodane-achtige diterpenen en tegelijkertijd geglycosyleerde flavonoïden. Deze observatie geeft aan dat het waarschijnlijk is dat de effectiviteit van deze extracten te wijten is aan een synergetische interactie tussen de twee secundaire metabolieten, waardoor hun biologische activiteit toeneemt. Dat wil gezegd, het gecombineerde effect van clerodane-achtige diterpenen en geglycosyleerde flavonoïden is groter dan de som van hun afzonderlijke effecten13.

Om de verkregen gegevens in de screening te bevestigen, evalueerden we het losmaken van S. mutans na hechting aan de speeksel pellicle en glucanen behandeld met geselecteerde CE. De tests maken gebruik van biofilmmodellen van in vitro enkelsoorten om de biologische activiteit van de geselecteerde ruwe extracten beter te evalueren en mogelijke actiedoelen te identificeren. De eerste analyse controleert of de gebruikte behandelingen in staat zijn om de hechting van S. mutans aan de speeksel pellicle te remmen, maar vooral of de cellen van het micro-organisme die zich aan de behandelde pellicle hebben gehouden, gemakkelijker van het oppervlak kunnen worden verwijderd door de mechanische stimulus, waardoor de eerste fase van biofilmvorming wordt onderbroken. De toevoeging van CE (met betere activiteit) tijdens de synthese van glucanen heeft de speeksel pellicle niet gewijzigd omdat geen ENKELE CE de verwijdering van cellen die aan de speeksel pellicle waren hecht aanzienlijk beïnvloedde (figuur 9A).

De hechting van de initiële glucanmatrix (gsHA) onderzoekt of de behandelingen de hechting van S. mutans aan de initiële glucanmatrix kunnen remmen. Toch controleert deze methodologie of de micro-organismencellen die zich aan de behandelde glucanen hebben gehouden, gemakkelijker door de mechanische stimulus van het oppervlak kunnen worden verwijderd, waardoor de vorming van biofilm in het stadium wordt onderbroken. Drie CE beïnvloedden de kwaliteit van glucanen gevormd door GtfB en verzwakten daarom de hechting van S. mutans aan de initiële glucanmatrix (de meeste S. mutanscellen werden verwijderd na hechting voor glucanen; Figuur 9B). Wij geloven dat dit gedrag gerelateerd is aan het synergisme tussen de secundaire metabolieten13.

De Systematische Aanpak heeft ons geholpen bij het identificeren en selecteren van actieve ruwe extracten om de vorming van cariogene biofilms te stoppen. Eenmaal geselecteerd en gebaseerd op het chromatografische profiel, hebben we de basis voor het ophelderen van de moleculaire werkingsmechanismen in complexe modellen.

