Summary
天然产品是开发新药和治疗剂的有希望的起点。然而，由于化学多样性高，从植物中寻找新的治疗化合物是一项具有挑战性和耗时的任务。我们描述了从植物提取物和分数中识别抗菌和抗生物膜分子的简化方法。
Abstract
天然产品提供结构不同的物质，具有无数的生物活动。然而，由于复杂的植物基质和耗时的隔离和鉴定程序，从植物中识别和分离活性化合物是具有挑战性的。因此，提出了一种从植物中筛选天然化合物的渐进方法，包括分离和识别潜在的活性分子。它包括植物材料的收集：原油提取物的准备和分馏;色谱和光谱学（UHPLC-DAD-HRMS和NMR）分析和化合物鉴定方法：生物分析（抗菌和抗生物膜活动;细菌"粘附力"到唾液颗粒和初始葡萄糖基质用选定的治疗治疗）：和数据分析。该模型简单、可重复，可持续控制多种化合物的高通量筛选、浓度和处理步骤。获得的数据为今后的研究提供了基础，包括含有最活跃提取物和/或分数的配方、分子的分离、微生物细胞和生物膜中特定目标的分子建模。例如，控制致癌生物膜的一个目标是抑制链 球菌突变 体葡萄糖转移酶的活性，这种转移酶合成细胞外基质的葡萄糖。这些酶的抑制可以防止生物膜的积累，降低其毒性。
Introduction
社会中最早使用的药物模型以天然产品为基础。从那时起，人类一直在寻找新的化学物质在自然界中，可以转化为药物1。这一搜索使民族植物筛查的技术和方法不断改进。NPs 提供了结构多样化物质的丰富来源，具有广泛的生物活动，可用于开发替代疗法或辅助疗法。然而，固有的复杂植物矩阵使得活性化合物的分离和鉴定成为一项具有挑战性和耗时的任务。
基于NPs的药物或配方可用于预防和/或治疗影响口腔的几种疾病，包括牙科蛀牙4。牙科蛀牙是全球最普遍的慢性疾病之一，它源于牙齿表面形成的富含糖分的饮食和微生物生物膜（牙菌斑）的相互作用，导致微生物代谢产生的有机酸导致脱氧，如果不治疗，会导致牙齿脱落5、6。虽然其他微生物可能与7有关，但链球菌是一种关键的致癌细菌，因为它是酸性、酸性且细胞外基质构建者。该物种编码多个外酶（如糖素转移酶或Gtfs），使用蔗糖作为基材8，以建立富含外聚糖精的细胞外基质，这是一个毒性决定因素9。此外，真菌念珠菌可以推动细胞外矩阵7的生产。尽管氟化物以各种方式施用，仍然是预防蛀牙10的基础，但需要新的方法作为辅助剂，以提高其有效性。此外，现有的抗斑块模式是基于使用广谱微生物制剂（如氯河西丁）11。作为替代方案，NPs是控制生物膜和预防蛀牙12，13的潜在疗法。
从植物中发现新的生物活性化合物的进一步进展包括必要的步骤或方法，例如：（一） 使用可靠和可重复的协议进行采样，考虑到植物往往表现出特异性：（二） 编制小规模的综合提取物及其各自的分数：（三） 其化学特征的定性和/或复制认为获取多维数据，例如GC-MS、LC-DAD-MS或NMR：（四） 使用可行的高产模型来评估生物活性：（五） 根据多变量数据分析或其他统计工具选择潜在的新热门歌曲：（六） 对目标化合物或有前途的候选人进行隔离和净化：和（七）使用分离化合物2，14对应生物活动的验证。
复制是快速识别原油提取物中已知化合物的过程，允许将新化合物与已经研究过的化合物区分开来。此外，当某些化合物已经描述生物活性时，这个过程可以防止隔离，并且特别有助于检测"频繁的击球手"。它已用于不同的非目标工作流程，从主要化合物识别或活动引导分馏的加速到提取物集合的化学剖析。它可以与代谢学研究完全集成，用于CE的非目标化学分析或代谢物的有针对性识别。所有这些最终导致在隔离程序1，15，16，17之前优先考虑提取物。
因此，在本手稿中，我们描述了从植物提取物和分数中识别抗菌和抗生物膜分子的系统方法。它包括四个多学科步骤：（1） 收集植物材料：（（二）制备粗制提取物和馏分，然后进行化学剖面分析：（3） 生物分析：（4）生物和化学数据分析（图1）。因此，我们提出了为分析 Cacasaria西尔维斯特里斯 提取物和针对 链球菌突变 体和 念珠菌13的分馏的抗菌和抗生物膜活动而制定的协议，以及植物化学特征和数据分析的程序。为了简单起眼，这里的重点是演示使用细菌筛选天然化合物的方法。
图1：系统方法的流程图，以识别植物提取物和分数中的活性分子。请点击这里查看此数字的较大版本。
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Protocol
1. 植物材料收集
- 植物材料
- 在电子平台上记录获得植物材料的情况，该平台将规范在进行采集的国家获得遗传遗产的情况。例如，在巴西，向国家遗传遗产和相关传统知识管理系统注册-SisGen（网站 https://sisgen.gov.br/paginas/login.aspx）。
- 收集感兴趣的植物材料的样本（例如叶子、茎、根、花、水果）。如果材料是在生殖阶段或植物阶段收集的，请进行登记。
- 记录收集参数（日期、地理参考、年平均温度和平均湿度百分比）。
- 精确识别样本，分类学家必须确认真实性。
- 植物样品稳定和储存
- 收集后立即将植物器官分离在单独的塑料袋或烧瓶中。
- （i） 立即冻结液氮中，（ii） 在循环空气烤箱中脱水（40 °C），或 （iii） 通过冻干冷冻干燥样品，从而激活潜在的酶反应。
- 将稳定材料存放在室温或冰柜中密封的袋子中，直至使用（-20 或 -80 °C，具体取决于储存期或预期用途）。
- 在分析磨机中研磨样品（刀或球，取决于组织类型或可用性），并使用标准化筛子标准化颗粒大小。
- 为后续提取步骤单独称重样品。
2. 将原油提取物 （CE） 和分数 （CEF） 准备到化学剖面分析和生物分析
- 原油提取物的制备
注：图 2A中的流程图中显示了这些步骤。- 用水酒精混合物（例如乙醇 （EtOH） 70% 或水、EtOH 和其他修饰剂的三元混合物（根据先前报告的实验设计定义）制备提取溶剂。
- 使用比例样本重量（干重，毫克）/提取溶剂（mL）从50到100毫克不等，每个mL溶剂。
- 对于快速和可重复的萃取，使用微管使用批量萃取。
注：此时应至少使用三个副本，以便进行统计分析。 - 执行超声波辅助提取（阿联酋），使其快速、简单和便宜。
- 为了获得最佳效率，重复三次程序（每次 15 分钟）。
- 每次提取步骤后，通过离心清除固体残留物，并去除超纳坦。
- 将超级纳坦单独组合，过滤并保存 aliquot，以同时进行化学分析和生物分析。如有必要，在真空、氮流或冻素化下去除萃取溶剂，并登记称重和产量。
- 存放在-20°C保护免受光线照射。
注：协议可在此处暂停以筛选 CE 并选择显示所需活动的方案。
- 原油提取物的分馏
注：图 2B中的流程图中显示了这些步骤。- 使用至少 1 克配制的墨盒。如果生物碱可能存在于 CE 中，请使用含有 0.1% 的福米酸 （FA） 的溶剂。
- 在最合适的溶剂（或溶剂混合物）中稀释样品，以获得100毫克/mL的样品溶液。然后，将样品溶液的 1 mL 传输到预制的固相提取墨盒 - SPE（1 克抽调剂，6 mL 容量）。
- 使用每个萃取的大约三个死卷进行分馏（到 1 g 的墨盒，它将对应于每个溶剂的 2 mL ）。如果生物碱可能存在于 CE 中，请使用含有 0.1% FA 的溶剂。
- 通过精英成分收集一小部分，并保存阿里引用以同时进行化学分析和生物分析。
- 在真空、氮流或冻毒下去除溶剂，并登记称重和产量。
注：如果 CE 难以溶解在初始的 elution 混合物中，则在将材料装载到墨盒顶部之前，以 1：1（w/w） 的比例将 CE 分散在实心相（例如 C18 或 celite）中。
注意事项： 提前称量微管，计算提取物和分数的质量产量。
- 化学分析
注：考虑到每个植物物种的化学分析都需要优化和具体的方法，在以下部分，我们描述了用于分析植物材料的最常见分析方法。作为一个实际的例子，开发并验证了反相液相色谱，用于同时分析酚类化合物和由两个品种 的Casaria西尔维斯· 斯沃茨（Salicacea）分化的苯酚化合物和克莱罗丹型二元体。UPLC-DAD 设备配备了除气器、第四纪泵、自动取样器、UV-Vis 光电二极管阵列探测器和烤箱（详见 Bueno 等人 2015年 18 日）。下列示例中描述的类似方法可根据其他植物物种和/或植物材料进行优化。- 色谱分析和连字符可能性
- 对于使用超高性能液体色谱 （UPLC） 的分离，请使用 C18 色谱柱（例如，150 × 2.1 毫米、2.6 微米、100°）受兼容的预柱保护。
注：其他柱相或色谱模式可根据植物种类/材料使用。传统 HPLC 也可用于：在这种情况下，必须选择合适的色谱列。要实现出色的分离，请根据流速 （μL/min）、柱温 （°C） 和注入体积 （μL） 调整色谱条件。移动相通常由水 （A） 和丙酮三醇或甲醇 （B） 组成，使用线性或多步排泄梯度或异质精英。也可以使用缓冲区、酸、碱或其他修饰剂。 - 执行植物材料分析 （CE 和/或 CEF），并根据可用的连字符记录所有相关数据，如光谱数据（使用紫外线和/或优先使用 MS 探测器）、保留时间（分钟）和其他数据。
注：液相色谱（LC）通常与高分辨率质谱仪（HRMS）连字符（耦合），作为LC+HRMS，通常用于CE OU CEF15中代谢物的快速注释。 - 如果需要定性数据且需要定量数据，则按照相同的协议仔细准备和注入校准曲线。
注：最佳色谱条件的开发可以在实验设计的帮助下进行，如Bueno等人描述的2015年18日，或类似的文献。在方法开发过程中考虑纳入内部标准非常重要。非常感谢他们，因为他们允许在样品准备和注射过程中正确的技术偏差，并进一步正常化的数据分析。
- 对于使用超高性能液体色谱 （UPLC） 的分离，请使用 C18 色谱柱（例如，150 × 2.1 毫米、2.6 微米、100°）受兼容的预柱保护。
- 色谱分析和连字符可能性
- 一次多变体数据分析
- 以适当的格式（例如ASCII、.txt或.csv格式）导出注册的色谱。如果分析多个样本，并且需要比较，则可以通过连接和对齐色度图来设置单个数据矩阵。由此产生的矩阵必须根据使用的内部标准使色谱规范化。
- 使用多变体和多变体方法分析植物代谢学数据。通过使用多变量统计方法（包括无人监督的主要组件分析 （PCA） 和分层聚类分析 （HCA） 或监督的部分最小方块分析（如 PLS、OPLS、PLS-DA）同时分析多个变量，探索和可视化代谢学数据集。单一的方法，如ANOVA，学生，图基和韦尔奇的t测试，是特别有趣的精确分析样品19之间的定量差异。
- 复制和化合物注释
注：此步骤的目标是快速在线识别已知的 NP，以避免可同时执行的单一或多变量数据分析的乏味隔离。- 执行检测到的化合物或目标化合物的识别水平：
- 已识别的化合物，包括完整的3D结构和立体化学（0级）：
- 通过两个正交参数（如保留时间和 MS/MS 频谱（1 级）实现的识别：
- 假定注释化合物和化合物类（2级和3级）：
- 不明或未分类的代谢物，可以根据分析数据（4级）19，20进行区分。
- 使用商业或公共数据库对已知化合物进行特征描述。在最重要的数据库中，可以突出显示：NIST（https://www.nist.gov）、威利（https://www.sisweb.com/software/ms/wiley.htm）、大众银行（https://massbank.eu/MassBank/）、GMD（http://gmd.mpimp-golm.mpg.de/）、METLIN（https://metlin.scripps.edu）和全球天然产品社会分子网络——GNPS数据库（https://gnps.ucsd.edu）19。
注：有不同级别的注释，它们依赖于研究期间使用的连字符技术，可能包括：基于MS（或NMR）的光谱数据库的辅助，以及硅胶光谱预测算法。 - 隔离、净化和完整的复合识别
注：如果给定化合物（其身份被统计方法怀疑）需要完整的结构识别，完成此任务的第一步是更大规模地分离和净化所需的化合物。可以通过扩展已开发的协议来实现。- 通过已建立和优化的预制色谱技术，对目标化合物进行快速和直接隔离。半准备HPLC与干负荷注入可用于避免妥协，通常需要在高负荷和样品溶解1之间。
- 完成分离化合物的完整结构特征和鉴定。这可以通过不同的技术组合来完成：
- 核磁共振（核磁共振）：
- 质谱学（ MS）：
- 紫外线（UV）和红外（IR）区域的光谱技术对于功能组的表征也非常有用：
- 使用脊医光谱学，如电子和振动圆形二极论（ECD和VCD，分别），拉曼光学活性（ROA）和X射线结晶术是绝对配置特征的重要技术。
- 执行检测到的化合物或目标化合物的识别水平：
3. 生物分析
注：生物筛选：为了快速评估CE和CEF潜在的生物活性，应组织和直接对天然物质进行初步筛查。
- 为生物分析准备 CE 和 CEF
- 用最好的溶剂（可以实验确定）重组干物质。实验设计21、22定义了溶剂的库存溶液和浓度。
- 计算库存溶液的溶剂浓度。为此，请使用公式：C1 x V1 = C2 x V2，其中 C1 表示 CE 和/或 CEF 的股票解决方案 （mg）：V1 表示溶剂的体积：C2 是 CE 和/或 CEF 的权重：V2 是库存解决方案的最终卷 （mL）。
注：例如，我们选择了84.15%EtOH和15%二甲基硫化物（DMSO）作为库存溶液的溶剂浓度。我们准备了CE的库存浓度为6毫克/mL，CEF的库存浓度为1毫克/mL13。稀释CE和CEF的溶剂将取决于生物活性的评价方法。用作车辆的溶剂不得干扰生物和毒理学活动。通常，水，DMSO，EtOH，或基于EtOH的水溶剂用于溶解植物提取物或植物衍生物4，13。
- 测试生物的制备
- 重新激活微生物菌株，例如血琼脂上的S.突变UA159（48小时， 37 °C， 5% CO2），并培养它在液体培养介质 （例如， tryptone-酵母提取物汤 [TYE： 2.5% （w/v） 尝试酮与 1.5% （w/v） 酵母提取物] 含有 1% 葡萄糖 （w/v） （TYEg） 16 小时， 37 ° C， 5% CO2.
- 在同一培养介质中对微生物的初始培养进行1：20稀释（初始培养的稀释比可能根据实验设计而改变）。
- 孵化，直到达到中日志生长阶段。
- 在TYEg中准备具有定义人群的生物测定（例如，每毫升2x106 个菌落形成单位-CFU/mL），用于抗微生物检测;TYE，配以1%蔗糖（w/v）（TYE）用于生物膜检测。
注：生长条件将取决于测试的微生物。
- 抗菌活性
注：这些步骤以图 3示例。- 在 96 井板中，添加 CE 和/或 CEF 库存解决方案（处理）的别名 （μL）。名言的体积由测试浓度定义，测试浓度必须根据以前的研究进行选择。例如，要在 0.5 毫克/mL 测试浓度下测试 CE，请在 6 mg/mL 下使用 16.67 μL 的库存溶液。为此计算，使用公式：C1 x V1 = C2 x V2，其中 C1 是库存浓度，V1 是库存溶液的体积，C2 是测试浓度，V2 是 96 井板的体积（对应 200μ L）。在此实验条件下，溶剂（车辆）的测试浓度为 7% EtOH 和 1.25% DMSO。
- 包括一组对照每个板：一列与治疗，没有不孕症（空白控制每个治疗，帮助区分浊度通过治疗本身与微生物生长）：带车辆和气管的柱子（CE 或 CEF 或 0 毫克/mL 控制的凹痕）;仅具有培养介质（培养介质控制）的列和仅具有不言自检（微生物生长控制）的列。
- 使用 TYEg，将音量调整为 100 μL。接下来，孵化，例如，24小时，37°C，5%二氧化碳 （取决于测试的微生物）。
- 将 100μL 的微生物接种到 96 井板中（1x10 6 CFU/mL）。
- 通过对油井的目视检查（晴朗或多云），根据浊度分析细菌生长。清晰：意味着微生物没有视觉增长。多云：意味着微生物有视觉增长。
- 测量每口井细菌培养物的吸收（光学密度或 O.D.）（使用 540 nm 的 ELISA 读卡器）。接下来，将100μL的培养物转移到含有900μL盐溶液（0.89%NaCl）的微管中，通过旋涡混合良好。接下来，继续执行十倍串行稀释，直到达到预期值。
- 在特定的琼脂板（重复）中接种所需稀释的别名。例如，血液琼脂板上特定稀释的 10 微升。
- 孵化。微生物之间的条件可以改变，例如，S.突变体：48小时，37°C，5%二氧化碳。
- 执行殖民地计数在板上以后转换为CFU/mL作为（一些殖民地x 10 n）/q。在此公式中，n等于稀释的绝对值（0、1、2 或 3），q等于在 mL 中，用于在 agar 板上镀上的每一个稀释板的移液量。此外，CFU/mL 可以转换为日志值。
注：当植物提取物被添加到培养介质中时，可能会产生萃取物颗粒的沉淀。这一事实可能使解释结果变得困难。当微板读取器测量浊度时，也会发生同样的情况，在某些情况下，细胞聚集在微板的底部。此外，根据所使用的提取物，植物叶提取物的颜色可能难以量化浊度23，24。另一种方法使用染料，揭示微生物细胞是否代谢活跃。
- 抗生物胶片活动
注：评估治疗对生物膜形成的影响的步骤见图4。- 生物膜的形成和加工
- 如抗微生物活性协议步骤所述，在 96 井板中稀释培养介质 （TYE） 中的稀释处理。
- 孵化板。在 S. mutans 的 示例中，孵化在 24 小时、37 °C 和 5% CO2期间进行。
- 孵化后，将板放在轨道摇床上（5分钟，37°C，75转/分钟），以松开不粘附于生物膜的细胞。然后，丢弃含有不粘附细胞的培养介质，用0.89%的NaCl清洗剩余的生物膜三次，以去除不粘附细胞。
- 处理过的生物膜生物质的量化
注：这些步骤在 图 4A中的流程图中进行了说明。- 将生物膜清洗在盘子上，为每口井添加 50 μL 的 1% 水晶紫水溶液。
- 在室温下孵化盘子35分钟。
- 用米利Q水清洗染色水井（三次），然后空气干燥60-90分钟。
- 通过在轨道摇床（5 分钟、37 °C、75 rpm）中孵化板，将染色油井中的水晶紫罗兰与 200 μL 的 99% EtOH 分离。
- 将每个油井的 150μL 点名与分离染料转移到另一个板，并量化样品生物量（ELISA 读取器 570 nm）。
- 对经过处理的生物膜的可行微生物群（CFU/mL）进行量化
注：图 4B中的流程图中显示了这些步骤。- 用移液器和 200 μL 的 NaCl 0.89% 从盘子中取出已洗过的生物膜，并将由此产生的悬架单独转移到无菌微管中。
- 每口井额外使用 200 μL 的 NaCl 0.89%，并将其转移到相应的管子中，该管子已经包含 200μL 的初始生物膜悬架。执行此过程，直到达到每个原始井 1 mL 生物膜的总悬浮。
- 使用每根管子的别名来执行十倍的串行稀释。
- 在特定的琼脂板（重复）中接种所需稀释的别名。例如，血液琼脂板上特定稀释的 10 微升。
- 孵化琼脂板（如48小时，37°C，5%二氧化碳），然后计算菌落，以确定CFU/mL如上所述。
- 生物膜的形成和加工
- 生物活性验证阶段
- 唾液颗粒形成
- 使用羟基阿帕特石 （HA） 珠（宏准备陶瓷羟基石类型 I 80 μm） 作为表面，形成唾液膜25.这些珠子表面模仿牙釉质。
- 在微管中称重 HA 珠（例如 10 毫克），并消毒。然后，使用吸附缓冲区（AB缓冲区：50 mM KCl， 1 mM KPO4，1 mm CaCl2，1 mm MgCl2，在 dd-H2O， pH 6.5]25 含有 0.1 m 苯甲基硫化物 （PMSF） 和 0.02% 钠阿齐德 （NaN3）洗珠。
- 收集和准备人类唾液26。有必要得到机构道德委员会的批准。
- 将500μL的唾液加入微管并孵育（40分钟，37°C，24转）。
- 接下来，取出唾液超纳坦并洗珠子（三次用AB缓冲液含有PMSF和NaN3）。sHA珠（带唾液颗粒的HA珠）现已准备好进行下游检测。
注：唾液是从健康志愿者那里收集的。收集后，用AB缓冲液和离心机稀释唾液（1：1 v/v）（1699 x g，20分钟，4°C）。通过过滤消毒（聚乙醚硫氟烃膜过滤器，低结合到0.22微米蛋白质）26.机构道德委员会必须批准这项研究。就我们而言，该机构的道德委员会批准了这项研究（CAAE： 68161417.0.000.5416）。
- 附着在薄膜唾液和葡萄糖上后分离 S. mutans， 用选定的提取物处理
- 如上所述，将微生物培养到中日志生长阶段。
- 当培养物达到所需的 O.D.时，离心机（4000 ×克为 20 分钟），用 0.89% NaCl 溶液清洗，使用与 0.89% NaCl 相同的培养基初始体积重新悬浮颗粒。
- 如果使用链球菌，如 S.突变体，用探针使培养物去链（30s，7W，三次）。如果使用单个细胞有机体，则可以跳过此步骤。
- 检查 O.D. （540 nm） 以将浓度调整为 2 x 106 CFU/mL。
- S. 突变体与唾液颗粒（sHA）的粘附和粘附细胞的分离
注：图 5中的流程图中显示了这些步骤。- 获取上述 sHA 样本。
- 添加一个aliquot（例如，我们添加500μL）的选定治疗（在测试浓度：例如，0.5毫克/mL）或控制在含有 sHA样本的微管中。
- 用治疗或控制（30分钟，37°C，24转/分钟）孵化 sHA 样品;然后，用AB缓冲器（包含PMSF和NaN3）清洗珠子三次。
- 添加微生物培养。在示例中，我们将 500 μL 的 S. mutans 培养（2 x 106 CFU/mL）添加到每个微管中。
- 孵化（1小时，37°C，24 rpm），然后用AB缓冲区清洗三次，去除未绑定的细胞。
- 重新悬念每个样品与阿利克索特（在示例中，我们添加1000μL）的AB缓冲区，并与探头声波（30s，7 W）。
- 使用每个悬架的点名进行十倍的串行稀释，通过在特定的琼脂板上电镀（48 小时、37 °C、5% CO2）来确定可行的菌落数量。接下来，数一数殖民地，以确定上述CFU/mL。
注：声波酸的步骤是执行分离细胞坚持sHA。
- S. 突变体与初始葡萄糖基质（gsHA）的粘附和粘附细胞的分离
注：图6中的流程图中显示了这些步骤。GtfB 酶是从培养超纳坦链球菌米勒里KSB8 中纯化的，该培养物旨在生产 GtfB。净化是使用含有两种蛋白酶抑制剂（0.1 mM PMSF和0.02%NaN 3）27、28的缓冲液，用含有羟基阿帕特石珠的色谱柱进行的。然后，在丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）上检查酶，并染上硝酸银。酶的Aliquot被储存在-80°C，直到使用。- 获取上述sHA样本。接下来，添加一个别名（在示例中，我们添加 500 μL） 的 GtfB 酶到每个管子中，并在同质化剂中孵育（40 分钟，37 °C，24 rpm）。然后，用 AB 缓冲器清洗三次（包含 PMSF 和 NaN3）。
- 在每个微管中加入含有治疗（或测试浓度对照，例如0.5毫克/mL）的蔗糖基板（100毫醇）的别名（例如，500微升）。
- 在同质化剂中孵育样品（4小时37°C，24 rpm）。然后，用AB缓冲液（PMSF和NaN3）进行三次清洗，以去除未纳入合成葡萄糖 （gsHA样本）的治疗和过量的蔗糖。
- 在每个微管中添加 500μL 的 S. mutans （2 x 106 CFU/mL）的别名（在示例中，我们添加 500 μL）。
- 在同质化剂（1小时37°C，24 rpm）中孵化，用AB缓冲液（带PMSF和NaN3）清洗三次，以去除未绑定的细胞。
- 用 AB 缓冲液（带 PMSF 和 NaN3）的方位引用（例如 1000 μL）重新悬生每个样本，并使用探针进行声波处理，以分离粘附于 gsHA（30 s， 7 W）的细胞。
- 使用每个悬架的点名进行十倍的串行稀释，通过在特定的琼脂板上电镀（48 小时、37 °C、5% CO2）来确定可行的菌落数量。接下来，数一数殖民地，以确定上述CFU/mL。
- 唾液颗粒形成
4. 生物数据分析
- 生物分析数据
- 在电子表格中输入生物分析的原始数据。计算每个治疗的微生物生长抑制日志为（CFU/mL治疗 +1） x 日志10。然后，计算微生物生长抑制的日志百分比，与使用车辆控制（原木10 CFU/mL治疗/平均10 CFU/mL的车辆控制）x 100%相比。
- 经治疗（CE和CEF治疗组）和车辆控制（负控制）治疗的浮法培养物和生物量的正确 O.D.如要更正，请将仅含有培养介质（Ablank）的井中处理过的油井的吸收减去为（A处理组介质 /A负控制介质）x 100%。
- 此校正后，计算生物质抑制的百分比，与车辆控制（A处理生物质/平均车辆控制）x 100% 相比。
- 提交生成的原始数据，用于使用特定软件对数据进行统计分析。
注：对给定治疗有效性的解释使用断点（如 IC50/IC90）确定。这些值被定义为能够抑制细菌生长或生物膜形成24的治疗的最低浓度。这些参数可以帮助解释数据，并为选择活性更好的化合物提供基础。
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Representative Results
我们提供了一个例子，使用系统的方法来筛选植物提取物和分数的生物活性，以确定潜在的活性分子为可能的新抗胆碱疗法：抗微生物和抗生物膜活性Cacaaria sylvestris提取物从不同的巴西生物群系对链球菌突变体和念珠菌13。
背景
特定口服微生物-宿主因子-富含蔗糖和淀粉的饮食之间的复杂相互作用可以调节致病生物膜的形成，并启动致癌过程30，31。美国突变体协调与牙齿癌的发展相关的生物膜的致病性，因为它生产负责外聚糖合成的Gtfs，除了其酸原性和酸度31。此外，Gtfs使念珠菌（和其他微生物）的粘附，增加生物膜32，33的毒性。我们进行了抗微生物和抗生物膜活动的C.西尔维斯特里斯叶提取物和分数从不同的巴西生物群系，属于林瓜和西尔维斯特里斯品种对S.穆坦和C.阿尔比坎13。C. 西尔维斯特里斯（"瓜阿通加"）是巴西以及南美洲和亚洲其他国家流行和传统使用的一部分。这种植物被引用在"国家对SUS感兴趣的药用植物名单"（RENISUS），其中包含71种，可以治疗疾病的高发病率在巴西36。var. sylvestris叶提取物的化学特征呈现丰富的植物化学成分，具有丰富的分枝35，而酚类化合物（主要是黄酮类化合物）在万里瓜18中占主导地位。
我们使用协议中描述的方法来识别哪些提取物和C.sylvetris的分数最活跃的微生物被评估，并且，根据使用简单模型的结果，我们选择哪些治疗将测试体外复杂模型（羟基石光盘，微观世界）37，38。在这里，我们介绍了十二个CE对S.突变体的筛选结果。重点是展示这种方法对筛选天然化合物的有用性，而不是解释和讨论数据。
我们从巴西12个不同种群中收集了两个品种的C.sylvestris个体的叶子，包括巴西生物群系的不同形态（请参阅Ribeiro等人2019年13年详情）。收集工作于2012年6月至9月和2013年9月之间进行（SisGen;注册#A00892A）。我们建议收集具有代表性的样本，包括不同化学类型和不同生物群系的个体，以解决次要代谢物的化学变异性问题。如果可用，应收集至少 3 到 5 个人。先前有关植物不具体化学变异性的信息也应考虑由Ribeiro等人描述2019年和布埃诺等人2015年13，18。CE 的化学成分由第 2 步中引用的色谱进行检查，我们在图 7中提供了化学特征。分析化学概况对于整合生物筛选中获得的数据的解释至关重要。
CES被分在十六角、阿科特和MEOH分数中。CE的分馏允许混合物的简化，以增加潜在活性化合物的浓度，并减少化合物之间协同作用和对抗的可能性。此外，在更简单的混合物（分数），它更容易获得光谱数据的化合物比在CE和执行复制分析2。通常，分馏可以通过液体萃取或固相萃取墨盒 （SPE） 完成，这些墨盒包含像 C18 （40 μm， 100 +） 等优先反向相吸入剂。可根据所需化合物的研究目的或化学性质，选择其他附件或附件混合物。如果所选技术是 SPE，则墨盒以前必须用纯有机溶剂（例如 EtOH）激活，并以初始溶剂为条件。提供标准化协议。因此，读者可以根据预期的研究和感兴趣的植物材料进行咨询和调整。
十二个 CE 以 84.15% EtOH 和 15% DMSO 实现 6 毫克/mL（库存解决方案）。在筛选测试之前，我们测试了不干扰微生物生长的乳糖浓度（车辆）。这一步骤很重要，因为它可以防止溶剂的抗菌和抗生物膜作用在测试治疗时影响结果。这些测试可以通过用不同浓度的溶剂（相关和/或分离）处理感兴趣的微生物培养物，在96井板上进行。因此，我们开始我们的筛选与CE在0.5毫克/mL和车辆浓度为7%EtOH和1.25%DMSO。
为了筛查抗菌和抗生物膜活性，96井板被处理如上所述。为此，增加了 16.67 μL 的库存溶液 CE （6 毫克/mL） 的体积，以 0.5 mg/mL 的浓度测试每个 CE。形成的生物膜按照第3步的描述进行处理。这种提取物对 S.mutans（IC 50 或3原木）有效用于评估这种细菌对唾液颗粒和初始葡萄糖基质的"粘附强度"，如第3步所述。
从生物测定中获得的原始数据在 Excel 中组织（如第 4 步所述），并以适当的统计处理13进行分析。识别具有最佳活性的提取物的截止点是 IC50 抑制（3 个日志）。从这个参数，四个提取物表现出良好的反应（图8）。这四个提取物的色谱数据表明，同时存在克莱罗丹型二苯甲酸酯和糖化黄酮类化合物。此外，它们还包括相同的生物群系（大西洋森林）和品种（西尔维斯特里斯）。为了帮助解释生物数据，我们比较了四个提取物的色谱轮廓和其他筛选提取物的最佳活性。与其他提取物相比，具有最佳活性提取物的克莱罗丹型分红素量较高，同时具有糖化黄酮类化合物。这一观察表明，这些提取物的有效性很可能是由于两个次要代谢物之间的协同作用，从而增加了它们的生物活性。即，丙酮类二苯丙胺和糖化黄酮类化合物的综合作用大于其单独作用13的总和。
为了确认在筛选中获得的数据，我们评估了S. mutans的分离后，粘附到唾液颗粒和葡萄糖处理与选定的 CE。这些检测使用体外单一物种的生物膜模型来更好地评估所选粗提取物的生物活性，并确定可能的行动目标。第一次分析验证了所使用的治疗方法是否能够抑制S.mutans对唾液颗粒的粘附，但主要是，粘附在治疗颗粒上的微生物细胞是否可以通过机械刺激更容易地从表面去除，从而中断生物膜形成的第一阶段。在葡萄糖合成过程中添加CE（具有更好的活性）并没有改变唾液颗粒，因为没有CE显著影响粘附在唾液颗粒上的细胞的去除（图9A）。
初始葡萄糖基质（gsHA） 的粘附性可研究这些治疗方法是否可以抑制 S. mutans 与初始葡萄糖基质的粘附。不过，这种方法验证了粘附在处理过的葡萄糖上的微生物细胞是否可以更容易地通过表面的机械刺激去除，从而中断阶段生物膜的形成。三个CE影响了GtfB形成的葡萄糖的质量，因此削弱了 S.突变体 与初始葡萄糖基质的粘附（大多数 S.突变 细胞在粘附葡萄糖后被切除： 图9B）。我们认为，这种行为与次要代谢物13之间的协同作用有关。
系统方法帮助我们识别和选择活性原油提取物，以阻止致癌生物膜的形成。一旦选择并基于色谱剖面图，我们就拥有了阐明复杂模型中分子作用机制的基础。
图2：植物材料提取和分馏流程图。插图显示了准备粗提取物（A）和粗提取物（B） 的分数的实验设计。阿联酋：超声辅助提取;SPE：固体相萃取。 请点击这里查看此数字的较大版本。
图3：评估96井板抗菌活性的实验设计。该图描绘了处理（粗提取物或分数）和对照。对于多种治疗的筛查，请在每口井中使用单个浓度（mg/mL）。CFU/mL：每毫升形成菌落形成单位。O.D.：光学密度。 请点击这里查看此数字的较大版本。
图4：96井板反生物膜检测实验设计。该图显示了处理（粗提取物和分数）和对照。对于各种治疗的筛查，在每口井中使用单个浓度（毫克/mL）。在 A中，说明了对经过处理的生物膜生物量进行量化的步骤。在 B中，显示确定已处理生物膜的人口（CFU/mL）的步骤。 请点击这里查看此数字的较大版本。
图5：评估唾液颗粒粘附的实验设计，其次是粘附细胞的分离。插图显示了要执行的步骤。治疗：根据生物筛查进行选择。 请点击这里查看此数字的较大版本。
图6：实验设计，以评估粘附于初始葡萄糖基质（gsHA），然后是粘附细胞的分离。插图显示了要执行的步骤。治疗：根据生物筛查进行选择。蔗糖基材：100毫米蔗糖。 请点击这里查看此数字的较大版本。
图7：巴西生物群系提取物中丙醇类二恶英和糖化黄酮类化合物的数量。字母S，I和L分别表示品种西尔维斯特里斯，中间和通用语言。保拉·卡罗莱纳·皮雷斯·布埃诺博士的个人交流。这个数字已经从里贝罗等人修改了13。请点击这里查看此数字的较大版本。
图8：从巴西生物群系中提取的C.西尔维斯特里斯粗提取物的抗微生物和抗生物膜活性对抗S.mutans。 A.被处理浮标细胞的百分比CFU（日志10）：经过处理的生物膜的生物量百分比。C. % CFU （日志10） 处理生物膜。所述数据为中位数（跟踪）和四分位数（框）。错误条表示最大值和最小值。星号表示特定提取物与车辆控制 （V） 的统计显著差异，其中：***p ≤ 0.0001;p ≤0.001：**p≤0.01：和*p≤0.05（克鲁斯卡尔-瓦利斯测试，其次是邓恩的多次比较测试）。每个物种的生长控制（未经治疗）代表Sm为S.突变体。每个图形中条形的颜色表示提取物所属的品种，即深灰色：var. sylvestris：浅灰色：瓦尔中间和白色：瓦林瓜。这个数字已经从里贝罗等人修改了13。请点击这里查看此数字的较大版本。
图9：S.突变分离后粘附到经过处理的唾液颗粒和葡萄糖的初始基质。治疗过的唾液颗粒和葡萄糖的S.突变体的释放后数据分别显示在（A）和（B）中。控制车辆 （V） 和两个分析测试的提取物之间没有区别。考虑到车辆控制 （V） 为 100%，获得 CFU/mL 的百分比。所述数据为中位数（跟踪）和四分位数（框）。错误条表示最大值和最小值。星号表示特定提取物与车辆控制 （V） 的统计显著差异，其中 ***p = 0.0001 和 **p < 0.0031 （Kruskal-Wallis 测试，然后是 Dunn 的多次比较测试）。增长控制由Sm代表为S.突变体。图形条形的颜色表示提取物所属的品种，是线条中深灰色的颜色。这个数字已经从里贝罗等人修改了13。请点击这里查看此数字的较大版本。
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Discussion
与天然原油提取物工作相关的主要挑战包括其复杂的组成和经典生物制导隔离研究的不足。虽然这个过程是缓慢的，但它是有效的，并导致在NP研究的主要发现。为了合理化，需要优先级驱动的研究来合理化。因此，使用现代化学分析方法分析CE和分离前的复制是重要的特征研究材料，特别是有用的，以避免重新隔离已知化合物与已经描述的生物活性2，15。此外，获取多维数据对于进一步进行多变量数据分析以找到对观测到的生物活动负责的潜在命中候选者是必要的。因此，研究人员可以专注于这些潜在候选人的隔离（大规模）。
在这里，我们提出了一个系统的方法，从植物提取物和分数活性化合物的生物分析指导识别（体外）。此协议允许采用多目标筛选和分析方法，以便同时筛选和分析多个活动组件。生物分析规模小，产量高，速度快，性价比高，易于繁殖，比传统方法（如最初分离感兴趣的化合物）少消耗试剂39.对于任何天然产品研究，分析工具（例如 HPLC-UV、HPLC-DAD、LC-MS）至关重要。最近，该方法更注重结构（化学为基础），在更高程度上利用了分析和阐明平台（LC-HRMS 和 HRMS/MS、高场 NMR）和复制策略的力量，这些策略包括快速识别已知分子。这一步骤有助于了解化学剖面与生物反应的关系，从而更集中地隔离候选活性代谢物3。有几种成熟的色谱分析方法。对于未知的 NP，有时可能需要执行飞行员才能找到最佳方法。例如，我们使用经验证的色谱分析方法，对C.sylvestris13、18两个品种产生的二次代谢物进行同步分析。在选择色谱方法时，我们建议考虑基于目标化合物的协议，以及所有可用方法的优缺点，特别侧重于其效率，当然，总成本涉及40。
尽管系统方法已证明可用于快速筛选和分析 NP 中的生物活性候选者，但仍存在重要的局限性。例如，生物量和浮现培养物的视觉和O.D.读数可能会产生误报结果13、23、24。使用微板读取器确定培养物的浊度可能会失败，当用于天然化合物23，24。这些失败的发生是因为（i）在某些测试生物体中，细胞聚集在井底，而在其他生物体中，细胞仍然处于悬浮状态：（二）CE中存在的固体颗粒沉淀，导致23、24号井浑浊。NP 的 pH 是一个也必须考虑的因素。治疗液的pH与次要代谢物的化学成分有关，因此影响生物反应。虽然 pH 值不是限制，但应根据研究目的谨慎评估。例如，在牙釉质表面的生物膜模型中，酸度可能导致不需要的釉质去纳化。在这些情况下，有必要在适当的缓冲器的帮助下调整 pH。因此，有必要进行测试，以验证pH调整是否影响先前观察到的生物反应。
