Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Systematisk tilnærming til å identifisere nye antimikrobielle og antibiofilmmolekyler fra planters ekstrakter og fraksjoner for å forhindre tannkaries

Published: March 31, 2021 doi: 10.3791/61773
Automatic Translation
*1, *1, *2, 2,3, 2, 1
1Department of Dental Materials and Prosthodontics, School of Dentistry, São Paulo State University (UNESP), 2Department of Organic Chemistry, Institute of Chemistry, São Paulo State University (UNESP), 3Faculty of Pharmaceutical Sciences of Ribeiraão Preto (FCFRP-USP), Department of Physics and Chemistry, University of São Paulo
* These authors contributed equally

Summary

Naturlige produkter representerer lovende utgangspunkt for utvikling av nye legemidler og terapeutiske midler. Men på grunn av det høye kjemiske mangfoldet er det utfordrende og tidkrevende å finne nye terapeutiske forbindelser fra planter. Vi beskriver en forenklet tilnærming for å identifisere antimikrobielle og antibiofilmmolekyler fra planteekstrakter og fraksjoner.

Abstract

Naturlige produkter gir strukturelt forskjellige stoffer, med en myriade av biologiske aktiviteter. Identifisering og isolering av aktive forbindelser fra planter er imidlertid utfordrende på grunn av den komplekse plantematrisen og tidkrevende isolasjons- og identifikasjonsprosedyrer. Derfor presenteres en trinnvis tilnærming for screening av naturlige forbindelser fra planter, inkludert isolasjon og identifisering av potensielt aktive molekyler. Det inkluderer innsamling av plantematerialet; forberedelse og fraksjonering av råoljeekstrakter; kromatografi og spektrometri (UHPLC-DAD-HRMS og NMR) tilnærminger for analyse og forbindelser identifikasjon; bioanalyser (antimikrobielle og antibiofilmaktiviteter; bakteriell "vedheftsstyrke" til spyttpellet og innledende glukanmatrise behandlet med utvalgte behandlinger); og dataanalyse. Modellen er enkel, reproduserbar, og tillater høy gjennomstrømning screening av flere forbindelser, konsentrasjoner, og behandlingstrinn kan konsekvent kontrolleres. Dataene som er innhentet, danner grunnlaget for fremtidige studier, inkludert formuleringer med de mest aktive ekstraktene og/eller brøkene, isolering av molekyler, modellering av molekyler til spesifikke mål i mikrobielle celler og biofilmer. For eksempel er et mål å kontrollere karogen biofilm å hemme aktiviteten til Streptococcus mutans glukotransferaser som syntetiserer den ekstracellulære matrisens glukaner. Hemming av disse enzymene forhindrer biofilmoppbygging, noe som reduserer dens virulens.

Introduction

De tidligste modellene av medisin som brukes i samfunn var basert på naturlige produkter (NPer). Siden da har mennesker lett etter nye kjemikalier i naturen som kan forvandles til narkotika1. Dette søket forårsaket en kontinuerlig forbedring av teknologier og metoder for etnobotanisk screening1,2,3. NPs tilbyr en rik kilde til strukturelt varierte stoffer, med et bredt spekter av biologiske aktiviteter som er nyttige for å utvikle alternative eller adjuvante terapier. Den iboende komplekse plantematrisen gjør imidlertid isolasjon og identifisering av de aktive forbindelsene til en utfordrende og tidkrevende oppgave4.

NPs-baserte legemidler eller formuleringer kan brukes til å forebygge og/eller behandle flere tilstander som påvirker orale, inkluderttannkaries 4. Dental karies, en av de mest utbredte kroniske sykdommene globalt, stammer fra samspillet mellom sukkerrikt kosthold og mikrobielle biofilmer (tannplakk) dannet på tannoverflaten som fører til demineralisering forårsaket av organiske syrer avledet fra mikrobiell metabolisme, og hvis ikke behandlet, fører til tanntap5,6. Selv om andre mikroorganismer kan være forbundet7, er Streptococcus mutans en kritisk karogen bakterie fordi den er surogen, sur og en ekstracellulær matrisebygger. Denne arten koder flere eksoenzymer (f.eks. glykosyltransferaser eller Gtfs) som bruker sukrose som substrat8 for å bygge den ekstracellulære matrisen rik på eksopolysakkarider, som er en virulensdeterminant9. Også sopp Candida albicans kan drive opp produksjonen av den ekstracellulærematrisen 7. Riktignok fluor, administrert i ulike modaliteter, er fortsatt grunnlaget for å forebygge tannkaries10, nye tilnærminger er nødvendig som adjuvans for å øke effektiviteten. I tillegg er tilgjengelige anti-plakk modaliteter basert på bruk av bredspektrede mikrobicider (f.eks klorhexidin)11. Som et alternativ er NPs potensielle terapier for å kontrollere biofilmer og forebygge tannkaries12,13.

Det videre fremskrittet i oppdagelsen av nye bioaktive forbindelser fra planter inkluderer nødvendige trinn eller tilnærminger som: (i) bruk av pålitelige og reproduserbare protokoller for prøvetaking, med tanke på at planter ofte viser intraspesifikk variasjon; (ii) utarbeidelsen av omfattende ekstrakter og deres respektive fraksjoner i liten skala; (iii) karakterisering og/eller deplisering av deres kjemiske profiler trodde oppkjøpet av flerdimensjonale data som GC-MS, LC-DAD-MS eller NMR, for eksempel; (iv) bruk av levedyktige og høykapasitetsmodeller for å vurdere bioaktivitet; (v) valg av potensielle nye treff basert på multivariatdataanalyse eller andre statistiske verktøy; (vi) for å utføre isolasjon og rensing av målrettede forbindelser eller lovende kandidater; og (vii) valideringen av de korresponderte biologiske aktivitetene ved hjelp av de isolerteforbindelsene 2,14.

Dereplisering er prosessen med raskt å identifisere kjente forbindelser i råoljeekstrakt og tillater differensiering av nye forbindelser fra de som allerede er studert. Dessuten forhindrer denne prosessen isolasjon når bioaktivitet allerede er beskrevet for visse forbindelser, og det er spesielt nyttig å oppdage "hyppige hitters". Den har blitt brukt i forskjellige untargeted arbeidsflyter som spenner fra store sammensatte identifikasjon eller akselerasjon av aktivitetsstyrt fraksjonering opp til kjemisk profilering av samlinger av ekstrakter. Det kan integreres fullt ut med metabolomiske studier for umålrettet kjemisk profilering av CE eller målrettet identifisering av metabolitter. Alt dette fører til slutt til å prioritere utdrag før isolasjonsprosedyrene1,15,16,17.

Derfor beskriver vi i det nåværende manuskriptet en systematisk tilnærming for å identifisere antimikrobielle og antibiofilmmolekyler fra planteekstrakter og fraksjoner. Det inkluderer fire tverrfaglige trinn: (1) samling av plantemateriale; (2) fremstilling av råoljeekstrakter (CE) og fraksjoner (CEF), etterfulgt av deres kjemiske profilanalyse; (3) bioanalyse; og (4) biologiske og kjemiske dataanalyser (figur 1). Dermed presenterer vi protokollen utviklet for å analysere antimikrobielle og antibiofilmaktiviteter av Casearia sylvestris ekstrakter og fraksjoner mot Streptococcus mutans og Candida albicans13, samt prosedyrene for fytokjemisk karakterisering og dataanalyse. For enkelhets skyld er fokuset her å demonstrere tilnærmingen for screening av naturlige forbindelser ved hjelp av bakterien.

Figure 1
Figur 1: Flytkart over den systematiske tilnærmingen for å identifisere aktive molekyler fra planteekstrakter og fraksjoner. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Innsamling av plantemateriale

  1. Plantemateriale
    1. Registrer tilgangen til plantematerialet på elektroniske plattformer som regulerer tilgangen til genetisk arv i landet der samlingen vil finne sted. For eksempel, i Brasil, registrer deg hos Det nasjonale systemet for styring av genetisk arv og tilhørende tradisjonell kunnskap - SisGen (https://sisgen.gov.br/paginas/login.aspx).
    2. Samle prøver av plantematerialet av interesse (f.eks blader, stengler, røtter, blomster, frukt). Registrer om materialet ble samlet inn under reproduksjons- eller vegetativ fase.
    3. Registrer oppsamlingsparametrene (dato, georeferencing, gjennomsnittlig årlig temperatur og gjennomsnittlig fuktighetsprosent).
    4. Identifiser prøvene nøyaktig, og en taksonomist må bekrefte ektheten.
  2. Stabilisering og lagring av planteprøver
    1. Separate planteorganer i individuelle plastposer eller flasker umiddelbart etter samlinger.
    2. Inaktivere potensielle enzymatiske reaksjoner ved (i) frysing umiddelbart i flytende nitrogen, (ii) dehydrerende i en sirkulerende luftovn (40 °C), eller (iii) frysetørke prøvene ved lyofilisering.
    3. Oppbevar det stabiliserte materialet i hermetisk forseglede poser ved romtemperatur eller i en fryser til bruk (-20 eller -80 °C, avhengig av oppbevaringsperioden eller tiltenkt bruk).
    4. Grind prøvene i en analytisk mølle (kniv eller ball, avhengig av vevstype eller tilgjengelighet) og standardiser partikkelstørrelse ved hjelp av standardiserte sikter.
    5. Vei prøvene individuelt for de påfølgende ekstraksjonstrinnene.