Figure 2
Figuur 2: Stroomdiagram van de extractie en fractionering van het plantmateriaal. De illustratie toont het experimentele ontwerp voor de bereiding van de ruwe extracten (A) en fractionering van ruwe extracten (B). VAE: Ultrasound Assisted Extraction; SPE: Extractie in vaste fase. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Experimenteel ontwerp voor de beoordeling van antimicrobiële activiteit in platen van 96 putten. De illustratie toont behandelingen (ruwe uittreksels of breuken) en controles. Gebruik voor de screening van meerdere behandelingen één concentratie (mg/ml) in elke put. CFU/ml: kolonievormende eenheden per milliliter. O.D.: optische dichtheid. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Experimenteel ontwerp voor antibiofilmtest in platen van 96 putten. De illustratie toont behandelingen (ruwe extracten en breuken) en controles. Gebruik voor de screening van verschillende behandelingen één concentratie (mg/ml) in elke put. In Aworden de stappen geïllustreerd om biomassa van behandelde biofilms te kwantificeren. In Bworden de stappen getoond om de populatie (CFU/ml) van de behandelde biofilms te bepalen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: Experimenteel ontwerp om de hechting aan de speeksel pellicle te evalueren, gevolgd door het losmaken van aanhechtingscellen. In de afbeelding ziet u de stappen die moeten worden uitgevoerd. Behandelingen: geselecteerd op basis van biologische screening. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 6
Figuur 6: Experimenteel ontwerp om de hechting op de oorspronkelijke glucanmatrix (gsHA) te evalueren, gevolgd door het losmaken van aanhechtingscellen. In de afbeelding ziet u de stappen die moeten worden uitgevoerd. Behandelingen: geselecteerd op basis van biologische screening. Sacharose substraat: 100 mmol sacharose. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 7
Figuur 7: Hoeveelheid clerodane-achtige diterpenen en geglycosyleerde flavonoïden in C. sylvestris-extracten uit Braziliaanse biomen. De letters S,I en L geven respectievelijk de variëteiten sylvestris, intermediate en linguaaan. Persoonlijke communicatie door Dr. Paula Carolina Pires Bueno. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van Ribeiro et al.13. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 8
Figuur 8: Antimicrobiële en antibiofilmactiviteit van C. sylvestris ruwe extracten uit Braziliaanse biomen tegen S. mutans.  A. % KVE (log10) van behandelde planktonische cellen; B. % biomassa van behandelde biofilms. C. % KVE (log10) van behandelde biofilm. De beschreven gegevens zijn mediaan (sporen) en interkwartiel (vakken). De foutbalken vertegenwoordigen de maximum- en minimumwaarden. De sterretjes duiden op een statistisch significant verschil tussen een specifiek extract en een voertuigbesturing (V), waarbij: ****p ≤ 0,0001; p ≤ 0,001; ** p ≤ 0,01; en *p ≤ 0,05 (Kruskal-Wallis-test, gevolgd door Dunns meervoudige vergelijkingstest). Elke soort groeicontrole (zonder behandeling) wordt vertegenwoordigd als Sm voor S. mutans. De kleuren van de staven in elke grafiek vertegenwoordigen de variëteit waartoe de extracten behoren, zijnde, in donkergrijze kleur: var. sylvestris; lichtgrijs: var. tussen- en wit: var. lingua. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van Ribeiro et al.13. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 9
Figuur 9: S. mutans detachement na hechting aan de behandelde speeksel pellicle en initiële matrix van glucanen. Post-release gegevens van S. mutans aan de behandelde speeksel pellicle en glucanen zijn weergegeven in (A) en (B), respectievelijk. Er was geen verschil tussen het controlevoertuig (V) en de extracten die voor beide analyses werden getest. Het percentage CFU/ml werd verkregen, rekening houdend met de voertuigbesturing (V) als 100%. De beschreven gegevens zijn mediaan (sporen) en interkwartiel (vakken). De foutbalken vertegenwoordigen de maximum- en minimumwaarden. De sterretjes duiden op een statistisch significant verschil van een specifiek extract ten opzichte van voertuigbesturing (V), waarbij ****p = 0,0001 en **p < 0,0031 (Kruskal-Wallis-test, gevolgd door de meervoudige vergelijkingstest van Dunn). De groeicontrole wordt vertegenwoordigd door Sm voor S. mutans. De kleuren van de balken van de grafiek vertegenwoordigen de variëteit waartoe de extracten behoren, namelijk de kleur donkergrijs tot var. sylvestris. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van Ribeiro et al.13. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De belangrijkste uitdagingen in verband met het werk met natuurlijke ruwe extracten omvatten hun complexe samenstelling en de ontoereikendheden van klassieke biogeleide isolatiestudies. Hoewel dit proces traag is, is het effectief en heeft het geleid tot belangrijke bevindingen in NP-onderzoek. Om te rationaliseren zijn prioriteringsgestuurde studies nodig om te rationaliseren. Zo is het gebruik van moderne chemische profileringsbenaderingen voor de analyse van CE en dereplicatie vóór isolatie belangrijk om het bestudeerde materiaal te karakteriseren en vooral nuttig om herisolatie van bekende verbindingen met reeds beschreven biologische activiteit2,15te voorkomen . Bovendien is het verkrijgen van multidimensionale gegevens noodzakelijk om verdere multivariate data-analyse uit te voeren om de potentiële hits kandidaten te vinden die verantwoordelijk zijn voor de waargenomen biologische activiteiten. Hierdoor kan de onderzoeker zich richten op het isolement (op grote schaal) van deze potentiële kandidaten.

Hier presenteren we een systematische aanpak voor bioassay-geleide identificatie (in vitro) van actieve verbindingen uit plantenextracten en fracties. Dit protocol maakt een multi-target screening- en analysemethode mogelijk, zodat meerdere actieve componenten tegelijkertijd kunnen worden gescreend en geanalyseerd. De bioassays zijn kleinschalig en van hoge opbrengst, zijn snel, kosteneffectief, gemakkelijk te reproduceren en verbruiken minder reagentia dan traditionele methoden (bijv. initiële isolatie van interessant verbindingen)39. Voor elk onderzoek naar natuurlijke producten is het van het grootste belang de analytische tools (bijvoorbeeld HPLC-UV, HPLC-DAD, LC-MS). De laatste tijd is de aanpak meer structuurgericht (op chemie gebaseerd) waarbij in hogere mate gebruik wordt gemaakt van de kracht van analytische en ophelderingsplatforms (LC-HRMS en HRMS/MS, high-field NMR) en dereplicatiestrategieën, die bestaan uit de snelle identificatie van reeds bekende moleculen. Deze stap helpt om de chemische profielrelatie met de biologische respons te begrijpen, wat resulteert in meer gerichte isolatie van kandidaat-actieve metabolieten3. Er zijn verschillende gevestigde methoden voor chromatografische analyse. Voor onbekende NPs kan het soms nodig zijn om pilots uit te voeren om de best mogelijke methode te vinden. We gebruiken bijvoorbeeld een analytische methode van chromatografie gevalideerd voor de gelijktijdige analyse van secundaire metabolieten geproduceerd door twee variëteiten van C. sylvestris13,18. Bij het kiezen van een chromatografiemethode stellen we voor om een protocol te overwegen op basis van de doelverbinding(en), en de voor- en nadelen van alle beschikbare methoden, met name gericht op hun efficiëntie en natuurlijk de totale kosten40.

Hoewel de systematische aanpak nuttig is gebleken voor het snel screenen en analyseren van bioactieve kandidaten in NPs, blijven er belangrijke beperkingen bestaan. De visuele en O.D. metingen van de biomassa en planktonische culturen kunnen bijvoorbeeld vals-positieve resultaten reproduceren13,23,24. Het bepalen van de troebelheid van de culturen met een microplaatlezer kan mislukken bij gebruik voor natuurlijke verbindingen23,24. Deze storingen treden op omdat (i) in sommige testorganismen de cellen op de bodem van de put zijn geclusterd en in andere organismen de cellen in suspensie blijven; ii) vaste deeltjes die in het CE-neerslag aanwezig zijn en troebelheid in de putten veroorzaken23,24. De pH van NPs is een factor die ook in overweging moet worden genomen. De pH van de behandelingsoplossing is gerelateerd aan de chemische samenstelling van de secundaire metabolieten en beïnvloedt daarom de biologische respons. Hoewel pH geen beperking is, moet deze met voorzichtigheid worden beoordeeld, afhankelijk van het doel van het onderzoek. In biofilmmodellen op tandglazuuroppervlakken kan zuurgraad bijvoorbeeld ongewenste demineralisatie van het glazuur veroorzaken. In deze gevallen is het noodzakelijk om de pH aan te passen met behulp van geschikte buffers. Daarom moeten tests worden uitgevoerd om na te gaan of de pH-aanpassing van invloed is op de eerder waargenomen biologische respons.

De klassieke tests om de activiteit van nieuwe verbindingen te beoordelen omvatten het bepalen van de minimale remmende concentratie (MIC) en de minimale bacteriedodende of fungicide concentratie (MBC of MFC)29,41. Wanneer het echter doel is om veel plantenextracten en breuken te screenen, wordt de techniek uitputtend. Bioscreening kan worden uitgevoerd met één concentratie van meerdere behandelingen (bv. plantenextracten van verschillende plaatsen)13,42,29. Voor deze situaties is de systematische aanpak een methode met hoge prestaties die consistente resultaten oplevert in minder werktijd. De behandelingen die in de biologische screening worden geselecteerd, kunnen worden geëvalueerd met behulp van verfijnde modellen (klinisch relevant, levensvatbaar en reproduceerbaar) om de biologische activiteit te bevestigen. Voor de controle van cariogene biofilm moeten laboratoriumstudies voornamelijk gericht zijn op biofilms die worden gevormd op hydroxyapatiet (tandglazuurvervanger) of emailleoppervlakken die rechtop zijn geplaatst, bedekt met een speeksel pellicle37. Het maakt het ook mogelijk om plantenmonsters van verschillende variëteiten en biomen op een reproduceerbare en snelle manier te screenen. De opname van deze twee variabelen (bioom en variëteit) is van vitaal belang omdat ze de variabiliteit van de chemische samenstelling van secundaire metabolieten18 beïnvloeden en de biologische respons moduleren. Deze systematische aanpak kan worden aangepast/aangepast voor toepassingen buiten oraal biofilmonderzoek. Het kan bijvoorbeeld bijzonder nuttig zijn voor andere gebieden die verband houden met biofilm, met behulp van andere soorten die van belang zijn.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Geen belangenconflicten aangegeven.

