Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Systematiskt tillvägagångssätt för att identifiera nya antimikrobiella och antibiofilmmolekyler från växters extrakt och fraktioner för att förhindra karies

Published: March 31, 2021 doi: 10.3791/61773
Automatic Translation
*1, *1, *2, 2,3, 2, 1
1Department of Dental Materials and Prosthodontics, School of Dentistry, São Paulo State University (UNESP), 2Department of Organic Chemistry, Institute of Chemistry, São Paulo State University (UNESP), 3Faculty of Pharmaceutical Sciences of Ribeiraão Preto (FCFRP-USP), Department of Physics and Chemistry, University of São Paulo
* These authors contributed equally

Summary

Naturliga produkter utgör lovande utgångspunkter för utveckling av nya läkemedel och terapeutiska medel. Men på grund av den höga kemiska mångfalden är det en utmanande och tidskrävande uppgift att hitta nya terapeutiska föreningar från växter. Vi beskriver ett förenklat tillvägagångssätt för att identifiera antimikrobiella och antibiofilm molekyler från växt extrakt och fraktioner.

Abstract

Naturliga produkter ger strukturellt olika ämnen, med en myriad av biologiska aktiviteter. Identifiering och isolering av aktiva föreningar från växter är dock utmanande på grund av den komplexa växtmatrisen och tidskrävande isolerings- och identifieringsförfaranden. Därför presenteras ett stegvis tillvägagångssätt för screening av naturliga föreningar från växter, inklusive isolering och identifiering av potentiellt aktiva molekyler. Det inkluderar insamling av växtmaterialet; Beredning och fraktionering av råextrakt. Metoder för kromatografi och spektrometri (UHPLC-DAD-HRMS och NMR) för analys och identifiering av föreningar. Bioassays (antimikrobiella och antibiofilmsaktiviteter; bakteriell "vidhäftningsstyrka" till saliv pellikeln och den ursprungliga glukanmatrisen som behandlats med utvalda behandlingar). och dataanalys. Modellen är enkel, reproducerbar och möjliggör screening med hög genomströmning av flera föreningar, koncentrationer och behandlingssteg kan kontrolleras konsekvent. De erhållna uppgifterna utgör grunden för framtida studier, inklusive formuleringar med de mest aktiva extrakten och/eller fraktionerna, isolering av molekyler, modelleringsmolekyler till specifika mål i mikrobiella celler och biofilmer. Ett mål för att kontrollera kariogen biofilm är till exempel att hämma aktiviteten hos Streptococcus mutans glukosyltransferaser som syntetiserar den extracellulära matrisens glukaner. Hämningen av dessa enzymer förhindrar biofilmuppbyggnaden, vilket minskar dess virulens.

Introduction

De tidigaste läkemedelsmodellerna som används i samhällen baserades på naturliga produkter.The earliest models of medicine used in societies were based on natural products (NPs). Sedan dess har människor letat efter nya kemikalier i naturen som kan omvandlas till droger1. Denna sökning orsakade en kontinuerlig förbättring av teknik och metoder för etnobotanisk screening1,2,3. NPs erbjuder en rik källa till strukturellt olika ämnen, med ett brett utbud av biologiska aktiviteter som är användbara för att utveckla alternativa eller adjuvanta terapier. Den inneboende komplexa växtmatrisen gör dock isoleringen och identifieringen av de aktiva föreningarna till en utmanande och tidskrävande uppgift4.

NPs-baserade läkemedel eller formuleringar kan användas för att förebygga och/eller behandla flera tillstånd som påverkar orala, inklusive karies4. Karies, en av de vanligaste kroniska sjukdomarna globalt, härrör från interaktionen mellan sockerrik kost och mikrobiella biofilmer (dental plack) som bildas på tandytan som leder till demineralisering orsakad av organiska syror som härrör från mikrobiell metabolism, och om den inte behandlas, leder till tandförlust5,6. Även om andra mikroorganismer kan associeras7, är Streptococcus mutans en kritisk kariogen bakterie eftersom den är surogen, sur och en extracellulär matrisbyggare. Denna art kodar för flera exoenzymer (t.ex. glykosyltransferaser eller gtfs) som använder sackaros som substrat8 för att bygga den extracellulära matrisen rik på exopolysackarider, som är en virulensbestämandefaktor 9. Svampen Candida albicans kan också driva upp produktionen av den extracellulära matrisen7. Även om fluor, administreras i olika former, förblir grunden för att förhindra karies10, behövs nya metoder som adjuvanser för att öka dess effektivitet. Dessutom är de tillgängliga antiplackmodaliteterna baserade på användning av bredspektrummikrobicida medel (t.ex. klorhexidin)11. Som ett alternativ är NPs potentiella terapier för att kontrollera biofilmer och förebygga karies12,13.

De ytterligare framstegen i upptäckten av nya bioaktiva föreningar från växter omfattar nödvändiga steg eller metoder såsom i) användning av tillförlitliga och reproducerbara protokoll för provtagning, med tanke på att växter ofta uppvisar intraspecifik variabilitet, ii) användning av tillförlitliga och reproducerbara protokoll för provtagning, med beaktande av att växter ofta uppvisar intraspecifik variabilitet, ii) användning av tillförlitliga och reproducerbara protokoll för provtagning, med beaktande av att växter ofta uppvisar intraspecifik variabilitet, ii) användning av tillförlitliga och reproducerbara protokoll för provtagning, med beaktande av att växter ofta uppvisar intraspecifik variabilitet, ii) användning av tillförlitliga och reproducerbara protokoll för provtagning, med beaktande av att växter ofta uppvisar intraspecifik variabilitet, ii) Beredning av omfattande extrakt och deras respektive fraktioner i liten skala. iii) Karakteriseringen och/eller derepliceringen av deras kemiska profiler, t.ex. iv) Användning av livskraftiga modeller och högavkastande modeller för att bedöma bioaktivitet. v) Urval av potentiella nya träffar på grundval av multivariat dataanalys eller andra statistiska verktyg. vi) att utföra isolering och rening av de målinriktade föreningarna eller de lovande kandidaterna, och vii) validering av de motsvarade biologiska aktiviteterna med hjälp av de isoleradeföreningarna 2,14.

Dereplication är processen att snabbt identifiera kända föreningar i råextrakt och tillåter differentiering av nya föreningar från de som redan har studerats. Dessutom förhindrar denna process isolering när bioaktivitet redan har beskrivits för vissa föreningar, och det är särskilt användbart att upptäcka "frekventa hitters". Det har använts i olika oberiktade arbetsflöden som sträcker sig från större sammansatt identifiering eller acceleration av aktivitetsstyrd fraktionering fram till kemisk profilering av samlingar av extrakt. Det kan integreras helt med metabolomiska studier för obeladda kemiska profilering av CE eller riktad identifiering av metaboliter. Allt detta leder slutligen till att prioritera extrakt före isoleringsförfarandena1,15,16,17.

Därför beskriver vi i det nuvarande manuskriptet ett systematiskt tillvägagångssätt för att identifiera antimikrobiella och antibiofilmmolekyler från växtextrakt och fraktioner. Den innehåller fyra tvärvetenskapliga steg: (1) insamling av växtmaterial; 2. Beredning av råextrakt (CE) och fraktioner (FSE), följt av deras kemiska profilanalys. 3. Bioassays. och (4) biologiska och kemiska dataanalyser (figur 1). Således presenterar vi protokollet utvecklat för att analysera de antimikrobiella och antibiofilm aktiviteterna i Casearia sylvestris extrakt och fraktioner mot Streptococcus mutans och Candida albicans13, liksom förfarandena för fytokemisk karakterisering och dataanalys. För enkelhetens skull är fokus här att demonstrera tillvägagångssättet för screening av naturliga föreningar med hjälp av bakterien.

Figure 1
Figur 1: Flödesschema över det systematiska tillvägagångssättet för att identifiera aktiva molekyler från växters extrakt och fraktioner. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Insamling av växtmaterial

  1. Växtmaterial
    1. Registrera tillgången till växtmaterialet på elektroniska plattformar som reglerar tillgången till genetiskt arv i det land där samlingen kommer att äga rum. I Brasilien registrerar du dig till exempel hos det nationella systemet för hantering av genetiskt arv och tillhörande traditionell kunskap – SisGen (https://sisgen.gov.br/paginas/login.aspx).
    2. Samla prover av växtmaterialet av intresse (t.ex. löv, stjälkar, rötter, blommor, frukter). Registrera om materialet samlades in under reproduktions- eller vegetativfasen.
    3. Registrera insamlingsparametrarna (datum, georeferencing, genomsnittlig årstemperatur och genomsnittlig fuktighetsprocent).
    4. Identifiera proverna exakt, och en taxonomist måste bekräfta äktheten.
  2. Stabilisering och lagring av växtprover
    1. Separera växtorganen i enskilda plastpåsar eller flaskor omedelbart efter uppsamlingen.
    2. Inaktivera potentiella enzymatiska reaktioner genom att i) omedelbart frysa i flytande kväve, ii) dehydrera i en cirkulerande luftugn (40 °C) eller iii) frysa proverna genom lyofilisering.
    3. Förvara det stabiliserade materialet i hermetiskt tillslutna påsar vid rumstemperatur eller i en frys tills det används (-20 eller -80 °C, beroende på lagringsperiod eller avsedd användning).
    4. Slipa proverna i ett analysbruk (kniv eller kula, beroende på vävnadstyp eller tillgänglighet) och standardisera partikelstorleken med hjälp av standardiserade siktar.
    5. Väg proverna individuellt för de efterföljande extraktionsstegen.

2. Beredning av råextrakt (CE) och fraktioner (FSE) till kemisk profilanalys och bioassays

  1. Beredning av råextrakt (CE)
    Obs: Stegen illustreras i flödesschemat i figur 2A.
    1. Förbered ett extraktionsmedel med en hydroalkoholblandning (t.ex. etanol (EtOH) 70% eller ternaryblandningar av vatten, EtOH och andra modifierare, definierade av experimentell design av enligt tidigare rapporter).
    2. Använd förhållandets provvikt (torrvikt, mg)/ extraktionsmedel (mL) som varierar från 50 till 100 mg för varje ml lösningsmedel.
    3. För snabba och reproducerbara extraktioner, använd batchextraktioner med hjälp av mikrorör.
      OBS: Minst tre replikat bör användas vid denna tidpunkt för att möjliggöra statistisk analys.
    4. Utför ultraljudsassisterade extraktioner (UAE) för att göra det snabbt, enkelt och billigt.
    5. Upprepa proceduren tre gånger (15 min vardera) för bästa effektivitet.
    6. Efter varje extraktionssteg dekantcerar du de fasta resterna genom centrifugering och tar bort supernatanten.
    7. Kombinera supernatanter individuellt, filtrera och spara alikvoter för samtidig kemisk analys och bioassays. Ta vid behov bort det extraherande lösningsmedlet under vakuum, kväveflöde eller lyofilisering och registrera vägning och utbyte.
    8. Förvara vid -20 °C skyddad mot ljus.
      PROTOKOLLET kan pausas här för att screena CE och välja de som presenterar önskad aktivitet.
  2. Fraktionering av råextrakt (FSE)
    Obs: Stegen illustreras i flödesschemat i figur 2B.
    1. Använd patroner med minst 1 g adsorbent. Om alkaloider potentiellt förekommer i CE, använd lösningsmedel som innehåller 0,1% av myrsyran (FA).
    2. Späd provet i det lämpligaste lösningsmedlet (eller lösningsmedelsblandningen) för att få en provlösning på 100 mg/ml. Överför sedan 1 ml av provlösningen till en förbetingad extraktionspatron med fast fas - SPE (1 g adsorbent, 6 ml kapacitet).
    3. Utför fraktioneringen med cirka tre döda volymer av varje extraktions eluent (till en patron på 1 g motsvarar den 2 ml av varje lösningsmedel). Om alkaloider potentiellt förekommer i CE, använd lösningsmedel som innehåller 0,1% av FA.
    4. Samla en fraktion genom eluent sammansättning och spara alikvoter för samtidig kemisk analys och bioassays.
    5. Ta bort lösningsmedlet under vakuum, kväveflöde eller lyofilisering och registrera vägning och utbyte.
      OBS: Om CE är svår att lösa upp i den ursprungliga elueringsblandningen, sprid CE i en fast fas (t.ex. C18 eller celit) i proportion 1:1 (w/w) innan materialet lastas på patronens översida.
      VARNING: Väg mikrorören i förväg för att beräkna massutbytet av extrakt och fraktioner.
  3. Analys av kemisk profilering
    OBS: Med tanke på att varje växtart kräver optimerade och specifika metoder för sin kemiska analys, beskriver vi i följande avsnitt de vanligaste analytiska metoderna som används för att analysera växtmaterial. Som ett praktiskt exempel utvecklades och validerades en omvänd fas flytande kromatografi för samtidig analys av fenolföreningar och clerodan-typ diterpenes differentiellt biosynteserade av två sorter av Casearia sylvestris Swartz (Salicaceae). UPLC-DAD-apparaten var utrustad med en avgasare, en kvartärpump, en automatisk provtagare, en UV-Vis fotodiodmatrisdetektor och en ugn (se detaljer i Bueno et al. 201518). Liknande metoder som beskrivs i följande exempel kan optimeras enligt andra växtarter och/eller växtmaterial.
    1. Kromatografisk analys och avstavningsmöjligheter
      1. För separationer med ultrahögprestanda flytande kromatografi (UPLC), använd en C18 kromatografisk kolumn (t.ex. 150 × 2,1 mm, 2,6 μm, 100 Å) skyddad av en kompatibel förkolonn.
        OBS: Andra kolumnfaser eller kromatografiska lägen kan användas beroende på växtarter/material. Konventionell HPLC kan också användas; I så fall måste en lämplig kromatografisk kolumn väljas. För att uppnå utmärkta separationer, justera kromatografiska förhållanden med tanke på flödeshastigheten (μL/min), kolumntemperaturen (°C) och injektionsvolymen (μL). Den mobila fasen består vanligtvis av vatten (A) och acetonitril eller metanol (B) med linjära eller multistep elueringsgradienter eller isokratisk eluering. Modifierare som buffertar, syror, baser eller andra kan också användas.
      2. Utför växtmaterialanalysen (CE och/eller FSE) och registrera alla relaterade data, såsom spektraldata (med hjälp av UV-Vis och/eller, företrädesvis, MS-detektorer), retentionstid (min) och andra, beroende på tillgänglig avstavning.
        OBS: Flytande kromatografi (LC) är vanligtvis avstavad (tillsammans) med högupplöst masspektrometri (HRMS), som LC−HRMS, och används ofta för snabb anteckning av metabolit i CE ou CEF15.
      3. Om kvalitativa data krävs och kvantitativa data är nödvändiga, förbered och injicera kalibreringskurvor noggrant enligt samma protokoll.
        OBS: Utvecklingen av de bästa kromatografiska förhållandena kan utföras med hjälp av utformningen av experiment, som beskrivs av Bueno et al. 201518, eller liknande litteratur. Det är viktigt att överväga att inkludera interna standarder under metodutvecklingen. De är mycket uppskattade eftersom de tillåter korrekta tekniska avvikelser under provberedning och injektioner, och ytterligare normalisering för dataanalys.
  4. Univariat och multivariat dataanalys
    1. Exportera de registrerade kromatogrammen i lämpligt format (t.ex. ASCII, .txt. eller .csv format). En enda datamatris kan ställas in genom att sammanfoga och justera kromatogrammen om flera exempel analyseras och jämförelser krävs. De resulterande matriserna måste normaliseras kromatogrammen enligt den interna standard som används.
    2. Analysera växtmetabolomikdata med hjälp av multivariata och univariata metoder. Utforska och visualisera metabolomiska datamängder genom samtidig analys av flera variabler med hjälp av multivariata statistiska metoder, inklusive oövervakad huvudkomponentanalys (PCA) och hierarkisk klusteranalys (HCA), eller övervakad partiell analys av minsta kvadrater (såsom PLS, OPLS, PLS-DA). Univariate metoder, såsom ANOVA, Student's, Tukey och Welchs t-test, är särskilt intressanta för den exakta analysen av kvantitativa skillnader mellan prover19.
  5. Dereplication och sammansatt anteckning
    OBS: Syftet med detta steg är att snabbt identifiera kända NPs online för att undvika tråkig isolering som kan utföras samtidigt till uni- eller multivariate dataanalysen.
    1. Utför identifieringsnivåerna för de detekterat eller målföreningarna:
      1. Identifierad förening, inklusive fullständig 3D-struktur och stereokemi (nivå 0).
      2. Identifiering som uppnås med två orthogonala parametrar, såsom retentionstid och MS/MS-spektrum (nivå 1).
      3. Putativt kommenterade föreningar och sammansatta klasser (nivåerna 2 och 3);
      4. Oidentifierade eller oklassificerade metaboliter som kan differentieras baserat på analysdata (nivå 4)19,20.
    2. Karakterisera de kända föreningarna med hjälp av kommersiella eller offentliga databaser. Bland de viktigaste databaserna kan det markeras: NIST (https://www.nist.gov), Wiley (https://www.sisweb.com/software/ms/wiley.htm), MassBank (https://massbank.eu/MassBank/), GMD (http://gmd.mpimp-golm.mpg.de/), METLIN (https://metlin.scripps.edu) och Global Natural Products Social Molecular Networking – GNPS-databasen (https://gnps.ucsd.edu)19.
      OBS: Det finns olika nivåer av anteckningar och de beror på den avstavade tekniken som används under studien och kan omfatta: hjälp av MS- (eller NMR) baserade spektral databaser, och i silico spektral förutsägelse algoritmer.
    3. Isolering, rening och fullständig sammansatt identifiering
      OBS: Om en given förening (vars identitet misstänktes med de statistiska metoderna) behöver fullständig strukturell identifiering, är det första steget för att utföra denna uppgift att isolera och rena önskade föreningar i större skala. Det kan åstadkommas genom att skala upp de redan utvecklade protokollen.
      1. Utför den snabba och direkta isoleringen av målföreningen (er) med förberedande kromatografiska tekniker väletablerade och optimerade. Semiförberedande HPLC med torrbelastningsinjektion kan användas för att undvika de kompromisser som i allmänhet måste göras mellan hög belastning och provlöslighet1.
      2. Utför fullständig strukturell karakterisering och identifiering av isolerade föreningar. Detta kan göras genom kombinationen av olika tekniker:
        1. Kärnmagnetisk resonans (NMR);
        2. Masspektrometri (MS);
        3. Spektrometriska tekniker i de ultravioletta (UV) och infraröda (IR) regionerna är också mycket användbara för karakteriseringen av de funktionella grupperna;
        4. Användningen av kiroptisk spektroskopi såsom elektronisk och vibrationsmässig cirkulär diktroism (ECD respektive VCD), Raman optisk aktivitet (ROA) och röntgenkristallografi är viktiga tekniker för absolut konfiguration karakterisering.

3. Bioassays

OBS: Biologisk screening: För att snabbt bedöma CE och FSE:s potentiella bioaktivitet bör den första screeningen av naturliga ämnen organiseras och vara enkel.

  1. Beredning av CE och FSE för bioassays
    1. Rekonstruera torrsubstansen med bästa möjliga lösningsmedel (som kan bestämmas experimentellt). Den experimentelladesignen 21,22 definierar stamlösningen och koncentrationen av lösningsmedel.
    2. Beräkna lösningsmedelskoncentrationen i stamlösningen. För att göra detta, använd formeln: C1 x V1 = C2 x V2, där C1 representerar stamlösningen (mg) av CE och/eller CEF; V1 representerar volymen lösningsmedel. C2 är CE:s och/eller FSE:s vikt. V2 är stamlösningens slutliga volym (ml).
      OBS: Till exempel valde vi 84,15% EtOH och 15% dimetylsulfoxid (DMSO) som lösningsmedelskoncentration av stamlösningen. Vi förberedde lagerkoncentrationen av CE till 6 mg/ml och FSE till 1 mg/ml13. Lösningsmedlet för att späda ut CE och FSE beror på metoden för utvärdering av den biologiska aktiviteten. Det lösningsmedel som används som fordon får inte störa den biologiska och toxikologiska aktiviteten. Vanligtvis används vatten, DMSO, EtOH eller ett vattenhaltigt lösningsmedel baserat på EtOH för att lösliga växtextrakt eller växtderivat4,13.
  2. Beredning av testorganismer
    1. Återaktivera en mikrobiell stam, till exempel S. mutans UA159 på blodagar (48 h, 37 °C, 5% CO2),och odla den i flytande odlingsmedium (t.ex. tryptonejästextraktbuljong [TYE: 2,5% (w/v) tryptone med 1,5% (w/v) jästextrakt] som innehåller 1% glukos (w/v) (TYEg) i 16 h, 37 ° C, 5% CO2.
    2. Utför en utspädning på 1:20 av mikroorganismens ursprungliga kultur i samma odlingsmedium (utspädningsförhållandet för den ursprungliga kulturen kan förändras enligt den experimentella designen).
    3. Inkubera tills den når tillväxtfasen mitt i stocken.
    4. Förbered inokulatet för bioassays med en definierad population (t.ex. 2x106 kolonibildande enheter per milliliter - CFU/mL) i TYEg för antimikrobiella analyser och TYE med 1% sackaros (w/v) (TYEs) för biofilmsanalyser.
      TILLVÄXTFÖRHÅLLANDENA beror på den mikroorganism som testas.
  3. Antimikrobiell aktivitet
    Obs: Stegen illustreras i figur 3.
    1. Tillsätt en alikvot (μL) av CE- och/eller CEF-stamlösningen (behandlingar) i en 96-brunnsplatta. Alikvotens volym definieras av testkoncentrationen, som måste väljas baserat på tidigare studier. Om du till exempel vill testa CE vid testkoncentrationen på 0,5 mg/ml, använd en 16,67 μL alikvot av stamlösningen vid 6 mg/ml. För denna beräkning, använd formeln: C1 x V1 = C2 x V2, där C1 är stamkoncentrationen, V1 är volymen av stamlösningen alikvot, C2 är testkoncentrationen och V2 är volymen på 96-brunnsplattan (vilket motsvarar 200 μL). I detta experimentella tillstånd kommer testkoncentrationen av lösningsmedel (fordon) att vara 7% EtOH och 1,25% DMSO.
    2. Inkludera en uppsättning kontroller för varje platta: en kolumn med behandlingar, utan inokulat (blankkontroll per behandling, hjälper till att skilja grumlighet genom den behandling som används själv från mikrobiell tillväxt); En kolonn med fordon och inokulat (spädning av CE- eller CEF- eller 0 mg/ml-manöverväxt). en kolumn med endast odlingsmediet (odlingsmediumkontroll) och en kolumn med endast inokulat (mikrobiell tillväxtkontroll).
    3. Justera volymen till 100 μL med TYEg. Inkubera sedan till exempel 24 timmar, 37 °C, 5 % CO2 (beroende på vilken mikroorganism som testas).
    4. Inokulera 100 μL mikroorganism inokulat (1x 106 CFU/mL) i 96-brunnsplattan.
    5. Analysera bakterietillväxten enligt grumlighet genom visuell inspektion av brunnarna (klar eller grumlig). Klart: betyder att det inte finns någon visuell tillväxt av mikroorganismen. Grumligt: innebär att det finns visuell tillväxt av mikroorganismen.
    6. Mätning av bakteriekulturens absorbans (optisk densitet eller O.D.) i varje brunn (ELISA-läsare med 540 nm). Överför sedan 100 μL av kulturerna till mikrorör som innehåller 900 μL saltlösning (0,89% NaCl), blanda väl genom virvel. Fortsätt sedan att utföra en tiofaldig seriell utspädning till önskat värde.
    7. Inokulera en alikvot av önskad utspädning i specifika agarplattor (i duplikat). Till exempel 10 μL av en specifik utspädning på blodagarplattor.
    8. Inkubera. Förhållandena kan förändras mellan mikroorganismer, till exempel S. mutans:48 h, 37 °C, 5% CO2.
    9. Utför koloniräkningar på plattorna för senare omvandling till CFU/ml som(Ett antal kolonier x 10 n)/q. I denna formelär n lika med utspädningens absoluta värde (0, 1, 2 eller 3) och q är lika med den mängd, i ml, rört för varje utspädning som pläteras på agarplattan. CFU/ml kan också konverteras till loggvärden.
      OBS: När växtextrakt tillsätts odlingsmediet kan utfällning av partiklar från extrakten förekomma. Detta faktum kan göra det svårt att tolka resultaten. Detsamma inträffar när en mikroplatta läsare mäter grumligheten som i vissa fall celler klumpar på botten av mikroplattan. Dessutom, beroende på extraktet som används, kan färgen på växtbladsextrakt göra det svårt att kvantifiera grumlighet23,24. En alternativ metod använder färgämnen som avslöjar om de mikrobiella cellerna är metaboliskt aktiva eller inte24.
  4. Antibiofilm aktivitet
    OBS: Stegen för att utvärdera effekten av behandlingar på biofilmsbildning illustreras i figur 4.
    1. Bildande och bearbetning av biofilmer
      1. Späd behandlingar i odlingsmedium (TYEs) i en 96-brunnsplatta som beskrivs i stegen i antimikrobiell aktivitet protokoll.
      2. Inkubera plattan. I exemplet med S. mutans utförs inkubationen under 24 timmar, vid 37 °C och 5% CO2.
      3. Efter inkubation, placera plattorna på en orbital shaker (5 min, 37 °C, 75 rpm) för att lossa cellerna som inte klibbas på biofilmen. Kassera sedan odlingsmediet som innehåller de inte vidhäftade cellerna och tvätta de återstående biofilmerna tre gånger med 0,89% NaCl för att ta bort icke-vidhäftande celler.
    2. Kvantifiering av biomassa från behandlade biofilmer
      Obs: Stegen illustreras i flödesschemat i figur 4A.
      1. Förvara biofilmerna tvättade på plattan och tillsätt 50 μL 1% kristallviolett vattenlösning till varje brunn.
      2. Inkubera plattan vid rumstemperatur i 35 min.
      3. Tvätta de färgade brunnarna med MilliQ-vatten (tre gånger) och lufttorka dem sedan i 60-90 min.
      4. Eluera kristallvioletten från de färgade brunnarna med 200 μL 99% EtOH genom att inkubera plattan i en orbital shaker (5 min, 37 °C, 75 varv/min).
      5. Överför en 150 μL alikvot från varje brunn med det eluterade färgämnet till en annan platta och kvantifiera provbiomassan (ELISA-läsaren 570 nm).
    3. Kvantifiering av den livskraftiga mikrobiella populationen (CFU/ml) av de behandlade biofilmerna
      Obs: Stegen illustreras i flödesschemat i figur 4B.
      1. Ta bort de tvättade biofilmerna från plattan med en pipett och 200 μL NaCl 0,89% och överför den resulterande suspensionen individuellt till sterila mikrorör.
      2. Använd ytterligare 200 μL NaCl 0,89% per brunn och överför den till motsvarande rör, som redan innehåller 200 μL av den ursprungliga biofilmsupphängningen. Utför denna process tills du når en total suspension på 1 ml biofilm per originalbrunn.
      3. Använd en alikvot från varje rör för att utföra en tiofaldig seriell utspädning.
      4. Inokulera en alikvot av önskad utspädning i specifika agarplattor (i duplikat). Till exempel 10 μL av en specifik utspädning på blodagarplattor.
      5. Inkubera agarplattor (t.ex. 48 timmar, 37 °C, 5 % CO2)och räkna sedan kolonierna för att bestämma CFU/ml enligt beskrivningen ovan.
  5. Valideringsfas för biologisk aktivitet
    1. Salivary pellicle bildas
      1. Använd Hydroxyapatit (HA) pärlor (Macro-Prep Ceramic Hydroxyapatite Typ I 80 μm) som en yta för att bilda salivfilm25. Dessa pärlor ytan efterliknar dental emalj.
      2. Väg HA-pärlor (t.ex. 10 mg) i mikrorör och sterilisera. Använd sedan adsorptionsbuffert (AB-buffert: 50 mM KCl, 1 mM KPO4,1 mM CaCl2,1 mM MgCl2,i dd-H2O, pH 6,5]25 innehållande 0,1 mM fenylmetylmetylfluorid (PMSF) och 0,02% natriumazid (NaN3)för att tvätta pärlorna.
      3. Samla och förbered mänskligt saliv26. Det är nödvändigt att ha godkännande från den institutionella etikkommittén.
      4. Tillsätt 500 μL saliv i mikrorör och inkubera (40 min, 37 °C, 24 varv/min).
      5. Ta sedan bort salivens supernatant och tvätta pärlorna (tre gånger med AB-buffert som innehåller PMSF och NaN3). SHA-pärlor (HA pärla med salivary pellicle) är nu redo för nedströms analyser.
        OBS: Saliv samlas in från friska frivilliga. Efter uppsamlingen späd saliven (1: 1 v/v) med AB-buffert och centrifug (1699 x g, 20 min, 4 °C). Sterilisera genom filtrering (polyetersulfonmembranfilter med låg bindning till 0,22 μm proteiner)26. Den institutionella etikkommittén måste godkänna studien. I vårt fall godkände institutionens etikkommitté studien (CAAE: 68161417.0.0000.5416).
    2. Lossning av S. mutans efter vidhäftning till filmen salivary och glukaner behandlade med utvalda extrakt
      1. Odla mikroorganismen fram till tillväxtfasen mitt i stocken, enligt beskrivningen ovan.
      2. När kulturer nådde önskad O.D., centrifuge (4000 × g i 20 min), tvätta med 0,89% NaCl-lösning och återanvänd pelleten med 0,89% NaCl med samma ursprungliga volym av odlingsmediet.
      3. Om du använder en streptokocker, såsom S. mutans, sonikera kulturerna med en sond för att dechain (30 s, 7 W, tre gånger). Om du använder en enda cellorganism kan detta steg hoppas över.
      4. Kontrollera O.D. (540 nm) för att justera koncentrationen till 2 x 106 CFU/ml.
    3. Vidhäftning av S. mutans till salivary pellicle (sHA) och avskildhet av vidhäftade celler
      Obs: Stegen illustreras i flödesschemat i figur 5.
      1. Hämta sHA-proverna enligt beskrivningen ovan.
      2. Tillsätt en alikvot (i exemplet lägger vi till 500 μL) av utvalda behandlingar (vid testkoncentrationen; till exempel 0,5 mg/ml) eller kontroller i mikrorör som innehåller prover av sHA.
      3. Inkubera sHA-proverna med behandlingar eller kontroller (30 min, 37 °C, 24 varv/min). tvätta sedan pärlorna tre gånger med AB-buffert (innehållande PMSF och NaN3).
      4. Lägg till mikroorganismkulturen. I exemplet lägger vi till 500 μL S. mutans kultur (2 x 106 CFU/mL) till varje mikrorör.
      5. Inkubera (1 h, 37 °C, 24 varv/min) och ta sedan bort obundna celler genom att tvätta tre gånger med AB-buffert.
      6. Återanvänd varje prov med en alikvot (i exemplet lägger vi till 1000 μL) AB-buffert och ultraljudsbehandling med en sond (30 s, 7 W).
      7. Använd en alikvot av varje suspension för en tiofaldig seriell utspädning för att bestämma antalet livskraftiga kolonier genom att plätera på specifika agarplattor (48 h, 37 °C, 5 % CO2). Räkna sedan kolonierna för att bestämma CFU/ ml enligt beskrivningen ovan.
        OBS: Sonicatets steg utförs för att lossa celler som sitter fast vid sHA.
    4. Vidhäftning av S. mutans till den ursprungliga glukanmatrisen (gsHA) och lossning av vidhäftade celler
      Obs: Stegen illustreras i flödesschemat i figur 6. GtfB enzymet renades från kulturen supernatant Streptococcus milleri KSB8 konstruerades för att producera GtfB. Reningen utfördes med en kromatografi kolumn som innehåller hydroxyapatit pärlor med buffertar som innehåller två proteashämmare (0,1 mM PMSF och 0,02% NaN3)27,28. Sedan kontrollerades enzymet på akrylamidgel (SDS-PAGE) och färgades med silvernitrat. Alikvoter av enzymet lagrades vid -80 °C fram till användning.
      1. Hämta sHA-proverna enligt beskrivningen ovan. Lägg sedan till en alikvot (i exemplet lägger vi till 500 μL) GtfB-enzym till varje rör och inkuberar i en homogenisator (40 min, 37 °C, 24 varv/min). Tvätta sedan tre gånger med AB-buffert (som innehåller PMSF och NaN3).
      2. Tillsätt en alikvot (t.ex. 500 μL) sackarossubstrat (100 ml sackaros) som innehåller behandlingarna (eller kontrollerna vid testkoncentrationen, t.ex. 0,5 mg/ml) i varje mikrorör.
      3. Inkubera proverna i en homogenisator (4 h, 37 °C, 24 varv/min). Utför sedan tre tvättar med AB-buffert (med PMSF och NaN3) för att avlägsna behandlingar och överskott av sackaros som inte ingår i syntetiserade glukaner (prover av gsHA).
      4. Lägg till en alikvot (i exemplet lägger vi till 500 μL) S. mutans inoculum (2 x 106 CFU/mL) till varje mikrorör.
      5. Inkubera i en homogenisator (1 h, 37 °C, 24 varv/min) och tvätta tre gånger med AB-buffert (med PMSF och NaN3) för att avlägsna obundna celler.
      6. Återanvänd varje prov med alikvot (t.ex. 1000 μL) AB-buffert (med PMSF och NaN3)och ultraljudsbehandling med en sond för att lossa celler som fästs vid gsHA (30 s, 7 W).
      7. Använd en alikvot av varje suspension för en tiofaldig seriell utspädning för att bestämma antalet livskraftiga kolonier genom att plätera på specifika agarplattor (48 h, 37 °C, 5 % CO2). Räkna sedan kolonierna för att bestämma CFU/ ml enligt beskrivningen ovan.

4. Analys av biologiska data

  1. Bioassays Data
    1. Mata in rådata för bioassays i ett kalkylblad. Beräkna loggen för mikrobiell tillväxthämning vid varje behandling som (ACFU/ml av behandlingar + 1) x log10. Beräkna sedan loggprocenten av mikrobiell tillväxthämning, jämfört med fordonsstyrning med (Alog10 CFU/ml behandling/mean Alog10 CFU/mL av fordonsstyrning) x 100%.
    2. Korrekt O.D. av planktoniska kulturer och biomassa som behandlas genom behandlingar (CE- och CEF-behandlade grupper) och genom fordonskontroll (negativ kontroll). För korrigering subtrahera absorbansen av behandlade brunnar från den som erhålls i brunnar som endast innehåller odlingsmedium (Ablank) som (Atreated groups medium /A negative controlmedium) x 100%.
    3. Efter denna korrigering, beräkna procentandelen av biomassahämningen, jämfört med fordonskontrollen som(A-behandlad biomassa/medelvärde Afordonskontroll) x 100%.
    4. Skicka in rådata som genererats för statistisk analys av data med hjälp av specifik programvara.
      OBS: Tolkningen av effektiviteten av en viss behandling bestäms med brytpunkter, såsom IC50/IC90. Dessa värden definieras som den lägsta koncentrationen av en behandling som kan hämma 50% respektive 90% av bakterietillväxt eller biofilmsbildning24. Dessa parametrar kan hjälpa till att tolka data och ge en grund för att välja föreningar med bättre aktivitet13,29.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi ger ett exempel på att använda ett systematiskt tillvägagångssätt för att screena den biologiska aktiviteten hos växtextrakt och fraktioner för att identifiera potentiellt aktiva molekyler för möjliga nya kariesbehandlingar: antimikrobiella och antibiofilmaktiviteter av Casearia sylvestris extrakt från distinkta brasilianska biomer mot Streptococcus mutans och Candida albicans13.

Bakgrund
Komplexa interaktioner mellan specifika orala mikroorganismer-värdfaktorer-diet rik på sackaros och stärkelse kan modulera bildandet av patogena biofilmer och initiera en kariogen process30,31. S. mutans orkestrerar patogeniciteten hos biofilmer i samband med utvecklingen av karies eftersom det producerar Gtfs som ansvarar för exopolysaccharides syntes, förutom dess acidogenicity och aciduricity31. Dessutom möjliggör Gtfs vidhäftning av Candida albicans (och andra mikroorganismer), vilket ökar biofilmens virulens32,33. Vi genomförde en screening av antimikrobiella och antibiofilm aktiviteter av C. sylvestris blad extrakt och fraktioner från olika brasilianska biomer, som tillhör lingua och sylvestris sorter mot S. mutans och C. albicans13. C. sylvestris ("guaçatonga") är en del av populär och traditionell användning i Brasilien, och andra länder i Sydamerika och Asien34,35. Denna växt citeras i "National List of Medicinal Plants of Interest to SUS" (RENISUS), som innehåller 71 arter som kan behandla sjukdomarna med hög incidens i Brasilien36. Den kemiska profilen av bladextrakt av var. sylvestris presenterar en rik fytokemisk sammansättning, med rikliga diterpener35, medan fenolföreningar (främst flavonoider) dominerar i var. lingua18.

Vi använder metoden som beskrivs i protokollet för att identifiera vilka extrakt och fraktioner av C. sylvetris som är mest aktiva för de mikroorganismer som utvärderas, och baserat på resultaten med hjälp av förenklade modeller väljer vi vilka behandlingar som kommer att testas in vitro komplexa modeller (hydroxyapatitskivor, mikrokosmer)37,38. Här presenterar vi resultaten av screeningen av de tolv CE mot S. mutans. Fokus ligger på att visa nyttan av detta tillvägagångssätt för screening av naturliga föreningar i stället för att tolka och diskutera data.

Vi samlade blad av individer från de två sorterna av C. sylvestris från tolv olika populationer i Brasilien, bestående av olika formationer av brasilianska biomer (se detaljer i Ribeiro et al. 201913). Samlingen genomfördes mellan juni och september 2012 och 2013 (SisGen; Registrera #A00892A). Vi rekommenderar att du samlar in representativa prover, inklusive individer av olika kemotyper och från olika biomer, för att ta itu med den kemiska variationen hos sekundära metaboliter. Om tillgängligt bör minst 3 till 5 personer samlas in. Tidigare uppgifter om anläggningens infraspecific kemiska variabilitet bör också betraktas som beskrivna av Ribeiro et al. 2019 och Bueno et al. 201513,18. CE:s kemiska sammansättning undersöktes av den kromatografiska som nämns i steg 2 och vi tillhandahåller den kemiska profilen i figur 7. Analysen av den kemiska profilen är nödvändig för att integrera tolkningen av data som erhållits vid biologisk screening.

CEs fraktionerades i Hex, AcOEt och MeOH fraktioner. Fraktionering av CE gör det möjligt att förenkla blandningen för att öka koncentrationen av de potentiellt aktiva föreningarna och minska möjligheterna till synergismer och antagonismer mellan föreningar. Dessutom, i enklare blandningar (fraktioner), är det lättare att få spektraldata av föreningarna än i CE och att utföra dereplicationsanalys2. Vanligtvis kan fraktionering göras genom vätske-vätskeextraktion eller fastfasutsugningspatroner (SPE) som innehåller företrädesvis omvänd fas adsorbent som C18 (40 μm, 100 Å). Andra adsorbenter eller blandningar av adsorbenter kan väljas, beroende på studieändamål eller kemisk karaktär hos de önskade föreningarna. Om den valda tekniken är SPE måste patronerna tidigare aktiveras med rent organiskt lösningsmedel (t.ex. EtOH) och konditioneras med den ursprungliga eluenten. Standardiserade protokoll är tillgängliga. Således kan läsaren konsultera och anpassa dem enligt den avsedda studien och växtmaterial av intresse.

De tolv CE var lösliga med 84,15% EtOH och 15% DMSO för att uppnå 6 mg/mL (stamlösning). Före screeningtesterna testade vi spädningskoncentrationen (fordonet) som inte stör mikrobiell tillväxt. Detta steg är viktigt eftersom det förhindrar att lösningsmedels antimikrobiella och antibiofilmsåtgärder påverkar resultaten vid testning av behandlingar. Testerna kan utföras på en 96-brunnsplatta genom att behandla mikroorganismens kultur med olika koncentrationer av lösningsmedel (associerade och/eller isolerade). Således började vi vår screening med CE vid 0,5 mg/ml och fordon vid en koncentration av 7% EtOH och 1,25% DMSO.

För screening antimikrobiell och antibiofilm verksamhet behandlades 96-brunn plattor som beskrivs ovan. För detta ändamål tillsattes volymen 16,67 μL stamlösning CE (6 mg/ml) för att testa varje CE vid koncentrationen 0,5 mg/ml. De biofilmer som bildades bearbetades enligt beskrivningen i steg 3. Extrakten effektiva mot S. mutans (IC50 eller 3 loggar) användes för att utvärdera "vidhäftningsstyrka" av denna bakterie till salivary pellicle och inledande glucan matris, som beskrivs i steg 3.

Rådata från biologiska analyser organiserades i Excel (enligt beskrivningen i steg 4) och analyserades med lämplig statistisk behandling13. Brytpunkten för att identifiera extrakten med den bästa aktiviteten var IC50-hämningen (3 loggar). Från denna parameter visade fyra extrakt ett gynnsamt svar (Figur 8). Kromatografiska data av dessa fyra extrakt visar samtidig förekomst av clerodane-typ diterpenes och glykosylerade flavonoider. Dessutom innehåller de samma biome (Atlantic Forest) och variation (sylvestris). För att hjälpa till att tolka de biologiska data jämförde vi den kromatografiska profilen för de fyra extrakten med den bästa aktiviteten med de andra screenade extrakten. Jämfört med de andra har extrakten med den bästa aktiviteten en högre mängd clerodanliknande diterpener och samtidigt glykosylerade flavonoider. Denna iakttagelse tyder på att det är troligt att effektiviteten av dessa extrakt beror på en synergistisk interaktion mellan de två sekundära metaboliterna, vilket ökar deras biologiska aktivitet. Det vill säga den kombinerade effekten av clerodan-typ diterpener och glykosylerade flavonoider är större än summan av deras separata effekter13.

För att bekräfta de data som erhållits vid screeningen utvärderade vi avskildhet av S. mutans efter vidhäftning till salivary pellicle och glukaner behandlas med utvalda CE. Analyserna använder biofilmsmodeller av in vitro-enstaka arter för att bättre utvärdera den biologiska aktiviteten hos de utvalda råextrakten och identifiera möjliga åtgärdsmål. Den första analysen verifierar om de behandlingar som används kan hämma vidhäftningen av S. mutans till salivary pellicle, men främst om cellerna i mikroorganismen som har klibbat vid den behandlade pellikeln lättare kan avlägsnas från ytan lättare av den mekaniska stimulansen, vilket avbryter det första steget av biofilmbildning. Tillsatsen av CE (med bättre aktivitet) under syntesen av glukaner ändrade inte salivary pellicle eftersom ingen CE väsentligt påverkade avlägsnandet av celler som klibbades på salivary pellicle (Figur 9A).

Vidhäftningen av den ursprungliga glukanmatrisen (gsHA) undersöker om behandlingarna kan hämma vidhäftningen av S. mutans till den ursprungliga glukanmatrisen. Ändå verifierar denna metodik om de mikroorganismceller som har klibbat vid de behandlade glukanerna lättare kan avlägsnas av den mekaniska stimulansen av ytan, vilket avbryter scenens biofilmbildning. Tre CE påverkade kvaliteten på glukaner som bildas av GtfB och försvagade därför vidhäftningen av S. mutans till den ursprungliga glukanmatrisen (de flesta S. mutans celler avlägsnades efter vidhäftning för glukaner; Figur 9B). Vi tror att detta beteende är relaterat till synergismen mellan de sekundära metaboliterna13.

Systematic Approach har hjälpt oss att identifiera och välja aktiva råextrakt för att stoppa bildandet av kariogena biofilmer. När vi har valts ut och baserat på den kromatografiska profilen har vi grunden för att belysa de molekylära verkningsmekanismerna i komplexa modeller.

Figure 2
Figur 2: Flödesschema över extraktion och fraktionering av växtmaterial. Illustrationen visar den experimentella designen för att förbereda råextrakten(A)och fraktionering av råextrakt (B). Förenade Arabemiraten: Ultraljud assisterad extraktion; SPE: Fast fasutsugning. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 3
Figur 3: Experimentell design för bedömning av antimikrobiell aktivitet i 96-brunnsplattor. Illustrationen visar behandlingar (råa extrakt eller fraktioner) och kontroller. För screening av flera behandlingar, använd en enda koncentration (mg/ml) i varje brunn. CFU/ml: kolonibildande enheter per milliliter. O.D.: optisk densitet. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 4
Figur 4: Experimentell design för antibiofilmsanalys i 96-brunnsplattor. Illustrationen visar behandlingar (råa extrakt och fraktioner) och kontroller. För screening av olika behandlingar, använd en enda koncentration (mg/ml) i varje brunn. I Aillustreras stegen för att kvantifiera biomassa av behandlade biofilmer. I Bvisas stegen för att bestämma populationen (CFU/ml) av de behandlade biofilmerna. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 5
Figur 5: Experimentell design för att utvärdera vidhäftningen till den salivära pellikeln, följt av lösgöring av vidhäftade celler. Bilden visar de steg som ska utföras. Behandlingar: utvalda baserat på biologisk screening. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 6
Figur 6: Experimentell design för att utvärdera vidhäftningen till den ursprungliga glukanmatrisen (gsHA) följt av lösgöring av vidhäftade celler. Bilden visar de steg som ska utföras. Behandlingar: utvalda baserat på biologisk screening. Sackaros substrat: 100 mmol sackaros. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 7
Figur 7: Mängd klerodanliknande diterpener och glykosylerade flavonoider i C. sylvestrisextrakt från brasilianska biomer. Bokstäverna S, I och L anger sorterna sylvestris, mellanliggande respektive lingua. Personlig kommunikation av Dr. Paula Carolina Pires Bueno. Denna siffra har ändrats från Ribeiro et al.13. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 8
Figur 8: Antimikrobiell och antibiofilmsaktivitet hos C. sylvestris råextrakt från brasilianska biomer mot S. mutans.  A. % CFU (stock10)av behandlade planktoniska celler. B. % biomassa av behandlade biofilmer. C. % CFU (stock10)av behandlad biofilm. De beskrivna uppgifterna är median (spår) och interkvartil (rutor). Felstaplarna representerar de högsta och lägsta värdena. Asteriskerna betecknar en statistiskt signifikant skillnad mellan ett visst extrakt kontra fordonsstyrning (V), där: ****p ≤ 0,0001; p ≤ 0.001, ** p ≤ 0,01; och *p ≤ 0,05 (Kruskal-Wallis test, följt av Dunns flera jämförelsetest). Varje arttillväxtkontroll (utan behandling) representeras som SM för S. mutans. Färgerna på staplarna i varje diagram representerar den sort som extrakten tillhör och är i mörkgrå färg: var. sylvestris; ljusgrå: var. mellanliggande och vit: var. lingua. Denna siffra har ändrats från Ribeiro et al.13. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 9
Figur 9: S. mutans detachment efter vidhäftning till den behandlade salivary pellicle och inledande matrisen av glukaner. Data efter frisättning av S. mutans till den behandlade salivary pellicle och glukaner visas i (A) respektive (B). Det fanns ingen skillnad mellan kontrollfordonet (V) och de utdrag som testades för båda analyserna. Andelen CFU/ml erhölls med tanke på fordonskontrollen (V) som 100%. De beskrivna uppgifterna är median (spår) och interkvartil (rutor). Felstaplarna representerar de högsta och lägsta värdena. Asteriskerna betecknar en statistiskt signifikant skillnad mellan ett specifikt extrakt kontra fordonsstyrning (V), där ****p = 0,0001 och **p < 0,0031 (Kruskal-Wallis-testet, följt av Dunns flerfaldiga jämförelsetest). Tillväxtkontrollen representeras av SM för S. mutans. Färgerna i diagrammens staplar representerar den sort som extrakten tillhör, vilket är färgen mörkgrå till var. sylvestris. Denna siffra har ändrats från Ribeiro et al.13. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De största utmaningarna i samband med arbetet med naturliga råextrakt är deras komplexa sammansättning och bristerna i klassiska biostyrda isoleringsstudier. Även om denna process är långsam är den effektiv och har lett till stora resultat i NP-forskning. För att rationalisera behövs prioriteringsdrivna studier för att rationalisera. Således är användningen av moderna kemiska profileringsmetoder för analys av CE och dereplication före isolering viktigt för att karakterisera det studerade materialet och särskilt användbart för att undvika återisolering av kända föreningar med redan beskriven biologiskaktivitet 2,15. Dessutom är förvärv av flerdimensionella data nödvändigt för att utföra ytterligare multivariat dataanalys för att hitta de potentiella träffar kandidater som ansvarar för de observerade biologiska aktiviteterna. Följaktligen kan forskaren fokusera på isoleringen (i stor skala) av dessa potentiella kandidater.

Här presenterar vi ett systematiskt tillvägagångssätt för bioassay-guidad identifiering (in vitro) av aktiva föreningar från växtextrakt och fraktioner. Detta protokoll tillåter en screening- och analysmetod med flera mål så att flera aktiva komponenter kan screenas och analyseras samtidigt. Bioassaysna är i liten skala och av hög avkastning, är snabba, kostnadseffektiva, lätta att reproducera och konsumerar färre reagenser än traditionella metoder (t.ex. initial isolering av föreningar av intresse)39. För all naturproduktforskning är det av största vikt analysverktygen (till exempel HPLC-UV, HPLC-DAD, LC-MS). Nyligen är tillvägagångssättet mer strukturorienterat (kemibaserat) och utnyttjar i högre grad kraften hos analytiska och klargörande plattformar (LC-HRMS och HRMS/MS, högfälts NMR) och dereplicationsstrategier, som består i snabb identifiering av redan kända molekyler. Detta steg hjälper till att förstå det kemiska profilförhållandet med det biologiska svaret vilket resulterar i mer fokuserad isolering av kandidataktiva metaboliter3. Det finns flera väletablerade metoder för kromatografisk analys. För okända NPs kan det ibland vara nödvändigt att utföra piloter för att hitta bästa möjliga metod. Till exempel använder vi en analytisk metod för kromatografi validerad för samtidig analys av sekundära metaboliter som produceras av två sorter av C. sylvestris13,18. När du väljer en kromatografimetod föreslår vi att man överväger ett protokoll baserat på målföreningen (s) och fördelarna och nackdelarna med alla tillgängliga metoder, med särskilt fokus på deras effektivitet och, naturligtvis, den totala kostnaden involverade40.

Även om det systematiska tillvägagångssättet har visat sig användbart för att snabbt undersöka och analysera bioaktiva kandidater i NPs, finns det fortfarande viktiga begränsningar. Till exempel kan visuella och O.D. avläsningar av biomassa och planktoniska kulturer reproducera falskt positiva resultat13,23,24. Att bestämma grumligheten hos kulturerna med en mikroplåtläsare kan misslyckas när det används för naturliga föreningar23,24. Dessa fel uppstår på grund av att i) i vissa testorganismer är cellerna grupperade längst ner i brunnen, och i andra organismer förblir cellerna i suspension; ii) fasta partiklar som förekommer i CE-fällningen och orsakar grumlighet i brunnarna23,24. PH för NPs är en faktor som också måste beaktas. Behandlingslösningens pH är relaterat till den kemiska sammansättningen av de sekundära metaboliterna och påverkar därför det biologiska svaret. Även om pH inte är en begränsning, bör det bedömas med försiktighet, beroende på syftet med studien. Till exempel, i biofilmmodeller på tandemaljytor, kan surhet orsaka oönskad emalj demineralisering. I dessa fall är det nödvändigt att justera pH med hjälp av lämpliga buffertar. Det är därför nödvändigt att utföra tester för att kontrollera om pH-justeringen påverkade det biologiska svar som observerats tidigare.

De klassiska testerna för att bedöma aktiviteten hos nya föreningar inkluderar bestämning av den lägsta hämmande koncentrationen (MIC) och den lägsta bakteriedödande eller fungicidkoncentrationen (MBC eller MFC)29,41. Men när målet är att screena många växtextrakt och fraktioner blir tekniken uttömmande. Bioscreening kan utföras med en enda koncentration av flera behandlingar (t.ex. växtextrakt från olika platser)13,42,29. För dessa situationer är det systematiska tillvägagångssättet en metod med hög prestanda som ger konsekventa resultat i mindre arbetstid. De behandlingar som väljs ut i den biologiska screeningen kan utvärderas med hjälp av raffinerade modeller (kliniskt relevanta, livskraftiga och reproducerbara) för att bekräfta den biologiska aktiviteten. För kontroll av kariogen biofilm bör laboratoriestudier huvudsakligen inriktas på biofilmer som bildas på hydroxyapatit (tandemaljersättning) eller emaljytor placerade i upprätt läge belagda med en salivär pellicle37. Det möjliggör också screening av växtprover av olika sorter och biomer på ett reproducerbart och snabbt sätt. Införandet av dessa två variabler (biome och sort) är avgörande eftersom de påverkar variabiliteten hos den kemiska sammansättningen av sekundära metaboliter18 och modulerar det biologiska svaret. Detta systematiska tillvägagångssätt kan anpassas/modifieras för tillämpningar utanför oral biofilmsforskning. Det kan till exempel vara särskilt användbart för andra områden relaterade till biofilm, med hjälp av andra arter av intresse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Inga intressekonflikter har deklarerats.

Acknowledgments

Vi uttrycker vår tacksamhet till Núcleo de Bioensaios, Biossíntese e Ecofisiologia de Produtos Naturais (NuBBE) vid Kemiinstitutet i UNESP, Araraquara/SP för att ha tillhandahållit laboratorierna för beredning av växtmaterial. Vi tackar också Applied Microbiology Laboratory vid institutionen för tandmaterial och prostodonti, UNESP, Araraquara/SP. Denna forskning stöddes av ett forskningsanslag från São Paulo Research Foundation (FAPESP #2013/07600–3 till AJC) och stipendier plus overheadfonder (FAPESP #2017/07408–6 och FAPESP #2019/23175–7 till SMR; #2011/21440–3 och #2012/21921–4 till PCPB). Det nationella rådet för vetenskaplig och teknisk utveckling i samarbete med FAPESP gav ytterligare stöd (INCT CNPq #465637/2014–0 och FAPESP #2014/50926–0 till AJC).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well microplates  Kasvi Flat bottom
Activated carbon LABSYNTH Clean up and/or fractionation step
Analytical mill Ika LabortechniK Model A11 Basic
Blood agar plates Laborclin
Chromatographic column C18 Phenomenex Kinetex 150 × 2.1 mm, 2.6 µm, 100Â
Dimethyl sulfoxide  Sigma-Aldrich Vehicle solution
ELISA plate reader Biochrom Ez
Ethanol J. T. Baker For extraction and fractionation steps, and mobile phase composition
Ethanol Sigma-Aldrich Vehicle solution
Ethyl acetate J. T. Baker Fractionation step
GraphPad Software La Jolla GraphPad Prism7
Hexane J. T. Baker Fractionation step
Incubator Thermo Scientific
Isopropanol J. T. Baker For extraction step
Lyophilizer (a freeze dryer) Savant Modulyo
Nylon Millipore LAC 0.22 µm x 13 mm
Orbital shaker Quimis Model G816 M20
Polyamide solid phase extraction cartridge Macherey-Nagel Clean up and/or fractionation step
Silica gel Merck 40–63 μm, 60 Â
Sodium Chloride (NaCl) Synth 0,89% in water
Solid phase extraction cartridges (SPE) Macherey-Nagel Clean up and/or fractionation step
Tryptone Difco
UHPLC-DAD Dionex Ultimate 3000 RS
Ultrasonic bath UNIQUE Model USC 2800
Yeast extract Difco

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Newman, D. J., Cragg, G. M. Natural Products as Sources of New Drugs over the Nearly Four Decades from 01/1981 to 09/2019. Journal of Natural Products. 83 (3), 770-803 (2020).
  2. Wolfender, J. L., Litaudon, M., Touboul, D., Queiroz, E. F. Innovative omics-based approaches for prioritisation and targeted isolation of natural products – new strategies for drug discovery. Natural Product Report. 36 (6), 855-868 (2019).
  3. Michel, T., Halabalaki, M., Skaltsounis, A. New Concepts, Experimental Approaches, and Dereplication Strategies for the Discovery of Novel Phytoestrogens from Natural Sources. Planta Medica. 79 (7), 514-532 (2013).
  4. Jeon, J. G., Rosalen, P. L., Falsetta, M. L., Koo, H. Natural products in caries research: current (limited) knowledge, challenges and future perspective. Caries Research. 45 (3), 243-263 (2011).
  5. Tonetti, M. S., Jepsen, S., Jin, L., Otomo-Corgel, J. Impact of the global burden of periodontal diseases on health, nutrition and wellbeing of mankind: A call for global action. Journal of Clinical Periodontology. 44 (5), 456-462 (2017).
  6. Peres, M. A., et al. Oral diseases: a global public health challenge. Lancet. 394 (10194), 249-260 (2019).
  7. Bowen, W. H., Burne, R. A., Wu, H., Koo, H. Oral biofilms: pathogens, matrix, and polymicrobial interactions in microenvironments. Trends Microbiology. 26 (3), 229-242 (2018).
  8. Paes Leme, A. F., Koo, H., Bellato, C. M., Bedi, G., Cury, J. A. The role of sucrose in cariogenic dental biofilm formation--new insight. Journal of Dental Research. 85 (10), 878-887 (2006).
  9. Koo, H., Falsetta, M. L., Klein, M. I. The exopolysaccharide matrix: a virulence determinant of cariogenic biofilm. Journal of Dental Research. 92 (12), 1065-1073 (2013).
  10. Cury, J. A., de Oliveira, B. H., dos Santos, A. P., Tenuta, L. M. Are dental fluoride releasing materials clinically effective on caries control. Dental Materials. 32 (3), 323-333 (2016).
  11. Mattos-Graner, R. O., Klein, M. I., Smith, D. J. Lessons Learned from Clinical Studies: Roles of Mutans Streptococci in the Pathogenesis of Dental Caries. Current Oral Health Reports. 1, 70-78 (2014).
  12. Rocha, G. R., Florez Salamanca, E. J., de Barros, A. L., Lobo, C. I. V., Klein, M. I. Effect of tt-farnesol and myricetin on in vitro biofilm formed by Streptococcus mutans and Candida albicans. BMC Complementary and Alternative Medicine. 18 (1), 61 (2018).
  13. Ribeiro, S. M., et al. Antimicrobial and antibiofilm activities of Casearia sylvestris extracts from distinct Brazilian Biomes against Streptococcus mutans and Candida albicans. BMC Complementary and Alternative Medicine. 19 (1), 308 (2019).
  14. Pilon, A. C., et al. Metabolômica de plantas: métodos e desafios. Quimica Nova. 43 (3), 329-354 (2020).
  15. Wolfender, J. L., Nuzillard, J. M., Hooft, J. J. J., Renault, J. H., Bertrand, S. Accelerating Metabolite Identification in Natural Product Research: Toward an Ideal Combination of Liquid Chromatography-High-Resolution Tandem Mass Spectrometry and NMR Profiling, in Silico Databases, and Chemometrics. Analytical Chemistry. 91 (1), 704-742 (2019).
  16. Allard, P. M., et al. Pharmacognosy in the digital era: shifting to contextualized metabolomics. Current opinion in biotechnology. 54, 57-64 (2018).
  17. Hubert, J., Nuzillard, J., Renault, J. Dereplication strategies in natural product research: How many tools and methodologies behind the same concept. Phytochemistry Reviews. 16, 55-95 (2017).
  18. Bueno, P. C. P., Pereira, F. M. V., Torres, R. B., Cavalheiro, A. J. Development of a comprehensive method for analysing clerodane-type diterpenes and phenolic compounds from Casearia sylvestris Swartz (Salicaceae) based on ultra-high performance liquid chromatography combined with chemometric tools. Journal of separation science. 38 (10), 1649-1656 (2015).
  19. Bueno, P. C. P., Lopes, N. P. Metabolomics to Characterize Adaptive and Signaling Responses in Legume Crops under Abiotic Stresses. American Chemical Society omega. 5 (4), 1752-1763 (2020).
  20. Blaženović, I., Kind, T., Ji, J., Fiehn, O. Software tools and approaches for compound identification of LC-MS/MS data in metabolomics. Metabolites. 8 (2), 31 (2018).
  21. Eloff, J. N. Quantifying the bioactivity of plant extracts during screening and bioassay-guided fractionation. Phytomedicine: International Journal Of Phytotherapy And Phytopharmacology. 11 (4), 370-371 (2004).
  22. Rios, J. L., Recio, M. C. Medicinal plants and antimicrobial activity. Journal of Ethnopharmacology. 100 (1-2), 80-84 (2005).
  23. Eloff, J. N. A sensitive and quick microplate method to determine the minimal inhibitory concentration of plant extracts for bacteria. Planta Medica. 64, 711-714 (1998).
  24. Eloff, J. N. Avoiding pitfalls in determining antimicrobial activity of plant extracts and publishing the results. BMC Complementary and Alternative Medicine. 19 (1), 106 (2019).
  25. Klein, M. I., Xiao, J., Heydorn, A., Koo, H. An analytical tool-box for comprehensive biochemical, structural and transcriptome evaluation of oral biofilms mediated by mutans streptococci. Journal of Visualized Experiments. (47), e2512 (2011).
  26. Lemos, J. A., Abranches, J., Koo, H., Marquis, R. E., Burne, R. A. Protocols to study the physiology of oral biofilms. Methods in molecular biology. 666, 87-102 (2010).
  27. Venkitaraman, A. R., Vacca-Smith, A. M., Kopec, L. K., Bowen, W. H. Characterization of glucosyltransferase B, GtfC, and GtfD in solution and on the surface of hydroxyapatite. Journal of Dental Research. 74, 1695-1701 (1995).
  28. Vacca-Smith, A. M., Venkitaraman, A. R., Quivey, R. G. Jr, Bowen, W. H. Interactions of streptococcal glucosyltransferases with alpha-amylase and starch on the surface of saliva-coated hydroxyapatite. Archives of Oral Biology. 41, 291-298 (1996).
  29. Van Dijck, P., et al. Methodologies for in vitro and in vivo evaluation of efficacy of antifungal and antibiofilm agents and surface coatings against fungal biofilms. Microbial Cell. 5 (7), 300-326 (2018).
  30. Marsh, P. D. Are dental diseases examples of ecological catastrophes. Microbiology. 149 (2), 279-294 (2003).
  31. Bowen, W. H., Koo, H. Biology of Streptococcus mutans-derived glucosyltransferases: role in extracellular matrix formation of cariogenic biofilms. Caries Research. 45 (1), 69-86 (2011).
  32. Lobo, C. I. V., et al. Dual-species biofilms of Streptococcus mutans and Candida albicans exhibit more biomass and are mutually beneficial compared with single-species biofilms. Journal of Oral Microbioly. 11 (1), 1581520 (2019).
  33. Kim, D., et al. Candida albicans stimulates Streptococcus mutans microcolony development via crosskingdom biofilm-derived metabolites. Scientific reports. 7, 41332 (2017).
  34. Ferreira, P. M. Folk uses and pharmacological properties of Casearia sylvestris: a medicinal review. Anais da Academia Brasileira de Ciencias. 83 (4), 1373-1384 (2011).
  35. Xia, L., Guo, Q., Tu, P., Chai, X. The genus Casearia: a phytochemical and pharmacological overview. Phytochemistry Reviews. 14, 99-135 (2015).
  36. Ferreira, P. M. P., et al. Toxicological findings about an anticancer fraction with casearins described by traditional and alternative techniques as support to the Brazilian Unified Health System (SUS). Journal of Ethnopharmacol. 15, 241 (2019).
  37. Koo, H., Xiao, J., Klein, M. I., Jeon, J. G. Exopolysaccharides produced by Streptococcus mutans glucosyltransferases modulate the establishment of microcolonies within multispecies biofilms. Journal of Bacteriology. 192 (12), 3024-3032 (2010).
  38. Maske, T. T., van de Sande, F. H., Arthur, R. A., Huysmans, M. -C. D. N. J. M., Cenci, M. S. In vitro biofilm models to study dental caries: a systematic review. Biofouling. 33 (8), 661-675 (2017).
  39. Fu, Y., Luo, J., Qin, J., Yang, M. Screening techniques for the identification of bioactive compounds in natural products. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 168, 189-200 (2019).
  40. Sarker, S. D., Nahar, L. An introduction to natural products isolation. Methods in molecular biology. 864, 1-25 (2012).
  41. Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI). Performance standards for antimicrobial susceptibility testing; twenty-fifth informational supplement. Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI). , Wayne, PA. CLSI document M100-S25 (2015).
  42. Saputo, S., Faustoferri, R. C., Quivey, R. G. Jr A drug repositioning approach reveals that Streptococcus mutans is susceptible to a diverse range of established antimicrobials and nonantibiotics. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 62 (1), 01674 (2018).

Tags

Biologi Nummer 169 Mikrobiologi biofilm naturprodukter mutans streptokocker antimikrobiella medel karies läkemedelsupptäckt biologiska metoder
Systematiskt tillvägagångssätt för att identifiera nya antimikrobiella och antibiofilmmolekyler från växters extrakt och fraktioner för att förhindra karies
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ribeiro, S. M., Fratucelli, É. D.… More

Ribeiro, S. M., Fratucelli, É. D. O., Fernandes, J. M., Bueno, P. C. P., Cavalheiro, A. J., Klein, M. I. Systematic Approach to Identify Novel Antimicrobial and Antibiofilm Molecules from Plants' Extracts and Fractions to Prevent Dental Caries. J. Vis. Exp. (169), e61773, doi:10.3791/61773 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter