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Biology

Approche systématique pour identifier les nouvelles molécules antimicrobiennes et antibiofilms à partir d’extraits et de fractions de plantes pour prévenir les caries dentaires

Published: March 31, 2021 doi: 10.3791/61773
Automatic Translation
*1, *1, *2, 2,3, 2, 1
1Department of Dental Materials and Prosthodontics, School of Dentistry, São Paulo State University (UNESP), 2Department of Organic Chemistry, Institute of Chemistry, São Paulo State University (UNESP), 3Faculty of Pharmaceutical Sciences of Ribeiraão Preto (FCFRP-USP), Department of Physics and Chemistry, University of São Paulo
* These authors contributed equally

Summary

Les produits naturels représentent des points de départ prometteurs pour le développement de nouveaux médicaments et agents thérapeutiques. Cependant, en raison de la grande diversité chimique, trouver de nouveaux composés thérapeutiques à partir des plantes est une tâche difficile et longue. Nous décrivons une approche simplifiée pour identifier les molécules antimicrobiennes et antibiofilms à partir d’extraits de plantes et de fractions.

Abstract

Les produits naturels fournissent des substances structurellement différentes, avec une myriade d’activités biologiques. Toutefois, l’identification et l’isolement des composés actifs par rapport aux plantes sont difficiles en raison de la matrice complexe des plantes et des procédures d’isolement et d’identification qui prennent beaucoup de temps. Par conséquent, une approche stepwise pour le criblage des composés naturels des usines, y compris l’isolement et l’identification des molécules potentiellement actives, est présentée. Il comprend la collecte du matériel végétal; préparation et fractionnement d’extraits bruts; les approches de chromatographie et de spectrométrie (UHPLC-DAD-HRMS et NMR) pour l’analyse et l’identification des composés; bioassays (activités antimicrobiennes et antibiofilms; « force d’adhérence » bactérienne à la pellicle salivaire et matrice de glucane initiale traitée avec des traitements sélectionnés); et l’analyse des données. Le modèle est simple, reproductible, et permet un criblage à haut débit de plusieurs composés, concentrations et étapes de traitement peuvent être constamment contrôlés. Les données obtenues fournissent les bases d’études futures, y compris des formulations avec les extraits et/ou fractions les plus actifs, l’isolement des molécules, la modélisation des molécules à des cibles spécifiques dans les cellules microbiennes et les biofilms. Par exemple, une cible pour contrôler le biofilm cariogenic est d’inhiber l’activité des glucosyltransferases de Streptococcus mutans qui synthétisent les glucanes de la matrice extracellulaire. L’inhibition de ces enzymes empêche l’accumulation de biofilm, diminuant sa virulence.

Introduction

Les premiers modèles de médecine utilisés dans les sociétés étaient basés sur des produits naturels (PN). Depuis lors, les humains ont été à la recherche de nouveaux produits chimiques dans la nature qui peuvent être transformés enmédicaments 1. Cette recherche a entraîné une amélioration continue des technologies et des méthodes de dépistage ethnobotanique1,2,3. Les PN offrent une riche source de substances structurellement diversifiées, avec un large éventail d’activités biologiques utiles pour développer des thérapies alternatives ou adjuvantes. Toutefois, la matrice végétale complexe inhérente fait de l’isolement et de l’identification des composés actifs une tâche difficile et fastidieuse4.

Les médicaments ou formulations à base de PN peuvent être utilisés pour prévenir et/ou traiter plusieurs affections affectant l’oral, y compris les caries dentaires4. Caries dentaires, l’une des maladies chroniques les plus répandues dans le monde, dérive de l’interaction de l’alimentation riche en sucre et biofilms microbiens (plaque dentaire) formés sur la surface des dents qui conduit à la déminéralisation causée par des acides organiques dérivés du métabolisme microbien, et si elle n’est pas traitée, conduit à la perte dedents 5,6. Bien que d’autres micro-organismes puissentêtre associés 7, Streptococcus mutans est une bactérie cariogenic critique parce qu’elle est acidogène, acidurique, et un constructeur extracellulaire de matrice. Cette espèce code plusieurs exoenzymes (p. ex., glycosyltransferases ou Gtfs) qui utilisent le saccharose comme substrat8 pour construire la matrice extracellulaire riche en exopolysaccharides, qui sont un déterminant de la virulence9. En outre, le champignon Candida albicans peut conduire jusqu’à la production de cette matrice extracellulaire7. Bien que le fluorure, administré dans diverses modalités, reste la base pour prévenir les caries dentaires10, de nouvelles approches sont nécessaires comme adjuvants pour augmenter son efficacité. De plus, les modalités anti plaque disponibles sont fondées sur l’utilisation d’agents microbicides à large spectre (p. ex., chlorhexidine)11. Comme alternative, les PN sont des thérapies potentielles pour contrôler les biofilms et prévenir les cariesdentaires 12,13.

Les progrès supplémentaires réalisés dans la découverte de nouveaux composés bioactifs provenant de plantes comprennent les étapes ou les approches nécessaires telles que : (i) l’utilisation de protocoles fiables et reproductibles pour l’échantillonnage, étant donné que les plantes présentent souvent une variabilité intraspécifique; (ii) la préparation d’extraits complets et de leurs fractions respectives à petite échelle; iii) la caractérisation et/ou la dréplication de leurs profils chimiques pensaient à l’acquisition de données multidimensionnelles telles que GC-MS, LC-DAD-MS ou NMR, par exemple; iv) l’utilisation de modèles viables et à haut rendement pour évaluer la bioactivité; v) la sélection de nouveaux résultats potentiels basés sur une analyse multivariante des données ou d’autres outils statistiques; vi) d’effectuer l’isolement et la purification des composés ciblés ou des candidats prometteurs; et (vii) la validation des activités biologiques correspondantes à l’aide des composés isolés2,14.

La dréplication est le processus d’identification rapide des composés connus dans l’extrait brut et permet de différecier de nouveaux composés de ceux qui ont déjà été étudiés. En outre, ce processus empêche l’isolement lorsque la bioactivité a déjà été décrite pour certains composés, et il est particulièrement utile de détecter les « frappeurs fréquents ». Il a été utilisé dans différents flux de travail non ciblés allant de l’identification des composés majeurs ou l’accélération de la fractionnement guidé par l’activité jusqu’au profilage chimique des collections d’extraits. Il peut être entièrement intégré avec des études métabolomiques pour le profilage chimique non ciblé de ce ou l’identification ciblée des métabolites. Tout cela conduit finalement à hiérarchiser les extraits avant les procéduresd’isolement 1,15,16,17.

Par conséquent, dans le présent manuscrit, nous décrivons une approche systématique pour identifier les molécules antimicrobiennes et antibiofilms à partir d’extraits végétaux et de fractions. Il comprend quatre étapes multidisciplinaires : (1) la collecte de matériel végétal; (2) la préparation d’extraits bruts (CE) et de fractions (CEF), suivie de leur analyse du profil chimique; (3) bioassays; et (4) les analyses de données biologiques et chimiques (figure 1). Ainsi, nous présentons le protocole développé pour analyser les activités antimicrobiennes et antibiofilms des extraits et fractions de Casearia sylvestris contre streptococcus mutans et candida albicans13, ainsi que les procédures de caractérisation phytochimique et d’analyse des données. Par souci de simplicité, l’objectif ici est de démontrer l’approche de dépistage des composés naturels à l’aide de la bactérie.

Figure 1
Figure 1 : Diagramme de flux de l’approche systématique pour identifier les molécules actives à partir d’extraits et de fractions de plantes. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Protocol

1. Collection de matériel végétal

  1. Matériel végétal
    1. Enregistrez l’accès au matériel végétal sur des plateformes électroniques qui régulent l’accès au patrimoine génétique dans le pays où la collecte aura lieu. Par exemple, au Brésil, inscrivez-vous auprès du Système national pour la gestion du patrimoine génétique et des savoirs traditionnels associés – SisGen (site Web https://sisgen.gov.br/paginas/login.aspx).
    2. Recueillir des échantillons du matériel végétal d’intérêt (p. ex., feuilles, tiges, racines, fleurs, fruits). Inscrivez-vous si le matériel a été recueilli pendant la reproduction ou la phase végétative.
    3. Enregistrez les paramètres de collecte (date, géoréférencement, température annuelle moyenne et pourcentage moyen d’humidité).
    4. Identifier les échantillons avec précision, et un taxonomiste doit confirmer l’authenticité.
  2. Stabilisation et stockage des échantillons végétaux
    1. Séparez les organes végétaux dans des sacs ou des flacons en plastique individuels immédiatement après les collections.
    2. Inactiver les réactions enzymatiques potentielles en gelant immédiatement dans de l’azote liquide, (ii) en déshydratant dans un four à air circulant (40 °C) ou (iii) en gelant les échantillons par lyophilisation.
    3. Conserver le matériau stabilisé dans des sacs hermétiquement scellés à température ambiante ou au congélateur jusqu’à utilisation (-20 ou -80 °C, selon la période d’entreposage ou l’utilisation prévue).
    4. Moudre les échantillons dans un moulin analytique (couteau ou boule, selon le type de tissu ou la disponibilité) et normaliser la taille des particules à l’aide de tamis normalisés.
    5. Pesez les échantillons individuellement pour les étapes d’extraction subséquentes.