Acknowledgments

We betuigen onze dank aan Núcleo de Bioensaios, Biossíntese e Ecofisiologia de Produtos Naturais (NuBBE) van het Chemie Instituut van UNESP, Araraquara/SP voor het leveren van de laboratoria voor het bereiden van plantaardig materiaal. We danken ook het Applied Microbiology Laboratory van de afdeling Tandmaterialen en Prosthodontie, UNESP, Araraquara/SP. Dit onderzoek werd ondersteund door een onderzoeksbeurs van de São Paulo Research Foundation (FAPESP #2013/07600–3 aan AJC) en beurzen plus overheadfondsen (FAPESP #2017/07408–6 en FAPESP #2019/23175-7 aan SMR; #2011/21440–3 en #2012/21921–4 naar PCPB). De Nationale Raad voor Wetenschappelijke en Technologische Ontwikkeling in samenwerking met fapesp verleende aanvullende steun (INCT CNPq #465637/2014–0 en FAPESP #2014/50926–0 aan AJC).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well microplates  Kasvi Flat bottom
Activated carbon LABSYNTH Clean up and/or fractionation step
Analytical mill Ika LabortechniK Model A11 Basic
Blood agar plates Laborclin
Chromatographic column C18 Phenomenex Kinetex 150 × 2.1 mm, 2.6 µm, 100Â
Dimethyl sulfoxide  Sigma-Aldrich Vehicle solution
ELISA plate reader Biochrom Ez
Ethanol J. T. Baker For extraction and fractionation steps, and mobile phase composition
Ethanol Sigma-Aldrich Vehicle solution
Ethyl acetate J. T. Baker Fractionation step
GraphPad Software La Jolla GraphPad Prism7
Hexane J. T. Baker Fractionation step
Incubator Thermo Scientific
Isopropanol J. T. Baker For extraction step
Lyophilizer (a freeze dryer) Savant Modulyo
Nylon Millipore LAC 0.22 µm x 13 mm
Orbital shaker Quimis Model G816 M20
Polyamide solid phase extraction cartridge Macherey-Nagel Clean up and/or fractionation step
Silica gel Merck 40–63 μm, 60 Â
Sodium Chloride (NaCl) Synth 0,89% in water
Solid phase extraction cartridges (SPE) Macherey-Nagel Clean up and/or fractionation step
Tryptone Difco
UHPLC-DAD Dionex Ultimate 3000 RS
Ultrasonic bath UNIQUE Model USC 2800
Yeast extract Difco

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Newman, D. J., Cragg, G. M. Natural Products as Sources of New Drugs over the Nearly Four Decades from 01/1981 to 09/2019. Journal of Natural Products. 83 (3), 770-803 (2020).
  2. Wolfender, J. L., Litaudon, M., Touboul, D., Queiroz, E. F. Innovative omics-based approaches for prioritisation and targeted isolation of natural products – new strategies for drug discovery. Natural Product Report. 36 (6), 855-868 (2019).
  3. Michel, T., Halabalaki, M., Skaltsounis, A. New Concepts, Experimental Approaches, and Dereplication Strategies for the Discovery of Novel Phytoestrogens from Natural Sources. Planta Medica. 79 (7), 514-532 (2013).
  4. Jeon, J. G., Rosalen, P. L., Falsetta, M. L., Koo, H. Natural products in caries research: current (limited) knowledge, challenges and future perspective. Caries Research. 45 (3), 243-263 (2011).
  5. Tonetti, M. S., Jepsen, S., Jin, L., Otomo-Corgel, J. Impact of the global burden of periodontal diseases on health, nutrition and wellbeing of mankind: A call for global action. Journal of Clinical Periodontology. 44 (5), 456-462 (2017).
  6. Peres, M. A., et al. Oral diseases: a global public health challenge. Lancet. 394 (10194), 249-260 (2019).
  7. Bowen, W. H., Burne, R. A., Wu, H., Koo, H. Oral biofilms: pathogens, matrix, and polymicrobial interactions in microenvironments. Trends Microbiology. 26 (3), 229-242 (2018).
  8. Paes Leme, A. F., Koo, H., Bellato, C. M., Bedi, G., Cury, J. A. The role of sucrose in cariogenic dental biofilm formation--new insight. Journal of Dental Research. 85 (10), 878-887 (2006).
  9. Koo, H., Falsetta, M. L., Klein, M. I. The exopolysaccharide matrix: a virulence determinant of cariogenic biofilm. Journal of Dental Research. 92 (12), 1065-1073 (2013).
  10. Cury, J. A., de Oliveira, B. H., dos Santos, A. P., Tenuta, L. M. Are dental fluoride releasing materials clinically effective on caries control. Dental Materials. 32 (3), 323-333 (2016).
  11. Mattos-Graner, R. O., Klein, M. I., Smith, D. J. Lessons Learned from Clinical Studies: Roles of Mutans Streptococci in the Pathogenesis of Dental Caries. Current Oral Health Reports. 1, 70-78 (2014).
  12. Rocha, G. R., Florez Salamanca, E. J., de Barros, A. L., Lobo, C. I. V., Klein, M. I. Effect of tt-farnesol and myricetin on in vitro biofilm formed by Streptococcus mutans and Candida albicans. BMC Complementary and Alternative Medicine. 18 (1), 61 (2018).
  13. Ribeiro, S. M., et al. Antimicrobial and antibiofilm activities of Casearia sylvestris extracts from distinct Brazilian Biomes against Streptococcus mutans and Candida albicans. BMC Complementary and Alternative Medicine. 19 (1), 308 (2019).
  14. Pilon, A. C., et al. Metabolômica de plantas: métodos e desafios. Quimica Nova. 43 (3), 329-354 (2020).
  15. Wolfender, J. L., Nuzillard, J. M., Hooft, J. J. J., Renault, J. H., Bertrand, S. Accelerating Metabolite Identification in Natural Product Research: Toward an Ideal Combination of Liquid Chromatography-High-Resolution Tandem Mass Spectrometry and NMR Profiling, in Silico Databases, and Chemometrics. Analytical Chemistry. 91 (1), 704-742 (2019).
  16. Allard, P. M., et al. Pharmacognosy in the digital era: shifting to contextualized metabolomics. Current opinion in biotechnology. 54, 57-64 (2018).
  17. Hubert, J., Nuzillard, J., Renault, J. Dereplication strategies in natural product research: How many tools and methodologies behind the same concept. Phytochemistry Reviews. 16, 55-95 (2017).
  18. Bueno, P. C. P., Pereira, F. M. V., Torres, R. B., Cavalheiro, A. J. Development of a comprehensive method for analysing clerodane-type diterpenes and phenolic compounds from Casearia sylvestris Swartz (Salicaceae) based on ultra-high performance liquid chromatography combined with chemometric tools. Journal of separation science. 38 (10), 1649-1656 (2015).
  19. Bueno, P. C. P., Lopes, N. P. Metabolomics to Characterize Adaptive and Signaling Responses in Legume Crops under Abiotic Stresses. American Chemical Society omega. 5 (4), 1752-1763 (2020).
  20. Blaženović, I., Kind, T., Ji, J., Fiehn, O. Software tools and approaches for compound identification of LC-MS/MS data in metabolomics. Metabolites. 8 (2), 31 (2018).
  21. Eloff, J. N. Quantifying the bioactivity of plant extracts during screening and bioassay-guided fractionation. Phytomedicine: International Journal Of Phytotherapy And Phytopharmacology. 11 (4), 370-371 (2004).
  22. Rios, J. L., Recio, M. C. Medicinal plants and antimicrobial activity. Journal of Ethnopharmacology. 100 (1-2), 80-84 (2005).
  23. Eloff, J. N. A sensitive and quick microplate method to determine the minimal inhibitory concentration of plant extracts for bacteria. Planta Medica. 64, 711-714 (1998).
  24. Eloff, J. N. Avoiding pitfalls in determining antimicrobial activity of plant extracts and publishing the results. BMC Complementary and Alternative Medicine. 19 (1), 106 (2019).
  25. Klein, M. I., Xiao, J., Heydorn, A., Koo, H. An analytical tool-box for comprehensive biochemical, structural and transcriptome evaluation of oral biofilms mediated by mutans streptococci. Journal of Visualized Experiments. (47), e2512 (2011).
  26. Lemos, J. A., Abranches, J., Koo, H., Marquis, R. E., Burne, R. A. Protocols to study the physiology of oral biofilms. Methods in molecular biology. 666, 87-102 (2010).
  27. Venkitaraman, A. R., Vacca-Smith, A. M., Kopec, L. K., Bowen, W. H. Characterization of glucosyltransferase B, GtfC, and GtfD in solution and on the surface of hydroxyapatite. Journal of Dental Research. 74, 1695-1701 (1995).
  28. Vacca-Smith, A. M., Venkitaraman, A. R., Quivey, R. G. Jr, Bowen, W. H. Interactions of streptococcal glucosyltransferases with alpha-amylase and starch on the surface of saliva-coated hydroxyapatite. Archives of Oral Biology. 41, 291-298 (1996).
  29. Van Dijck, P., et al. Methodologies for in vitro and in vivo evaluation of efficacy of antifungal and antibiofilm agents and surface coatings against fungal biofilms. Microbial Cell. 5 (7), 300-326 (2018).
  30. Marsh, P. D. Are dental diseases examples of ecological catastrophes. Microbiology. 149 (2), 279-294 (2003).
  31. Bowen, W. H., Koo, H. Biology of Streptococcus mutans-derived glucosyltransferases: role in extracellular matrix formation of cariogenic biofilms. Caries Research. 45 (1), 69-86 (2011).
  32. Lobo, C. I. V., et al. Dual-species biofilms of Streptococcus mutans and Candida albicans exhibit more biomass and are mutually beneficial compared with single-species biofilms. Journal of Oral Microbioly. 11 (1), 1581520 (2019).
  33. Kim, D., et al. Candida albicans stimulates Streptococcus mutans microcolony development via crosskingdom biofilm-derived metabolites. Scientific reports. 7, 41332 (2017).
  34. Ferreira, P. M. Folk uses and pharmacological properties of Casearia sylvestris: a medicinal review. Anais da Academia Brasileira de Ciencias. 83 (4), 1373-1384 (2011).
  35. Xia, L., Guo, Q., Tu, P., Chai, X. The genus Casearia: a phytochemical and pharmacological overview. Phytochemistry Reviews. 14, 99-135 (2015).
  36. Ferreira, P. M. P., et al. Toxicological findings about an anticancer fraction with casearins described by traditional and alternative techniques as support to the Brazilian Unified Health System (SUS). Journal of Ethnopharmacol. 15, 241 (2019).
  37. Koo, H., Xiao, J., Klein, M. I., Jeon, J. G. Exopolysaccharides produced by Streptococcus mutans glucosyltransferases modulate the establishment of microcolonies within multispecies biofilms. Journal of Bacteriology. 192 (12), 3024-3032 (2010).
  38. Maske, T. T., van de Sande, F. H., Arthur, R. A., Huysmans, M. -C. D. N. J. M., Cenci, M. S. In vitro biofilm models to study dental caries: a systematic review. Biofouling. 33 (8), 661-675 (2017).
  39. Fu, Y., Luo, J., Qin, J., Yang, M. Screening techniques for the identification of bioactive compounds in natural products. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 168, 189-200 (2019).
  40. Sarker, S. D., Nahar, L. An introduction to natural products isolation. Methods in molecular biology. 864, 1-25 (2012).
  41. Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI). Performance standards for antimicrobial susceptibility testing; twenty-fifth informational supplement. Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI). , Wayne, PA. CLSI document M100-S25 (2015).
  42. Saputo, S., Faustoferri, R. C., Quivey, R. G. Jr A drug repositioning approach reveals that Streptococcus mutans is susceptible to a diverse range of established antimicrobials and nonantibiotics. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 62 (1), 01674 (2018).

Tags

Biologie Microbiologie biofilm natuurlijke producten mutans streptokokken antimicrobiële stoffen tandcariës medicijnontdekking biologische benaderingen
Systematische aanpak om nieuwe antimicrobiële en antibiofilmmoleculen uit plantenextracten en -fracties te identificeren om tandheelkundige cariës te voorkomen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ribeiro, S. M., Fratucelli, É. D.… More

Ribeiro, S. M., Fratucelli, É. D. O., Fernandes, J. M., Bueno, P. C. P., Cavalheiro, A. J., Klein, M. I. Systematic Approach to Identify Novel Antimicrobial and Antibiofilm Molecules from Plants' Extracts and Fractions to Prevent Dental Caries. J. Vis. Exp. (169), e61773, doi:10.3791/61773 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter