Summary
Het huidige protocol beschrijft een methode voor DNA-isolatie van bloedmonsters en darmbiopten, generatie van TCRβ- en IGH PCR-bibliotheken voor de volgende generatie sequencing, prestaties van een NGS-run en basisgegevensanalyse.
Abstract
Immunologisch geheugen, het kenmerk van adaptieve immuniteit, wordt georkestreerd door T- en B-lymfocyten. In omloop en verschillende organen zijn er miljarden unieke T- en B-cel klonen, en elk kan een specifiek antigeen binden, wat leidt tot proliferatie, differentiatie en / of cytokinesecretie. De enorme heterogeniteit in T- en B-cellen wordt gegenereerd door willekeurige recombinatie van verschillende genetische segmenten. Next-generation sequencing (NGS) technologieën, ontwikkeld in het afgelopen decennium, maken een ongekend diepgaand beeld van het T- en B-celreceptor-immuunrepertoire mogelijk. Studies bij verschillende ontstekingsaandoeningen, immunodeficiënties, infecties en maligniteiten toonden duidelijke veranderingen aan in clonaliteit, gengebruik en biofysische eigenschappen van immuunrepertoire, wat belangrijke inzichten gaf over de rol van adaptieve immuunresponsen bij verschillende aandoeningen.
Hier bieden we een gedetailleerd protocol voor NGS van immuunrepertoire van T- en B-cellen uit bloed en weefsel. We presenteren een pijplijn die begint met DNA-isolatie door bibliotheekvoorbereiding, sequencing op NGS-sequencer en eindigt met basisanalyses. Deze methode maakt het mogelijk om specifieke T- en B-cellen op nucleotide- of aminozuurniveau te verkennen en kan zo dynamische veranderingen in lymfocytenpopulaties en diversiteitsparameters bij verschillende ziekten identificeren. Deze techniek komt langzaam in de klinische praktijk en heeft het potentieel voor identificatie van nieuwe biomarkers, risicostratificatie en precisiegeneeskunde.
Introduction
Het adaptieve immuunsysteem, bestaande uit T- en B-lymfocyten, maakt gebruik van immunologisch geheugen om een eerder aangetroffen antigeen te herkennen en een snelle reactie te initiëren. Lymfocyten worden gegenereerd in het beenmerg en rijpen in de thymus (T-cellen) of het beenmerg (B-cellen). Zowel de T-celreceptor (TCR) als de B-celreceptor (BCR) vertonen unieke configuraties die herkenning van specifieke antigenen mogelijk maken. In homeostase circuleren en onderzoeken T- en B-cellen voortdurend de triljoenen verschillende peptiden die worden gepresenteerd op antigeen-presenterende cellen. TCR- of BCR-ligatie van een specifiek antigeen met een hoge affiniteit, samen met de juiste co-stimulatie, leidt tot celactivatie, wat resulteert in cytokinesecretie, klonale expansie en generatie van antilichamen, in het geval van B-cellen.
De enorme reeks van de verschillende T- of B-cellen wordt gezamenlijk immuunrepertoire genoemd, waardoor talloze verschillende epitopen kunnen worden herkennen. Om zo'n uitgebreid repertoire te genereren, vindt een complex proces van willekeurige assemblage van verschillende gensegmenten plaats, waardoor bijna eindeloze combinaties van receptoren ontstaan die unieke antigenen kunnen binden1. Dit proces, V(D)J recombinatie genoemd, omvat herschikkingen van verschillende variabele (V), diversiteit (D) en het samenvoegen van (J) genen, vergezeld van willekeurige deleties en invoegingen van nucleotiden in de knooppunten2.
De architectuur van het adaptieve immuunsysteem interesseert wetenschappers al tientallen jaren op verschillende gebieden. In het verleden werden Sanger-sequencing, complementaire bepalende regio 3 (CDR3) spectratypering en flowcytometrie gebruikt om het immuunrepertoire te karakteriseren, maar zorgden voor een lage resolutie. In het afgelopen decennium maakten de vooruitgang in next-generation sequencing (NGS) methoden diepgaand inzicht in de kenmerken en samenstelling van iemands TCR- en BCR-repertoires3,4. Deze HTS-sequentie (High Throughput Systems) sequentie en verwerken miljoenen herschikte TCR- of BCR-producten tegelijkertijd en maken een hoge-resolutieanalyse van specifieke T- en B-cellen op nucleotide- of aminozuurniveau mogelijk. NGS biedt een nieuwe strategie om het immuunrepertoire in zowel gezondheid als ziekte te bestuderen. Studies met HTS toonden veranderde TCR- en BCR-repertoires aan bij auto-immuunziekten5, primaire immunodeficiënties6,7en maligniteiten, zoals bij acute myeloïde leukemie8. Met behulp van NGS hebben wij en anderen oligoklonale expansie van specifieke T- en B-celklonen aangetoond, bij patiënten met inflammatoire darmziekte (IBD), waaronder colitis ulcerosa en de ziekte van Crohn9,10,11,12,13,14. Over het algemeen suggereren studies uit verschillende gebieden dat veranderingen in het repertoire een cruciale rol spelen bij de pathogenese van immuungemedieerde aandoeningen.
Het huidige protocol beschrijft een methode voor isolatie van DNA uit intestinale biopten en bloed, het genereren van TCRβ- en IGH PCR-bibliotheken voor NGS en de prestaties van sequencing run. We bieden ook basisstappen in de analyse van immuunrepertoiregegevens. Dit protocol kan ook worden toegepast voor het genereren van TCRα-, TCRγ- en IGL-bibliotheken. De methode is ook compatibel met andere organen (bijv. lymfeklieren, tumoren, synoviale vloeistof, vetweefsel, enz.) zolang weefselspecifieke spijsverteringsprotocollen worden gebruikt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Deze studie werd goedgekeurd door de institutionele beoordelingscommissie van het Sheba Medical Center en er werd geïnformeerde schriftelijke toestemming verkregen van alle deelnemende proefpersonen.
1. DNA-isolatie en kwantificering
- Spijsvertering en celanalyse van darmbiopten
- Haal darmbiopten op, vers verzameld of opgeslagen bij -20 °C of -80 °C. Als u bevroren biopten gebruikt, ontdooi dan op ijs.
- Voeg 600 μL kernanalyseoplossing toe aan een steriele microcentrifugebuis van 1,7 ml, gekoeld op ijs.
- Plaats de biopsie in een microcentrifugebuis met lysisoplossing en incubeer gedurende 15-30 min bij 65 °C.
- Voeg 17,5 μL 20 mg/ml proteïnase K toe en incubeer 's nachts bij 55 °C, met zacht schudden.
- Laat het monster 5 minuten afkoelen tot kamertemperatuur voordat u doorgaat naar stap 1.3.
- Celanalyse van volbloed
- Verkrijg 3 ml volbloed in EDTA-, heparine- of citraatbevattende buis.
- Giet de buis voorzichtig tot ze grondig gemengd zijn en breng het bloed over naar een steriele centrifugebuis van 15 ml met 9 ml cellysisoplossing. Keer meerdere keren om tijdens een incubatieperiode van 10 minuten bij kamertemperatuur.
- Centrifugeer op 2.000 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en gooi vervolgens zoveel mogelijk supernatant weg zonder de zichtbare witte pellet te verstoren. Er blijft ongeveer 50-100 μL restvloeistof over.
- Vortexbuis krachtig gedurende 15 s tot volledig geresuspendeerd. Voeg 3 ml kernen en pipet meerdere keren toe. De oplossing moet stroperig worden.
- Eiwitprecipitatie
- Voeg 200 μL eiwitprecipitatiebuffer toe aan het weefsel, of 1 ml aan het bloed. Vortex krachtig gedurende 20 s en incubeer op ijs gedurende 5 min. Kleine eiwitklontjes kunnen zichtbaar zijn na vortexing.
- Centrifugeer op 16.000 x g gedurende 4 min. Er moet zich een strakke pellet vormen die neergeslagen eiwitten bevat.
- Breng supernatant voorzichtig over, zonder de pellet te verstoren, naar een nieuwe buis van 1,7 ml.
OPMERKING: Als de pellet niet strak zit, overweeg dan een andere centrifuge op 16.000 x g gedurende 4 minuten.
- DNA neerslag en rehydratatie
- Voeg 1 ml 2-propanol toe aan de buis met het supernatant en meng voorzichtig door om te keren. DNA moet zichtbaar worden als witte zwevende substantie.
- Centrifugeer gedurende 1 min. op 16.000 x g. Verwijder het supernatant volledig met behulp van een pipet.
- Voeg 1 ml vers bereide 70% ethanol toe en keer de buis meerdere keren om. Centrifugeer op 16.000 x g gedurende 1 min bij kamertemperatuur. Gooi supernatant voorzichtig weg.
- Herhaal stap 1.4.3.
- Plaats de open buis omgekeerd op schoon absorberend papier gedurende 10-15 minuten. Keer de buis om en bevestig volledige hydratatie. Laat indien nodig nog 10-15 minuten aan de lucht drogen.
OPMERKING: Het is cruciaal dat pellets volledig drogen. - Voeg 50 μL ultrazuiver water (UPW) toe. Indien nodig kan DNA na kwantificering meer worden verdund.
- Incubeer gedurende 1 uur op een hitteblok bij 65 °C, voor DNA-rehydratatie.
- DNA-kwantificering
OPMERKING: DNA werd gekwantificeerd met behulp van een fluorometer en aangewezen reagentia, zoals gespecificeerd in de tabel met materialen.- Breng normen op kamertemperatuur en bereid de kit voor, inclusief 0,5 ml aangewezen buizen.
- Bereid buffer- en kleurstofmengsel in een buis van 15 ml, afhankelijk van het aantal monsters. Voeg 200 μL buffer en 1 μL kleurstof per monster toe. Voeg 2 monsters toe voor standaarden. Het wordt aanbevolen om een extra monster te berekenen om te voorkomen dat de buffer niet voldoende is.
- Plaats voor de 2 normen 190 μL van de bovengenoemde bereide mix in een buis van 0,5 ml. Voeg 10 μL van de standaard toe.
- Plaats voor elk monster 199 μL van het bovengenoemde mengsel in een buis van 0,5 ml. Voeg 1 μL DNA toe.
- Lees de monsters. Het resultaat duidt op de DNA-concentratie van het monster.
- Als de monsters over de limiet zijn, verdun het DNA 1:10 met UPW en herhaal de aflezing.
2. Bibliotheekvoorbereiding
OPMERKING: Het huidige protocol maakt gebruik van een multiplex, PCR-gebaseerde testkit die compatibel is met NGS-sequencers. De kit bevat 24 verschillende indexen die elk gericht zijn op geconserveerde regio's binnen deV-β en deJ-β regio's. Dit maakt een PCR-reactie in één stap mogelijk en het bundelen van verschillende monsters. Zie de tabel met materialen voor meer informatie.
- Bereid DNA-monsters voor. Verkrijg 150 ng DNA en tel UPW op voor een totaal van 5 μL.
OPMERKING: Het is mogelijk om minder dan 150 ng DNA te gebruiken voor bibliotheekvoorbereiding, met een minimale concentratie van 10 ng/μL. - Plaats pipetten en tips 15 minuten in de kap met UV-licht om rest-DNA af te breken. Laat ondertussen verschillende indexbuizen (voor bibliotheekvoorbereiding) en DNA-polymerase ontdooien op ijs.
- Voeg in een biologische kap 45 μL van de verschillende indexbuizen toe aan PCR-buizen. Voeg 0,2 μL van het DNA-polymerase en de 5 μL DNA die in stap 2.1 is bereid, toe aan PCR-buizen.
- Voer de PCR-reactie uit met behulp van een vooraf ingesteld programma, volgens de instructies van de fabrikant.
3. Amplicon zuivering en kwantificering
- Gebruik magnetische kralen voor het verwijderen van overtollige primers, nucleotiden en enzymen.
- Verwarm de kralen minstens 30 min op kamertemperatuur. Bereid voldoende verse 80% ethanol voor 400 μL per monster.
- Voeg 50 μL (IGH) of 35 μL (TCRβ) van de kralen toe aan elke PCR-buis en meng door 10 keer te pipetten. Incubeer 10 min bij kamertemperatuur.
- Plaats het gemengde monster gedurende 5 minuten op de magnetische standaard.
- Aspireer 95 μL (IGH) of 80 μL (TCRβ) van de heldere vloeistof en gooi weg. Aspireer de resterende vloeistof met behulp van een tip van 10 μL.
- Voeg 200 μL 80% ethanol toe aan elk monster. Incubeer 30 s. Aspireer 195 μL ethanol en gooi weg. Aspireer resterende vloeistof met behulp van 10 μL tip.
- Herhaal stap 3.1.5. Open de doppen van de buizen en laat 5 minuten aan de lucht drogen.
- Onmiddellijk na de 5 minuten uit de magnetische standaard verwijderen en 25 μL elutiebuffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0) toevoegen. Meng door pipetten tot homogeen. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 2 minuten.
- Plaats de buizen gedurende 5 minuten op de magnetische standaard. Breng 22 μL over naar een nieuwe PCR-buis. Meet de DNA-concentratie (stap 1.5).
- Amplicon kwantificering
OPMERKING: Het huidige protocol maakt gebruik van een geautomatiseerde elektroforesemachine voor kwaliteitscontrole van DNA-concentratie, grootte en integriteit. Zie de tabel met materialen voor meer informatie.- Plaats reagentia en screentape minstens 30 minuten op kamertemperatuur.
- Maak in een nieuwe microcentrifugebuis van 1,7 ml een verdunning van 1 ng/μL van de DNA-monsters die in stap 3.1.8 met UPW zijn gekwantificeerd voor een totaal volume van ten minste 3 μL.
- Vortex verdund DNA voor gebruik. Plaats 2 μL buffer, samen met 2 μL van het verdunde DNA in de voorgelabelde gespecialiseerde PCR-strips (meegeleverd in de kit) en plaats de doppen. Plaats op shaker gedurende 1 min, gevolgd door spin down van PCR strips.
OPMERKING: Zorg er vanwege de viscositeit van de buffer voor dat overtollige buffer van de punt wordt verwijderd voordat deze naar de monsterbuizen wordt overgedragen. - Plaats in de machine, de screentape en PCR strips zonder de doppen. Open het deksel van de tipbox in de machine. Wijs de positie toe met de juiste labels. Start de machine.
OPMERKING: Het output histogram moet een enkele piek zijn op de gewenste grootte van de amplicons (Figuur 1A). In monsters van slechte kwaliteit zullen extra pieken worden waargenomen(figuur 1B),wat wijst op een slechte padopruiming of vorming van primer dimers.
4. Next-generation sequencing
- Kwantificering en pooling van bibliotheek
- Bereken de uiteindelijke DNA-concentratie in nM, met behulp van DNA-waarde uit stap 3.1.8, en de grootte in basisparen (bp) van de piek van het product, verkregen uit de resultaten van de elektroforesemachine (zie figuur 1).
- Bereken voor elk monster het te nemen DNA-volume voor een eindconcentratie van 4 nM, in een eindvolume van 10-20 μL elutiebuffer.
- Bereid voor elk monster een nieuwe verdunningsmix en neem er 2 μL van naar een nieuwe poolmix.
OPMERKING: Voeg voor monsters met minder dan 4 nM de maximaal mogelijke hoeveelheid monster toe.
- NGS run van bibliotheek
OPMERKING: Het huidige protocol maakt gebruik van een sequencerplatform met banktop. Zie de tabel met materialen voor meer informatie.- Bereid een verse oplossing van 0,2 N NaOH. Voeg 10 μL 0,2 N NaOH toe aan de verdunde bibliotheek die is voorbereid in stap 4.1.3. Voeg kort 5% PhiX toe aan tube en vortex. Draai de buis naar beneden om ervoor te zorgen dat alle oplossing zich op de bodem van de buis heeft gevestigd.
- Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur om het dubbelstrengs DNA te denatureren. Voeg kort 980 μL voorgekoelde buffer uit de kit toe aan de buis met DNA en vortex.
- Plaats de verdunde bibliotheek op ijs en bereid de bibliotheek als volgt voor. Voeg voor een mix van 17 pM 425 μL DNA toe vanaf stap 4.2.2 en 575 μL buffer. Draai de bibliotheek meerdere keren om en draai naar beneden. Plaats 600 μL van de uiteindelijke bibliotheek op de daarvoor bestemde cartridge en plaats monsters in de machine.
- Start de uitvoering volgens de software-instructies.
5. Sequencing analyse
- Download sequencingstatistieken van sequencer en controleer of sequencinggegevens binnen de volgende bereiken vallen (specifiek voor de kit die in het huidige protocol wordt gebruikt). Monsters die niet aan deze criteria voldoen, moeten opnieuw worden uitgevoerd:
Clusterdichtheid (dichtheid (K/mm2)): 945K – 1800K
Percentage leesdoorlaatfilter (clusters PF (%)): >90%
Kwaliteitsscores (%>=Q30): >85%
PhiX uitlijning (uitgelijnd %): 1,5% - 10%
PhiX-foutpercentage (%): <1,0%
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hierin beschrijven we een methode voor DNA-isolatie uit darmweefsel en bloed, voorbereiding van bibliotheken voor NGS en basisstappen van een sequencingrun voor immuunrepertoiresequenties. De run genereert fastq-bestanden, die verder kunnen worden geconverteerd naar fasta-bestanden voor gebruik in het internationale ImMunoGeneTics (IMGT)/HighV-QUEST-platform. Deze HTS voert en beheert vele analyses van tienduizenden herschikte TCRβ- en IGH-sequenties, op nucleotideniveau15. IMGT/HighV-QUEST maakt analyse van verschillende TCR's en IGH-repertoires in zowel gezondheid als ziekte mogelijk. Dit kan leiden tot identificatie van nieuwe "ziektespecifieke" klonen, analyse van klonale expansie- en diversiteitsparameters, afbakening van differentieel V(D)J-gebruik, analyse van somatische hypermutaties en meer. De IMGT/HighV-QUEST biedt CSV-bestanden, die specifieke sequenties en hun overvloed bevatten. Het gebruik van genomisch DNA als uitgangsmateriaal levert sequentienummers op die representatief zijn voor celnummers. Als de oorspronkelijke DNA-hoeveelheid gelijk is, kan dus ook het percentage T-cellen in een bepaald monster worden berekend.
We nemen een basisanalyse op van representatieve, autologe bloed- en rectale monsters van een patiënt met IL10-receptordeficiëntie en een voorgeschiedenis van ernstige infantiele IBD, als gevolg van een schadelijke IL10RA-mutatie. Samples werden geësetest voor zowel TCRβ als IGH repertoire. Het intestinale TCRβ-monster leverde in totaal 12.450 sequenties op, waarvan 9.050 sequenties uniek waren. Het bloed TCRβ-monster had in totaal 54.880 sequenties, waarvan er 35.110 uniek waren. In het intestinale IGH-monster werden in totaal 49.070 sequenties verkregen, waarvan er 23.670 uniek waren. In het bloed IGH-monster werden in totaal 13.710 sequenties verkregen, waarvan er 13.540 uniek waren. Alle klonen kunnen worden geïdentificeerd door hun unieke volgorde, zowel op het nucleotide- als aminozuurniveau. Deze sequenties kunnen worden vergeleken tussen verschillende patiënten, op zoek naar gedeelde klonen, of bij dezelfde patiënt tussen verschillende anatomische sites (bijv. bloed versus darm). We presenteren voor elk van de monsters de 5 meest voorkomende klonen (Tabel 1).
Om de mate van klonale expansie te kwantificeren kunnen verschillende indices worden gebruikt, waaronder Shannon's H, Gini-Simpson, entropie en clonaliteit. Als voorbeeld, Shannon's H, die rekening houdt met het aantal unieke sequenties (rijkdom van het repertoire) en hoe gelijkmatig ze worden verdeeld, bleek te zijn verminderd in de intestinale IGH van de patiënt versus bloed (8,3 vs. 9,5), wat wijst op klonale expansie van B-cellen in de ontstoken darm.
Voor een breed overzicht van het repertoire werden Treemap-afbeeldingen (www.treemap.com) gegenereerd (figuur 2). Elk gekleurd vierkant vertegenwoordigt een andere kloon en de grootte correleert met de frequentie. Deze Treemap beelden tonen klonale expansie in het intestinale IGH repertoire in vergelijking met het bloed. In het TCRβ-repertoire daarentegen wordt een duidelijke klonale expansie waargenomen in het bloed, in vergelijking met autologe darm.
Op genniveau geeft NGS informatie over V-D- en J-gebruik op het niveau van gen, familie of allel, zoals weergegeven in tabel 1. Bovendien kunnen specifieke V(D)J-combinaties worden afgeleid uit de gegevens voor TCRβ- en IGH-repertoires(figuur 3A, B),die differentiële gengebruikspatronen in verschillende omstandigheden kunnen onthullen. Biofysische eigenschappen van het CDR3-gebied zoals lengte (tabel 1) of hydrofobiciteit kunnen ook worden geanalyseerd. Belangrijk is dat de cdr3-lengteverdeling wordt gewijzigd bij verschillende immuungemedieerde aandoeningen10,16,17. Bij IL10R-deficiënte patiënten hebben bijvoorbeeld van bloed afgeleide T-cellen, maar geen B-cellen, een kortere CDR3-lengte en differentiële hydrofobiciteit, in vergelijking met gezonde controles7.
Figuur 1: Representatieve bioanalysatorgegevens. Representatieve beelden van intestinale TCRβ-monsters met optimale resultaten (A) met de gewenste piek bij 400 bp. Een voorbeeld van een bibliotheek van lage kwaliteit (B) met extra pieken bij 179bp en 114bp (gemarkeerd *). Pieken aan de uiteinden zijn bovenste en onderste markeringen van de elektroforesestrook. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2: Overzicht van T- en B-cel immuunrepertoire. Treemap diagrammen van TCRβ en IGH bloed- en darmmonsters. Elk gekleurd vierkant vertegenwoordigt een andere kloon en de grootte correleert met de frequentie. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3: Representatieve grafieken van het gebruik van TCRβ en IGH V-J. Een representatief darmmonster met het totale aantal sequenties voor elke V-J-combinatie in TCRβ (A) of IGH (B). Gegevens worden niet weergegeven voor D-gebruik. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Veranderingen in overvloed en functie van B- en T-lymfocyten worden vaak aangetroffen in verschillende maligniteiten18, chronische ontstekingsstoornissen (bijv. colitis ulcerosa en reumatoïde artritis)10,19, en in verschillende immunodeficiënties17,20. De huidige methode maakt gebruik van NGS om een diepgaand beeld van TCR- en BCR-repertoires te vergemakkelijken, waardoor subtiele veranderingen in T- en B-celklonaliteit, het delen van klonen, V(D)J-gengebruik en informatie over de mate van somatische hypermutaties in het geval van B-cellen kunnen worden gedetecteerd.
De methode van DNA-isolatie werd beschreven voor darmbiopten en bloedmonsters. Met wijzigingen van lysis en DNA-extractie kan de methode echter worden toegepast op andere weefsels zoals tumoren, lymfeklieren, synoviale vloeistof, enz. Het is belangrijk om tijdens de voorbereiding van de bibliotheek de verschillende primersets niet te kruisvervuilen. Bij het opruimen van kraal moet ervoor worden gezorgd dat buizen te allen tijde van incubatie op de magneet worden achterlaat. Voor DNA-monsters met lage concentraties kunnen de voorraden gedurende 10-20 minuten bij 65 °C worden geconcentreerd. Bovendien kunnen amplicons worden geëuteerd uit kralen in slechts 20 μL elutiebuffer.
Verschillende technieken die in het verleden werden gebruikt om het landschap van T- en B-celsamenstelling te karakteriseren, gaven slechts een oppervlakkig overzicht van het immuunrepertoire. Een van de grootste voordelen van NGS voor analyse van immuunrepertoire is het vermogen om unieke klonen te identificeren en ze bijgevolg te volgen op verschillende anatomische locaties (bijv. darm versus bloed versus lymfeklier) of bij verschillende individuen. De klinische implicaties van een dergelijke techniek zijn significant en gaan verder dan het verbeteren van het begrip van de rol van T- of B-cellen bij verschillende immuungemedieerde ziekten of maligniteiten21. In de oncologie wordt NGS gebruikt om specifieke klonen te identificeren die voorspellende biomarkers kunnen zijn voor de patiënten die hoogstwaarschijnlijk zullen profiteren van de huidige immunotherapieën22,23,24. Bij leukemie wordt NGS gebruikt om de volledige uitroeiing van kankercellen te bevestigen door detectie van resterende leukemische klonen die na behandeling25bij een patiënt achterblijven.
Een van de belangrijkste beperkingen van immuunrepertoireanalyse van hele weefsels of bloedmonsters is het onvermogen om repertoireveranderingen in minder frequente populaties te identificeren. Als bijvoorbeeld regulerende T-cellen, die slechts een paar procenten van de totale CD4+ T-cellen bevatten, een uniek repertoireprofiel uitdrukken, zou dit worden gemist als deze studies op volbloed zouden worden uitgevoerd. Dit probleem zou kunnen worden aangepakt door deze studies uit te voeren naar gesorteerde immuunpopulaties. Als alternatief heeft zich in de afgelopen jaren technologie ontwikkeld om de koppeling van RNA-gegevens met één cel met TCR- of IGH-repertoireprofielen te vergemakkelijken26. Dit biedt een ander niveau van functionaliteit van de T- of B-cellen, omdat het transcriptielandschap van elke kloon kan worden gekarakteriseerd. Als voorbeeld gebruikten Zemmour et al. scRNAseq TCRseq om aan te tonen dat regulerende T-cellen uit menselijk bloed een brede heterogeniteit vertonen met een geactiveerde subpopulatie die transcriptie gerelateerd is aan conventionele T-cellen27. Evenzo identificeerde deze methode bij patiënten met hepatocellulair carcinoom 11 verschillende T-cel subsets die de tumor infiltreren, elk met een uniek transcriptie- en repertoireprofiel28. Studies zoals deze zullen nuttig zijn, vooral bij het bestuderen van zeldzame populaties, en zullen belangrijke functionele informatie van specifieke klonen opleveren.
NGS van immuunrepertoire is een nieuw onderzoeksveld dat nieuwe inzichten biedt over adaptieve immuunfunctie en de rol van T- en B-cellen bij verschillende ziekten. Bovendien komt het snel de klinische wereld binnen in verschillende disciplines, door ziektegerelateerde clonotypen te volgen. Er zijn momenteel verschillende beschikbare kits voor immuunrepertoire. Deze zijn gebaseerd op een vergelijkbare methodologie, ongeacht of ze RNA of DNA als bron gebruiken. Ze gebruiken vergelijkbare technieken voor kalibratie, biascorrecties en analysetools; en moet dus goed worden gekozen op basis van specifieke eisen. Een van de grote voordelen van de huidige kit is dat het een gebruiksklare en geoptimaliseerde is voor menselijk immuunrepertoire, zonder kalibratie. In de toekomst zullen we meer studies zien die repertoirekenmerken gebruiken als biomarkers voor verschillende ziekten, wat mogelijk ook leidt tot de ontwikkeling van gerichte therapieën tegen deze klonen. Wij zijn van mening dat onderzoekers moeten overwegen om deze methoden toe te passen voor het bestuderen van het adaptieve immuunlandschap bij verschillende aandoeningen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
geen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-propanol | Sigma | I9516-500ML | |
| 1.7 mL micro-centrifuge tubes | Axygen | 8187631104051 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Greiner | 188261 | |
| Absolute ethanol | Merck | 1.08543.0250 | |
| Amplitaq Gold | Thermo Fisher | N8080241 | |
| AMPure XP Beads | Beckman Coulter | A63881 | |
| Heat block | Bioer | Not applicable | |
| High Sensitivity D1000 Sample Buffer | Agilent | 5067-5603 | For Tapestation |
| High Sensitivity D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5584 | For Tapestation. Tubes sold seperately |
| Lymphotrack Assay kit | Invivoscribe | TRB: 70-91210039 IGH: 70-92250019 | Each includes 24 indexes |
| MiSeq Reagent Kit v2 (500 cycle) | Illumina | MS-102-2003 | Includes standard flow cell type and all reagents required |
| MiSeq Sequencer | Illumina | SY-410-1003 | |
| PCR strips | 4titude | 4ti-0792 | |
| Proteinase K | Invitrogen | EO0491 | |
| Qubit 4 Fluorometer | Thermo Fisher | Q33226 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher | Q32854 | Includes buffer, dye, standards, and specialized tubes |
| Shaker | Biosan | Not applicable | |
| Tapestation 2100 Bioanalyzer | Agilent | G2940CA | |
| ultra pure water | Bio-lab | 7501 | |
| Wizard DNA isolation kit | Promega | A1120 | Includes cell lysis solution, nuclei lysis solution, and protein precipitation buffer |
References
- Bassing, C. H., Swat, W., Alt, F. W. The mechanism and regulation of chromosomal V(D)J recombination. Cell. 109, Suppl 45-55 (2002).
- Roth, D. B. V(D)J Recombination: Mechanism, Errors, and Fidelity. Microbiology Spectrum. 2 (6), (2014).
- Heather, J. M., Ismail, M., Oakes, T., Chain, B. High-throughput sequencing of the T-cell receptor repertoire: pitfalls and opportunities. Brief Bioinformatics. 19 (4), 554-565 (2018).
- Pabst, O., Hazanov, H., Mehr, R. Old questions, new tools: does next-generation sequencing hold the key to unraveling intestinal B-cell responses. Mucosal Immunology. 8 (1), 29-37 (2015).
- Bashford-Rogers, R. J. M., Smith, K. G. C., Thomas, D. C. Antibody repertoire analysis in polygenic autoimmune diseases. Immunology. 155 (1), 3-17 (2018).
- Lee, Y. N., et al. Characterization of T and B cell repertoire diversity in patients with RAG deficiency. Science Immunology. 1 (6), (2016).
- Werner, L., et al. Alterations in T and B Cell Receptor Repertoires Patterns in Patients With IL10 Signaling Defects and History of Infantile-Onset IBD. Frontiers Immunology. 11, 109 (2020).
- Zhang, J., et al. Immune receptor repertoires in pediatric and adult acute myeloid leukemia. Genome Medicine. 11 (1), 73 (2019).
- Chapman, C. G., et al. Characterization of T-cell Receptor Repertoire in Inflamed Tissues of Patients with Crohn's Disease Through Deep Sequencing. Inflammatory Bowel Diseases. 22 (6), 1275-1285 (2016).
- Werner, L., et al. Altered T cell receptor beta repertoire patterns in pediatric ulcerative colitis. Clinical and Experimental Immunology. 196 (1), 1-11 (2019).
- Bashford-Rogers, R. J. M., et al. Analysis of the B cell receptor repertoire in six immune-mediated diseases. Nature. 574 (7776), 122-126 (2019).
- Wu, J., et al. Expanded TCRbeta CDR3 clonotypes distinguish Crohn's disease and ulcerative colitis patients. Mucosal Immunology. 11 (5), 1487-1495 (2018).
- Rosati, E., et al. Identification of disease-associated traits and clonotypes in the T-cell receptor repertoire of monozygotic twins affected by inflammatory bowel diseases. Journam of Crohn's and Colitis. , (2019).
- Allez, M., et al. T cell clonal expansions in ileal Crohn's disease are associated with smoking behaviour and postoperative recurrence. Gut. 68 (11), 1961-1970 (2019).
- Li, S., et al. IMGT/HighV QUEST paradigm for T cell receptor IMGT clonotype diversity and next generation repertoire immunoprofiling. Nature Communications. 4, 2333 (2013).
- H, I. J., et al. Strategies for B-cell receptor repertoire analysis in primary immunodeficiencies: from severe combined immunodeficiency to common variable immunodeficiency. Frontiers Immunology. 6, 157 (2015).
- Ghraichy, M., Galson, J. D., Kelly, D. F., Truck, J. B-cell receptor repertoire sequencing in patients with primary immunodeficiency: a review. Immunology. 153 (2), 145-160 (2018).
- Zhuang, Y., et al. Application of immune repertoire sequencing in cancer immunotherapy. International Immunopharmacology. 74, 105688 (2019).
- Liu, X., et al. T cell receptor beta repertoires as novel diagnostic markers for systemic lupus erythematosus and rheumatoid arthritis. Annual Rheumatic Diseases. 78 (8), 1070-1078 (2019).
- Wong, G. K., Heather, J. M., Barmettler, S., Cobbold, M. Immune dysregulation in immunodeficiency disorders: The role of T-cell receptor sequencing. Journal of Autoimmunity. 80, 1-9 (2017).
- Delhalle, S., Bode, S. F. N., Balling, R., Ollert, M., He, F. Q. A roadmap towards personalized immunology. NPJ System Biology and Applications. 4, 9 (2018).
- Laubli, H., et al. The T cell repertoire in tumors overlaps with pulmonary inflammatory lesions in patients treated with checkpoint inhibitors. Oncoimmunology. 7 (2), 1386962 (2018).
- Hogan, S. A., et al. Peripheral Blood TCR Repertoire Profiling May Facilitate Patient Stratification for Immunotherapy against Melanoma. Cancer Immunology Research. 7 (1), 77-85 (2019).
- Aversa, I., Malanga, D., Fiume, G., Palmieri, C. Molecular T-Cell Repertoire Analysis as Source of Prognostic and Predictive Biomarkers for Checkpoint Blockade Immunotherapy. International Journal of Molecular Sciences. 21 (7), (2020).
- Hirsch, P., et al. Precision and prognostic value of clone-specific minimal residual disease in acute myeloid leukemia. Haematologica. 102 (7), 1227-1237 (2017).
- De Simone, M., Rossetti, G., Pagani, M. Single Cell T Cell Receptor Sequencing: Techniques and Future Challenges. Frontiers Immunology. 9, 1638 (2018).
- Zemmour, D., et al. Single-cell gene expression reveals a landscape of regulatory T cell phenotypes shaped by the TCR. Nature Immunology. 19 (3), 291-301 (2018).
- Zheng, C., et al. Landscape of Infiltrating T Cells in Liver Cancer Revealed by Single-Cell Sequencing. Cell. 169 (7), 1342-1356 (2017).
