Summary
يصف البروتوكول الحالي طريقة لعزل الحمض النووي من عينات الدم والخزعات المعوية ، وتوليد مكتبات TCRβ و IGH PCR لتسلسل الجيل التالي ، وأداء تشغيل NGS وتحليل البيانات الأساسية.
Abstract
الذاكرة المناعية، السمة المميزة للمناعة التكيفية، يتم تنظيمها من قبل الخلايا الليمفاوية T و B. في الدورة الدموية والأعضاء المختلفة ، وهناك مليارات من استنساخ الخلايا الفريدة تي وباء ، ويمكن لكل واحد ربط مستضد معين ، مما يؤدي إلى الانتشار والتمايز و / أو إفراز السيتوكين. يتم إنشاء التغايرية واسعة في الخلايا T و B عن طريق إعادة دمج عشوائي من شرائح وراثية مختلفة. تمكن تقنيات تسلسل الجيل التالي (NGS) ، التي تم تطويرها في العقد الماضي ، من رؤية متعمقة غير مسبوقة للذخيرة المناعية لمستقبلات الخلايا T و B. أظهرت الدراسات في مختلف الحالات الالتهابية والفيزيولوجيا المناعية والعدوى والخبيثة تغيرات ملحوظة في اللاستنساخ واستخدام الجينات والخصائص الفيزيائية الحيوية للذخيرة المناعية ، مما يوفر رؤى مهمة حول دور الاستجابات المناعية التكيفية في الاضطرابات المختلفة.
هنا، ونحن نقدم بروتوكول مفصل لNGS من ذخيرة المناعة من الخلايا T و B من الدم والأنسجة. نحن نقدم خط أنابيب بدءا من عزل الحمض النووي من خلال إعداد المكتبة ، والتسلسل على المنظم NGS وتنتهي مع التحليلات الأساسية. تمكن هذه الطريقة من استكشاف خلايا T و B محددة على مستوى النيوكليوتيدات أو الأحماض الأمينية ، وبالتالي يمكن تحديد التغيرات الديناميكية في مجموعات الخلايا الليمفاوية ومعلمات التنوع في الأمراض المختلفة. هذه التقنية تدخل ببطء الممارسة السريرية ولديها القدرة على تحديد المؤشرات الحيوية الجديدة ، وتقسيم المخاطر والطب الدقيق.
Introduction
يستخدم الجهاز المناعي التكيفي، المكون من الخلايا اللمفاوية T و B، الذاكرة المناعية للتعرف على مستضد سبق مواجهته وبدء استجابة سريعة. يتم إنشاء الخلايا الليمفاوية في نخاع العظام وتنضج في الغدة الصعترية (الخلايا التائية) أو نخاع العظم (خلايا B). تعرض كل من مستقبلات الخلايا التائية (TCR) ومستقبلات الخلايا B (BCR) تكوينات فريدة تسمح بالاعتراف بالمضادات المحددة. في التوازن، T و B الخلايا تعميم ومسح باستمرار تريليونات الببتيدات المختلفة المقدمة على الخلايا تقديم مستضد. ربط TCR أو BCR مستضد معين مع تقارب عالية، جنبا إلى جنب مع التحفيز المشترك المناسب، يؤدي إلى تنشيط الخلية، مما أدى إلى إفراز السيتوكين، والتوسع اللاستنساخي وتوليد الأجسام المضادة، في حالة الخلايا B.
تسمى المجموعة الهائلة من الخلايا T أو B المختلفة ذخيرة المناعة بشكل جماعي ، مما يتيح التعرف على عدد لا يحصى من الأسطح المختلفة. من أجل توليد مثل هذه ذخيرة واسعة، عملية معقدة من التجمع العشوائي من شرائح الجينات المختلفة يحدث، وخلق مجموعات لا نهاية لها تقريبا من المستقبلات التي يمكن أن تربط مستضدات فريدة من نوعها1. هذه العملية، ودعا V (D)J إعادة التركيب، ويشمل إعادة ترتيب متغير مختلف (V)، والتنوع (D) والانضمام (J) الجينات، يرافقه حذف عشوائي وإدراج النيوكليوتيدات فيتقاطعات 2.
وقد أثارت بنية الجهاز المناعي التكيفي اهتمام العلماء في مجالات مختلفة لعقود عديدة. في الماضي، كان تسلسل سانجر، والتحديد التكميلي للمنطقة 3 (CDR3) الأطياف، وقياس التدفق الخلوي تستخدم لتوصيف ذخيرة المناعة، ولكن قدمت دقة منخفضة. في العقد الماضي، مكن التقدم في الجيل القادم من أساليب التسلسل (NGS) من رؤية متعمقة لخصائص وتكوين ذخيرتي TCR و BCRللفرد 3و4. هذه النظم عالية الإنتاجية (HTS) تسلسل ومعالجة الملايين من المنتجات TCR أو BCR إعادة ترتيبها في وقت واحد، وتسمح بتحليل عالية الدقة من خلايا T و B محددة على مستوى النيوكليوتيد أو الأحماض الأمينية. NGS يوفر استراتيجية جديدة لدراسة ذخيرة المناعة في كل من الصحة والمرض. أظهرت الدراسات التي تستخدم HTS تغيير TCR وBCR repertoires في أمراض المناعة الذاتية5، وdeficiencies المناعية الأولية6،7، والأورام الخبيثة ، كما هو الحال في سرطان الدم النخاعي الحاد8. باستخدام NGS ، أظهرنا نحن وآخرون توسعا في قلة القلة لاستنساخ خلايا T و B محددة ، في المرضى الذين يعانون من مرض التهاب الأمعاء (IBD) ، بما في ذلك التهاب القولون التقرحيومرض كرون9و10و11و12و13و14. بشكل عام، تشير الدراسات من مختلف المجالات إلى أن التغيرات في الذخيرة لها دور حاسم في مسببات الأمراض في الاضطرابات بوساطة المناعة.
يصف البروتوكول الحالي طريقة لعزل الحمض النووي عن الخزعات المعوية والدم ، وتوليد مكتبات TCRβ و IGH PCR ل NGS ، وأداء تشغيل التسلسل. كما نقدم الخطوات الأساسية في تحليل بيانات الذخيرة المناعية. يمكن تطبيق هذا البروتوكول على إنشاء مكتبات TCRα و TCRа و IGL أيضا. كما تتوافق هذه الطريقة مع الأعضاء الأخرى (مثل الغدد الليمفاوية والأورام والسائل الزليلي والأنسجة الدهنية وما إلى ذلك) طالما يتم استخدام بروتوكولات الهضم الخاصة بالأنسجة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على هذه الدراسة من قبل مجلس المراجعة المؤسسية في مركز شيبا الطبي، وتم الحصول على موافقة خطية مستنيرة من جميع الأشخاص المشاركين.
1. عزل الحمض النووي والتحديد الكمي
- الهضم وتحلل الخلايا من خزعات الأمعاء
- استرجاع خزعات الأمعاء، إما التي تم جمعها حديثا أو تلك المخزنة في -20 درجة مئوية أو -80 درجة مئوية. إذا كنت تستخدم الخزعات المجمدة، إذابة على الجليد.
- أضف 600 ميكرولتر من محلول تحلل النوى إلى أنبوب طرد مركزي صغير معقم سعة 1.7 مل، مبرد على الثلج.
- ضع الخزعة في أنبوب طرد دقيق مع محلول التحلل واحتضنها عند 65 درجة مئوية لمدة 15-30 دقيقة.
- إضافة 17.5 ميكرولتر من 20 ملغ / مل بروتيناز K واحتضان بين عشية وضحاها في 55 درجة مئوية، مع اهتزاز لطيف.
- السماح للعينة لتبرد لدرجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق قبل الشروع في الخطوة 1.3.
- تحلل الخلايا من الدم كله
- الحصول على 3 مل من الدم الكامل في EDTA-, الهيبارين-, أو أنبوب يحتوي على سيترات.
- أنبوب الصخور بلطف حتى مختلطة تماما، ونقل الدم إلى أنبوب الطرد المركزي 15 مل معقمة تحتوي على 9 مل من محلول تحلل الخلية. عكس عدة مرات خلال فترة حضانة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- الطرد المركزي في 2000 × غرام لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة، ومن ثم تجاهل أكبر قدر ممكن من الناسخ دون إزعاج بيليه الأبيض مرئية. سيبقى ما يقرب من 50-100 ميكرولتر من السائل المتبقي.
- دوامة أنبوب بقوة لمدة 15 ق حتى resuspended تماما. إضافة 3 مل من محلول تحلل النوى وماصة عدة مرات. يجب أن يصبح الحل لزجا.
- هطول الأمطار البروتين
- إضافة 200 ميكرولتر من البروتين هطول الأمطار العازلة إلى الأنسجة، أو 1 مل إلى الدم. دوامة بقوة لمدة 20 ق واحتضان على الجليد لمدة 5 دقائق. قد تكون كتل البروتين الصغيرة مرئية بعد الدوامة.
- جهاز طرد مركزي عند 16,000 x g لمدة 4 دقائق. يجب أن تتشكل بيليه ضيق يحتوي على بروتينات معجلة.
- نقل supernatant بعناية، دون إزعاج بيليه، إلى أنبوب جديد 1.7 مل.
ملاحظة: إذا لم يكن بيليه ضيقا، ففكر في جهاز طرد مركزي آخر عند 16,000 × ز لمدة 4 دقائق.
- هطول الأمطار والحمض النووي والإماهة
- إضافة 1 مل من 2-propanol إلى أنبوب يحتوي على supernatant، وتخلط بلطف عن طريق عكس. يجب أن يصبح الحمض النووي مرئيا كمادة عائمة بيضاء.
- جهاز طرد مركزي عند 16,000 x g لمدة دقيقة واحدة. إزالة supernatant تماما باستخدام ماصة.
- إضافة 1 مل من الإيثانول الطازج 70٪، وانبوب عكس عدة مرات. جهاز طرد مركزي عند 16,000 x g لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة. تجاهل supernatant بعناية.
- كرر الخطوة 1.4.3.
- ضع أنبوب مفتوح مقلوب على ورق ماصة نظيف لمدة 10-15 دقيقة. إعادة عكس أنبوب وتأكيد الترطيب الكامل. إذا لزم الأمر، اتركيه ليجفف الهواء لمدة 10-15 دقيقة إضافية.
ملاحظة: من المهم أن تجف بيليه تماما. - أضف 50 ميكرولتر من المياه فائقة النقاء (UPW). إذا لزم الأمر، يمكن تخفيف الحمض النووي أكثر بعد القياس الكمي.
- حضانة لمدة 1 ساعة على كتلة الحرارة في 65 درجة مئوية، لإماهة الحمض النووي.
- تحديد كمي للحمض النووي
ملاحظة: تم قياس الحمض النووي باستخدام مقياس الفلور والكواشف المعينة، على النحو المحدد في جدول المواد.- جلب المعايير لدرجة حرارة الغرفة وإعداد عدة، بما في ذلك أنابيب 0.5 مل المعينة.
- إعداد العازلة ومزيج صبغ في أنبوب 15 مل، وفقا لعدد من العينات. إضافة 200 ميكرولتر من العازلة و 1 ميكرولتر من الصبغة لكل عينة. تضمين عينتين للمعايير. من المستحسن حساب عينة إضافية لتجنب أن المخزن المؤقت لن يكون كافيا.
- بالنسبة للمعايير 2، ضع 190 ميكرولتر من المزيج المعد أعلاه في أنبوب 0.5 مل. أضف 10 ميكرولتر من المعيار.
- لكل عينة، ضع 199 ميكرولتر من المزيج المعد أعلاه في أنبوب 0.5 مل. أضف 1 ميكرولتر من الحمض النووي.
- اقرأ العينات. وتشير النتيجة إلى تركيز الحمض النووي للعينة.
- إذا كانت العينات فوق الحد، تمييع الحمض النووي 1:10 مع UPW، وكرر قراءة.
2. إعداد المكتبة
ملاحظة: يستخدم البروتوكول الحالي عدة المقايسة متعددة الأجهزة المستندة إلى PCR متوافقة مع التسلسلات NGS. تحتوي المجموعة على 24 مؤشر مختلف يستهدف كل منها المناطق المحفوظة داخلβ V ومناطقβ J. وهذا يمكن تفاعل PCR خطوة واحدة وتجميع عينات مختلفة. انظر جدول المواد للحصول على التفاصيل.
- إعداد عينات الحمض النووي. الحصول على 150 نانوغرام من الحمض النووي وإضافة UPW لما مجموعه 5 ميكرولتر.
ملاحظة: من الممكن استخدام أقل من 150 نانوغرام من الحمض النووي لإعداد المكتبة، مع تركيز الحد الأدنى من 10 نانوغرام / ميكرولتر. - ضع ماصة ونصائح في غطاء محرك السيارة مع ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 15 دقيقة لكسر الحمض النووي المتبقي. وفي الوقت نفسه، اسمح لأنابيب الفهرس المختلفة (لإعداد المكتبة) وبلمرة الحمض النووي بالذوبان على الجليد.
- في غطاء محرك السيارة البيولوجي، أضف 45 ميكرولتر من أنابيب الفهرس المختلفة إلى أنابيب PCR. لمتابعة, إضافة 0.2 ميكرولتر من بوليمرات الحمض النووي و 5 ميكرولتر من الحمض النووي أعدت في الخطوة 2.1 في أنابيب PCR.
- تشغيل تفاعل PCR باستخدام برنامج محدد مسبقا ، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
3. تنقية التضخيم والتحديد الكمي
- استخدام الخرز المغناطيسي لإزالة التمهيديات الزائدة، النيوكليوتيدات، والإنزيمات.
- قم بتدفئة الخرز على الأقل 30 دقيقة إلى درجة حرارة الغرفة. إعداد ما يكفي من الإيثانول الطازج 80٪ ل400 ميكرولتر لكل عينة.
- إضافة 50 ميكرولتر (IGH) أو 35 ميكرولتر (TCRа) من الخرز إلى كل أنبوب PCR وخلط عن طريق الأنابيب 10 مرات. احتضان 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- ضع العينة المختلطة على الحامل المغناطيسي لمدة 5 دقائق.
- أسبيرات 95 ميكرولتر (IGH) أو 80 ميكرولتر (TCRа) من السائل واضحة وتجاهل. أسبيرات السائل المتبقي باستخدام طرف 10 ميكرولتر.
- إضافة 200 ميكرولتر من الإيثانول 80٪ إلى كل عينة. احتضان 30 s. أسبيرات 195 ميكرولتر من الإيثانول والتخلص منها. يستنشق السائل المتبقي باستخدام طرف 10 ميكرولتر.
- كرر الخطوة 3.1.5. افتح أغطية الأنابيب ودع الهواء يجف لمدة 5 دقائق.
- مباشرة بعد 5 دقائق، وإزالة من موقف المغناطيسي وإضافة 25 ميكرولتر من العازلة elution (10 م تريس-HCl، درجة الحموضة 8.0). تخلط عن طريق الأنابيب حتى متجانسة. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 دقيقة.
- ضع الأنابيب على الحامل المغناطيسي لمدة 5 دقائق. نقل 22 ميكرولتر إلى أنبوب PCR جديد. قياس تركيز الحمض النووي (الخطوة 1.5).
- القياس الكمي للتضخيم
ملاحظة: يستخدم البروتوكول الحالي آلة كهربائية آلية لمراقبة جودة تركيز الحمض النووي وحجمه وسلامته. انظر جدول المواد للحصول على التفاصيل.- ضع الكواشف وشريط الشاشة في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة على الأقل.
- في أنبوب طرد مركزي صغير سعة 1.7 مل، قم بتمييع عينات الحمض النووي 1 نانوغرام/ميكرولتر في الخطوة 3.1.8 مع UPW بحجم إجمالي لا يقل عن 3 ميكرولتر.
- دوامة الحمض النووي المخفف قبل الاستخدام. ضع 2 ميكرولتر من العازلة، جنبا إلى جنب مع 2 ميكرولتر من الحمض النووي المخفف في شرائط PCR المتخصصة المسماة مسبقا (المنصوص عليها في المجموعة) ووضع القبعات. مكان على شاكر لمدة 1 دقيقة، تليها تدور أسفل من شرائط PCR.
ملاحظة: نظرا ل لزوجة المخزن المؤقت، تأكد من إزالة المخزن المؤقت الزائد من الطرف قبل نقله إلى أنابيب العينة. - ضعه في الجهاز وشريط الشاشة وشرائط PCR بدون القبعات. افتح غطاء صندوق الأطراف داخل الجهاز. تعيين الموضع مع تسميات مناسبة. بدء تشغيل الجهاز.
ملاحظة: يجب أن يكون الرسم البياني الإخراج ذروة واحدة في الحجم المطلوب من amplicons(الشكل 1A). في عينات من نوعية رديئة، وسوف يلاحظ قمم إضافية(الشكل 1B)،مما يدل على سوء تنظيف حبة أو تشكيل dimers التمهيدي.
4. تسلسل الجيل التالي
- تحديد حجم المكتبة وتجميعها
- احسب تركيز الحمض النووي النهائي في nM، باستخدام قيمة الحمض النووي من الخطوة 3.1.8، والحجم في أزواج الأساس (bp) من ذروة المنتج، التي تم الحصول عليها من نتائج الجهاز الكهربائي (انظر الشكل 1).
- لكل عينة، حساب حجم الحمض النووي لاتخاذ لتركيز النهائي من 4 مليون متر، في حجم النهائي من 10-20 ميكرولتر elution العازلة.
- إعداد مزيج تخفيف جديد لكل عينة وتأخذ 2 ميكرولتر منه إلى مزيج تجمع جديد.
ملاحظة: بالنسبة للنماذج التي تحتوي على أقل من 4 nM، أضف أقصى قدر ممكن من العينة.
- NGS تشغيل المكتبة
ملاحظة: يستخدم البروتوكول الحالي منصة التسلسل الأعلى مقاعد البدلاء. انظر جدول المواد للحصول على التفاصيل.- إعداد حل جديد من 0.2 N NaOH. إضافة 10 ميكرولتر من 0.2 N NaOH إلى المكتبة المخففة المعدة في الخطوة 4.1.3. إضافة 5٪ فيإكس إلى أنبوب ودوامة لفترة وجيزة. تدور أسفل الأنبوب لضمان كل حل قد استقر إلى الجزء السفلي من الأنبوب.
- احتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة لإزالة الحمض النووي المزدوج الذين تقطعت بهم السبل. أضف 980 ميكرولتر من العازلة المبردة مسبقا من المجموعة إلى الأنبوب الذي يحتوي على الحمض النووي ودوامة لفترة وجيزة.
- ضع المكتبة المخففة على الجليد، واستعد المكتبة على النحو التالي. للحصول على مزيج من 17 pM، أضف 425 ميكرولتر من الحمض النووي من الخطوة 4.2.2 و 575 ميكرولتر من المخزن المؤقت. عكس المكتبة عدة مرات وتدور إلى أسفل. تحميل 600 ميكرولتر من المكتبة النهائية على خرطوشة المعينة، ووضع عينات في الجهاز.
- بدء التشغيل باتباع إرشادات البرنامج.
5. تحليل التسلسل
- تحميل مقاييس التسلسل من المنظم، والتحقق من أن تسلسل البيانات ضمن النطاقات التالية (محددة للمجموعة المستخدمة في البروتوكول الحالي). نماذج لا تفي بهذه المعايير عرضة لتكرار تشغيل:
كثافة الكتلة (الكثافة (K/mm2)): 945K - 1800K
النسبة المئوية لعوامل التصفية التي تمرر القراءات (كتل PF (٪):>90٪
درجات الجودة (٪>=Q30): >85٪
محاذاة PhiX (محاذاة ٪): 1.5٪ - 10٪
معدل خطأ PhiX (٪): <1.0٪
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
هنا، ونحن نصف طريقة لعزل الحمض النووي من الأنسجة المعوية والدم، وإعداد المكتبات لNGS، والخطوات الأساسية لتشغيل تسلسل لتسلسل ذخيرة المناعة. سيقوم التشغيل بإنشاء ملفات fastq ، والتي يمكن تحويلها إلى ملفات fasta لاستخدامها في ImMunoGeneTics الدولية (IMGT) / منصة HighV-QUEST. هذا HTS ينفذ ويدير العديد من التحليلات لعشرات الآلاف من تسلسل TCRβ وIGH أعيد ترتيبها، في مستوى النيوكليوتيد15. IMGT / HighV - QUEST تمكن من تحليل مختلف TCRs وIGH repertoires في كل من الصحة والمرض. وهذا يمكن أن يؤدي إلى تحديد المستنسخين "خاصة بالأمراض" الجديدة، وتحليل التوسع التخفيي ومعايير التنوع، وتحديد استخدام V(D)J التفاضلي، وتحليل الطفرات المفرطة الجسدية، وأكثر من ذلك. يوفر IMGT/HighV-QUEST ملفات CSV، التي تحتوي على تسلسلات محددة ووفرة لها. استخدام الحمض النووي الجينومي كمادة البداية تسفر عن أرقام التسلسل التي تمثل أرقام الخلايا. وهكذا، إذا كانت كمية الحمض النووي الأصلية متساوية، يمكن أيضا حساب النسبة المئوية للخلايا التائية في عينة معينة.
ونحن تشمل تحليلا أساسيا من ممثل, عينات الدم المستقيم المستقيم من المريض مع نقص مستقبلات IL10 وتاريخ من IBD شديدة الطفولية بداية, الناجمة عن طفرة IL10RA ضارة. تم فحص العينات لكل من ذخيرة TCRβ و IGH. وأسفرت عينة TCRβ المعوية عن ما مجموعه 450 12 تسلسلا، منها 050 9 تسلسلا فريدا من نوعه. كان لعينة الدم TCRβ ما مجموعه 54,880 تسلسلا، منها 35,110 كانت فريدة من نوعها. وفي عينة IGH المعوية، تم الحصول على ما مجموعه 070 49 تسلسلا، منها 670 23 تسلسلا فريدا. وفي عينة الدم من IGH، تم الحصول على ما مجموعه 710 13 تسلسلات، منها 540 13 تسلسلا فريدا من نوعه. ويمكن تحديد جميع المستنسخين من خلال تسلسل فريد من نوعه سواء على مستوى النيوكليوتيد أو الأحماض الأمينية. يمكن مقارنة هذه التسلسلات بين المرضى المختلفين ، بحثا عن استنساخ مشترك ، أو في نفس المريض بين مواقع تشريحية مختلفة (على سبيل المثال ، الدم مقابل الأمعاء). نحن نقدم لكل عينة من العينات 5 استنساخ الأكثر شيوعا (الجدول 1).
لقياس درجة التوسع اللاستنساخي يمكن استخدام مؤشرات مختلفة، بما في ذلك H شانون، جيني سيمبسون، الإنتروبيا والقبانية. على سبيل المثال ، تم العثور على H شانون ، الذي يأخذ في الاعتبار عدد التسلسلات الفريدة (ثراء الذخيرة) وكيف يتم توزيعها بالتساوي أن ينخفض في IGH المريض المعوي مقابل الدم (8.3 مقابل 9.5) ، مما يشير إلى التوسع اللاستنساخي للخلايا B في الأمعاء الملتهبة.
للحصول على نظرة عامة واسعة على المرجع ، تم إنشاء صور Treemap (www.treemap.com)(الشكل 2). يمثل كل مربع ملون استنساخ مختلف، ويرتبط الحجم بتردده. هذه الصور Treemap تظهر التوسع التخفي في ذخيرة IGH المعوية مقارنة مع الدم. في المقابل ، في ذخيرة TCRβ ، لوحظ توسع كلوي ملحوظ في الدم ، بالمقارنة مع الأمعاء الذاتية.
وعلى مستوى الجينات، تقدم NGS معلومات عن استخدام V-D-و J- على مستوى الجين أو العائلة أو الأليل، كما هو موضح في الجدول 1. وعلاوة على ذلك، يمكن استنتاج تركيبات V(D)J محددة من البيانات الخاصة بذخيرتي TCRβ و IGH(الشكل 3A،B)،والتي يمكن أن تكشف عن أنماط استخدام الجينات التفاضلية في ظروف مختلفة. يمكن أيضا تحليل الخصائص الفيزيائية الحيوية لمنطقة CDR3 مثل الطول(الجدول 1)أو رهاب الماء. الأهم من ذلك، يتم تغيير توزيع طول CDR3 في اضطرابات مختلفة بوساطة المناعة10،16،17. على سبيل المثال، في المرضى الذين يعانون من نقص IL10R، والخلايا التائية المشتقة من الدم، ولكن ليس الخلايا B، لديها أقصر CDR3 طول، والماء التفاضلية، بالمقارنة مع الضوابط الصحية7.
الشكل 1: بيانات تحليل البيانات الحيوية التمثيلية. صور تمثيلية لعينات TCRβ المعوية التي تظهر النتائج المثلى(A)مع الذروة المطلوبة عند 400 نقطة أساس. مثال على مكتبة منخفضة الجودة(B)مع قمم إضافية في 179bp و 114bp (ملحوظ *). القمم التي ينظر إليها في نهايات هي علامات العلوي والسفلي من قطاع الكهربائي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: نظرة عامة على ذخيرة مناعية الخلايا T و B. مخططات خريطة الشجرة من TCRβ وIGH الدم وعينات الأمعاء. يمثل كل مربع ملون استنساخ مختلف، ويرتبط الحجم بتردده. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: الرسوم البيانية التمثيلية لاستخدام TCRβ و IGH V-J. عينة معوية تمثيلية تصور العدد الإجمالي للتسلسلات لكل تركيبة V-J في TCRβ (A) أو IGH (B). لا يتم عرض البيانات للاستخدام D. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وغالبا ما تواجه التغيرات في وفرة ووظيفة الخلايا الليمفاوية B و T في الأورام الخبيثة المختلفة18, اضطرابات التهابية مزمنة (على سبيل المثال, التهاب القولون التقرحي والتهاب المفاصل الروماتويدي)10,19, وفي مختلف المناعي17,20. وتستخدم الطريقة الحالية نظام NGS لتسهيل رؤية متعمقة لذخيرة TCR وBCR ، مما يتيح الكشف عن التغيرات الطفيفة في كلونية الخلايا T و B ، ومشاركة المستنسخين ، واستخدام جين V(D)J ، ومعلومات عن درجة الطفرات المفرطة الجسدية في حالة الخلايا B.
وصفت طريقة عزل الحمض النووي للخزعات المعوية وعينات الدم. ومع ذلك ، مع تعديلات التحلل واستخراج الحمض النووي ، يمكن تطبيق الطريقة على الأنسجة الأخرى مثل الأورام والغدد الليمفاوية والسائل الزليلي ، إلخ. من المهم أثناء إعداد المكتبة عدم تلويث مجموعات التمهيدي المختلفة. في تنظيف الخرز ، يجب توخي الحذر لترك الأنابيب على المغناطيس في جميع أوقات الحضانة. بالنسبة لعينات الحمض النووي ذات التركيزات المنخفضة، يمكن تركيز المخزونات عند 65 درجة مئوية لمدة 10-20 دقيقة. وعلاوة على ذلك، يمكن أن تكون eluted amplicons من الخرز في أقل من 20 ميكرولتر elution العازلة.
تقنيات مختلفة تستخدم في الماضي لتوصيف المناظر الطبيعية لتكوين الخلايا T و B قدمت فقط لمحة سطحية عن ذخيرة المناعة. واحدة من أكبر مزايا NGS لتحليل ذخيرة المناعة هي القدرة على تحديد المستنسخين الفريدين ، وبالتالي تتبعها في مواقع تشريحية مختلفة (على سبيل المثال ، الأمعاء مقابل الدم مقابل العقدة الليمفاوية) أو في أفراد مختلفين. الآثار السريرية لمثل هذه التقنية كبيرة، وتتجاوز تعزيز فهم دور الخلايا T أو B في مختلف الأمراض بوساطة المناعة أو الأورام الخبيثة21. في علم الأورام ، يتم استخدام NGS لتحديد استنساخ محدد يمكن أن يكون علامات بيولوجية تنبؤية للمرضى الذين سيستفيدون على الأرجح من العلاجات المناعية الحالية22و23و24. في سرطان الدم ، يتم استخدام NGS لتأكيد الاستئصال الكامل للخلايا السرطانية من خلال الكشف عن استنساخ اللوكيميا المتبقية التي تبقى في المريض بعد العلاج25.
أحد القيود الرئيسية لتحليل الذخيرة المناعية لعينات الأنسجة أو الدم الكاملة هو عدم القدرة على تحديد التغيرات في الذخيرة في المجموعات السكانية الأقل تكرارا. على سبيل المثال، إذا كانت الخلايا التائية التنظيمية، التي لا تضم سوى نسب مئوية قليلة من إجمالي خلايا CD4+ T، تعبر عن ملف تعريف ذخيرة فريد، فإن هذا لن يتم تفويته إذا أجريت هذه الدراسات على الدم الكامل. ويمكن معالجة هذه المشكلة من خلال إجراء هذه الدراسات على مجموعات المناعة المفرزة. بدلا من ذلك، في السنوات الأخيرة تطورت التكنولوجيا لتسهيل اقتران بيانات الحمض النووي الريبي خلية واحدة مع TCR أو IGH مرجع ملامح26. وهذا يوفر مستوى آخر من وظائف الخلايا T أو B، حيث يمكن وصف المناظر الطبيعية النسخية لكل استنساخ. على سبيل المثال، استخدم Zemmour وآخرون scRNAseq TCRseq لإثبات أن الخلايا التائية التنظيمية من دم الإنسان، تظهر تغايرا واسعا مع فئة فرعية نشطة ترتبط نسخيا بالخلايا التائية التقليدية27. وبالمثل، في المرضى الذين يعانون من سرطان الكبد هذه الطريقة حددت 11 مجموعات فرعية الخلية التائية المتميزة التي تتسلل إلى الورم، كل واحد مع نسخة فريدة من نوعها وذخيرة الشخصي28. وستكون دراسات من هذا القبيل مفيدة خاصة عند دراسة مجموعات نادرة من السكان، وستوفر معلومات وظيفية هامة عن استنساخات محددة.
NGS من ذخيرة المناعة هو مجال البحوث الجديدة التي توفر رؤى جديدة حول وظيفة المناعة التكيفية ودور الخلايا T و B في مختلف الأمراض. بالإضافة إلى ذلك ، فإنه يدخل بسرعة إلى العالم السريري في تخصصات مختلفة ، من خلال تتبع الأمراض المرتبطة بالأنماط الجينية. هناك حاليا عدة مجموعات المتاحة للذخيرة المناعية. وتستند هذه على منهجية مماثلة، بغض النظر عما إذا كانت تستخدم الحمض النووي الريبي أو الحمض النووي كمصدر. وهي تستخدم تقنيات مماثلة للمعايرة وتصحيحات التحيز وأدوات التحليل؛ وبالتالي تحتاج إلى اختيارها بشكل صحيح وفقا لمطالب محددة. واحدة من المزايا العظيمة للمجموعة الحالية هي أنها جاهزة للاستخدام ومحسنة للذخيرة المناعية البشرية ، دون الحاجة إلى المعايرة. في المستقبل سنرى المزيد من الدراسات باستخدام ميزات ذخيرة كعلامات بيولوجية لأمراض مختلفة، مما قد يؤدي أيضا إلى تطوير العلاجات المستهدفة ضد هذه المستنسخات. نعتقد أن الباحثين يجب أن يفكروا في تطبيق هذه الأساليب لدراسة المشهد المناعي التكيفي في اضطرابات مختلفة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
جميع المؤلفين ليس لديهم ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
اي.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-propanol | Sigma | I9516-500ML | |
| 1.7 mL micro-centrifuge tubes | Axygen | 8187631104051 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Greiner | 188261 | |
| Absolute ethanol | Merck | 1.08543.0250 | |
| Amplitaq Gold | Thermo Fisher | N8080241 | |
| AMPure XP Beads | Beckman Coulter | A63881 | |
| Heat block | Bioer | Not applicable | |
| High Sensitivity D1000 Sample Buffer | Agilent | 5067-5603 | For Tapestation |
| High Sensitivity D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5584 | For Tapestation. Tubes sold seperately |
| Lymphotrack Assay kit | Invivoscribe | TRB: 70-91210039 IGH: 70-92250019 | Each includes 24 indexes |
| MiSeq Reagent Kit v2 (500 cycle) | Illumina | MS-102-2003 | Includes standard flow cell type and all reagents required |
| MiSeq Sequencer | Illumina | SY-410-1003 | |
| PCR strips | 4titude | 4ti-0792 | |
| Proteinase K | Invitrogen | EO0491 | |
| Qubit 4 Fluorometer | Thermo Fisher | Q33226 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher | Q32854 | Includes buffer, dye, standards, and specialized tubes |
| Shaker | Biosan | Not applicable | |
| Tapestation 2100 Bioanalyzer | Agilent | G2940CA | |
| ultra pure water | Bio-lab | 7501 | |
| Wizard DNA isolation kit | Promega | A1120 | Includes cell lysis solution, nuclei lysis solution, and protein precipitation buffer |
References
- Bassing, C. H., Swat, W., Alt, F. W. The mechanism and regulation of chromosomal V(D)J recombination. Cell. 109, Suppl 45-55 (2002).
- Roth, D. B. V(D)J Recombination: Mechanism, Errors, and Fidelity. Microbiology Spectrum. 2 (6), (2014).
- Heather, J. M., Ismail, M., Oakes, T., Chain, B. High-throughput sequencing of the T-cell receptor repertoire: pitfalls and opportunities. Brief Bioinformatics. 19 (4), 554-565 (2018).
- Pabst, O., Hazanov, H., Mehr, R. Old questions, new tools: does next-generation sequencing hold the key to unraveling intestinal B-cell responses. Mucosal Immunology. 8 (1), 29-37 (2015).
- Bashford-Rogers, R. J. M., Smith, K. G. C., Thomas, D. C. Antibody repertoire analysis in polygenic autoimmune diseases. Immunology. 155 (1), 3-17 (2018).
- Lee, Y. N., et al. Characterization of T and B cell repertoire diversity in patients with RAG deficiency. Science Immunology. 1 (6), (2016).
- Werner, L., et al. Alterations in T and B Cell Receptor Repertoires Patterns in Patients With IL10 Signaling Defects and History of Infantile-Onset IBD. Frontiers Immunology. 11, 109 (2020).
- Zhang, J., et al. Immune receptor repertoires in pediatric and adult acute myeloid leukemia. Genome Medicine. 11 (1), 73 (2019).
- Chapman, C. G., et al. Characterization of T-cell Receptor Repertoire in Inflamed Tissues of Patients with Crohn's Disease Through Deep Sequencing. Inflammatory Bowel Diseases. 22 (6), 1275-1285 (2016).
- Werner, L., et al. Altered T cell receptor beta repertoire patterns in pediatric ulcerative colitis. Clinical and Experimental Immunology. 196 (1), 1-11 (2019).
- Bashford-Rogers, R. J. M., et al. Analysis of the B cell receptor repertoire in six immune-mediated diseases. Nature. 574 (7776), 122-126 (2019).
- Wu, J., et al. Expanded TCRbeta CDR3 clonotypes distinguish Crohn's disease and ulcerative colitis patients. Mucosal Immunology. 11 (5), 1487-1495 (2018).
- Rosati, E., et al. Identification of disease-associated traits and clonotypes in the T-cell receptor repertoire of monozygotic twins affected by inflammatory bowel diseases. Journam of Crohn's and Colitis. , (2019).
- Allez, M., et al. T cell clonal expansions in ileal Crohn's disease are associated with smoking behaviour and postoperative recurrence. Gut. 68 (11), 1961-1970 (2019).
- Li, S., et al. IMGT/HighV QUEST paradigm for T cell receptor IMGT clonotype diversity and next generation repertoire immunoprofiling. Nature Communications. 4, 2333 (2013).
- H, I. J., et al. Strategies for B-cell receptor repertoire analysis in primary immunodeficiencies: from severe combined immunodeficiency to common variable immunodeficiency. Frontiers Immunology. 6, 157 (2015).
- Ghraichy, M., Galson, J. D., Kelly, D. F., Truck, J. B-cell receptor repertoire sequencing in patients with primary immunodeficiency: a review. Immunology. 153 (2), 145-160 (2018).
- Zhuang, Y., et al. Application of immune repertoire sequencing in cancer immunotherapy. International Immunopharmacology. 74, 105688 (2019).
- Liu, X., et al. T cell receptor beta repertoires as novel diagnostic markers for systemic lupus erythematosus and rheumatoid arthritis. Annual Rheumatic Diseases. 78 (8), 1070-1078 (2019).
- Wong, G. K., Heather, J. M., Barmettler, S., Cobbold, M. Immune dysregulation in immunodeficiency disorders: The role of T-cell receptor sequencing. Journal of Autoimmunity. 80, 1-9 (2017).
- Delhalle, S., Bode, S. F. N., Balling, R., Ollert, M., He, F. Q. A roadmap towards personalized immunology. NPJ System Biology and Applications. 4, 9 (2018).
- Laubli, H., et al. The T cell repertoire in tumors overlaps with pulmonary inflammatory lesions in patients treated with checkpoint inhibitors. Oncoimmunology. 7 (2), 1386962 (2018).
- Hogan, S. A., et al. Peripheral Blood TCR Repertoire Profiling May Facilitate Patient Stratification for Immunotherapy against Melanoma. Cancer Immunology Research. 7 (1), 77-85 (2019).
- Aversa, I., Malanga, D., Fiume, G., Palmieri, C. Molecular T-Cell Repertoire Analysis as Source of Prognostic and Predictive Biomarkers for Checkpoint Blockade Immunotherapy. International Journal of Molecular Sciences. 21 (7), (2020).
- Hirsch, P., et al. Precision and prognostic value of clone-specific minimal residual disease in acute myeloid leukemia. Haematologica. 102 (7), 1227-1237 (2017).
- De Simone, M., Rossetti, G., Pagani, M. Single Cell T Cell Receptor Sequencing: Techniques and Future Challenges. Frontiers Immunology. 9, 1638 (2018).
- Zemmour, D., et al. Single-cell gene expression reveals a landscape of regulatory T cell phenotypes shaped by the TCR. Nature Immunology. 19 (3), 291-301 (2018).
- Zheng, C., et al. Landscape of Infiltrating T Cells in Liver Cancer Revealed by Single-Cell Sequencing. Cell. 169 (7), 1342-1356 (2017).