2. Utarbeidelse av råoljeekstrakter (CE) og fraksjoner (CEF) til kjemisk profilanalyse og bioanalyser

  1. Utarbeidelse av råoljeekstrakter (CE)
    MERK: Trinnene er illustrert i flytdiagrammet i figur 2A.
    1. Forbered et ekstraksjonsoppløsende væske med en hydroalkoholblanding (f.eks. etanol (EtOH) 70% eller ternære blandinger av vann, EtOH og andre modifikatorer, definert av eksperimentell design av i henhold til tidligere rapporter).
    2. Bruk forholdet prøvevekt (tørr vekt, mg)/ ekstraksjon løsemiddel (ml) varierer fra 50 til 100 mg for hver ml oppløsningsvæske.
    3. For raske og reproduserbare ekstraksjoner, bruk batchekstraksjoner ved hjelp av mikrorør.
      MERK: Minst tre replikeringer bør brukes på dette tidspunktet for å tillate statistisk analyse.
    4. Utfør ultralydassisterte ekstraksjoner (UAE) for å gjøre det raskt, enkelt og billig.
    5. Gjenta prosedyren tre ganger (15 min hver) for best mulig effektivitet.
    6. Etter hvert ekstraksjonstrinn dekanterer du de faste rester ved sentrifugering og fjerner supernatanten.
    7. Kombiner supernativa individuelt, filtrer og lagre aliquots for samtidig kjemisk analyse og bioanalyser. Fjern eventuelt ekstraheringsmiddelet under vakuum, nitrogenstrøm eller lyofilisering, og registrer veie- og utbyttet.
    8. Oppbevares ved -20 °C beskyttet mot lys.
      MERK: Protokollen kan settes på pause her for å vise CE og velge de som presenterer ønsket aktivitet.
  2. Fraksjonering av råoljeekstrakter (CEF)
    MERK: Trinnene er illustrert i flytdiagrammet i figur 2B.
    1. Bruk patroner med minst 1 g adsorbent. Hvis alkaloider potensielt finnes i CE, bruk løsemidler som inneholder 0,1 % av maursyre (FA).
    2. Fortynn prøven i det mest egnede løsningsmiddelet (eller løsningsmiddelblandingen) for å oppnå en 100 mg/ml prøveløsning. Deretter overfører du 1 ml av prøveløsningen til en forhåndsbetinget en solidfaseekstraksjonskassetter - SPE (1 g adsorbent, 6 ml kapasitet).
    3. Utfør fraksjoneringen ved hjelp av rundt tre døde volumer av hver ekstraksjonsekant (til en sylinderampulle på 1 g, det tilsvarer 2 ml av hvert oppløsningsmiddel). Hvis alkaloider er potensielt til stede i CE, bruk løsemidler som inneholder 0,1% av FA.
    4. Samle en brøkdel av eluent sammensetning og lagre aliquots for samtidig kjemisk analyse og bioanalyser.
    5. Fjern oppløsningsvæsken under vakuum, nitrogenstrøm eller lyofilisering og registrer veiing og utbytte.
      MERK: Hvis CE er vanskelig å oppløse i den første elutionblandingen, disperger CE i en fast fase (f.eks. C18 eller celite) i 1:1 (w/w) før du legger materialet på toppen av sylinderampullen.
      FORSIKTIG: Vei mikrorørene på forhånd for å beregne masseutbyttet av ekstrakter og brøker.
  3. Analyse av kjemisk profilering
    MERK: Tatt i bruk at hver planteart krever optimaliserte og spesifikke metoder for kjemisk analyse, beskriver vi i de følgende avsnittene de vanligste analytiske tilnærmingene som brukes til å analysere plantematerialer. Som et praktisk eksempel ble en omvendt fase flytende kromatografi utviklet og validert for samtidig analyse av fenoliske forbindelser og clerodane-type diterpenes differensial biosyntetisert av to varianter av Casearia sylvestris Swartz (Salicaceae). UPLC-DAD-apparatet var utstyrt med en avgasser, en kvartær pumpe, en automatisk sampler, en UV-Vis fotodiodearraydetektor og en ovn (se detaljer i Bueno et al. 201518). Lignende tilnærminger beskrevet i følgende eksempler kan optimaliseres i henhold til andre plantearter og/ eller plantematerialer.
    1. Kromatografisk analyse og orddelingsmuligheter
      1. For separasjoner ved hjelp av ultrahøy ytelse flytende kromatografi (UPLC), bruk en C18 kromatografisk kolonne (f.eks. 150 × 2,1 mm, 2,6 μm, 100 Å) beskyttet av en kompatibel forkolonne.
        MERK: Andre kolonnefaser eller kromatografiske moduser kan brukes avhengig av plantearter/materiale. Konvensjonell HPLC kan også brukes; i så fall må en passende kromatografisk kolonne velges. For å oppnå utmerkede separasjoner, juster kromatografiske forhold med tanke på strømningshastigheten (μL/min), kolonnetemperatur (°C) og injeksjonsvolum (μL). Den mobile fasen består vanligvis av vann (A) og acetonitril eller metanol (B) ved hjelp av lineære eller flertrinns elution gradienter eller isokratisk elitning. Modifikatorer som buffere, syrer, baser eller andre kan også brukes.
      2. Utfør anleggsmaterialeanalysen (CE og/eller CEF) og registrer alle relaterte data, for eksempel spektraldata (ved hjelp av uv-vis og/eller fortrinnsvis MS-detektorer), oppbevaringstid (min) og andre, avhengig av tilgjengelig orddeling.
        MERK: Flytende kromatografi (LC) brukes vanligvis bindestrek (kombinert) med høyoppløselig massespektrometri (HRMS), som LC-HRMS, og brukes vanligvis til rask merknad av metabolitten i CE ou CEF15.
      3. Hvis kvalitative data er nødvendig og kvantitative data er nødvendig, klargjør og injiserer kalibreringskurver nøye, etter samme protokoll.
        MERK: Utviklingen av de beste kromatografiske forholdene kan utføres ved hjelp av utformingen av eksperimenter, som beskrevet av Bueno et al. 201518, eller lignende litteratur. Det er viktig å vurdere inkludering av interne standarder under metodeutviklingen. De er veldig verdsatt siden de tillater riktige tekniske avvik under prøveforberedelse og injeksjoner, og videre normalisering for dataanalyse.
  4. Dataanalyse for univariate og multivariat
    1. Eksporter de registrerte kromatatogrammene i et passende format (f.eks. ASCII, .txt. eller .csv format). En enkelt datamatrise kan angis ved å bli med og justere kromatogrammene hvis flere prøver analyseres, og sammenligninger er nødvendige. De resulterende matrisene må normaliseres kromatogrammene i henhold til den interne standarden som brukes.
    2. Analyser plantemetaboliene ved hjelp av multivariat- og univariatmetoder. Utforsk og visualiser metabolomikkdatasett gjennom samtidig analyse av flere variabler ved hjelp av multivariat statistiske metoder, inkludert uovervåket hovedkomponentanalyse (PCA) og hierarkisk klyngeanalyse (HCA), eller overvåket delvis minst kvadratanalyse (for eksempel PLS, OPLS, PLS-DA). Univariate metoder, som ANOVA, Student's, Tukey og Welch's t-test, er spesielt interessant for presis analyse av kvantitative forskjeller mellom prøver19.
  5. Dereplisering og forbindelser merknad
    MERK: Målet med dette trinnet er dedikert til rask on-line identifisering av kjente NPer for å unngå kjedelig isolasjon som kan utføres samtidig til uni- eller multivariate dataanalyse.
    1. Utfør identifikasjonsnivåene for de oppdagede eller målforbindelsene:
      1. Identifisert forbindelse, inkludert full 3D-struktur og stereokjemi (nivå 0);
      2. Identifikasjon oppnådd ved to ortogonale parametere, for eksempel oppbevaringstid og MS/MS-spektrum (nivå 1);
      3. Antatt kommenterte forbindelser og sammensatte klasser (nivå 2 og 3);
      4. Uidentifiserte eller uklassifiserte metabolitter som kan differensieres basert på analytiske data (nivå 4)19,20.
    2. Karakterisere kjente forbindelser ved hjelp av kommersielle eller offentlige databaser. Blant de viktigste databasene kan den fremheves: NIST (https://www.nist.gov), Wiley (https://www.sisweb.com/software/ms/wiley.htm), MassBank (https://massbank.eu/MassBank/), GMD (http://gmd.mpimp-golm.mpg.de/), METLIN (https://metlin.scripps.edu) og Global Natural Products Social Molecular Networking - GNPS database (https://gnps.ucsd.edu)19.
      MERK: Det er forskjellige nivåer av merknader, og de er avhengige av bindestrekteknikken som brukes under studien, og kan omfatte: hjelp fra MS- (eller NMR) baserte spektrale databaser, og i silico spektrale prediksjonsalgoritmer.
    3. Isolasjon, rensing og fullstendig sammensatt identifikasjon
      MERK: Hvis en gitt forbindelse (hvis identitet ble mistenkt av de statistiske metodene) trenger fullstendig strukturell identifikasjon, er det første trinnet for å oppnå denne oppgaven å isolere og rense de ønskede forbindelsene i større skala. Det kan oppnås ved å skalere opp de allerede utviklede protokollene.
      1. Utfør rask og direkte isolering av målforbindelsen (e) ved å forberede kromatografiske teknikker godt etablert og optimalisert. Semi-forberedende HPLC med tørrlastinjeksjon kan brukes til å unngå kompromisser som vanligvis må gjøres mellom høy belastning og prøveløselighet1.
      2. Oppnå fullstendig strukturell karakterisering og identifisering av isolerte forbindelser. Dette kan gjøres gjennom kombinasjonen av ulike teknikker:
        1. Kjernefysisk magnetisk resonans (NMR);
        2. Massespektrometri (MS);
        3. Spektrometriske teknikker i ultrafiolette (UV) og infrarøde (IR) regioner er også svært nyttige for karakterisering av funksjonelle grupper;
        4. Bruken av kiroptical spektroskopi som elektronisk og vibrasjonssirkelsirisk diktoisme (henholdsvis ECD og VCD), Raman optisk aktivitet (ROA) og røntgenkrystallografi er viktige teknikker for absolutt konfigurasjonskarakterisering.

3. Bioanalyser

MERK: Biologisk screening: For raskt å vurdere CE og Cefs potensielle bioaktivitet, bør den første screeningen av naturlige stoffer organiseres og grei.

  1. Utarbeidelse av CE og CEF for bioanalyser
    1. Rekonstituer det tørre stoffet med best mulig løsemidler (som kan bestemmes eksperimentelt). Den eksperimentelledesign 21,22 definere lagerløsningen og konsentrasjonen av løsemidler.
    2. Beregn oppløsningsvæskekonsentrasjonen av lagerløsningen. For å gjøre dette, bruk formelen: C1 x V1 = C2 x V2, hvor C1 representerer lagerløsningen (mg) av CE og / eller CEF; V1 representerer volumet av løsemiddel; C2 er vekten av CE og / eller CEF; V2 er det endelige volumet (ml) av lagerløsningen.
      MERK: For eksempel valgte vi 84,15% EtOH og 15% dimetylsulfoksid (DMSO) som løsemiddelkonsentrasjonen av lagerløsningen. Vi forberedte lagerkonsentrasjonen av CE til 6 mg/ml og CEF til 1 mg/ml13. Oppløsningsvæsken for å fortynne CE og CEF vil avhenge av metoden for evaluering av den biologiske aktiviteten. Oppløsningsvæsken som brukes som kjøretøy må ikke forstyrre biologisk og toksikologisk aktivitet. Vanligvis brukes vann, DMSO, EtOH eller et vandig løsningsmiddel basert på EtOH til å løse planteekstrakter eller plantederivater4,13.
  2. Fremstilling av testorganismer
    1. Reaktiver en mikrobiell stamme, for eksempel S. mutans UA159 på blod agar (48 h, 37 °C, 5 % CO2), og kultur det i flytende kultur medium (f.eks. tryptone-gjær ekstrakt kjøttkraft [TYE: 2,5% (w / v) tryptone med 1,5% (w / v) gjær ekstrakt] som inneholder 1% glukose (w / v) (TYEg) for 16 h, 37 ° C, 5% CO2.
    2. Utfør en 1:20 fortynning av mikroorganismens første kultur i samme kulturmedium (fortynningsforholdet til den første kulturen kan endres i henhold til eksperimentell design).
    3. Inkuber til den når midtloggvekstfasen.
    4. Forbered inokulumet for bioanalyser med en definert populasjon (f.eks. 2x106 kolonidannende enheter per milliliter - CFU/ml) i TYEg for antimikrobielle analyser og TYE med 1 % sukrose (w/v) (TYEer) for biofilmanalyser.
      MERK: Vekstforholdene vil avhenge av mikroorganismen som er testet.
  3. Antimikrobiell aktivitet
    MERK: Trinnene er illustrert i figur 3.
    1. I en 96-brønns plate, tilsett en aliquot (μL) av CE og / eller CEF lagerløsning (behandlinger). Volumet av aliquot er definert av testkonsentrasjonen, som må velges basert på tidligere studier. For eksempel, for å teste CE ved 0,5 mg / ml testkonsentrasjon, bruk en 16,67 μL aliquot av lageroppløsningen ved 6 mg / ml. For denne beregningen, bruk formelen: C1 x V1 = C2 x V2, hvor C1 er lagerkonsentrasjonen, V1 er volumet av lagerløsningen aliquot, C2 er testkonsentrasjonen, og V2 er volumet av 96-brønnplaten (som tilsvarer 200 μL). I denne eksperimentelle tilstanden vil testkonsentrasjonen av løsemidlene (kjøretøy) være 7% EtOH og 1,25% DMSO.
    2. Inkluder et sett med kontroller for hver plate: en kolonne med behandlinger, uten inokulen (tom kontroll per behandling, bidra til å skille turbiditet ved behandlingen som brukes seg fra mikrobiell vekst); en kolonne med kjøretøy og inokuleum (fortynningsmiddel for CE eller CEF eller 0 mg/ml kontroll); en kolonne med bare kulturmediet (kultur medium kontroll) og en kolonne med bare inoculum (mikrobiell vekstkontroll).
    3. Juster volumet til 100 μL ved hjelp av TYEg. Deretter inkubere, for eksempel 24 h, 37 °C, 5% CO2 (avhengig av mikroorganismen som er testet).
    4. Inokuler 100 μL mikroorganisme inokuleum (1x 106 CFU/ml) i 96-brønnsplaten.
    5. Analyser bakterieveksten i henhold til turbiditet ved visuell inspeksjon av brønnene (klar eller overskyet). Klart: betyr at det ikke er noen visuell vekst av mikroorganismen. Skyet: betyr at det er visuell vekst av mikroorganismen.
    6. Måling av absorpsjonen (optisk tetthet eller O.D.) av bakteriekulturen i hver brønn (ELISA-leser ved hjelp av 540 nm). Deretter overfører du 100 μL av kulturene til mikrorør som inneholder 900 μL saltoppløsning (0,89 % NaCl), bland godt ved å virvle. Deretter fortsetter du å utføre en ti ganger seriell fortynning til ønsket verdi.
    7. Inokuler en aliquot av ønsket fortynning i spesifikke agarplater (i duplikat). For eksempel, 10 μL av en bestemt fortynning på blod agar plater.
    8. Ruge. Forholdene kan endres mellom mikroorganismer, for eksempel S. mutaner:48 h, 37 °C, 5 % CO2.
    9. Utfør kolonitellinger på platene for senere transformasjon til CFU / ml som(En rekke kolonier x 10n)/q. I denne formelen ern lik den absolutte verdien av fortynningen (0, 1, 2 eller 3), og q tilsvarer mengden, i ml, pipetted for hver fortynning belagt på agarplaten. CFU/ml kan også konverteres til loggverdier.
      MERK: Når planteekstrakter legges til kulturmediet, kan det oppstå nedbør av partikler fra ekstraktene. Dette faktum kan gjøre det vanskelig å tolke resultatene. Det samme skjer når en mikroplateleser måler turbiditeten som i noen tilfeller klumper seg på bunnen av mikroplaten. I tillegg, avhengig av ekstraktet som brukes, kan fargen på plantebladekstrakter gjøre det vanskelig å kvantifisere turbiditet23,24. En alternativ metode bruker fargestoffer som avslører om mikrobielle celler er metabolsk aktive eller ikke24.
  4. Antibiofilm aktivitet
    MERK: Trinnene for å evaluere effekten av behandlinger på biofilmdannelse er illustrert i figur 4.
    1. Dannelse og behandling av biofilmer
      1. Fortynn behandlinger i kulturmedium (TYE) i en 96-brønnsplate som beskrevet i trinnene i antimikrobiell aktivitetsprotokoll.
      2. Inkuber platen. I eksemplet med S. mutaner utføres inkubasjonen i løpet av 24 timer, ved 37 °C og 5 % CO2.
      3. Etter inkubasjon, plasser platene på en orbital shaker (5 min, 37 °C, 75 rpm) for å løsne cellene som ikke følges biofilmen. Deretter kaster du kulturmediet som inneholder de ikke-tilfredse cellene, og vask de resterende biofilmene tre ganger med 0,89% NaCl for å fjerne ikke-tilhengerceller.
    2. Kvantifisering av biomasse fra behandlede biofilmer
      MERK: Trinnene er illustrert i flytdiagrammet i figur 4A.
      1. Hold biofilmene vasket på platen og tilsett 50 μL av 1% krystallfiolett vandig løsning til hver brønn.
      2. Inkuber platen ved romtemperatur i 35 min.
      3. Vask de beisede brønnene med MilliQ-vann (tre ganger) og lufttørk dem i 60-90 min.
      4. Elute krystallfiolett fra de beisede brønnene med 200 μL på 99% EtOH ved å inkubere platen i en orbital shaker (5 min, 37 ° C, 75 rpm).
      5. Overfør en 150 μL aliquot fra hver brønn med eluted fargestoff til en annen plate og kvantifisere prøvebiomassen (ELISA-leser 570 nm).
    3. Kvantifisering av den levedyktige mikrobielle populasjonen (CFU/ml) av de behandlede biofilmene
      MERK: Trinnene er illustrert i flytdiagrammet i figur 4B.
      1. Fjern de vasket biofilmene fra platen med en pipette og 200 μL NaCl 0,89% og overfør den resulterende suspensjonen individuelt for å sterilisere mikrorør.
      2. Bruk ytterligere 200 μL NaCl 0,89 % per brønn og overfør den til tilsvarende rør, som allerede inneholder 200 μL av den første biofilmfjæringen. Utfør denne prosessen til du når en total suspensjon på 1 ml biofilm per original brønn.
      3. Bruk en aliquot fra hvert rør for å utføre en ti ganger seriell fortynning.
      4. Inokuler en aliquot av ønsket fortynning i spesifikke agarplater (i duplikat). For eksempel, 10 μL av en bestemt fortynning på blod agar plater.
      5. Inkuber agarplater (f.eks. 48 timer, 37 °C, 5 % CO2),og tell deretter koloniene for å bestemme CFU/ml som beskrevet ovenfor.
  5. Valideringsfase for biologisk aktivitet
    1. Spyttpelletdannelse
      1. Bruk Hydroksyapatitt (HA) perler (Macro-Prep Keramisk Hydroxyapatite Type I 80 μm) som en overflate for å danne spyttfilmen25. Disse perlene overflaten etterligne dental emalje.
      2. Vei HA-perlene (f.eks. 10 mg) i mikrorør og steriliser. Deretter bruker du adsorpsjonsbuffer (AB-buffer: 50 mM KCl, 1 mM KPO4, 1 mM CaCl2,1 mM MgCl2, i dd-H2O, pH 6,5]25 inneholder 0,1 mM fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF) og 0,02% natriumazid (NaN3) for å vaske perlene.
      3. Samle og forberede menneskelig spytt26. Det er nødvendig å ha godkjenning fra institusjonell etikkkomité.
      4. Tilsett 500 μL spytt i mikrorør og inkuber (40 min, 37 °C, 24 o/min).
      5. Deretter fjerner du spyttovernadanten og vasker perlene (tre ganger med AB-buffer som inneholder PMSF og NaN3). SHA-perlene (HA-perle med spyttpellet) er nå klare for nedstrøms analyser.
        MERK: Spytt samles inn fra friske frivillige. Etter oppsamling, fortynne spytt (1: 1 v / v) med AB buffer og sentrifuge (1699 x g, 20 min, 4 °C). Steriliser ved filtrering (polyetersulfonmembranfilter med lav binding til 0,22 μm proteiner)26. Den institusjonelle etikkkomiteen må godkjenne studien. I vårt tilfelle godkjente institusjonens etikkkomité studien (CAAE: 68161417.0.0000.5416).
    2. Løsrivelse av S. mutans etter vedheft til filmen spytt og glukan behandlet med utvalgte ekstrakter
      1. Dyrp mikroorganismen til midtloggvekstfasen, som beskrevet ovenfor.
      2. Når kulturer nådde ønsket O.D., sentrifuge (4000 × g for 20 min), vask med 0,89% NaCl løsning og resuspend pellet med 0,89% NaCl bruker samme opprinnelige volum av kulturmediet.
      3. Hvis du bruker en streptokokker, for eksempel S. mutans, sonikere kulturene med en sonde for å dechain (30 s, 7 W, tre ganger). Hvis du bruker en enkeltcelleorganisme, kan dette trinnet hoppes over.
      4. Kontroller O.D. (540 nm) for å justere konsentrasjonen til 2 x 106 CFU/ml.
    3. Vedheft av S. mutans til spyttpellet (sHA) og løsrivelse av tilslutnede celler
      MERK: Trinnene er illustrert i flytdiagrammet i figur 5.
      1. Få tak i sHA-prøvene som beskrevet ovenfor.
      2. Legg til en aliquot (i eksemplet legger vi til 500 μL) av utvalgte behandlinger (ved testkonsentrasjonen, for eksempel 0,5 mg / ml) eller kontroller i mikrorør som inneholder prøver av sHA.
      3. Inkuber sHA-prøvene med behandlinger eller kontroller (30 min, 37 °C, 24 o/min); deretter vaske perlene tre ganger med AB buffer (inneholder PMSF og NaN3).
      4. Tilsett mikroorganismekulturen. I eksemplet legger vi til 500 μL S. mutans kultur (2 x 106 CFU / ml) til hvert mikrorør.
      5. Inkuber (1 t, 37 °C, 24 o/min) og fjern deretter ubundne celler ved å vaske tre ganger med AB-buffer.
      6. Resuspend hver prøve med en aliquot (i eksemplet legger vi til 1000 μL) AB buffer og sonikere med en sonde (30 s, 7 W).
      7. Bruk en aliquot av hver suspensjon for en ti ganger seriell fortynning for å bestemme antall levedyktige kolonier ved å plating på bestemte agarplater (48 h, 37 ° C, 5% CO2). Deretter teller koloniene for å bestemme CFU / ml som beskrevet ovenfor.
        MERK: Sonikeris trinnet utføres for å løsne celler som følges av sHA.
    4. Vedheft av S. mutaner til den første glukanmatrisen (gsHA) og løsrivelse av tilslutne celler
      MERK: Trinnene er illustrert i flytdiagrammet i figur 6. GtfB enzymet ble renset fra kulturen supernatant Streptococcus milleri KSB8 konstruert for å produsere GtfB. Rensingen ble utført med en kromatografikolonne som inneholdt hydroksyapatittperler ved hjelp av buffere som inneholder to proteasehemmere (0,1 mM PMSF og 0,02 % NaN3)27,28. Deretter ble enzymet sjekket på akrylamidgel (SDS-PAGE) og farget med sølvnitrat. Aliquots av enzymet ble lagret ved -80 °C til bruk.
      1. Få tak i sHA-prøvene som beskrevet ovenfor. Deretter legger vi til en aliquot (i eksemplet legger vi til 500 μL) av GtfB-enzymet til hvert rør og inkubere i en homogenisator (40 min, 37 °C, 24 rpm). Vask deretter tre ganger med AB-buffer (inneholder PMSF og NaN3).
      2. Tilsett et aliquot (f.eks. 500 μL) sukrosesubstrat (100 mmol sukrose) som inneholder behandlingene (eller kontrollene ved testkonsentrasjonen, f.eks. 0,5 mg/ml) til hvert mikrorør.
      3. Inkuber prøvene i en homogenisator (4 t, 37 °C, 24 o/min). Deretter utfører du tre vasker med AB-buffer (med PMSF og NaN3) for å fjerne behandlingene og overskuddet av sukrose som ikke er innlemmet i de syntetiserte glukanene (prøver av gsHA).
      4. Legg til en aliquot (i eksemplet legger vi til 500 μL) S. mutans inoculum (2 x 106 CFU / ml) til hvert mikrorør.
      5. Inkuber i en homogenisator (1 t, 37 °C, 24 o/min) og vask tre ganger med AB-buffer (med PMSF og NaN3) for å fjerne ubundne celler.
      6. Gjenoppusser hver prøve med en aliquot (f.eks. 1000 μL) AB-buffer (med PMSF og NaN3) og sonikere med en sonde for å løsne celler som følges gsHA (30 s, 7 W).
      7. Bruk en aliquot av hver suspensjon for en ti ganger seriell fortynning for å bestemme antall levedyktige kolonier ved å plating på bestemte agarplater (48 h, 37 ° C, 5% CO2). Deretter teller koloniene for å bestemme CFU / ml som beskrevet ovenfor.

4. Analyse av biologiske data

  1. Bioanalyse Data
    1. Skriv inn rådata for bioanalysene i et regneark. Beregn loggen over mikrobiell veksthemming ved hver behandling som (ACFU/ml behandlinger + 1) x logg10. Deretter beregner du loggprosenten av mikrobiell veksthemming, sammenlignet med kjøretøykontroll ved hjelp av (Alog10 CFU/ml behandling/mean Alog10 CFU/ml kjøretøykontroll) x 100 %.
    2. Korrekt o.d. av planktoniske kulturer og biomasse behandlet av behandlinger (CE og CEF behandlet grupper) og ved kjøretøykontroll (negativ kontroll). For korreksjon trekker du absorpsjonen av behandlede brønner fra det som oppnås i brønner som bare inneholder kulturmedium (Ablank) som(A-behandlede grupper medium /Anegativt kontrollmedium) x 100 %.
    3. Etter denne korreksjonen beregner du prosentandelen av biomassehemmingen, sammenlignet med kjøretøykontroll som (Enbehandlet biomasse/mean Akjøretøykontroll)x 100%.
    4. Send inn rådata som genereres for statistisk analyse av dataene ved hjelp av spesifikk programvare.
      MERK: Tolkningen av effektiviteten av en gitt behandling bestemmes ved hjelp av avbruddspunkter, for eksempel IC50/IC90. Disse verdiene er definert som minimumskonsentrasjonen av en behandling som er i stand til å hemme henholdsvis 50% og 90%, av bakteriell vekst ellerbiofilmdannelse 24. Disse parameterne kan bidra til å tolke dataene og gi grunnlag for å velge forbindelser med bedreaktivitet 13,29.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi gir et eksempel på å bruke en systematisk tilnærming til å screene den biologiske aktiviteten til planteekstrakter og fraksjoner for å identifisere potensielt aktive molekyler for mulige nye anti-karies terapier: antimikrobielle og antibiofilmaktiviteter av Casearia sylvestris ekstrakter fra forskjellige brasilianske biomer mot Streptococcus mutans og Candida albicans13.

Bakgrunn
Komplekse interaksjoner mellom spesifikke orale mikroorganismer-vert faktorer-diett rik på sukrose og stivelse kan modulere dannelsen av patogene biofilmer og initiere en kardiogen prosess30,31. S. mutans orkestrerer patogeniteten til biofilmer forbundet med utviklingen av tannkaries fordi den produserer Gtfs som er ansvarlig for eksopolysakkaridersyntese, i tillegg til surogenitet ogsurhet 31. I tillegg gjør Gtfs det mulig å vedhefte Candida albicans (og andre mikroorganismer), noe som øker virulensen av biofilmen32,33. Vi gjennomførte en screening av antimikrobielle og antibiofilmaktiviteter av C. sylvestris bladekstrakter og fraksjoner fra forskjellige brasilianske biomer, som tilhører lingua og sylvestris varianter mot S. mutans og C. albicans13. C. sylvestris ("guaçatonga") er en del av populær og tradisjonell bruk i Brasil, og andre land i Sør-Amerika og Asia34,35. Dette anlegget er sitert i "National List of Medicinal Plants of Interest to SUS" (RENISUS), som inneholder 71 arter som kan behandle sykdommene med høy forekomst i Brasil36. Den kjemiske profilen av bladekstrakter av var. sylvestris presenterer en rik fytokjemisk sammensetning, med rikelig diterpenes35, mens fenoliske forbindelser (hovedsakelig flavonoider) dominerer i var. lingua18.

Vi bruker tilnærmingen som er beskrevet i protokollen for å identifisere hvilke ekstrakter og fraksjoner av C. sylvetris som er mest aktive for mikroorganismer evaluert, og basert på resultatene ved hjelp av forenklede modeller, velger vi hvilke behandlinger som skal testes in vitro komplekse modeller (hydroksyapatittplater, mikrokosmos)37,38. Her presenterer vi resultatene av screening av de tolv CE mot S. mutans. Fokuset er å demonstrere nytten av denne tilnærmingen for screening av naturlige forbindelser i stedet for å tolke og diskutere dataene.

Vi samlet bladene av individer fra de to varianter av C. sylvestris fra tolv forskjellige populasjoner i Brasil, bestående av ulike formasjoner av brasilianske biomer (vær så snill, se detaljer i Ribeiro et al. 201913). Samlingen ble utført mellom juni og september 2012 og 2013 (SisGen; Registrer #A00892A). Vi anbefaler å samle representative prøver, inkludert personer av forskjellige kjemotyper og fra forskjellige biomer, for å håndtere den kjemiske variasjonen til sekundære metabolitter. Hvis tilgjengelig, bør minst 3 til 5 personer samles inn. Tidligere opplysninger om planteinfraspesifikk kjemisk variasjon bør også betraktes som beskrevet av Ribeiro et al. 2019 og Bueno et al. 201513,18. Den kjemiske sammensetningen av CE ble undersøkt av kromatografisk sitert i trinn 2, og vi gir den kjemiske profilen i figur 7. Analysen av den kjemiske profilen er avgjørende for å integrere tolkningen av data innhentet i biologisk screening.

CEs ble fraksjonert i Hex, AcOEt, og MeOH fraksjoner. Fraksjoneringen av CE gjør det mulig forenkling av blandingen å øke konsentrasjonen av de potensielt aktive forbindelsene og redusere mulighetene for synergismer og antagonismer mellom forbindelser. I tillegg, i enklere blandinger (fraksjoner), er det lettere å få spektrale data av forbindelsene enn i CE og å utføre dereplication analyse2. Vanligvis kan fraksjonering gjøres ved væske-væske ekstraksjon eller solidfase ekstraksjon patroner (SPE) som inneholder fortrinnsvis reversert fase adsorbent som C18 (40 μm, 100 Å). Andre adsorbekter eller blandinger av adsorbekter kan velges, avhengig av studieformål eller kjemisk karakter av de ønskede forbindelsene. Hvis den valgte teknikken er SPE, må patronene tidligere aktiveres med rent organisk oppløsningsvæske (f.eks. EtOH) og forfattet med den første eluent. Standardiserte protokoller er tilgjengelige. Dermed kan leseren konsultere og tilpasse dem i henhold til den tiltenkte studien og plantemateriale av interesse.

De tolv CE ble solubilisert med 84,15% EtOH og 15% DMSO for å oppnå 6 mg / ml (lagerløsning). Før screeningtestene testet vi fortynningskonsentrasjonen (kjøretøy) som ikke forstyrrer mikrobiell vekst. Dette trinnet er viktig fordi det forhindrer de antimikrobielle og antibiofilm handlingene til løsemidlene fra å påvirke resultatene ved testing av behandlinger. Testene kan utføres på en 96-brønnsplate ved å behandle kulturen i mikroorganismen av interesse med forskjellige konsentrasjoner av løsemidler (assosiert og / eller isolert). Dermed begynte vi vår screening med CE på 0,5 mg / ml og kjøretøy med en konsentrasjon på 7% EtOH og 1,25% DMSO.

For screening av antimikrobiell og antibiofilmaktivitet ble 96-brønnplater behandlet som beskrevet ovenfor. For dette formålet ble volumet på 16,67 μL lageroppløsning CE (6 mg/ml) lagt til for å teste hver CE ved konsentrasjonen på 0,5 mg/ml. Biofilmene som ble dannet ble behandlet som beskrevet i trinn 3. Ekstraktene som var effektive mot S. mutans (IC50 eller 3 logger) ble brukt til å evaluere "vedheftsstyrken" av denne bakterien til spyttpellet og den første glukanmatrisen, som beskrevet i trinn 3.

Rådataene hentet fra biologiske analyser ble organisert i Excel (som beskrevet i trinn 4) og analysert med passende statistisk behandling13. Cutoff-punktet for å identifisere ekstraktene med den beste aktiviteten var IC50-hemmingen (3 logger). Fra denne parameteren viste fire ekstrakter en gunstig respons (figur 8). De kromatografiske dataene til disse fire ekstraktene viser samtidig tilstedeværelse av clerodane-type diterpener og glykosylert flavonoider. I tillegg inkluderer de samme biome (Atlantic Forest) og variasjon (sylvestris). For å bidra til å tolke de biologiske dataene sammenlignet vi den kromatografiske profilen til de fire ekstraktene med den beste aktiviteten med de andre skjermede ekstraktene. Sammenlignet med de andre har ekstraktene med den beste aktiviteten en høyere mengde clerodane-type diterpener og samtidig glykosylert flavonoider. Denne observasjonen indikerer at det er sannsynlig at effektiviteten av disse ekstraktene skyldes en synergistisk interaksjon mellom de to sekundære metabolittene, og dermed øker deres biologiske aktivitet. Det vil si at den kombinerte effekten av clerodane-type diterpener og glykosylert flavonoider er større enn summen av deres separate effekter13.

For å bekrefte dataene som er innhentet i screeningen, evaluerte vi løsrivelse av S. mutaner etter vedheft til spyttpellet og glukaner behandlet med utvalgte CE. Analysene bruker biofilmmodeller av in vitro-enarter for å evaluere bedre den biologiske aktiviteten til de valgte råoljeekstraktene og identifisere mulige handlingsmål. Den første analysen bekrefter om behandlingene som brukes er i stand til å hemme overholdelsen av S. mutaner til spyttpellet, men hovedsakelig om cellene i mikroorganismen som har festet seg til den behandlede pellicleen, lettere kan fjernes fra overflaten av den mekaniske stimulansen, og dermed avbryte den første fasen av biofilmdannelse. Tillegg av CE (med bedre aktivitet) under syntesen av glaner endret ikke spyttpellet fordi ingen CE påvirket fjerningen av celler som følges spyttpellet (figur 9A).

Vedheftet av den første glukanmatrisen (gsHA) undersøker om behandlingene kan hemme vedheftet av S. mutaner til den første glukanmatrisen. Likevel verifiserer denne metodikken om mikroorganismecellene som har holdt seg til de behandlede glukanene, kan fjernes av den mekaniske stimulansen lettere av overflaten, og dermed avbryte scenen biofilmdannelse. Tre CE påvirket kvaliteten på glannøtter dannet av GtfB og svekket derfor vedheftet av S. mutans til den første glukanmatrisen (de fleste S. mutansceller ble fjernet etter vedheft for glaner; Figur 9B). Vi tror at denne virkemåten er relatert til synergismen mellom sekundære metabolitter13.

Den systematiske tilnærmingen har hjulpet oss med å identifisere og velge aktive råoljeekstrakter for å stoppe dannelsen av kardiogene biofilmer. Når valgt og basert på den kromatografiske profilen, har vi grunnlag for å belyse de molekylære virkningsmekanismene i komplekse modeller.

Figure 2
Figur 2: Strømningskart over plantematerialets utvinning og fraksjonering. Illustrasjonen viser eksperimentell design for å forberede råoljeekstrakter (A) og fraksjonering av råoljeekstrakter (B). UAE: Ultralyd assistert ekstraksjon; SPE: Solid fase ekstraksjon. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Eksperimentell design for vurdering av antimikrobiell aktivitet i 96-brønnsplater. Illustrasjonen viser behandlinger (rå ekstrakter eller fraksjoner) og kontroller. For screening av flere behandlinger, bruk en enkelt konsentrasjon (mg/ml) i hver brønn. CFU/ml: kolonidannende enheter per milliliter. O.D.: optisk tetthet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Eksperimentell design for antibiofilmanalyse i 96-brønnsplater. Illustrasjonen viser behandlinger (rå ekstrakter og fraksjoner) og kontroller. For screening av ulike behandlinger, bruk en enkelt konsentrasjon (mg / ml) i hver brønn. I Aillustreres trinnene for å kvantifisere biomasse av behandlede biofilmer. I Bvises trinnene for å bestemme populasjonen (CFU/ml) av de behandlede biofilmene. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Eksperimentell design for å evaluere vedheftet til spyttpellet, etterfulgt av løsrivelse av tilslutnede celler. Illustrasjonen viser trinnene som skal utføres. Behandlinger: valgt basert på biologisk screening. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Eksperimentell design for å evaluere vedheftet til den første glukanmatrisen (gsHA) etterfulgt av løsrivelse av tilslutnede celler. Illustrasjonen viser trinnene som skal utføres. Behandlinger: valgt basert på biologisk screening. Sukrose substrat: 100 mmol sukrose. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 7
Figur 7: Antall clerodane-type diterpener og glykosylert flavonoider i C. sylvestris ekstrakter fra brasilianske biomer. Bokstavene S,I og L indikerer varianter sylvestris,mellomliggende, og lingua, henholdsvis. Personlig kommunikasjon av Dr. Paula Carolina Pires Bueno. Dette tallet er endret fra Ribeiro et al.13. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 8
Figur 8: Antimikrobiell og antibiofilm aktivitet av C. sylvestris råolje ekstrakter fra brasilianske biomer mot S. mutans.  A. % CFU (logg10) av behandlede planktoniske celler; B. % biomasse av behandlede biofilmer. C. % CFU (logg10) av behandlet biofilm. De beskrevne dataene er median (spor) og interkvartil (bokser). Feilfeltene representerer maksimums- og minimumsverdiene. Stjernene betegner en statistisk signifikant forskjell på et bestemt utdrag versus kjøretøykontroll (V), der: ****p ≤ 0,0001; p ≤ 0.001; ** p ≤ 0,01; og *p ≤ 0,05 (Kruskal-Wallis test, etterfulgt av Dunn flere sammenligninger test). Hver art vekstkontroll (uten behandling) er representert som Sm for S. mutans. Fargene på stolpene i hver graf representerer variasjonen som ekstraktene tilhører, og er i mørk grå farge: var. sylvestris; lys grå: var. mellomliggende og hvit: var. lingua. Dette tallet er endret fra Ribeiro et al.13. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 9
Figur 9: S. mutans løsrivelse etter vedheft til den behandlede spyttpellet og første matrise av glannøtter. Etter utgivelsen av S. mutans til de behandlede spyttpellet og glaner er vist i (A) og (B), henholdsvis. Det var ingen forskjell mellom kontrollkjøretøyet (V), og ekstraktene som ble testet for begge analysene. Prosentandelen av CFU/ml ble innhentet med tanke på kjøretøykontrollen (V) som 100 %. De beskrevne dataene er median (spor) og interkvartil (bokser). Feilfeltene representerer maksimums- og minimumsverdiene. Stjernene betegner en statistisk signifikant forskjell på et bestemt utdrag versus kjøretøykontroll (V), der ****p = 0,0001 og **p < 0,0031 (Kruskal-Wallis-testen, etterfulgt av multippelsammenligningstest av Dunn). Vekstkontrollen er representert av Sm for S. mutans. Fargene på stolpene i grafen representerer variasjonen som ekstraktene tilhører, og er fargen mørk grå til var. sylvestris. Dette tallet er endret fra Ribeiro et al.13. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De viktigste utfordringene knyttet til arbeidet med naturlige råoljeekstrakter utgjør deres komplekse sammensetning og utilstrekkelighetene til klassiske biostyrte isolasjonsstudier. Selv om denne prosessen er treg, er den effektiv og har ført til store funn i NP-forskning. For å rasjonalisere er det nødvendig med prioriteringsdrevne studier for å rasjonalisere. Dermed er bruk av moderne kjemisk profilering tilnærminger for analyse av CE og duplisering før isolasjon viktig å karakterisere det studerte materialet og spesielt nyttig for å unngå re-isolasjon av kjenteforbindelsermed allerede beskrevet biologisk aktivitet 2,15. Dessuten er anskaffelsen av flerdimensjonale data nødvendig for å utføre ytterligere multivariatdataanalyse for å finne potensielle treff kandidater som er ansvarlige for de observerte biologiske aktivitetene. Følgelig kan forskeren fokusere på isolasjonen (i stor skala) av disse potensielle kandidatene.

Her presenterer vi en systematisk tilnærming for bioanalysestyrt identifikasjon (in vitro) av aktive forbindelser fra planteekstrakter og fraksjoner. Denne protokollen tillater en flermålsscreenings- og analysemetode slik at flere aktive komponenter kan screenes og analyseres samtidig. Bioanalysene er i liten skala og med høy avkastning, er raske, kostnadseffektive, enkle å reprodusere og forbruker færre reagenser enn tradisjonelle metoder (f.eks. innledende isolering av forbindelser av interesse)39. For enhver naturlig produktforskning er det avgjørende de analytiske verktøyene (for eksempel HPLC-UV, HPLC-DAD, LC-MS). Nylig er tilnærmingen mer strukturorientert (kjemibasert) ved hjelp av, i høyere grad, kraften i analytiske og belysningsplattformer (LC-HRMS og HRMS / MS, høyfelts NMR) og avledningsstrategier, som består i rask identifisering av allerede kjente molekyler. Dette trinnet bidrar til å forstå det kjemiske profilforholdet til den biologiske responsen som resulterer i mer fokusert isolering av kandidataktive metabolitter3. Det finnes flere veletablerte metoder for kromatografisk analyse. For ukjente NPer kan det noen ganger være nødvendig å utføre piloter for å finne best mulig metode. For eksempel bruker vi en analytisk metode for kromatografi validert for samtidig analyse av sekundære metabolitter produsert av to varianter av C. sylvestris13,18. Når du velger en kromatografimetode, foreslår vi at du vurderer en protokoll basert på målforbindelsen (e), og fordelene og ulempene ved alle tilgjengelige metoder, med fokus spesielt på effektiviteten og, selvfølgelig, den totale kostnaden involvert40.

Selv om den systematiske tilnærmingen har vist seg nyttig for rask screening og analyse av bioaktive kandidater i NPer, er det fortsatt viktige begrensninger. For eksempel kan de visuelle og O.D. avlesningene av biomassen og planktoniske kulturer reprodusere falske positive resultater13,23,24. Bestemme turbiditet av kulturer med en mikroplateleser kan mislykkes når den brukes til naturligeforbindelser 23,24. Disse feilene oppstår fordi (i) i noen testorganismer, cellene er gruppert på bunnen av brønnen, og i andre organismer forblir cellene i suspensjon; (ii) faste partikler som finnes i CE-bunnsplitten og forårsaker turbiditet ibrønnene 23,24. PH av NPs er en faktor som også må vurderes. PH av behandlingsløsningen er relatert til den kjemiske sammensetningen av sekundære metabolitter og påvirker derfor den biologiske responsen. Selv om pH ikke er en begrensning, bør det vurderes med forsiktighet, avhengig av formålet med studien. For eksempel, i biofilmmodeller på tannemaljeoverflater, kan surhet forårsake uønsket emaljedemineralisering. I disse tilfellene er det nødvendig å justere pH ved hjelp av egnede buffere. Derfor er det nødvendig å gjennomføre tester for å verifisere om pH-justeringen påvirket den biologiske responsen som ble observert tidligere.

De klassiske testene for å vurdere aktiviteten til nye forbindelser inkluderer å bestemme minimum hemmende konsentrasjon (MIC) og minimum bakteriedrepende eller soppdrepende konsentrasjon (MBC eller MFC)29,41. Men når målet er å screene mange planteekstrakter og fraksjoner, blir teknikken uttømmende. Bioscreening kan utføres med en enkelt konsentrasjon av flere behandlinger (f.eks planteekstrakter fra forskjellige steder)13,42,29. For disse situasjonene er den systematiske tilnærmingen en metode med høy ytelse som returnerer konsistente resultater i mindre arbeidstid. Behandlingene som er valgt i den biologiske screeningen kan evalueres ved hjelp av raffinerte modeller (klinisk relevante, levedyktige og reproduserbare) for å bekrefte den biologiske aktiviteten. For kontroll av karogen biofilm, bør laboratoriestudier fokusere hovedsakelig på biofilmer dannet på hydroksyapatitt (tannemaljeerstatning) eller emaljeoverflater plassert i oppreist stilling belagt med en spyttpellet37. Det tillater også screening av planteprøver av forskjellige varianter og biomer på en reproduserbar og rask måte. Inkluderingen av disse to variablene (biome og variasjon) er viktig fordi de påvirker variasjonen av den kjemiske sammensetningen av sekundære metabolitter18 og modulere den biologiske responsen. Denne systematiske tilnærmingen kan tilpasses/endres for bruksområder utenfor oral biofilmforskning. For eksempel kan det være spesielt nyttig for andre felt knyttet til biofilm, ved hjelp av andre arter av interesse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklært.

Acknowledgments

Vi uttrykker vår takknemlighet til Núcleo de Bioensaios, Biossíntese e Ecofisiologia de Produtos Naturais (NuBBE) ved Chemistry Institute of UNESP, Araraquara/SP for å gi laboratoriene for å forberede plantemateriale. Vi takker også Applied Microbiology Laboratory ved Institutt for tannmaterialer og prosthodonti, UNESP, Araraquara / SP. Denne forskningen ble støttet av et forskningsstipend fra São Paulo Research Foundation (FAPESP #2013/07600–3 til AJC) og stipender pluss indirekte midler (FAPESP #2017/07408–6 og FAPESP #2019/23175-7 til SMR; #2011/21440–3 og #2012/21921–4 til PCPB). National Council for Scientific and Technological Development i samarbeid med FAPESP ga ytterligere støtte (INCT CNPq #465637/2014–0 og FAPESP #2014/50926–0 til AJC).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well microplates  Kasvi Flat bottom
Activated carbon LABSYNTH Clean up and/or fractionation step
Analytical mill Ika LabortechniK Model A11 Basic
Blood agar plates Laborclin
Chromatographic column C18 Phenomenex Kinetex 150 × 2.1 mm, 2.6 µm, 100Â
Dimethyl sulfoxide  Sigma-Aldrich Vehicle solution
ELISA plate reader Biochrom Ez
Ethanol J. T. Baker For extraction and fractionation steps, and mobile phase composition
Ethanol Sigma-Aldrich Vehicle solution
Ethyl acetate J. T. Baker Fractionation step
GraphPad Software La Jolla GraphPad Prism7
Hexane J. T. Baker Fractionation step
Incubator Thermo Scientific
Isopropanol J. T. Baker For extraction step
Lyophilizer (a freeze dryer) Savant Modulyo
Nylon Millipore LAC 0.22 µm x 13 mm
Orbital shaker Quimis Model G816 M20
Polyamide solid phase extraction cartridge Macherey-Nagel Clean up and/or fractionation step
Silica gel Merck 40–63 μm, 60 Â
Sodium Chloride (NaCl) Synth 0,89% in water
Solid phase extraction cartridges (SPE) Macherey-Nagel Clean up and/or fractionation step
Tryptone Difco
UHPLC-DAD Dionex Ultimate 3000 RS
Ultrasonic bath UNIQUE Model USC 2800
Yeast extract Difco