2. Préparation d’extraits bruts (CE) et de fractions (CEF) à l’analyse du profil chimique et aux bioassays

  1. Préparation d’extraits bruts (CE)
    REMARQUE : Les étapes sont illustrées dans le diagramme d’écoulement de la figure 2A.
    1. Préparer un solvant d’extraction avec un mélange hydroalcoolique (p. ex., éthanol (EtOH) 70 % ou mélanges ternaires d’eau, etoh, et d’autres modificateurs, définis par la conception expérimentale de selon les rapports précédents).
    2. Utilisez le rapport poids de l’échantillon (poids sec, mg)/ solvant d’extraction (mL) variant de 50 à 100 mg pour chaque mL de solvant.
    3. Pour des extractions rapides et reproductibles, utilisez des extractions par lots à l’aide de microtubes.
      REMARQUE : Au moins trois répliques doivent être utilisées à ce stade pour permettre l’analyse statistique.
    4. Effectuez des extractions assistées par ultrasons (EAU) pour le rendre rapide, facile et bon marché.
    5. Répétez la procédure trois fois (15 min chacun) pour obtenir la meilleure efficacité.
    6. Après chaque étape d’extraction, décanter les résidus solides par centrifugation et enlever le supernatant.
    7. Combinez les supernatants individuellement, filtrez et économisez des aliquots pour une analyse chimique et des bioassays simultanés. Si nécessaire, retirez le solvant d’extraction sous vide, le flux d’azote ou la lyophilisation, et enregistrez la pesée et le rendement.
    8. Conserver à -20 °C à l’abri de la lumière.
      REMARQUE : Le protocole peut être mis en pause ici pour filtrer le CE et sélectionner ceux qui présentent l’activité désirée.
  2. Fractionnement des extraits bruts (CEF)
    REMARQUE : Les étapes sont illustrées dans le diagramme d’écoulement de la figure 2B.
    1. Utilisez des cartouches avec au moins 1 g d’adsorbent. Si les alcaloïdes sont potentiellement présents dans le CE, utilisez des solvants contenant 0,1 % de l’acide formique (FA).
    2. Diluer l’échantillon dans le solvant (ou mélange de solvant) le plus approprié pour obtenir une solution d’échantillon de 100 mg/mL. Ensuite, transférez 1 mL de la solution d’échantillon à une cartouche d’extraction de phase solide précon conditionnée - SPE (1 g d’adsorbent, 6 mL de capacité).
    3. Effectuer la fractionnement en utilisant environ trois volumes morts de chaque eluent d’extraction (à une cartouche de 1 g, il correspondra à 2 mL de chaque solvant). Si les alcaloïdes sont potentiellement présents dans le CE, utilisez des solvants contenant 0,1 % de la FA.
    4. Recueillir une fraction par composition élitente et enregistrer des aliquots pour l’analyse chimique simultanée et les bioassays.
    5. Enlevez le solvant sous vide, le flux d’azote ou la lyophilisation et enregistrez la pesée et le rendement.
      REMARQUE : Si le CE est difficile à dissoudre dans le mélange d’élitution initial, dispersez le CE en phase solide (p. ex., C18 ou celite) en proportion de 1:1 (w/w) avant de charger le matériau sur le dessus de la cartouche.
      MISE EN GARDE: Pesez les microtubes à l’avance pour calculer le rendement en masse des extraits et des fractions.
  3. Analyse du profilage chimique
    REMARQUE : Étant donné que chaque espèce végétale a besoin de méthodes optimisées et spécifiques pour son analyse chimique, dans les sections suivantes, nous décrivons les approches analytiques les plus courantes utilisées pour analyser les matériaux végétaux. À titre d’exemple pratique, une chromatographie liquide en phase inverse a été mise au point et validée pour l’analyse simultanée de composés phénoliques et de diterpenes de type clérodane biosynthésiés différemment par deux variétés de Casearia sylvestris Swartz (Salicaceae). L’appareil UPLC-DAD était équipé d’un dégasser, d’une pompe quaternaire, d’un échantillonneur automatique, d’un détecteur de tableau de photodiodes UV-Vis et d’un four (voir les détails dans Bueno et al., 201518). Des approches similaires décrites dans les exemples suivants peuvent être optimisées en fonction d’autres espèces végétales et/ou de matériaux végétaux.
    1. Possibilités d’analyse chromagraphique et d’hyphenation
      1. Pour les séparations utilisant une chromatographie liquide ultra-performante (UPLC), utilisez une colonne chromatographique C18 (p. ex., 150 × 2,1 mm, 2,6 μm, 100 Å) protégée par une pré-colonne compatible.
        REMARQUE : D’autres phases de colonne ou modes chromatographiques peuvent être utilisés en fonction de l’espèce végétale ou du matériau. Hplc conventionnel peut également être utilisé; dans ce cas, une colonne chromatographic appropriée doit être choisie. Pour obtenir d’excellentes séparations, ajustez les conditions chromatographiques en tenant compte du débit (μL/min), de la température de la colonne (°C) et du volume d’injection (μL). La phase mobile se compose généralement d’eau (A) et d’acétyltrile ou de méthanol (B) à l’aide de gradients d’élitution linéaires ou multi-étapes ou d’élitution isocratique. Des modificateurs tels que des tampons, des acides, des bases ou d’autres peuvent également être utilisés.
      2. Effectuer l’analyse des matières végétales (CE et/ou CEF) et enregistrer toutes les données connexes, telles que les données spectrales (à l’aide d’un UV-Vis et/ou, de préférence, les détecteurs de SP), le temps de rétention (min), et d’autres, selon l’hyphenation disponible.
        REMARQUE : La chromatographie liquide (LC) est habituellement hyphenated (couplée) avec la spectrométrie de masse à haute résolution (HRMS), comme LC−HRMS, et est couramment utilisée pour l’annotation rapide du métabolite dans CE ou CEF15.
      3. Si des données qualitatives sont nécessaires et que des données quantitatives sont nécessaires, préparez et injectez soigneusement des courbes d’étalonnage, selon le même protocole.
        REMARQUE : Le développement des meilleures conditions chromatographic peut être exécuté avec l’aide de la conception des expériences, comme décrit par Bueno et autres 201518,ou littérature semblable. Il est important d’envisager l’inclusion de normes internes lors de l’élaboration de la méthode. Ils sont très appréciés car ils permettent des écarts techniques corrects pendant la préparation de l’échantillon et les injections, et une normalisation plus poussée pour l’analyse des données.
  4. Analyse de données univariate et multivarié
    1. Exporter les chromatogrammes enregistrés dans un format approprié (p. ex., ASCII, .txt. ou .csv format). Une matrice de données unique peut être définie en joignant et en alignant les chromatogrammes si plusieurs échantillons sont analysés, et des comparaisons sont nécessaires. Les matrices qui en résultent doivent être normalisées les chromatogrammes selon la norme interne utilisée.
    2. Analyser les données métabolomiques des plantes à l’aide de méthodes multivariées et univariées. Explorez et visualisez les ensembles de données métabolomiques au moyen de l’analyse simultanée de variables multiples à l’aide de méthodes statistiques multivariées, y compris l’analyse des principaux composants non supervisés (PCA) et l’analyse hiérarchique du clustering (HCA), ou l’analyse partielle des moindres carrés supervisée (comme le PLS, l’OPLS, le PLS-DA). Les méthodes univariables, telles que le t-test d’ANOVA, Student’s, Tukey et Welch, sont particulièrement intéressantes pour l’analyse précise des différences quantitatives entreles échantillons 19.
  5. Dréplication et annotation des composés
    REMARQUE : L’objectif de cette étape est consacré à l’identification rapide en ligne des PN connus afin d’éviter l’isolement fastidieux qui peut être effectué simultanément à l’analyse de données uni ou multivariées.
    1. Effectuer les niveaux d’identification des composés détectés ou cibles :
      1. Composé identifié, y compris la structure 3D complète et la stéréochimie (niveau 0);
      2. Identification réalisée par deux paramètres orthogonaux, tels que le temps de rétention et le spectre MS/SP (niveau 1);
      3. Composés et classes composés putativement annotés (niveaux 2 et 3);
      4. Métabolites non identifiés ou non classifiés qui peuvent être différenciés sur la base de données analytiques (niveau 4)19,20.
    2. Caractériser les composés connus à l’aide des bases de données commerciales ou publiques. Parmi les bases de données les plus importantes, il peut être mis en évidence : NIST (https://www.nist.gov), Wiley (https://www.sisweb.com/software/ms/wiley.htm), MassBank (https://massbank.eu/MassBank/), GMD (http://gmd.mpimp-golm.mpg.de/), METLIN (https://metlin.scripps.edu) et Global Natural Products Social Molecular Networking – base de données GNPS (https://gnps.ucsd.edu)19.
      REMARQUE : Il existe différents niveaux d’annotations et ils dépendent de la technique hyphenated employée pendant l’étude et peuvent inclure : l’aide des bases de données spectrales basées sur ms- (ou NMR), et dans les algorithmes spectrals de prédiction silico.
    3. Isolement, purification et identification complète des composés
      REMARQUE : Si un composé donné (dont l’identité a été suspectée par les méthodes statistiques) a besoin d’une identification structurelle complète, la première étape pour accomplir cette tâche est d’isoler et de purifier les composés désirés à une plus grande échelle. Il peut être accompli en haussant les protocoles déjà développés.
      1. Effectuer l’isolement rapide et direct du composé cible (s) par des techniques chromatographiques préparatives bien établies et optimisées. HpLC semi-preparative avec injection de charge sèche peut être utilisé pour éviter les compromis qui doivent généralement être faites entre le chargement élevé et la solubilisation del’échantillon 1.
      2. Réaliser la caractérisation structurelle complète et l’identification des composés isolés. Ceci peut être fait par la combinaison de différentes techniques :
        1. Résonance magnétique nucléaire (RMN);
        2. Spectrométrie de masse (SP);
        3. Les techniques spectrométriques dans les régions ultraviolettes (UV) et infrarouges (IR) sont également très utiles pour la caractérisation des groupes fonctionnels;
        4. L’utilisation de la spectroscopie chiropticale telle que le dichroism circulaire électronique et vibratoire (ECD et VCD, respectivement), l’activité optique de Raman (ROA), et la cristallographie de rayon X sont des techniques importantes pour la caractérisation absolue de configuration.

3. Bioassays

REMARQUE : Dépistage biologique : Pour évaluer rapidement la bioactivité potentielle de ce et de CEF, le dépistage initial des substances naturelles devrait être organisé et simple.

  1. Préparation de ce et cef pour les bioassays
    1. Reconstituer la matière sèche avec les meilleurs solvants possibles (qui peuvent être déterminés expérimentalement). La conception expérimentale21,22 définissent la solution de stock et la concentration de solvants.
    2. Calculer la concentration de solvants de la solution de stock. Pour ce faire, utilisez la formule : C1 x V1 = C2 x V2, où C1 représente la solution de stock (mg) de CE et/ou de CEF; V1 représente le volume de solvant; C2 est le poids du CE et/ou du CEF; V2 est le volume final (mL) de la solution stock.
      REMARQUE : Par exemple, nous avons choisi 84,15 % d’EtOH et 15 % de sulfure de diméthyle (DMSO) comme concentration de solvants de la solution de stock. Nous avons préparé la concentration de stock du CE à 6 mg/mL et du CEF à 1 mg/mL13. Le solvant pour diluer le CE et le CEF dépendra de la méthode d’évaluation de l’activité biologique. Le solvant utilisé comme véhicule ne doit pas interférer avec l’activité biologique et toxicologique. En règle générale, l’eau, DMSO, EtOH, ou un solvant aqueux à base d’EtOH est utilisé pour solubiliser les extraits de plantes ou les dérivésvégétaux 4,13.
  2. Préparation d’organismes d’essai
    1. Réactiver une souche microbienne, par exemple S. mutans UA159 sur l’agar sanguin (48 h, 37 °C, 5 % de CO2) et culture dans le milieu de culture liquide (p. ex., bouillon d’extrait tryptone-levure [TYE : 2,5 % (w/v) tryptone avec 1,5 % (w/v) extrait de levure) contenant 1 % de glucose (w/v) (TYEg) pendant 16 h, 37 ° C, 5 % de CO2.
    2. Effectuer une dilution de 1:20 de la culture initiale du micro-organisme dans le même milieu de culture (le rapport de dilution de la culture initiale peut changer selon la conception expérimentale).
    3. Incuber jusqu’à ce qu’il atteigne la phase de croissance mi-journal.
    4. Préparer l’inoculum à des bioassays avec une population définie (p. ex., 2x106 unités de formation de colonies par millilitre - CFU/mL) dans TYEg pour les essais antimicrobiens et TYE avec 1 % de saccharose (w/v) (TYEs) pour les essais de biofilms.
      REMARQUE : Les conditions de croissance dépendront du micro-organisme testé.
  3. Activité antimicrobienne
    REMARQUE : Les étapes sont illustrées à la figure 3.
    1. Dans une assiette de 96 puits, ajouter un aliquot (μL) de la solution de stock CE et/ou CEF (traitements). Le volume de l’aliquot est défini par la concentration d’essai, qui doit être sélectionnée sur la base d’études antérieures. Par exemple, pour tester ce à la concentration d’essai de 0,5 mg/mL, utilisez un aliquot de 16,67 μL de la solution de stock à 6 mg/mL. Pour ce calcul, utilisez la formule: C1 x V1 = C2 x V2, où C1 est la concentration de stock, V1 est le volume de la solution stock aliquot, C2 est la concentration d’essai, et V2 est le volume de la plaque de 96 puits (qui correspond à 200 μL). Dans cet état expérimental, la concentration d’essai des solvants (véhicule) sera de 7% EtOH et 1,25% DMSO.
    2. Inclure un ensemble de contrôles pour chaque plaque: une colonne avec des traitements, sans l’inoculum (contrôle vierge par traitement, aider à différencier la turbidité par le traitement utilisé lui-même de la croissance microbienne); une colonne avec véhicule et inoculum (diluant de CE ou CEF ou contrôle de 0 mg/mL); une colonne avec seulement le milieu de culture (contrôle moyen de culture) et une colonne avec seulement l’inoculum (contrôle microbien de croissance).
    3. À l’aide de TYEg, réglez le volume à 100 μL. Ensuite, incuber, par exemple, 24 h, 37 °C, 5 % de CO2 (selon le micro-organisme testé).
    4. Inoculer 100 μL d’inoculum micro-organisme (1x 106 CFU/mL) dans la plaque de 96 puits.
    5. Analyser la croissance bactérienne en fonction de la turbidité par inspection visuelle des puits (clair ou nuageux). Clair : signifie qu’il n’y a pas de croissance visuelle du micro-organisme. Nuageux : signifie qu’il y a une croissance visuelle du micro-organisme.
    6. Mesure de l’absorption (densité optique ou O.D.) de la culture bactérienne dans chaque puits (lecteur ELISA utilisant 540 nm). Ensuite, transférez 100 μL des cultures vers des microtubes contenant 900 μL de solution saline (0,89% NaCl), bien mélanger par vortex. Ensuite, continuez à effectuer une dilution sérielle décuplé jusqu’à la valeur désirée.
    7. Inoculer un aliquot de la dilution désirée dans des plaques d’agar spécifiques (en double). Par exemple, 10 μL d’une dilution spécifique sur les plaques d’agar sanguin.
    8. Incuber. Les conditions peuvent changer entre les micro-organismes, par exemple, S. mutans: 48 h, 37 °C, 5 % DE CO2.
    9. Effectuer le nombre de colonies sur les plaques pour une transformation ultérieure en CFU/mL comme (Uncertain nombre de colonies x 10 n)/q. Dans cette formule,n égale la valeur absolue de la dilution (0, 1, 2 ou 3), et q égale la quantité, en mL, pipetted pour chaque dilution plaquée sur la plaque d’agar. En outre, le CFU/mL peut être converti en valeurs de journal.
      REMARQUE : Lorsque des extraits végétaux sont ajoutés au milieu de culture, des précipitations de particules provenant des extraits peuvent se produire. Ce fait peut rendre difficile l’interprétation des résultats. Il en va de même lorsqu’un lecteur de microplaques mesure la turbidité car, dans certains cas, les cellules s’agglutinent au bas de la microplaque. En outre, selon l’extrait utilisé, la couleur des extraits de feuilles végétales peut rendre difficile la quantification de laturbidité 23,24. Une méthode alternative utilise des sous-formes qui révèlent si les cellules microbiennes sont métaboliquement actives ou non24.
  4. Activité antibiofilm
    REMARQUE : Les étapes d’évaluation de l’effet des traitements sur la formation de biofilms sont illustrées à la figure 4.
    1. Formation et traitement de biofilms
      1. Diluer les traitements dans le milieu de la culture (TYEs) dans une plaque de 96 puits tel que décrit dans les étapes du protocole d’activité antimicrobienne.
      2. Incuber la plaque. Dans l’exemple de S. mutans, l’incubation est effectuée pendant 24 h, à 37 °C et 5 % de CO2.
      3. Après l’incubation, placer les plaques sur un shaker orbital (5 min, 37 °C, 75 rpm) pour desserrer les cellules qui n’adhèrent pas au biofilm. Ensuite, jetez le milieu de culture contenant les cellules non adhérentes, et lavez les biofilms restants trois fois avec 0,89% de NaCl pour enlever les cellules non adhérentes.
    2. Quantification de la biomasse à partir de biofilms traités
      REMARQUE : Les étapes sont illustrées dans le diagramme d’écoulement de la figure 4A.
      1. Gardez les biofilms lavés sur la plaque et ajoutez 50 μL de solution aqueuse de violette cristalline à chaque puits.
      2. Incuber la plaque à température ambiante pendant 35 min.
      3. Laver les puits tachés avec de l’eau MilliQ (trois fois) puis les sécher à l’air pendant 60-90 min.
      4. Elute la violette cristalline des puits tachés avec 200 μL de 99% EtOH en incubant la plaque dans un shaker orbital (5 min, 37 °C, 75 rpm).
      5. Transférer un aliquot de 150 μL de chaque puits avec le colorant éluté dans une autre plaque et quantifier la biomasse de l’échantillon (lecteur ELISA 570 nm).
    3. Quantification de la population microbienne viable (CFU/mL) des biofilms traités
      REMARQUE : Les étapes sont illustrées dans le diagramme d’écoulement de la figure 4B.
      1. Retirez les biofilms lavés de la plaque à l’aide d’une pipette et de 200 μL de NaCl 0,89 % et transférez la suspension qui en résulte individuellement sur des microtubes stériles.
      2. Utilisez 200 μL supplémentaires de NaCl 0,89 % par puits et transférez-le au tube correspondant, contenant déjà 200 μL de la suspension initiale du biofilm. Effectuez ce processus jusqu’à ce qu’il atteigne une suspension totale de 1 mL de biofilm par puits d’origine.
      3. Utilisez un aliquot de chaque tube pour effectuer une dilution en série décuplée.
      4. Inoculer un aliquot de la dilution désirée dans des plaques d’agar spécifiques (en double). Par exemple, 10 μL d’une dilution spécifique sur les plaques d’agar sanguin.
      5. Incuber des plaques d’agar (p. ex., 48 h, 37 °C, 5 % de CO2),puis compter les colonies pour déterminer le CFU/mL tel que décrit ci-dessus.
  5. Phase de validation de l’activité biologique
    1. Formation de pellicle salivaire
      1. Utilisez hydroxyapatite (HA) perles (Macro-Prep Céramique Hydroxyapatite Type I 80 μm) comme une surface pour former le film salivaire25. Ces perles de surface imitent l’émail dentaire.
      2. Peser les perles HA (p. ex., 10 mg) dans les microtubes et stériliser. Ensuite, utilisez le tampon d’adsorption (tampon AB : 50 mM KCl, 1 mM KPO4, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, en dd-H2O, pH 6,5]25 contenant 0,1 mM de fluorure de phénylméthylsulfonyl (PMSF) et 0,02 % d’azide de sodium (NaN3) pour laver les perles.
      3. Recueillir et préparer la salivehumaine 26. Il est nécessaire d’obtenir l’approbation du comité d’éthique institutionnelle.
      4. Ajouter 500 μL de salive dans les microtubes et incuber (40 min, 37 °C, 24 rpm).
      5. Ensuite, retirez le surnatant salivaire et lavez les perles (trois fois avec tampon AB contenant PMSF et NaN3). Les perles sHA (perle HA avec pellicle salivaire) sont maintenant prêtes pour les analyses en aval.
        REMARQUE : La salive est recueillie auprès de bénévoles en bonne santé. Après la collecte, diluer la salive (1: 1 v/v) avec tampon AB et centrifugeuse (1699 x g, 20 min, 4 °C). Stériliser par filtration (filtre à membrane polyethersulfone avec une faible liaison à 0,22 μm protéines)26. Le Comité d’éthique institutionnelle doit approuver l’étude. Dans notre cas, le Comité d’éthique de l’institution a approuvé l’étude (CAAE: 68161417.0.000.5416).
    2. Détachement de S. mutans après adhérence au film salivaire et glucanes traités avec des extraits sélectionnés
      1. Cultivez le micro-organisme jusqu’à la phase de croissance mi-bûche, comme décrit ci-dessus.
      2. Lorsque les cultures ont atteint l’O.D. désiré, centrifugeuse (4000 × g pendant 20 min), laver avec 0,89% de solution NaCl et résuser la pastille avec 0,89% NaCl en utilisant le même volume initial du milieu de culture.
      3. Si vous utilisez un streptocoque, comme S. mutans,soniquez les cultures avec une sonde pour déchaîner (30 s, 7 W, trois fois). Si vous utilisez un seul organisme cellulaire, cette étape peut être ignorée.
      4. Vérifiez l’O.D. (540 nm) pour ajuster la concentration à 2 x 106 CFU/mL.
    3. Adhérence de S. mutans au pellicle salivaire (sHA) et détachement des cellules adhérentes
      REMARQUE : Les étapes sont illustrées dans le diagramme d’écoulement de la figure 5.
      1. Obtenez les échantillons de sHA tels que décrits ci-dessus.
      2. Ajoutez un aliquot (dans l’exemple, nous ajoutons 500 μL) de traitements sélectionnés (à la concentration d’essai; par exemple, 0,5 mg/mL) ou des contrôles dans des microtubes contenant des échantillons de sHA.
      3. Incuber les échantillons de sHA avec des traitements ou des contrôles (30 min, 37 °C, 24 rpm); puis, laver les perles trois fois avec tampon AB (contenant PMSF et NaN3).
      4. Ajouter la culture micro-organisme. Dans l’exemple, nous ajoutons 500 μL de culture S. mutans (2 x 106 CFU/mL) à chaque microtube.
      5. Incuber (1 h, 37 °C, 24 rpm) puis retirer les cellules non liées en les lavant trois fois avec un tampon AB.
      6. Resuspendez chaque échantillon avec un aliquot (dans l’exemple, nous ajoutons 1000 μL) de tampon AB et sonicate avec une sonde (30 s, 7 W).
      7. Utilisez un aliquot de chaque suspension pour une dilution en série décuplée pour déterminer le nombre de colonies viables en placage sur des plaques d’agar spécifiques (48 h, 37 °C, 5 % de CO2). Ensuite, comptez les colonies pour déterminer le CFU/mL tel que décrit ci-dessus.
        REMARQUE : L’étape du sonicate est effectuée pour détacher les cellules adhérés au sHA.
    4. Adhérence de S. mutans à la matrice initiale de glucane(gsHA)et détachement des cellules adhérentes
      REMARQUE : Les étapes sont illustrées dans le diagramme d’écoulement de la figure 6. L’enzyme GtfB a été purifiée à partir de la culture supernatant Streptococcus milleri KSB8 conçu pour produire GtfB. La purification a été effectuée avec une colonne de chromatographie contenant des perles d’hydroxyapatite utilisant des tampons contenant deux inhibiteurs de protéase (0,1 mM PMSF et 0,02% NaN3)27,28. Ensuite, l’enzyme a été vérifiée sur le gel d’acrylamide (SDS-PAGE) et tachée de nitrate d’argent. Aliquots de l’enzyme ont été stockés à -80 °C jusqu’à utilisation.
      1. Obtenez les échantillons de sHA tels que décrits ci-dessus. Ensuite, ajoutez un aliquot (dans l’exemple, nous ajoutons 500 μL) d’enzyme GtfB à chaque tube et incubons dans un homogénéisant (40 min, 37 °C, 24 rpm). Ensuite, lavez trois fois avec tampon AB (contenant PMSF et NaN3).
      2. Ajouter un aliquot (p. ex., 500 μL) de substrat saccharose (100 mmol de saccharose) contenant les traitements (ou contrôles à la concentration d’essai, p. ex., 0,5 mg/mL) à chaque microtube.
      3. Incuber les échantillons dans un homogénéisateur (4 h, 37 °C, 24 rpm). Ensuite, effectuez trois lavages avec tampon AB (avec PMSF et NaN3) pour enlever les traitements et l’excès de saccharose non incorporés dans les glucanes synthétisés (échantillons de gsHA).
      4. Ajouter un aliquot (dans l’exemple, nous ajoutons 500 μL) de S. mutans inoculum (2 x 106 CFU/mL) à chaque microtube.
      5. Incuber dans un homogénéiseur (1 h, 37 °C, 24 rpm) et laver trois fois avec un tampon AB (avec PMSF et NaN3) pour enlever les cellules non liées.
      6. Resuspendez chaque échantillon avec un aliquot (p. ex., 1 000 μL) de tampon AB (avec PMSF et NaN3) et soniquez avec une sonde pour détacher les cellules adhérés à la gsHA (30 s, 7 W).
      7. Utilisez un aliquot de chaque suspension pour une dilution en série décuplée pour déterminer le nombre de colonies viables en placage sur des plaques d’agar spécifiques (48 h, 37 °C, 5 % de CO2). Ensuite, comptez les colonies pour déterminer le CFU/mL tel que décrit ci-dessus.

4. Analyse des données biologiques

  1. Données Bioassays
    1. Entrez des données brutes pour les bioassays dans une feuille de calcul. Calculez le journal de l’inhibition de croissance microbienne par chaque traitement comme (ACFU/mL des traitements + 1) x log10. Ensuite, calculer le pourcentage de journal de l’inhibition de la croissance microbienne, par rapport au contrôle du véhicule à l’aide (Unlog10 CFU / mLde traitement / moyenne Alog10 CFU / mL de contrôle du véhicule) x 100%.
    2. O.D. correct des cultures planctoniques et de la biomasse traitées par des traitements (groupes traités ce et CEF) et par contrôle des véhicules (contrôle négatif). Pour la correction, soustrayez l’absorption des puits traités de celui obtenu dans les puits contenant seulement le milieu de culture (Ablank) comme (Agroupes traités moyen /Un milieude contrôle négatif)x 100%.
    3. Après cette correction, calculer le pourcentage de l’inhibition de la biomasse, par rapport au contrôle du véhicule comme (Atraité biomasse/ moyenne Un contrôledu véhicule) x 100%.
    4. Soumettez les données brutes générées pour l’analyse statistique des données à l’aide de logiciels spécifiques.
      REMARQUE : L’interprétation de l’efficacité d’un traitement donné est déterminée à l’aide de points d’arrêt, tels quel’IC 50/IC90. Ces valeurs sont définies comme la concentration minimale d’un traitement capable d’inhiber 50 % et 90 %, respectivement, de croissance bactérienne ou de formation debiofilms 24. Ces paramètres peuvent aider à interpréter les données et fournir une base pour la sélection des composés avec une meilleureactivité 13,29.

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Representative Results

Nous fournissons un exemple d’utilisation d’une approche systématique pour examiner l’activité biologique des extraits et des fractions de plantes afin d’identifier des molécules potentiellement actives pour de nouvelles thérapies anti-caries possibles : activités antimicrobiennes et antibiofilms de Casearia sylvestris extraits de biomes brésiliens distincts contre streptocoques mutans et candida albicans13.

Fond
Les interactions complexes entre les micro-organismes oraux spécifiques-facteurs d’hôte-régime riche en saccharose et amidon peuvent moduler la formation des biofilms pathogènes et initier un processus cariogenic30,31. S. mutans orchestre la pathogénicité des biofilms associés au développement des caries dentaires parce qu’il produit des Gtfs responsables de la synthèse des exopolysaccharides, en plus de son acidogénicité et de son aciduricité31. En outre, Gtfs permet l’adhésion de Candida albicans (et d’autres micro-organismes), augmentant la virulence du biofilm32,33. Nous avons effectué une projection des activités antimicrobiennes et antibiofilms des extraits de feuilles de C. sylvestris et des fractions de différents biomes brésiliens, appartenant aux variétés lingua et sylvestris contre S. mutans et C. albicans13. C. sylvestris (« guaçatonga ») fait partie de l’utilisation populaire et traditionnelle au Brésil, et dans d’autres pays d’Amérique du Sud etd’Asie 34,35. Cette plante est citée dans la « Liste nationale des plantes médicinales d’intérêt pour sus » (RENISUS), qui contient 71 espèces qui pourraient traiter les maladies avec une incidence élevée au Brésil36. Le profil chimique des extraits de feuilles de var. sylvestris présente une riche composition phytochimique, avec des diterpenesabondants 35, tandis que les composés phénoliques (principalement flavonoïdes) prédominent dans var. lingua18.

Nous utilisons l’approche décrite dans le protocole pour identifier quels extraits et fractions de C. sylvetris sont les plus actifs pour les micro-organismes évalués, et, sur la base des résultats à l’aide de modèles simplistes, nous sélectionnons quels traitements seront testés modèles complexes in vitro (disques hydroxyapatites, microcosmes)37,38. Ici, nous présentons les résultats de la projection des douze CE contre S. mutans. L’objectif est de démontrer l’utilité de cette approche pour le dépistage des composés naturels au lieu d’interpréter et de discuter des données.

Nous avons recueilli les feuilles des individus des deux variétés de C. sylvestris de douze populations différentes au Brésil, comprenant différentes formations de biomes brésiliens (s’il vous plaît, voir les détails dans Ribeiro et al. 201913). La collection a été réalisée entre juin et septembre 2012 et 2013 (SisGen; Inscrivez-vous #A00892A). Nous recommandons de recueillir des échantillons représentatifs, y compris des individus de différents chimiotypes et de différents biomes, afin de remédier à la variabilité chimique des métabolites secondaires. Si disponible, au moins 3 à 5 personnes devraient être recueillies. Les informations antérieures concernant la variabilité chimique infraspécifique des plantes devraient également être considérées comme décrites par Ribeiro et coll. 2019 et Bueno et coll. 201513,18. La composition chimique du CE a été examinée par la chromatographie citée à l’étape 2 et nous fournissons le profil chimique de la figure 7. L’analyse du profil chimique est essentielle pour intégrer l’interprétation des données obtenues lors du dépistage biologique.

Les CA ont été fractionnées en fractionnements de Hex, AcOEt et MeOH. La fractionnement du CE permet la simplification du mélange pour augmenter la concentration des composés potentiellement actifs et diminuer les possibilités de synergismes et d’antagonismes entre les composés. En outre, dans les mélanges plus simples (fractions), il est plus facile d’obtenir des données spectrales des composés que dans ce et d’effectuer l’analyse de déreplication2. Habituellement, la fractionnement peut être fait par extraction liquide-liquide ou cartouches d’extraction en phase solide (SPE) contenant des adsorbents de phase inversée préférentiellement comme C18 (40 μm, 100 Å). D’autres adsorbents ou mélanges d’adsorbents peuvent être choisis, selon les fins de l’étude ou la nature chimique des composés désirés. Si la technique choisie est la SPE, les cartouches doivent être précédemment activées avec du solvant organique pur (p. ex., EtOH) et conditionnées avec l’élitente initiale. Des protocoles normalisés sont disponibles. Ainsi, le lecteur peut les consulter et les adapter en fonction de l’étude prévue et du matériel végétal d’intérêt.

Les douze CE ont été solubilisés avec 84,15% EtOH et 15% DMSO pour atteindre 6 mg/mL (solution stock). Avant les tests de dépistage, nous avons testé la concentration de diluants (véhicule) qui n’interfère pas avec la croissance microbienne. Cette étape est importante parce qu’elle empêche les actions antimicrobiennes et antibiofilms des solvants d’affecter les résultats lors de l’essai des traitements. Les tests peuvent être effectués sur une plaque de 96 puits en traitant la culture du micro-organisme d’intérêt avec différentes concentrations de solvants (associés et/ou isolés). Ainsi, nous avons commencé notre criblage avec CE à 0.5 mg/mL et véhicule à une concentration de 7% EtOH et 1.25% DMSO.

Pour le dépistage de l’activité antimicrobienne et antibiofilm, 96 plaques de puits ont été traitées comme décrit ci-dessus. À cette fin, le volume de 16,67 μL de solution de stock CE (6 mg/mL) a été ajouté pour tester chaque CE à la concentration de 0,5 mg/mL. Les biofilms formés ont été traités comme décrit à l’étape 3. Les extraits efficaces contre S. mutans (IC50 ou 3 billots) ont été utilisés pour évaluer la « force d’adhérence » de cette bactérie à la matrice salivaire de pellicle et de glucane initiale, telle que décrite dans l’étape 3.

Les données brutes obtenues à partir d’analyses biologiques ont été organisées dans Excel (tel que décrit à l’étape 4) et analysées avec un traitement statistiqueapproprié 13. Le point de coupure pour identifier les extraits avec la meilleure activité était l’inhibitionIC 50 (3 billots). À partir de ce paramètre, quatre extraits ont montré une réponse favorable( Figure 8). Les données chromatographic de ces quatre extraits montrent la présence simultanée des diterpenes clerodane-type et des flavonoïdes glycoylated. En outre, ils comprennent le même biome (forêt atlantique) et la variété (sylvestris). Pour aider à interpréter les données biologiques, nous avons comparé le profil chromatographic des quatre extraits avec la meilleure activité avec les autres extraits projetés. Par rapport aux autres, les extraits avec la meilleure activité ont une plus grande quantité de diterpenes clerodane-type et, simultanément, flavonoïdes glycoylated. Cette observation indique qu’il est probable que l’efficacité de ces extraits est due à une interaction synergique entre les deux métabolites secondaires, augmentant ainsi leur activité biologique. C’est-à-dire que l’effet combiné des diterpenes de type clerodane et des flavonoïdes glycoylés est supérieur à la somme de leurs effets distincts13.

Pour confirmer les données obtenues lors du dépistage, nous avons évalué le détachement de S. mutans après adhérence au pellicle salivaire et aux glucanes traités avec ce sélectionné. Les analyses utilisent des modèles biofilms d’une seule espèce in vitro pour mieux évaluer l’activité biologique des extraits bruts sélectionnés et identifier les cibles d’action possibles. La première analyse vérifie si les traitements utilisés sont capables d’inhiber l’adhérence de S. mutans au pellicle salivaire, mais surtout, si les cellules du micro-organisme qui ont adhéré au pellicle traité peuvent être enlevées de la surface plus facilement par le stimulus mécanique, interrompant ainsi la première étape de la formation de biofilm. L’ajout de CE (avec une meilleure activité) pendant la synthèse des glucanes n’a pas modifié le pellicle salivaire parce qu’aucun CE n’a affecté de manière significative l’enlèvement des cellules adhéré au pellicle salivaire (figure 9A).

L’adhérence de la matrice glucane initiale (gsHA) étudie si les traitements peuvent inhiber l’adhérence de S. mutans à la matrice glucane initiale. Pourtant, cette méthodologie vérifie si les cellules micro-organismes qui ont adhéré aux glucanes traitées peuvent être enlevées par le stimulus mécanique plus facilement de la surface, interrompant ainsi la formation de biofilm de stade. Trois CE ont affecté la qualité des glucanes formées par GtfB et ont donc affaibli l’adhérence de S. mutans à la matrice initiale de glucane (la plupart des cellules de S. mutans ont été enlevées après adhérence pour des glucanes ; Figure 9B). Nous croyons que ce comportement est lié au synergisme entre les métabolites secondaires13.

L’approche systématique nous a aidés à identifier et à sélectionner des extraits bruts actifs pour arrêter la formation de biofilms cariogéniques. Une fois sélectionnés et basés sur le profil chromatographique, nous avons la base pour élucider les mécanismes moléculaires d’action dans des modèles complexes.

Figure 2
Figure 2 : Diagramme d’écoulement de l’extraction et de la fractionnement des matières végétales. L’illustration montre la conception expérimentale pour préparer les extraits bruts (A) et la fractionnement des extraits bruts (B). Émirats arabes unis : Extraction assistée par ultrasons; SPE : Extraction de phase solide. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Conception expérimentale pour évaluer l’activité antimicrobienne dans des plaques de 96 puits. L’illustration représente des traitements (extraits bruts ou fractions) et des contrôles. Pour le dépistage de plusieurs traitements, utilisez une seule concentration (mg/mL) dans chaque puits. CFU/mL : unités de formation de colonie par millilitre. O.D.: densité optique. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : Conception expérimentale de l’analyse d’antibiofilm dans des assiettes de 96 puits. L’illustration montre des traitements (extraits bruts et fractions) et des contrôles. Pour le dépistage de divers traitements, utilisez une seule concentration (mg/mL) dans chaque puits. Dans A, les étapes de quantification de la biomasse des biofilms traités sont illustrées. En B, est montré les étapes pour déterminer la population (CFU / mL) des biofilms traités. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5
Figure 5 : Conception expérimentale pour évaluer l’adhérence au pellicle salivaire, suivie du détachement des cellules adhérentes. L’illustration montre les étapes à effectuer. Traitements : sélectionnés en fonction du dépistage biologique. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 6
Figure 6 : Conception expérimentale pour évaluer l’adhérence à la matrice initiale de glucane(gsHA)suivie du détachement des cellules adhérentes. L’illustration montre les étapes à effectuer. Traitements : sélectionnés en fonction du dépistage biologique. Substrat de saccharose : 100 mmol de saccharose. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 7
Figure 7 : Quantité de diterpenes de type clerodane et de flavonoïdes glycoylés dans des extraits de C. sylvestris provenant de biomes brésiliens. Les lettres S, I, et L indiquent les variétés sylvestris, intermédiaire, et lingua, respectivement. Communication personnelle par le Dr Paula Carolina Pires Bueno. Ce chiffre a été modifié à partir de Ribeiro et coll.13. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 8
Figure 8 : Activité antimicrobienne et antibiofilm des extraits bruts de C. sylvestris provenant de biomes brésiliens contre S. mutans.  A. % de CFU (log10) de cellules planctoniques traitées; B. % biomasse des biofilms traités. C. % CFU (log10) de biofilm traité. Les données décrites sont médianes (traces) et interquartiles (boîtes). Les barres d’erreur représentent les valeurs maximales et minimales. Les astérisques désignent une différence statistiquement significative d’un extrait spécifique par rapport au contrôle du véhicule (V), où : ****p ≤ 0,0001; p ≤ 0,001; ** p ≤ 0,01; et *p ≤ 0,05 (test Kruskal-Wallis, suivi du test de comparaisons multiples de Dunn). Chaque contrôle de la croissance des espèces (sans traitement) est représenté comme Sm pour S. mutans. Les couleurs des barres de chaque graphique représentent la variété à laquelle appartiennent les extraits, étant, en couleur gris foncé : var. sylvestris; gris clair: var. intermédiaire et blanc: var. lingua. Ce chiffre a été modifié à partir de Ribeiro et coll.13. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 9
Figure 9 : Détachement de S. mutans après adhérence au pellicle salivaire traité et à la matrice initiale des glucanes. Les données post-libération de S. mutans sur le pellicle salivaire traité et les glucanes sont montrées dans (A) et (B), respectivement. Il n’y avait aucune différence entre le véhicule de commande (V) et les extraits testés pour les deux analyses. Le pourcentage de CFU/mL a été obtenu considérant que le contrôle du véhicule (V) était de 100 %. Les données décrites sont médianes (traces) et interquartiles (boîtes). Les barres d’erreur représentent les valeurs maximales et minimales. Les astérisques désignent une différence statistiquement significative d’un extrait spécifique par rapport au contrôle du véhicule (V), où ****p = 0,0001 et **p < 0,0031 (test Kruskal-Wallis, suivi du test de comparaison multiple de Dunn). Le contrôle de la croissance est représenté par Sm pour S. mutans. Les couleurs des barres du graphique représentent la variété à laquelle appartiennent les extraits, étant la couleur gris foncé à var. sylvestris. Ce chiffre a été modifié à partir de Ribeiro et coll.13. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Discussion

Les principaux défis liés au travail avec des extraits bruts naturels comprennent leur composition complexe et les insuffisances des études classiques d’isolement bioguidé. Bien que ce processus soit lent, il est efficace et a mené à des résultats majeurs dans la recherche sur les PN. Pour rationaliser, des études axées sur la hiérarchisation sont nécessaires pour rationaliser. Ainsi, l’utilisation d’approches modernes de profilage chimique pour l’analyse de l’EC et la redondant avant l’isolement sont importantes pour caractériser le matériau étudié et particulièrement utiles pour éviter le ré-isolement des composés connus avec l’activité biologiquedéjà décrite 2,15. En outre, l’acquisition de données multidimensionnelles est nécessaire pour effectuer d’autres analyses de données multivariées afin de trouver les candidats potentiels responsables des activités biologiques observées. Par conséquent, le chercheur peut se concentrer sur l’isolement (à grande échelle) de ces candidats potentiels.

Ici, nous présentons une approche systématique pour l’identification guidée par bioassay (in vitro) des composés actifs à partir d’extraits végétaux et de fractions. Ce protocole permet une méthode de dépistage et d’analyse multi-cibles afin que plusieurs composants actifs puissent être sélectionnés et analysés simultanément. Les bioassays sont à petite échelle et à haut rendement, sont rapides, rentables, faciles à reproduire et consomment moins de reagents que les méthodes traditionnelles (p. ex., isolement initial des composés d’intérêt)39. Pour toute recherche sur les produits naturels, il est primordial d’utiliser les outils analytiques (par exemple, HPLC-UV, HPLC-DAD, LC-MS). Récemment, l’approche est davantage axée sur la structure (basée sur la chimie) en utilisant, dans une plus haute mesure, la puissance des plates-formes d’analyse et d’élucidation (LC-HRMS et HRMS/MS, NMR à champ élevé) et des stratégies de dréplication, qui consistent en l’identification rapide de molécules déjà connues. Cette étape aide à comprendre la relation de profil chimique avec la réponse biologique ayant pour résultat l’isolement plus focalisé des métabolites actifs de candidat3. Il existe plusieurs méthodes bien établies pour l’analyse chromatographic. Pour les PN inconnus, il peut parfois être nécessaire d’exécuter des pilotes pour trouver la meilleure méthode possible. Par exemple, nous utilisons une méthode analytique de chromatographie validée pour l’analyse simultanée des métabolites secondaires produits par deux variétés de C. sylvestris13,18. Lors du choix d’une méthode de chromatographie, nous suggérons d’envisager un protocole basé sur le composé cible (s), et les avantages et les inconvénients de toutes les méthodes disponibles, en mettant l’accent en particulier sur leur efficacité et, bien sûr, le coût totalimpliqué 40.

Bien que l’approche systématique se soit avérée utile pour le dépistage rapide et l’analyse des candidats bioactifs dans les PN, il subsiste d’importantes limites. Par exemple, les lectures visuelles et o.d. de la biomasse et des cultures planctoniques peuvent reproduire des résultats faussement positifs13,23,24. Déterminer la turbidité des cultures avec un lecteur de microplaque peut échouer lorsqu’il est utilisé pour les composésnaturels 23,24. Ces défaillances se produisent parce que (i) dans certains organismes d’essai, les cellules sont groupées au fond du puits, et, dans d’autres organismes, les cellules restent en suspension; (ii) les particules solides présentes dans le CE précipitent et causent la turbidité dans les puits23,24. Le pH des PN est un facteur qui doit également être pris en considération. Le pH de la solution de traitement est lié à la composition chimique des métabolites secondaires et, par conséquent, influence la réponse biologique. Bien que le pH ne soit pas une limitation, il doit être évalué avec prudence, selon l’objet de l’étude. Par exemple, dans les modèles de biofilm sur les surfaces d’émail dentaire, l’acidité peut causer une déminéralisation non désirée de l’émail. Dans ces cas, il est nécessaire d’ajuster le pH à l’aide de tampons appropriés. Par conséquent, il est nécessaire d’effectuer des tests pour vérifier si l’ajustement du pH a affecté la réponse biologique observée précédemment.

Les tests classiques pour évaluer l’activité de nouveaux composés comprennent la détermination de la concentration inhibitrice minimale (MIC) et de la concentration bactériicide ou fongicide minimale (MBC ou MFC)29,41. Cependant, lorsque l’objectif est de filtrer de nombreux extraits de plantes et fractions, la technique devient exhaustive. Le bioprocrage peut être effectué avec une seule concentration de traitements multiples (p. ex., extraits de plantes provenant d’endroits distincts)13,42,29. Pour ces situations, l’approche systématique est une méthode à haute performance qui renvoie des résultats cohérents en moins de temps de travail. Les traitements sélectionnés dans le dépistage biologique peuvent être évalués à l’aide de modèles raffinés (cliniquement pertinents, viables et reproductibles) pour confirmer l’activité biologique. Pour le contrôle du biofilm cariogénique, les études de laboratoire devraient se concentrer principalement sur les biofilms formés sur l’hydroxyapatite (substitut de l’émail des dents) ou les surfaces émail placées en position verticale recouvertes d’un pellicle salivaire37. Il permet également le criblage d’échantillons de plantes de différentes variétés et biomes d’une manière reproductible et rapide. L’inclusion de ces deux variables (biome et variété) est essentielle parce qu’elles influencent la variabilité de la composition chimique des métabolitessecondaires 18 et modulent la réponse biologique. Cette approche systématique peut être adaptée/modifiée pour des applications en dehors de la recherche orale sur le biofilm. Par exemple, il peut être particulièrement utile pour d’autres domaines liés au biofilm, en utilisant d’autres espèces d’intérêt.

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Disclosures

Aucun conflit d’intérêts n’a été déclaré.

Acknowledgments

Nous exprimons notre gratitude à Núcleo de Bioensaios, Biossíntese e Ecofisiologia de Produtos Naturais (NuBBE) de l’Institut de chimie de l’UNESP, Araraquara/SP pour avoir fourni les laboratoires pour la préparation du matériel végétal. Nous remercions également le Laboratoire de microbiologie appliquée du Département des matériaux dentaires et de la prosthodontie, l’UNESP, Araraquara/SP. Cette recherche a été appuyée par une subvention de recherche de la São Paulo Research Foundation (FAPESP #2013/07600-3 à l’AJC) et des bourses d’études ainsi que des fonds généraux (FAPESP #2017/07408-6 et FAPESP #2019/23175-7 au SMR; #2011/21440-3 et #2012/21921-4 au PCPB). Le Conseil national du développement scientifique et technologique, en association avec la FAPESP, a apporté un soutien supplémentaire (INCT CNPq #465637/2014-0 et FAPESP #2014/50926-0 à l’AJC).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well microplates  Kasvi Flat bottom
Activated carbon LABSYNTH Clean up and/or fractionation step
Analytical mill Ika LabortechniK Model A11 Basic
Blood agar plates Laborclin
Chromatographic column C18 Phenomenex Kinetex 150 × 2.1 mm, 2.6 µm, 100Â
Dimethyl sulfoxide  Sigma-Aldrich Vehicle solution
ELISA plate reader Biochrom Ez
Ethanol J. T. Baker For extraction and fractionation steps, and mobile phase composition
Ethanol Sigma-Aldrich Vehicle solution
Ethyl acetate J. T. Baker Fractionation step
GraphPad Software La Jolla GraphPad Prism7
Hexane J. T. Baker Fractionation step
Incubator Thermo Scientific
Isopropanol J. T. Baker For extraction step
Lyophilizer (a freeze dryer) Savant Modulyo
Nylon Millipore LAC 0.22 µm x 13 mm
Orbital shaker Quimis Model G816 M20
Polyamide solid phase extraction cartridge Macherey-Nagel Clean up and/or fractionation step
Silica gel Merck 40–63 μm, 60 Â
Sodium Chloride (NaCl) Synth 0,89% in water
Solid phase extraction cartridges (SPE) Macherey-Nagel Clean up and/or fractionation step
Tryptone Difco
UHPLC-DAD Dionex Ultimate 3000 RS
Ultrasonic bath UNIQUE Model USC 2800
Yeast extract Difco

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Newman, D. J., Cragg, G. M. Natural Products as Sources of New Drugs over the Nearly Four Decades from 01/1981 to 09/2019. Journal of Natural Products. 83 (3), 770-803 (2020).
  2. Wolfender, J. L., Litaudon, M., Touboul, D., Queiroz, E. F. Innovative omics-based approaches for prioritisation and targeted isolation of natural products – new strategies for drug discovery. Natural Product Report. 36 (6), 855-868 (2019).
  3. Michel, T., Halabalaki, M., Skaltsounis, A. New Concepts, Experimental Approaches, and Dereplication Strategies for the Discovery of Novel Phytoestrogens from Natural Sources. Planta Medica. 79 (7), 514-532 (2013).
  4. Jeon, J. G., Rosalen, P. L., Falsetta, M. L., Koo, H. Natural products in caries research: current (limited) knowledge, challenges and future perspective. Caries Research. 45 (3), 243-263 (2011).
  5. Tonetti, M. S., Jepsen, S., Jin, L., Otomo-Corgel, J. Impact of the global burden of periodontal diseases on health, nutrition and wellbeing of mankind: A call for global action. Journal of Clinical Periodontology. 44 (5), 456-462 (2017).
  6. Peres, M. A., et al. Oral diseases: a global public health challenge. Lancet. 394 (10194), 249-260 (2019).
  7. Bowen, W. H., Burne, R. A., Wu, H., Koo, H. Oral biofilms: pathogens, matrix, and polymicrobial interactions in microenvironments. Trends Microbiology. 26 (3), 229-242 (2018).
  8. Paes Leme, A. F., Koo, H., Bellato, C. M., Bedi, G., Cury, J. A. The role of sucrose in cariogenic dental biofilm formation--new insight. Journal of Dental Research. 85 (10), 878-887 (2006).
  9. Koo, H., Falsetta, M. L., Klein, M. I. The exopolysaccharide matrix: a virulence determinant of cariogenic biofilm. Journal of Dental Research. 92 (12), 1065-1073 (2013).
  10. Cury, J. A., de Oliveira, B. H., dos Santos, A. P., Tenuta, L. M. Are dental fluoride releasing materials clinically effective on caries control. Dental Materials. 32 (3), 323-333 (2016).
  11. Mattos-Graner, R. O., Klein, M. I., Smith, D. J. Lessons Learned from Clinical Studies: Roles of Mutans Streptococci in the Pathogenesis of Dental Caries. Current Oral Health Reports. 1, 70-78 (2014).
  12. Rocha, G. R., Florez Salamanca, E. J., de Barros, A. L., Lobo, C. I. V., Klein, M. I. Effect of tt-farnesol and myricetin on in vitro biofilm formed by Streptococcus mutans and Candida albicans. BMC Complementary and Alternative Medicine. 18 (1), 61 (2018).
  13. Ribeiro, S. M., et al. Antimicrobial and antibiofilm activities of Casearia sylvestris extracts from distinct Brazilian Biomes against Streptococcus mutans and Candida albicans. BMC Complementary and Alternative Medicine. 19 (1), 308 (2019).
  14. Pilon, A. C., et al. Metabolômica de plantas: métodos e desafios. Quimica Nova. 43 (3), 329-354 (2020).
  15. Wolfender, J. L., Nuzillard, J. M., Hooft, J. J. J., Renault, J. H., Bertrand, S. Accelerating Metabolite Identification in Natural Product Research: Toward an Ideal Combination of Liquid Chromatography-High-Resolution Tandem Mass Spectrometry and NMR Profiling, in Silico Databases, and Chemometrics. Analytical Chemistry. 91 (1), 704-742 (2019).
  16. Allard, P. M., et al. Pharmacognosy in the digital era: shifting to contextualized metabolomics. Current opinion in biotechnology. 54, 57-64 (2018).
  17. Hubert, J., Nuzillard, J., Renault, J. Dereplication strategies in natural product research: How many tools and methodologies behind the same concept. Phytochemistry Reviews. 16, 55-95 (2017).
  18. Bueno, P. C. P., Pereira, F. M. V., Torres, R. B., Cavalheiro, A. J. Development of a comprehensive method for analysing clerodane-type diterpenes and phenolic compounds from Casearia sylvestris Swartz (Salicaceae) based on ultra-high performance liquid chromatography combined with chemometric tools. Journal of separation science. 38 (10), 1649-1656 (2015).
  19. Bueno, P. C. P., Lopes, N. P. Metabolomics to Characterize Adaptive and Signaling Responses in Legume Crops under Abiotic Stresses. American Chemical Society omega. 5 (4), 1752-1763 (2020).
  20. Blaženović, I., Kind, T., Ji, J., Fiehn, O. Software tools and approaches for compound identification of LC-MS/MS data in metabolomics. Metabolites. 8 (2), 31 (2018).
  21. Eloff, J. N. Quantifying the bioactivity of plant extracts during screening and bioassay-guided fractionation. Phytomedicine: International Journal Of Phytotherapy And Phytopharmacology. 11 (4), 370-371 (2004).
  22. Rios, J. L., Recio, M. C. Medicinal plants and antimicrobial activity. Journal of Ethnopharmacology. 100 (1-2), 80-84 (2005).
  23. Eloff, J. N. A sensitive and quick microplate method to determine the minimal inhibitory concentration of plant extracts for bacteria. Planta Medica. 64, 711-714 (1998).
  24. Eloff, J. N. Avoiding pitfalls in determining antimicrobial activity of plant extracts and publishing the results. BMC Complementary and Alternative Medicine. 19 (1), 106 (2019).
  25. Klein, M. I., Xiao, J., Heydorn, A., Koo, H. An analytical tool-box for comprehensive biochemical, structural and transcriptome evaluation of oral biofilms mediated by mutans streptococci. Journal of Visualized Experiments. (47), e2512 (2011).
  26. Lemos, J. A., Abranches, J., Koo, H., Marquis, R. E., Burne, R. A. Protocols to study the physiology of oral biofilms. Methods in molecular biology. 666, 87-102 (2010).
  27. Venkitaraman, A. R., Vacca-Smith, A. M., Kopec, L. K., Bowen, W. H. Characterization of glucosyltransferase B, GtfC, and GtfD in solution and on the surface of hydroxyapatite. Journal of Dental Research. 74, 1695-1701 (1995).
  28. Vacca-Smith, A. M., Venkitaraman, A. R., Quivey, R. G. Jr, Bowen, W. H. Interactions of streptococcal glucosyltransferases with alpha-amylase and starch on the surface of saliva-coated hydroxyapatite. Archives of Oral Biology. 41, 291-298 (1996).
  29. Van Dijck, P., et al. Methodologies for in vitro and in vivo evaluation of efficacy of antifungal and antibiofilm agents and surface coatings against fungal biofilms. Microbial Cell. 5 (7), 300-326 (2018).
  30. Marsh, P. D. Are dental diseases examples of ecological catastrophes. Microbiology. 149 (2), 279-294 (2003).
  31. Bowen, W. H., Koo, H. Biology of Streptococcus mutans-derived glucosyltransferases: role in extracellular matrix formation of cariogenic biofilms. Caries Research. 45 (1), 69-86 (2011).
  32. Lobo, C. I. V., et al. Dual-species biofilms of Streptococcus mutans and Candida albicans exhibit more biomass and are mutually beneficial compared with single-species biofilms. Journal of Oral Microbioly. 11 (1), 1581520 (2019).
  33. Kim, D., et al. Candida albicans stimulates Streptococcus mutans microcolony development via crosskingdom biofilm-derived metabolites. Scientific reports. 7, 41332 (2017).
  34. Ferreira, P. M. Folk uses and pharmacological properties of Casearia sylvestris: a medicinal review. Anais da Academia Brasileira de Ciencias. 83 (4), 1373-1384 (2011).
  35. Xia, L., Guo, Q., Tu, P., Chai, X. The genus Casearia: a phytochemical and pharmacological overview. Phytochemistry Reviews. 14, 99-135 (2015).
  36. Ferreira, P. M. P., et al. Toxicological findings about an anticancer fraction with casearins described by traditional and alternative techniques as support to the Brazilian Unified Health System (SUS). Journal of Ethnopharmacol. 15, 241 (2019).
  37. Koo, H., Xiao, J., Klein, M. I., Jeon, J. G. Exopolysaccharides produced by Streptococcus mutans glucosyltransferases modulate the establishment of microcolonies within multispecies biofilms. Journal of Bacteriology. 192 (12), 3024-3032 (2010).
  38. Maske, T. T., van de Sande, F. H., Arthur, R. A., Huysmans, M. -C. D. N. J. M., Cenci, M. S. In vitro biofilm models to study dental caries: a systematic review. Biofouling. 33 (8), 661-675 (2017).
  39. Fu, Y., Luo, J., Qin, J., Yang, M. Screening techniques for the identification of bioactive compounds in natural products. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 168, 189-200 (2019).
  40. Sarker, S. D., Nahar, L. An introduction to natural products isolation. Methods in molecular biology. 864, 1-25 (2012).
  41. Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI). Performance standards for antimicrobial susceptibility testing; twenty-fifth informational supplement. Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI). , Wayne, PA. CLSI document M100-S25 (2015).
  42. Saputo, S., Faustoferri, R. C., Quivey, R. G. Jr A drug repositioning approach reveals that Streptococcus mutans is susceptible to a diverse range of established antimicrobials and nonantibiotics. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 62 (1), 01674 (2018).

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Biologie Numéro 169 Microbiologie biofilm produits naturels streptocoques mutans antimicrobiens caries dentaires découverte de médicaments approches biologiques
Approche systématique pour identifier les nouvelles molécules antimicrobiennes et antibiofilms à partir d’extraits et de fractions de plantes pour prévenir les caries dentaires
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Ribeiro, S. M., Fratucelli, É. D.… More

Ribeiro, S. M., Fratucelli, É. D. O., Fernandes, J. M., Bueno, P. C. P., Cavalheiro, A. J., Klein, M. I. Systematic Approach to Identify Novel Antimicrobial and Antibiofilm Molecules from Plants' Extracts and Fractions to Prevent Dental Caries. J. Vis. Exp. (169), e61773, doi:10.3791/61773 (2021).

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