评估新化合物活性的经典测试包括确定最低抑制浓度 （MIC） 和最低杀菌剂或真菌浓度 （MBC 或 MFC）29，41。然而，当目标是筛选许多植物提取物和分数时，该技术将变得详尽无遗。生物筛选可以进行单一浓度的多种处理（例如，来自不同地方的植物提取物）13，42，29。对于这些情况，系统方法是一种高性能的方法，在更少的工作时间内返回一致的结果。在生物筛选中选择的治疗方法可以使用精制模型（临床相关、可行和可重复）进行评估，以确认生物活性。为了控制致癌生物膜，实验室研究应主要侧重于在羟基甲酸物（牙釉质替代品）或釉质表面形成的生物膜，这些生物膜位于直立位置，涂有唾液颗粒37。它还允许以可重复和快速的方式筛选不同品种和生物群系的植物样本。这两个变量（生物群系和品种）的加入至关重要，因为它们影响二次代谢物18化学成分的变异性，并调节生物反应。这种系统方法可用于口服生物膜研究以外的应用。例如，它可以特别有用的其他领域与生物膜有关，使用其他感兴趣的物种。
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Disclosures
没有宣布任何利益冲突。
Acknowledgments
我们感谢联合国ESP化学研究所（NuBBE）的比奥莱奥·德·比奥恩萨奥斯、比奥森特塞·埃·普罗杜托斯·纳图拉伊斯（NuBBE）为植物材料的编写提供实验室。我们还感谢牙科材料和普罗斯特霍顿学部、UNESP、阿拉夸拉/SP的应用微生物实验室。这项研究得到了圣保罗研究基金会（FAPESP #2013/07600–3 至 AJC）的研究资助和奖学金以及间接费用基金 （FAPESP #2017/07408-6 和 FAPESP #2019/23175-7 到 SMR） 的支持： #2011/21440–3 和#2012/21921–4 至 PCPB）。国家科学和技术发展委员会与FAPESP合作提供了额外支持（国家科学技术中心#465637/2014-0和FAPESP#2014/50926-0至AJC）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well microplates | Kasvi | Flat bottom | |
| Activated carbon | LABSYNTH | Clean up and/or fractionation step | |
| Analytical mill | Ika LabortechniK | Model A11 Basic | |
| Blood agar plates | Laborclin | ||
| Chromatographic column C18 | Phenomenex Kinetex | 150 × 2.1 mm, 2.6 µm, 100Â | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | Vehicle solution | |
| ELISA plate reader | Biochrom Ez | ||
| Ethanol | J. T. Baker | For extraction and fractionation steps, and mobile phase composition | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | Vehicle solution | |
| Ethyl acetate | J. T. Baker | Fractionation step | |
| GraphPad Software | La Jolla | GraphPad Prism7 | |
| Hexane | J. T. Baker | Fractionation step | |
| Incubator | Thermo Scientific | ||
| Isopropanol | J. T. Baker | For extraction step | |
| Lyophilizer (a freeze dryer) | Savant | Modulyo | |
| Nylon Millipore | LAC | 0.22 µm x 13 mm | |
| Orbital shaker | Quimis | Model G816 M20 | |
| Polyamide solid phase extraction cartridge | Macherey-Nagel | Clean up and/or fractionation step | |
| Silica gel | Merck | 40–63 μm, 60 Â | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Synth | 0,89% in water | |
| Solid phase extraction cartridges (SPE) | Macherey-Nagel | Clean up and/or fractionation step | |
| Tryptone | Difco | ||
| UHPLC-DAD | Dionex | Ultimate 3000 RS | |
| Ultrasonic bath | UNIQUE | Model USC 2800 | |
| Yeast extract | Difco |
References
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