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Newman, D. J., Cragg, G. M. Natural Products as Sources of New Drugs over the Nearly Four Decades from 01/1981 to 09/2019. Journal of Natural Products. 83 (3), 770-803 (2020).
  2. Wolfender, J. L., Litaudon, M., Touboul, D., Queiroz, E. F. Innovative omics-based approaches for prioritisation and targeted isolation of natural products – new strategies for drug discovery. Natural Product Report. 36 (6), 855-868 (2019).
  3. Michel, T., Halabalaki, M., Skaltsounis, A. New Concepts, Experimental Approaches, and Dereplication Strategies for the Discovery of Novel Phytoestrogens from Natural Sources. Planta Medica. 79 (7), 514-532 (2013).
  4. Jeon, J. G., Rosalen, P. L., Falsetta, M. L., Koo, H. Natural products in caries research: current (limited) knowledge, challenges and future perspective. Caries Research. 45 (3), 243-263 (2011).
  5. Tonetti, M. S., Jepsen, S., Jin, L., Otomo-Corgel, J. Impact of the global burden of periodontal diseases on health, nutrition and wellbeing of mankind: A call for global action. Journal of Clinical Periodontology. 44 (5), 456-462 (2017).
  6. Peres, M. A., et al. Oral diseases: a global public health challenge. Lancet. 394 (10194), 249-260 (2019).
  7. Bowen, W. H., Burne, R. A., Wu, H., Koo, H. Oral biofilms: pathogens, matrix, and polymicrobial interactions in microenvironments. Trends Microbiology. 26 (3), 229-242 (2018).
  8. Paes Leme, A. F., Koo, H., Bellato, C. M., Bedi, G., Cury, J. A. The role of sucrose in cariogenic dental biofilm formation--new insight. Journal of Dental Research. 85 (10), 878-887 (2006).
  9. Koo, H., Falsetta, M. L., Klein, M. I. The exopolysaccharide matrix: a virulence determinant of cariogenic biofilm. Journal of Dental Research. 92 (12), 1065-1073 (2013).
  10. Cury, J. A., de Oliveira, B. H., dos Santos, A. P., Tenuta, L. M. Are dental fluoride releasing materials clinically effective on caries control. Dental Materials. 32 (3), 323-333 (2016).
  11. Mattos-Graner, R. O., Klein, M. I., Smith, D. J. Lessons Learned from Clinical Studies: Roles of Mutans Streptococci in the Pathogenesis of Dental Caries. Current Oral Health Reports. 1, 70-78 (2014).
  12. Rocha, G. R., Florez Salamanca, E. J., de Barros, A. L., Lobo, C. I. V., Klein, M. I. Effect of tt-farnesol and myricetin on in vitro biofilm formed by Streptococcus mutans and Candida albicans. BMC Complementary and Alternative Medicine. 18 (1), 61 (2018).
  13. Ribeiro, S. M., et al. Antimicrobial and antibiofilm activities of Casearia sylvestris extracts from distinct Brazilian Biomes against Streptococcus mutans and Candida albicans. BMC Complementary and Alternative Medicine. 19 (1), 308 (2019).
  14. Pilon, A. C., et al. Metabolômica de plantas: métodos e desafios. Quimica Nova. 43 (3), 329-354 (2020).
  15. Wolfender, J. L., Nuzillard, J. M., Hooft, J. J. J., Renault, J. H., Bertrand, S. Accelerating Metabolite Identification in Natural Product Research: Toward an Ideal Combination of Liquid Chromatography-High-Resolution Tandem Mass Spectrometry and NMR Profiling, in Silico Databases, and Chemometrics. Analytical Chemistry. 91 (1), 704-742 (2019).
  16. Allard, P. M., et al. Pharmacognosy in the digital era: shifting to contextualized metabolomics. Current opinion in biotechnology. 54, 57-64 (2018).
  17. Hubert, J., Nuzillard, J., Renault, J. Dereplication strategies in natural product research: How many tools and methodologies behind the same concept. Phytochemistry Reviews. 16, 55-95 (2017).
  18. Bueno, P. C. P., Pereira, F. M. V., Torres, R. B., Cavalheiro, A. J. Development of a comprehensive method for analysing clerodane-type diterpenes and phenolic compounds from Casearia sylvestris Swartz (Salicaceae) based on ultra-high performance liquid chromatography combined with chemometric tools. Journal of separation science. 38 (10), 1649-1656 (2015).
  19. Bueno, P. C. P., Lopes, N. P. Metabolomics to Characterize Adaptive and Signaling Responses in Legume Crops under Abiotic Stresses. American Chemical Society omega. 5 (4), 1752-1763 (2020).
  20. Blaženović, I., Kind, T., Ji, J., Fiehn, O. Software tools and approaches for compound identification of LC-MS/MS data in metabolomics. Metabolites. 8 (2), 31 (2018).
  21. Eloff, J. N. Quantifying the bioactivity of plant extracts during screening and bioassay-guided fractionation. Phytomedicine: International Journal Of Phytotherapy And Phytopharmacology. 11 (4), 370-371 (2004).
  22. Rios, J. L., Recio, M. C. Medicinal plants and antimicrobial activity. Journal of Ethnopharmacology. 100 (1-2), 80-84 (2005).
  23. Eloff, J. N. A sensitive and quick microplate method to determine the minimal inhibitory concentration of plant extracts for bacteria. Planta Medica. 64, 711-714 (1998).
  24. Eloff, J. N. Avoiding pitfalls in determining antimicrobial activity of plant extracts and publishing the results. BMC Complementary and Alternative Medicine. 19 (1), 106 (2019).
  25. Klein, M. I., Xiao, J., Heydorn, A., Koo, H. An analytical tool-box for comprehensive biochemical, structural and transcriptome evaluation of oral biofilms mediated by mutans streptococci. Journal of Visualized Experiments. (47), e2512 (2011).
  26. Lemos, J. A., Abranches, J., Koo, H., Marquis, R. E., Burne, R. A. Protocols to study the physiology of oral biofilms. Methods in molecular biology. 666, 87-102 (2010).
  27. Venkitaraman, A. R., Vacca-Smith, A. M., Kopec, L. K., Bowen, W. H. Characterization of glucosyltransferase B, GtfC, and GtfD in solution and on the surface of hydroxyapatite. Journal of Dental Research. 74, 1695-1701 (1995).
  28. Vacca-Smith, A. M., Venkitaraman, A. R., Quivey, R. G. Jr, Bowen, W. H. Interactions of streptococcal glucosyltransferases with alpha-amylase and starch on the surface of saliva-coated hydroxyapatite. Archives of Oral Biology. 41, 291-298 (1996).
  29. Van Dijck, P., et al. Methodologies for in vitro and in vivo evaluation of efficacy of antifungal and antibiofilm agents and surface coatings against fungal biofilms. Microbial Cell. 5 (7), 300-326 (2018).
  30. Marsh, P. D. Are dental diseases examples of ecological catastrophes. Microbiology. 149 (2), 279-294 (2003).
  31. Bowen, W. H., Koo, H. Biology of Streptococcus mutans-derived glucosyltransferases: role in extracellular matrix formation of cariogenic biofilms. Caries Research. 45 (1), 69-86 (2011).
  32. Lobo, C. I. V., et al. Dual-species biofilms of Streptococcus mutans and Candida albicans exhibit more biomass and are mutually beneficial compared with single-species biofilms. Journal of Oral Microbioly. 11 (1), 1581520 (2019).
  33. Kim, D., et al. Candida albicans stimulates Streptococcus mutans microcolony development via crosskingdom biofilm-derived metabolites. Scientific reports. 7, 41332 (2017).
  34. Ferreira, P. M. Folk uses and pharmacological properties of Casearia sylvestris: a medicinal review. Anais da Academia Brasileira de Ciencias. 83 (4), 1373-1384 (2011).
  35. Xia, L., Guo, Q., Tu, P., Chai, X. The genus Casearia: a phytochemical and pharmacological overview. Phytochemistry Reviews. 14, 99-135 (2015).
  36. Ferreira, P. M. P., et al. Toxicological findings about an anticancer fraction with casearins described by traditional and alternative techniques as support to the Brazilian Unified Health System (SUS). Journal of Ethnopharmacol. 15, 241 (2019).
  37. Koo, H., Xiao, J., Klein, M. I., Jeon, J. G. Exopolysaccharides produced by Streptococcus mutans glucosyltransferases modulate the establishment of microcolonies within multispecies biofilms. Journal of Bacteriology. 192 (12), 3024-3032 (2010).
  38. Maske, T. T., van de Sande, F. H., Arthur, R. A., Huysmans, M. -C. D. N. J. M., Cenci, M. S. In vitro biofilm models to study dental caries: a systematic review. Biofouling. 33 (8), 661-675 (2017).
  39. Fu, Y., Luo, J., Qin, J., Yang, M. Screening techniques for the identification of bioactive compounds in natural products. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 168, 189-200 (2019).
  40. Sarker, S. D., Nahar, L. An introduction to natural products isolation. Methods in molecular biology. 864, 1-25 (2012).
  41. Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI). Performance standards for antimicrobial susceptibility testing; twenty-fifth informational supplement. Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI). , Wayne, PA. CLSI document M100-S25 (2015).
  42. Saputo, S., Faustoferri, R. C., Quivey, R. G. Jr A drug repositioning approach reveals that Streptococcus mutans is susceptible to a diverse range of established antimicrobials and nonantibiotics. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 62 (1), 01674 (2018).

Tags

Biologi Mikrobiologi biofilm naturlige produkter mutans streptokokker antimikrobielle tannkaries narkotikaoppdagelse biologiske tilnærminger
Systematisk tilnærming til å identifisere nye antimikrobielle og antibiofilmmolekyler fra planters ekstrakter og fraksjoner for å forhindre tannkaries
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ribeiro, S. M., Fratucelli, É. D.… More

Ribeiro, S. M., Fratucelli, É. D. O., Fernandes, J. M., Bueno, P. C. P., Cavalheiro, A. J., Klein, M. I. Systematic Approach to Identify Novel Antimicrobial and Antibiofilm Molecules from Plants' Extracts and Fractions to Prevent Dental Caries. J. Vis. Exp. (169), e61773, doi:10.3791/61773 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter