Summary
当前协议描述了从血液样本和肠道活检中分离脱氧核糖核酸的方法、用于下一代测序的 TCR® 和 IGH PCR 库的生成、NGS 运行的性能和基本数据分析。
Abstract
免疫记忆是适应性免疫的标志，由T和B淋巴细胞编排。在循环和不同的器官中，有数十亿个独特的T细胞和B细胞克隆，每个克隆可以结合特定的抗原，导致增殖、分化和/或细胞因子分泌。T细胞和B细胞中巨大的异质性是由不同基因片段的随机重组产生的。近十年来开发的下一代测序技术，使T和B细胞受体免疫剧目能够史无前例地深入观察。对各种炎症条件、免疫缺陷、感染和恶性肿瘤的研究表明，免疫资源在克隆性、基因使用和生物物理特性方面发生了显著变化，为适应性免疫反应在不同疾病中的作用提供了重要的见解。
在这里，我们为来自血液和组织的T细胞和B细胞的免疫剧目NGS提供详细的协议。我们通过图书馆准备、NGS测序仪测序和基本分析，提出从 DNA 分离开始的管道。这种方法能够在核苷酸或氨基酸水平上探索特定的T和B细胞，从而能够识别淋巴细胞种群的动态变化和不同疾病的多样性参数。该技术正在慢慢进入临床实践，具有识别新型生物标志物、风险分层和精密医学的潜力。
Introduction
自适应免疫系统由T和B淋巴细胞组成，利用免疫记忆识别以前遇到的抗原并启动快速反应。淋巴细胞在骨髓中生成，在胸腺（T细胞）或骨髓（B细胞）中成熟。T细胞受体 （TCR） 和 B 细胞受体 （BCR） 都显示独特的配置，允许识别特定的抗原。在平衡中，T细胞和B细胞不断循环和测量抗原呈现细胞上出现的数万亿种不同的肽。TCR 或 BCR 结对具有高亲和力的特定抗原，以及适当的共同刺激，导致细胞活化，导致细胞因子分泌、克隆扩张和抗体生成，在 B 细胞的情况下。
不同T或B细胞的巨大阵列统称为免疫剧目，能够识别无数不同的表皮。为了产生如此庞大的剧目，不同基因片段的随机组装过程非常复杂，产生几乎无穷无尽的受体组合，可以结合独特的抗原1。这个过程称为V（D）J重组，包括不同变量（V）、多样性（D）和连接（J）基因的重新排列，同时在2号路口随机删除和插入核苷酸。
几十年来，适应性免疫系统的架构一直让不同领域的科学家感兴趣。过去，桑格测序、互补确定区域 3 （CDR3） 光谱和流动细胞测量用于描述免疫剧目，但分辨率较低。在过去十年中，下一代测序 （NGS） 方法的进步使人们能够深入了解个人 TCR 和 BCR 剧目3、4的特征和组成。这些高通量系统 （HTS） 序列和处理数百万重新排列的 TCR 或 BCR 产品，并允许高分辨率分析核苷酸或氨基酸水平的特定 T 和 B 细胞。NGS 提供了一个新的策略来研究健康和疾病的免疫剧目。利用HTS的研究表明，在自身免疫性疾病5、原发性免疫力6、7和恶性肿瘤（如急性骨髓性白血病8）中，TCR和BCR的病变。使用NGS，我们和其他人已经显示寡头球扩大特定的T和B细胞克隆，在炎症性肠病（IBD）患者，包括溃疡性结肠炎和克罗恩病9，10，11，12，13，14。总的来说，来自不同领域的研究表明，剧目的变化在免疫介质紊乱的发病机理中起着至关重要的作用。
当前协议描述了从肠道活检和血液中分离脱氧核糖核酸的方法、为 NGS 生成 TCR® 和 IGH PCR 库以及测序运行的性能。我们还提供免疫剧目数据分析的基本步骤。此协议也适用于 TCR®、TCRγ和 IGL 库的生成。只要使用组织特定的消化方案，该方法还与其他器官（如淋巴结、肿瘤、突触液、脂肪组织等）兼容。
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Protocol
这项研究得到了谢巴医疗中心机构审查委员会的批准，并获得了所有参与主体的书面同意。
1. DNA分离和量化
- 肠道活检的消化和细胞裂解
- 检索肠道活检，无论是新收集的还是储存在-20°C或-80°C的活检。 如果使用冷冻活检，在冰上解冻。
- 在无菌的1.7mL微离心管中加入600微L核裂解溶液，在冰上冷却。
- 将活检放入带裂解溶液的微中性管中，在 65 °C 下孵育 15-30 分钟。
- 加入 17.5 μL 的 20 毫克/mL 蛋白酶 K，在 55 °C 的夜间孵化，轻轻摇晃。
- 允许样品冷却到室温5分钟，然后继续步骤1.3。
- 全血细胞裂解
- 在EDTA、肝素或含柠檬酸管中获取3mL的全血。
- 轻轻摇管，直到彻底混合，并将血液转移到无菌的15mL离心管含有9mL的细胞裂解溶液。在室温下10分钟的潜伏期内倒置数次。
- 离心机在室温下在2，000 x g下10分钟，然后丢弃尽可能多的超自然，而不会干扰可见的白色颗粒。剩余液体将保留约50-100微L。
- 漩涡管大力为15s，直到完全恢复。加入3mL的核裂解溶液和多次管道。解决方案应变得粘稠。
- 蛋白质沉淀
- 在组织中加入 200 μL 的蛋白质沉淀缓冲，或在血液中加入 1 mL。涡流大力20秒，在冰上孵育5分钟。旋涡后可能可见小蛋白质团。
- 离心机在16，000 x g 4分钟。应形成含有沉淀蛋白的紧密颗粒。
- 小心地将超自然的，而不打扰颗粒，转移到一个新的1.7 mL管。
注意：如果颗粒不紧，考虑在16，000 x 克 的离心机4分钟。
- DNA沉淀和补液
- 将 1 mL 的 2 丙醇添加到含有超自然体的管中，然后通过倒置轻轻混合。DNA应该变成白色漂浮物质可见。
- 离心机在16，000 x g 1分钟。使用移液器完全去除超自然。
- 加入1mL新准备的70%乙醇，并倒管几次。离心机在室温下1分钟在16，000 x g。 小心丢弃超自然。
- 重复步骤 1.4.3。
- 将打开的管倒置在清洁吸水纸上10-15分钟。重新倒置管并确认完全水化。如有需要，请离开空气干燥，再干燥10-15分钟。
注意：颗粒完全干燥至关重要。 - 加入 50μL 的超纯净水 （UPW）。如果需要，DNA在量化后可以被稀释更多。
- 在 65 °C 的热块上孵育 1 小时，用于 DNA 补液。
- DNA定量
注：DNA使用荧光计和指定试剂进行量化，如材料表所示。- 将标准带到室温下，并准备套件，包括 0.5 mL 指定管。
- 根据样品数量，在 15 mL 管中准备缓冲和染料混合物。每个样品添加 200 μL 缓冲区和 1 μL 染料。包括2个标准样本。建议计算额外的示例，以避免缓冲区不足。
- 对于 2 个标准，将上述准备组合的 190 μL 放在 0.5 mL 管中。添加标准的 10 μL。
- 对于每个样品，将上述准备混合物的 199 μL 放在 0.5 mL 管中。添加 1μL 的 DNA。
- 阅读样本。结果表明样本的DNA浓度。
- 如果样品超过极限，用 UPW 稀释 DNA 1：10，然后重复读取。
2. 图书馆准备
注：当前协议使用与 NGS 测序器兼容的基于 PCR 的多路复用检测套件。该套件包含 24 个不同的指数，每个指标针对 Vβ 和 Jβ 区域内的保守区域。这允许一步 PCR 反应和汇集不同的样本。有关详细信息，请参阅材料表。
- 准备DNA样本。获取 150 ng 的 DNA 并添加 UPW，总计 5 μL。
注：可用于图书馆准备时使用少于 150 ng 的 DNA，最低浓度为 10 ng/μL。 - 将移液器和尖端与紫外线一起放在引擎盖中15分钟，以分解残余DNA。同时，允许不同的索引管（用于库准备）和DNA聚合酶在冰上解冻。
- 在生物罩中，将不同指数管中的 45 μL 添加到 PCR 管中。接下来，将 0.2μL 的 DNA 聚合酶和步骤 2.1 中准备的 5 μL DNA 添加到 PCR 管中。
- 根据制造商的说明，使用预设程序运行 PCR 反应。
3. 放大器净化和量化
- 使用磁珠去除多余的引物、核苷酸和酶。
- 将珠子加热至少30分钟至室温。准备足够的新鲜 80% 乙醇，每个样品 400μL。
- 将珠子的 50 μL （IGH） 或 35 μL （TCR®） 添加到每个 PCR 管中，通过管道混合 10 次。在室温下孵化10分钟。
- 将混合样品放在磁性支架上5分钟。
- 吸气 95 μL （IGH） 或 80 μL （TCR®） 的透明液体和丢弃。使用 10 μL 尖端吸气剩余液体。
- 在每个样品中加入 200 μL 的 80% 乙醇。孵化 30s.吸气195微升乙醇并丢弃。使用 10 μL 尖端吸气剩余液体。
- 重复步骤 3.1.5。打开管子的盖子，让空气干燥5分钟。
- 5分钟后立即从磁性支架上取出，并添加25μL的洗脱缓冲器（10米特里斯-HCl，pH 8.0）。通过管道混合，直到均匀。在室温下孵化2分钟。
- 将管子放在磁性支架上5分钟。将 22 μL 传输到新的 PCR 管。测量DNA浓度（第1.5步）。
- 安普利肯量化
注：当前协议使用自动电泳机对DNA浓度、大小和完整性进行质量控制。有关详细信息，请参阅材料表。- 在室温下放置试剂和屏幕录像带至少30分钟。
- 在一个新的 1.7 mL 微型离心管中，对步骤 3.1.8 与 UPW 进行 1 ng/μL 稀释，总容量至少为 3 μL。
- 漩涡在使用前稀释了DNA。将 2μL 缓冲区与稀释后的 DNA 的 2μL 一起放在预先标记的专用 PCR 条（在套件中提供），并放置盖子。将摇床放置1分钟，然后旋转PCR条。
注意：由于缓冲区的粘度，请确保在转移到样品管之前从尖端取出多余的缓冲区。 - 放置在机器中，屏幕和 PCR 条没有盖子。打开机器内部的尖端盒盖。用适当的标签分配位置。启动机器。
注：输出直方图应为放大体所需大小的单个峰值（图 1A）。在质量差的样本中，将观察到额外的峰值（图1B），表明珠子清理不良或引物变暗器的形成。
4. 下一代测序
- 图书馆的量化和汇集
- 使用步骤 3.1.8 的 DNA 值以及产品峰值基对 （bp） 的大小计算 nM 中的最终 DNA 浓度，这些浓度来自电泳机结果（见图 1）。
- 对于每个样本，在最终体积为 10-20 μL 的洗脱缓冲器中计算 DNA 体积以达到最终浓度 4 nM。
- 为每个样品准备新的稀释混合，并将 2 μL 从样品中取到新的池混合。
注意：对于小于 4 nM 的样品，请添加可能的最大样本量。
- 图书馆的NGS运行
注：当前协议使用台式序器平台。有关详细信息，请参阅材料表。- 准备0.2 N NaOH的新解决方案。将 10 μL 的 0.2 N NaOH 添加到以步骤 4.1.3 编制的稀释库中。将 5% PhiX 短暂添加到管和涡流中。向下旋转管，以确保所有解决方案都稳定到管的底部。
- 在室温下孵育5分钟，以去自然化双搁浅的DNA。将 980 μL 的预冷缓冲器从试剂盒添加到含有 DNA 和涡流的管中。
- 将稀释后的图书馆放在冰上，并准备如下图书馆。对于 17 pM 的混合，从第 4.2.2 步和 575 μL 缓冲器中添加 425 μL 的 DNA。倒置库几次，并旋转下来。将最终库的 600 μL 加载到指定的墨盒中，并将样品放在机器中。
- 按照软件说明开始运行。
5. 测序分析
- 从测序器下载测序指标，并验证测序数据是否在以下范围内（具体用于当前协议中使用的工具包）。不符合这些标准的样本需重复运行：
集群密度（密度（K/mm2）：945K = 1800K
读取传递过滤器百分比（集群PF（%））：>90%
质量得分（%>=Q30）：>85%
皮克斯对齐 （对齐%）： 1.5% - 10%
皮克斯误差率（%）：<1.0%
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Representative Results
在此，我们描述了一种从肠道组织和血液中分离DNA的方法，NGS的库的准备，以及免疫排泄测序测序运行的基本步骤。运行将生成 fastq 文件，可进一步转换为 fasta 文件，用于国际免疫基因 （IMGT） /HighV-QUEST 平台。此 HTS 在核苷酸级别15上执行和管理数万个重新排列的 TCR® 和 IGH 序列的许多分析。IMGT/高V-QUEST 能够分析健康和疾病中的不同 TCR 和 IGH 剧目。这可以导致新的"疾病特异性"克隆的识别，克隆扩张和多样性参数的分析，差异V（D）J的使用划分，体细胞超突变的分析，等等。IMGT/高V-QUEST 提供 CSV 文件，其中包含特定序列及其丰度。使用基因组DNA作为起始材料产生代表细胞数的序列号。因此，如果原始DNA数量相等，也可以计算给定样本中T细胞的百分比。
我们包括来自具有代表性的、自体血液和直肠样本的基本分析，该样本来自 IL10 受体缺乏症患者以及由有害IL10RA突变导致的严重婴儿发病 IBD 的历史。对 TCR® 和 IGH 剧目的样本进行了检测。肠道TCR®样本共产生12，450个序列，其中9，050个序列是独一无二的。血液TCR®样本共有54，880个序列，其中35，110个是独一无二的。在肠道IGH样本中，共获得49，070个序列，其中23，670个是独一无二的。在血液IGH样本中，共获得13，710个序列，其中13，540个是独一无二的。所有克隆都可以通过核苷酸或氨基酸水平的独特序列来识别。这些序列可以在不同的患者之间进行比较，以寻找共享的克隆，也可以在不同解剖部位（例如血液与肠道）之间的同一患者中进行比较。我们为每个样本呈现5个最常见的克隆（表1）。
为了量化克隆扩张的程度，可以使用不同的指数，包括香农的H，基尼-辛普森，熵和克隆性。例如，Shannon's H，它考虑到了独特的序列的数量（丰富的剧目）和它们是如何均匀分布被发现在患者的肠道IGH与血液（8.3对9.5）减少，这表明B细胞在发炎肠道的克隆扩张。
为了全面概述剧目，生成了树图图像（www.treemap.com）（图 2）。每个彩色方块表示不同的克隆，其大小与其频率相关。这些树图图像显示肠道IGH剧目与血液相比的克隆扩张。相比之下，在TCR®剧目中，与自体肠相比，血液中观察到明显的克隆扩张。
在基因水平上，NGS提供有关V-D-和J-使用在基因、家族或等位基因水平的信息，如表1所示。此外，从TCR®和IGH剧目（图3A，B）的数据中可以推断出特定的V（D）J组合，这些组合可以揭示不同条件下的差异基因使用模式。也可以分析 CDR3 区域的生物物理特性，如长度（表 1）或疏水性。重要的是，CDR3长度分布在不同的免疫介质紊乱10，16，17改变。例如，在IL10R缺乏患者中，血液衍生的T细胞，但不是B细胞，与健康对照7相比，CDR3长度较短，且存在微分疏水性。
图1：具有代表性的生物分析数据。肠道TCR®样本的代表性图像显示最佳结果（A），预期峰值为 400 bp。低质量库（B）的示例，其额外峰值为 179bp 和 114bp（标记 *）。在末端看到的峰值是电泳条的上下标记。 请单击此处查看此图的较大版本。
图2：T和B细胞免疫剧目概述。TCR® 和 IGH 血液和肠道样本的树图图。每个彩色方块表示不同的克隆，其大小与其频率相关。 请单击此处查看此图的较大版本。
图3：TCR®和IGH V-J用法的代表图。一个代表肠道样本，描绘了 TCR®（A） 或 IGH（B）中每个 V-J 组合的序列总数。数据未显示为 D 使用。 请单击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
B和T淋巴细胞的丰度和功能的变化经常遇到不同的恶性肿瘤18，慢性炎症性疾病（如溃疡性结肠炎和类风湿关节炎）10，19，并在各种免疫缺陷17，20。当前方法利用 NGS 促进对 TCR 和 BCR 剧目的深入观察，从而能够检测 T 和 B 细胞克隆的细微变化、克隆共享、V（D）J 基因的使用以及 B 细胞体细胞超突变程度的信息。
介绍了肠道活检和血液样本的DNA分离方法。然而，通过裂解和DNA提取的修改，该方法可以应用于其他组织，如肿瘤，淋巴结，合成液等。在图书馆准备过程中，重要的是不要交叉污染不同的引金集。在珠子清理时，应注意在潜伏的所有时间将管子留在磁铁上。对于低浓度的DNA样本，库存可集中在65°C10-20分钟。此外，在20μL的洗脱缓冲器中，可以从珠子中稀释安培。
过去用于描述T细胞和B细胞组成景观的不同技术只提供了免疫剧目的肤浅概述。NGS在免疫剧目分析方面的最大优点之一是能够识别独特的克隆，从而在不同的解剖部位（如肠道与血液与淋巴结）或不同个体中跟踪克隆。这种技术的临床意义重大，它超越了对T或B细胞在不同免疫介质疾病或恶性肿瘤中的作用的理解。在肿瘤学方面，NGS用于识别特定的克隆，这些克隆可以预测那些最有可能受益于当前免疫疗法22、23、24的患者的生物标志物。在白血病中，NGS用于通过检测治疗后留在患者体内的残余白血病克隆来确认癌细胞的完全根除。
对整个组织或血液样本进行免疫剧目分析的主要局限性之一是无法识别不太频繁的人群的剧目变化。例如，如果监管T细胞（只占CD4+T 细胞总数的几个百分比）表达了独特的剧目特征，那么如果对全血进行这些研究，就会错过这一点。这个问题可以通过对分类免疫人群进行这些研究来解决。或者，近年来，技术已经发展，以促进单细胞RNA数据与TCR或IGH剧目配置文件26耦合。这提供了 T 或 B 细胞的另一级功能，因为每个克隆的转录横向可以描述。例如，Zemmour等人使用scRNASeqTCRSeq来证明，从人类血液中调节T细胞，显示广泛的异质性与激活的亚人口，是转录相关的常规T细胞27。同样，在肝细胞癌患者中，这种方法识别出11个不同的T细胞子集，渗透到肿瘤中，每个子集都有独特的转录和转录轮廓28。像这样的研究将有所帮助，特别是在研究稀有种群时，并且会提供特定克隆的重要功能信息。
免疫剧目NGS是一个新的研究领域，它提供了关于适应性免疫功能和T和B细胞在各种疾病中的作用的新见解。此外，它通过跟踪疾病相关氯诺型，正在不同学科迅速进入临床世界。目前有几套可用于免疫剧目。这些基于类似的方法，无论他们是否使用RNA或DNA作为来源。他们使用类似的技术进行校准、偏置校正和分析工具;因此，需要根据具体要求进行正确的选择。当前套件的一大优点是，它是一种现成的使用和优化的人类免疫剧目，无需校准。将来，我们将看到更多的研究使用剧目特征作为不同疾病的生物标志物，也可能导致针对这些克隆的靶向疗法的发展。我们认为研究人员应该考虑应用这些方法来研究不同疾病的适应性免疫图景。
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Disclosures
所有作者都没有什么可透露的。
Acknowledgments
没有。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-propanol | Sigma | I9516-500ML | |
| 1.7 mL micro-centrifuge tubes | Axygen | 8187631104051 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Greiner | 188261 | |
| Absolute ethanol | Merck | 1.08543.0250 | |
| Amplitaq Gold | Thermo Fisher | N8080241 | |
| AMPure XP Beads | Beckman Coulter | A63881 | |
| Heat block | Bioer | Not applicable | |
| High Sensitivity D1000 Sample Buffer | Agilent | 5067-5603 | For Tapestation |
| High Sensitivity D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5584 | For Tapestation. Tubes sold seperately |
| Lymphotrack Assay kit | Invivoscribe | TRB: 70-91210039 IGH: 70-92250019 | Each includes 24 indexes |
| MiSeq Reagent Kit v2 (500 cycle) | Illumina | MS-102-2003 | Includes standard flow cell type and all reagents required |
| MiSeq Sequencer | Illumina | SY-410-1003 | |
| PCR strips | 4titude | 4ti-0792 | |
| Proteinase K | Invitrogen | EO0491 | |
| Qubit 4 Fluorometer | Thermo Fisher | Q33226 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher | Q32854 | Includes buffer, dye, standards, and specialized tubes |
| Shaker | Biosan | Not applicable | |
| Tapestation 2100 Bioanalyzer | Agilent | G2940CA | |
| ultra pure water | Bio-lab | 7501 | |
| Wizard DNA isolation kit | Promega | A1120 | Includes cell lysis solution, nuclei lysis solution, and protein precipitation buffer |
References
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