Summary
現在のプロトコルは、血液サンプルおよび腸内生検からのDNA分離、次世代シーケンシングのためのTCRβおよびIGH PCRライブラリの生成、NGSランの性能および基本的なデータ分析のための方法を記述する。
Abstract
免疫学的記憶は、適応免疫の特徴であり、Tリンパ球およびBリンパ球によって調整される。循環や異なる器官では、何十億ものユニークなT細胞クローンとB細胞クローンがあり、それぞれが特定の抗原に結合し、増殖、分化および/またはサイトカイン分泌につながる。T細胞とB細胞の広大な異種性は、異なる遺伝的セグメントのランダムな組み換えによって生成される。過去10年間に開発された次世代シーケンシング(NGS)技術は、TおよびB細胞受容体免疫レパートリーの前例のない詳細なビューを可能にします。様々な炎症性疾患、免疫不全、感染症および悪性腫瘍の研究は、クローン性、遺伝子使用法、および免疫レパートリーの生物物理学的特性の顕著な変化を示し、異なる疾患における適応免疫応答の役割に関する重要な洞察を提供した。
ここでは、血液および組織からのTおよびB細胞の免疫レパートリーのNGSに対する詳細なプロトコルを提供する。DNAの単離から図書館の準備、NGSシーケンサーのシーケンシング、基本的な分析で終わるパイプラインを提示します。この方法は、ヌクレオチドまたはアミノ酸レベルでの特定のTおよびB細胞の探索を可能にし、したがって、異なる疾患におけるリンパ球集団および多様性パラメータの動的変化を同定することができる。この技術はゆっくりと臨床現場に入っており、新しいバイオマーカー、リスク階層化、精密医療の同定の可能性を秘めています。
Introduction
Tリンパ球とBリンパ球で構成される適応免疫系は、免疫学的記憶を利用して、以前に遭遇した抗原を認識し、迅速な応答を開始する。リンパ球は骨髄で発生し、胸腺(T細胞)または骨髄(B細胞)で成熟する。T細胞受容体(TCR)とB細胞受容体(BCR)の両方が、特異的抗原の認識を可能にする独自の構成を示す。ホメオスタシスでは、T細胞とB細胞は常に循環し、抗原提示細胞に提示される異なるペプチドの兆を調査する。高い親和性を有する特定の抗原のTCRまたはBCRライゲーションは、適切な共刺激と共に、細胞活性化をもたらし、サイトカイン分泌、クローン拡張および抗体の生成をもたらし、B細胞の場合に。
異なるTまたはB細胞の巨大な配列は、総称して免疫レパートリーと呼ばれます, 異なるエピトープの無数の認識を可能にします.このような広大なレパートリーを生成するために、異なる遺伝子セグメントのランダム集合の複雑なプロセスが起こり、ユニークな抗原1に結合することができる受容体のほぼ無限の組み合わせを作成する。このプロセスは、V(D)Jの組み換えと呼ばれ、異なる変数(V)、多様性(D)および結合(J)遺伝子の再配列を含み、結合部2におけるヌクレオチドのランダムな欠失および挿入を伴う。
適応免疫システムのアーキテクチャは、何十年もの間、異なる分野の科学者に興味を持っています。以前は、サンガーシーケンシング、相補決定領域3(CDR3)スペクトルタイピング、およびフローサイトメトリーを使用して免疫レパートリーを特徴付け、低分解能を提供した。過去10年間で、次世代シーケンシング(NGS)法の進歩により、個人のTCRおよびBCRレパートリー3,4の特性と組成に関する詳細な洞察が可能になった。これらのハイスループットシステム(HTS)配列と処理は、同時に並べ替えられたTCRまたはBCR製品の数百万を、ヌクレオチドまたはアミノ酸レベルで特定のTおよびB細胞の高解像度分析を可能にします。NGSは、健康と病気の両方の免疫レパートリーを研究するための新しい戦略を提供します。HTSを利用した研究は、自己免疫疾患におけるTCRおよびBCRレパートリーの改変を実証した5、原発性免疫不全6、7、および急性骨髄性白血病における悪性腫瘍8などである。NGSを用いて、我々および他の人々は、炎症性腸疾患(IBD)を有する患者において、潰瘍性大腸炎およびクローン病9、10、11、12、13、14のオリゴクローナル拡張を示している。全体として、異なる分野からの研究は、レパートリーの変化が免疫媒介性疾患の病因において重要な役割を果たしていることを示唆している。
現在のプロトコルは、腸内生検および血液からのDNAの分離、NGS用のTCRβおよびIGH PCRライブラリの生成、およびシーケンシング実行の性能を記述する。免疫レパートリーデータ解析の基本ステップも提供しています。このプロトコルは、TCRα、TCRγ、およびIGLライブラリの生成にも適用できます。この方法は、組織特異的な消化プロトコルが使用されている限り、他の器官(例えば、リンパ節、腫瘍、滑液、脂肪組織など)と互換性がある。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
この研究は、シェバ医療センターの機関審査委員会によって承認され、すべての参加対象からインフォームド・コンセントが得られました。
1. DNAの分離と定量
- 腸内生検の消化と細胞のリシス
- 腸内生検を取り出し、採取したばかりか、-20°Cまたは-80°Cで保存したものを回収する。 凍結生検を使用する場合は、氷の上で解凍します。
- 氷の上で冷やされた無菌1.7 mLマイクロ遠心分離チューブに600 μLの核溶解溶液を加えます。
- リシス溶液を用いたマイクロ遠心チューブに生検を入れ、65°Cで15〜30分間インキュベートします。
- 17.5 μLの20 mg/mLプロテイナーゼKを加え、穏やかな揺れで55°Cで一晩インキュベートします。
- サンプルを室温まで5分間冷却してから、ステップ1.3に進みます。
- 全血の細胞リシス
- EDTA-、ヘパリン、またはクエン酸含有チューブで全血の3 mLを得る。
- チューブを十分に混合するまで軽く揺れ、9 mLの細胞溶解液を含む無菌15 mL遠心分離管に血液を移す。室温で10分のインキュベーション期間中に数回反転します。
- 室温で10分間2,000 x gで遠心分離機を使用し、可視の白いペレットを邪魔することなく、できるだけ多くの上清を捨てます。残りの液体の約50〜100 μLが残ります。
- 渦管は完全に再懸濁されるまで15 sのために精力的に。3 mLの核溶解溶液とピペットを数回加えます。解決策は粘性になるはずです。
- タンパク質沈殿
- 組織に200μLのタンパク質沈殿バッファーを加えるか、血液に1 mLを加えます。20sのために激しく渦を、5分間氷の上でインキュベート。小さなタンパク質塊は、渦の後に見ることができる。
- 遠心分離機 16,000 x g で 4 分間沈殿タンパク質を含むタイトなペレットが形成されるはずです。
- 慎重にペレットを乱すことなく、上清を新しい1.7 mLチューブに移します。
注:ペレットがタイトでない場合は、4分間16,000 x g で別の遠心分離機を検討してください。
- DNA沈殿と水分補給
- 上清を含むチューブに2-プロパノール1mLを加え、反転させて軽く混ぜます。DNAは白い浮遊物質として見えるようになるはずです。
- 16,000 x g で遠心分離機 1分間ピペットを使用して上清を完全に取り除く。
- 1 mLの新しく調製した70%エタノールを加え、チューブを数回反転させます。室温で1分1分の16,000 x g で遠心分離機。上清を慎重に捨てなさい。
- ステップ 1.4.3 を繰り返します。
- 開いたチューブをクリーンな吸収性紙に10〜15分間反転します。チューブを再反転し、完全な水分補給を確認します。必要に応じて、さらに10〜15分間空気乾燥してください。
注:ペレットを完全に乾燥させることは非常に重要です。 - 50 μLの超純水(UPW)を加えます。必要に応じて、DNAは定量後により希釈することができる。
- 65°Cのヒートブロックで1時間インキュベートし、DNAリハイドレーションを行います。
- DNA定量
注:DNAは、材料表に指定されたフルオロメーターと指定試薬を使用して定量化しました。- 標準を室温に持ち込み、0.5 mL指定チューブを含むキットを準備します。
- サンプル数に応じて、バッファーと色分けを15 mLチューブで調製します。サンプルあたり200μLのバッファーと1μLの染料を加えます。標準用のサンプルを2つ含めます。バッファーが十分でないことを避けるために、追加サンプルを計算することをお勧めします。
- 2つの標準では、上記の調製済みミックスの190 μLを0.5 mLチューブに入れてください。標準の10 μLを追加します。
- 各サンプルに対して、上記の調製済みミックスの199 μLを0.5 mLチューブに入れてください。DNAを1μL加えます。
- サンプルを読んでください。結果は、サンプルのDNA濃度を示す。
- サンプルが限界を超えている場合は、DNA 1:10をUPWで希釈し、読み取りを繰り返します。
2. 図書館の準備
注:現在のプロトコルは、NGSシーケンサーと互換性のあるマルチプレックスPCRベースのアッセイキットを使用しています。このキットには、V βおよびJ β領域内の各ターゲットの保存領域に24の異なるインデックスが含まれています。これにより、異なるサンプルのワンステップPCR反応とプールが可能になります。詳細については、資料一覧を参照してください。
- DNAサンプルを準備します。150 ngのDNAを得て、合計5 μLのUPWを加えます。
注:最低濃度10 ng/μLで、ライブラリー調製には150ng未満のDNAを使用することが可能です。 - 残留DNAを分解するために15分間UVライトでフードにピペットとチップを入れます。一方、異なるインデックスチューブ(ライブラリ調製用)とDNAポリメラーゼが氷の上で解凍することを可能にする。
- 生物学的フードでは、異なるインデックスチューブから45 μLをPCRチューブに追加します。その後、ステップ2.1で作製したDNAポリメラーゼを0.2μL、5μLのDNAをPCRチューブに加えます。
- メーカーの指示に従って、事前設定プログラムを使用してPCR反応を実行します。
3. アンプリコンの精製と定量
- 過剰なプライマー、ヌクレオチド、酵素の除去には、磁気ビーズを使用してください。
- ビーズを室温まで30分以上温めます。サンプルあたり400 μLに対して、80%のエタノールを十分に準備します。
- 各PCRチューブに50μL(IGH)または35μL(TCRβ)を加え、10回ピペットで混合します。室温で10分インキュベートします。
- 混合サンプルを磁気スタンドに5分間置きます。
- 透明液の95μL(IGH)または80μL(TCRβ)を吸引し、廃棄する。10 μL の先端を使用して残りの液体を吸引します。
- 各サンプルに200μLの80%エタノールを加えます。インキュベート 30 s.195 μLのエタノールを吸引し廃棄する。10 μL の先端を使用して残りの液体を吸引します。
- ステップ 3.1.5 を繰り返します。チューブのキャップを開け、空気を5分間乾燥させます。
- 5分後、磁気スタンドから取り出し、溶出バッファー(10 mM Tris-HCl、pH 8.0)を25 μL加えます。均質になるまでピペットで混ぜます。室温で2分間インキュベートします。
- チューブを磁気スタンドに5分間置きます。22 μL を新しい PCR チューブに移します。DNA濃度を測定する(ステップ1.5)。
- アンプリコン定量
注: 現在のプロトコルでは、DNAの濃度、サイズ、および完全性の品質管理に自動化された電気泳動機を使用しています。詳細については、資料一覧を参照してください。- 試薬とスクリーンテープを室温で30分以上置きます。
- 新しい1.7 mLマイクロ遠心分離チューブで、ステップ3.1.8で定量したDNAサンプルを、少なくとも3μLの総体積でUPWで定量化します。
- 使用前に渦を希釈したDNA。2 μL のバッファーを、事前にラベル付けされた特殊 PCR ストリップ (キットに用意) に希釈した DNA の 2 μL と共に置き、キャップを置きます。シェーカーに1分間置き、続いてPCRストリップのスピンダウンを行います。
メモ:バッファーの粘性のため、サンプルチューブに移る前に余分なバッファをチップから取り除くことを確認してください。 - キャップなしで機械、スクリーンテープ、PCRストリップに置きます。機械の中の先端箱のふたを開けろ。適切なラベルを使用して位置を割り当てます。マシンを起動します。
注: 出力ヒストグラムは、アンプリコンの目的のサイズで単一のピークにする必要があります(図1A)。品質の悪いサンプルでは、追加のピークが観察されます (図 1B),悪いビーズのクリーンアップまたはプライマーダイマーの形成を示します.
4. 次世代シーケンシング
- ライブラリの定量化とプール
- nMの最終DNA濃度を算出し、ステップ3.1.8からのDNA値を用いて、製品のピークの塩基対(bp)のサイズと、電気泳動機の結果から得た( 図1参照)。
- 各サンプルについて、最終濃度4 nMの最終濃度を10~20 μLの溶出バッファーで測定するDNA容積を計算します。
- 各サンプルに新しい希釈ミックスを準備し、それから2μLを新しいプールミックスに取り込みます。
注: 4 nM 未満のサンプルの場合は、可能な限りサンプルの量を追加します。
- 図書館のNGSラン
注: 現在のプロトコルでは、ベンチトップ シーケンサー プラットフォームを使用します。詳細については、資料一覧を参照してください。- 0.2 N NaOHの新鮮な溶液を準備します。ステップ 4.1.3 で作成した希釈ライブラリに 0.2 N NaOH の 10 μL を追加します。チューブと渦に5%のPhiXを短時間追加します。チューブをスピンダウンして、すべての溶液がチューブの底に落ち着くようにします。
- 二重鎖DNAを変性させるために室温で5分間インキュベートする。キットから980 μLのプレチルドバッファーを、DNAと渦を含むチューブに短時間追加します。
- 希釈したライブラリーを氷の上に置き、次のようにライブラリを準備します。17 pMの混合の場合、ステップ 4.2.2 および 575 μL のバッファーから 425 μL の DNA を追加します。ライブラリを数回反転し、スピンダウンします。最終ライブラリの600μLを指定カートリッジに積み込み、サンプルを機械に入れます。
- ソフトウェアの指示に従って実行を開始します。
5. シーケンシング解析
- シーケンシング・メトリックをシーケンサーからダウンロードし、シーケンシング・データが次の範囲 (現行プロトコルで使用されているキットに固有) 内であることを確認します。これらの条件を満たさないサンプルは、繰り返し実行される可能性があります。
クラスター密度(密度(K/mm2)):945K - 1800K
フィルターを通過する読み取りの割合 (クラスター PF (%)): >90%
品質スコア(%>=Q30):>85%
PhiXアライメント(アラインメント%):1.5%-10%
PhiXエラー率(%):<1.0%
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ここでは、腸組織および血液からのDNA分離方法、NGS用ライブラリの調製、免疫レパートリーシーケンシングのためのシーケンシングランの基本的なステップについて述べうる。実行は、国際ImMunoGenetics(IMGT)/HighV-QUESTプラットフォームで使用するために、さらにfastaファイルに変換することができ、fastqファイルを生成します。このHTSは、ヌクレオチドレベル15で、何万もの再構成されたTCRβおよびIGH配列の多くの分析を行い、管理する。IMGT/高V-QUESTは健康と病気の両方で異なるTDRおよびIGHレパートリーの分析を可能にする。これは、新しい「疾患特異的な」クローンの同定、クローン拡張および多様性パラメータの分析、微分V(D)Jの使用法の線引き、体細胞性ハイパー突然変異の分析、および多くのにつながる可能性があります。IMGT/HighV-QUESTは、特定のシーケンスとその豊富さを含むCSVファイルを提供します。ゲノムDNAを出発物質として使用すると、細胞番号を代表する配列番号が得られます。したがって、元のDNA量が等しい場合、所定のサンプル中のT細胞の割合も計算できます。
IL10受容体欠損症の患者の代表的な自己血液および直腸サンプルからの基礎分析と、有害な IL10RA 突然変異に起因する重度の乳児発症IBDの既往歴を含む。TCRβおよびIGHレパートリーの両方についてサンプルをアッセイした。腸管TCRβサンプルは合計12,450配列を生成し、そのうち9,050配列はユニークであった。血液TCRβサンプルは、合計54,880配列を持っていました, そのうちの35,110はユニークでした.腸管IGHサンプルでは、合計49,070個の配列が得られ、そのうち23,670個がユニークであった。血液IGHサンプルでは、合計13,710配列が得られ、そのうち13,540個がユニークであった。すべてのクローンは、ヌクレオチドまたはアミノ酸レベルの両方でそれらのユニークな配列によって同定することができる。これらの配列は、異なる患者間で、共有クローンを探索する場合、または異なる解剖学的部位(例えば、血液対腸)間の同じ患者で比較することができる。サンプルのそれぞれについて、最も頻繁に 5 つのクローンを提示します (表 1)。
クローン拡張の程度を定量化するために、シャノンのH、ジニ・シンプソン、エントロピー、クローン性など、異なるインデックスを使用できます。一例として、シャノンのHは、ユニークな配列の数(レパートリーの豊かさ)を考慮に入れ、それらが分布する均等が患者の腸内IGH対血液(8.3対9.5)で減少することが判明し、炎症を起こした腸内のB細胞のクローン拡張を示唆した。
レパートリーの概要を説明するために、ツリーマップイメージ(www.treemap.com)が生成されました (図2)。色付きの正方形はそれぞれ異なるクローンを表し、サイズはその頻度と相関します。これらのツリーマップ画像は、血液と比較して腸IGHレパートリーのクローン拡張を示す。これに対し、TCRβレパートリーでは、自家の腸と比較して、血液中に顕著なクローン拡張が観察される。
NGSは、遺伝子レベルにおいて、V-D-およびJ-の使用法に関する情報を、表1に示すように、遺伝子、家族、または対立遺伝子のいずれかのレベルで提供する。また、TCRβとIGHレパートリー(図3A,B)のデータから特定のV(D)Jの組み合わせを推定することができ、様々な条件で遺伝子の異なる使用パターンを明らかにすることができます。長さ(表1)または疎水性などのCDR3領域の生物物理学的性質も分析することができる。重要なことに、CDR3の長さの分布は、異なる免疫媒介性障害10、16、17において変化する。例えば、IL10R欠損患者において、血液由来T細胞は、B細胞ではないが、CDR3の長さ、および疎水性の差を有し、健康な対照7と比較して。
図1:代表的なバイオアナライザデータ最適な結果を示す腸TCRβサンプルの代表的な画像(A)は、400bpで所望のピークを有する。179bp と 114bp (*とマーク) の追加のピークを持つ低品質ライブラリー (B) の例。端部に見られるピークは、電気泳動ストリップの上下マーカーである。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:TおよびB細胞免疫レパートリーの概要。TCRβおよびIGH血液および腸管サンプルのツリーマップ図。色付きの正方形はそれぞれ異なるクローンを表し、サイズはその頻度と相関します。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:TCRβおよびIGH V-Jの使用の代表的なグラフ。TCRβ(A)またはIGH(B)の各V-J組み合わせの全配列数を示す代表的な腸管サンプル。D の使用に関するデータは表示されません。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bリンパ球およびTリンパ球の存在量および機能の変化は、しばしば異なる悪性腫瘍18において遭遇するが、慢性炎症性疾患(例えば、潰瘍性大腸炎および関節リウマチ)10、19、および種々の免疫不全17、20において。現在の方法では、NGSを利用してTCRおよびBCRレパートリーの詳細なビューを容易にし、TおよびB細胞のクローンの微妙な変化、クローンの共有、V(D)J遺伝子の使用、およびB細胞の場合の体細胞ハイパー突然変異の程度に関する情報を検出することができます。
腸内生検及び血液試料に対するDNA分離の方法について説明した。しかし、リシスやDNA抽出の改変により、この方法は腫瘍、リンパ節、滑液などの他の組織に適用することができる。図書館の準備中に異なるプライマーセットを交差汚染しないことが重要です。ビーズのクリーンアップでは、インキュベーションのすべての時間で磁石にチューブを残すために注意する必要があります。低濃度のDNAサンプルの場合、在庫は65°Cで10〜20分間濃縮することができます。さらに、アンプリコンは、わずか20 μL溶出バッファー内のビーズから溶出することができます。
TおよびB細胞組成の景観を特徴付けるために過去に使用された異なる技術は、免疫レパートリーの表面的な概観のみを提供した。免疫レパートリー解析のためのNGSの最大の利点の1つは、ユニークなクローンを同定し、その結果、異なる解剖学的部位(例えば、腸対血液対リンパ節)または異なる個体でそれらを追跡する能力である。このような技術の臨床的意義は重要であり、異なる免疫媒介性疾患または悪性腫瘍におけるTまたはB細胞の役割の理解を高める以上のものである。腫瘍学では、NGSは、現在の免疫療法22、23、24の恩恵を受ける可能性が最も高い患者のための予測バイオマーカーであり得る特定のクローンを同定するために使用される。白血病では、NGSは、治療25後に患者に残存する残存白血病クローンの検出によって癌細胞の完全な根絶を確認するために使用される。
全組織または血液サンプルの免疫レパートリー分析の主な制限の1つは、頻度の低い集団におけるレパートリーの変化を同定できないことである。例えば、CD4+ T細胞の数パーセントしか含みない制御性T細胞がユニークなレパートリープロファイルを発現する場合、全血に関するこれらの研究を行う場合、これは見逃されるであろう。この問題は、ソートされた免疫集団に関するこれらの研究を行うことによって対処することができる。あるいは、近年では、TCRまたはIGHレパートリープロファイル26との単一細胞RNAデータの結合を容易にする技術が開発されている。これは、各クローンの転写風景を特徴付けることができるので、TまたはB細胞の別のレベルの機能を提供する。一例として、Zemmourらは、ヒト血液由来の調節T細胞を示すためにscRNAEq TCRseqを用い、従来のT細胞27に転写的に関連する活性化亜集団を有する広範な不均一性を示す。同様に、肝細胞癌患者において、この方法は、腫瘍に浸透する11の異なるT細胞サブセットを同定し、それぞれが独特の転写およびレパートリープロファイル28を有する。このような研究は、特にまれな集団を研究する場合に役立ち、特定のクローンの重要な機能情報を提供します。
免疫レパートリーのNGSは、適応免疫機能と様々な疾患におけるT細胞およびB細胞の役割に関する新しい洞察を提供する新しい研究分野です。さらに、疾患関連のクロノタイプを追跡することにより、異なる分野で臨床界に急速に参入している。現在、免疫レパートリー用のキットがいくつか用意されています。これらは、RNAまたはDNAをソースとして使用しているかどうかに関係なく、同様の方法論に基づいています。キャリブレーション、バイアス補正、解析ツールにも同様の手法を使用しています。したがって、特定の要求に応じて適切に選択する必要があります。現在のキットの大きな利点の1つは、すぐに使用でき、校正を必要とせずに、人間の免疫レパートリーに最適化されることです。将来的には、レパートリー機能を異なる疾患のバイオマーカーとして使用する研究が増え、これらのクローンに対する標的療法の開発につながる可能性があります。私たちは、研究者が異なる障害の適応免疫環境を研究するためにこれらの方法を適用することを検討すべきであると考えています。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
すべての著者は開示するものは何もありません。
Acknowledgments
何一つ。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-propanol | Sigma | I9516-500ML | |
| 1.7 mL micro-centrifuge tubes | Axygen | 8187631104051 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Greiner | 188261 | |
| Absolute ethanol | Merck | 1.08543.0250 | |
| Amplitaq Gold | Thermo Fisher | N8080241 | |
| AMPure XP Beads | Beckman Coulter | A63881 | |
| Heat block | Bioer | Not applicable | |
| High Sensitivity D1000 Sample Buffer | Agilent | 5067-5603 | For Tapestation |
| High Sensitivity D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5584 | For Tapestation. Tubes sold seperately |
| Lymphotrack Assay kit | Invivoscribe | TRB: 70-91210039 IGH: 70-92250019 | Each includes 24 indexes |
| MiSeq Reagent Kit v2 (500 cycle) | Illumina | MS-102-2003 | Includes standard flow cell type and all reagents required |
| MiSeq Sequencer | Illumina | SY-410-1003 | |
| PCR strips | 4titude | 4ti-0792 | |
| Proteinase K | Invitrogen | EO0491 | |
| Qubit 4 Fluorometer | Thermo Fisher | Q33226 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher | Q32854 | Includes buffer, dye, standards, and specialized tubes |
| Shaker | Biosan | Not applicable | |
| Tapestation 2100 Bioanalyzer | Agilent | G2940CA | |
| ultra pure water | Bio-lab | 7501 | |
| Wizard DNA isolation kit | Promega | A1120 | Includes cell lysis solution, nuclei lysis solution, and protein precipitation buffer |
References
- Bassing, C. H., Swat, W., Alt, F. W. The mechanism and regulation of chromosomal V(D)J recombination. Cell. 109, Suppl 45-55 (2002).
- Roth, D. B. V(D)J Recombination: Mechanism, Errors, and Fidelity. Microbiology Spectrum. 2 (6), (2014).
- Heather, J. M., Ismail, M., Oakes, T., Chain, B. High-throughput sequencing of the T-cell receptor repertoire: pitfalls and opportunities. Brief Bioinformatics. 19 (4), 554-565 (2018).
- Pabst, O., Hazanov, H., Mehr, R. Old questions, new tools: does next-generation sequencing hold the key to unraveling intestinal B-cell responses. Mucosal Immunology. 8 (1), 29-37 (2015).
- Bashford-Rogers, R. J. M., Smith, K. G. C., Thomas, D. C. Antibody repertoire analysis in polygenic autoimmune diseases. Immunology. 155 (1), 3-17 (2018).
- Lee, Y. N., et al. Characterization of T and B cell repertoire diversity in patients with RAG deficiency. Science Immunology. 1 (6), (2016).
- Werner, L., et al. Alterations in T and B Cell Receptor Repertoires Patterns in Patients With IL10 Signaling Defects and History of Infantile-Onset IBD. Frontiers Immunology. 11, 109 (2020).
- Zhang, J., et al. Immune receptor repertoires in pediatric and adult acute myeloid leukemia. Genome Medicine. 11 (1), 73 (2019).
- Chapman, C. G., et al. Characterization of T-cell Receptor Repertoire in Inflamed Tissues of Patients with Crohn's Disease Through Deep Sequencing. Inflammatory Bowel Diseases. 22 (6), 1275-1285 (2016).
- Werner, L., et al. Altered T cell receptor beta repertoire patterns in pediatric ulcerative colitis. Clinical and Experimental Immunology. 196 (1), 1-11 (2019).
- Bashford-Rogers, R. J. M., et al. Analysis of the B cell receptor repertoire in six immune-mediated diseases. Nature. 574 (7776), 122-126 (2019).
- Wu, J., et al. Expanded TCRbeta CDR3 clonotypes distinguish Crohn's disease and ulcerative colitis patients. Mucosal Immunology. 11 (5), 1487-1495 (2018).
- Rosati, E., et al. Identification of disease-associated traits and clonotypes in the T-cell receptor repertoire of monozygotic twins affected by inflammatory bowel diseases. Journam of Crohn's and Colitis. , (2019).
- Allez, M., et al. T cell clonal expansions in ileal Crohn's disease are associated with smoking behaviour and postoperative recurrence. Gut. 68 (11), 1961-1970 (2019).
- Li, S., et al. IMGT/HighV QUEST paradigm for T cell receptor IMGT clonotype diversity and next generation repertoire immunoprofiling. Nature Communications. 4, 2333 (2013).
- H, I. J., et al. Strategies for B-cell receptor repertoire analysis in primary immunodeficiencies: from severe combined immunodeficiency to common variable immunodeficiency. Frontiers Immunology. 6, 157 (2015).
- Ghraichy, M., Galson, J. D., Kelly, D. F., Truck, J. B-cell receptor repertoire sequencing in patients with primary immunodeficiency: a review. Immunology. 153 (2), 145-160 (2018).
- Zhuang, Y., et al. Application of immune repertoire sequencing in cancer immunotherapy. International Immunopharmacology. 74, 105688 (2019).
- Liu, X., et al. T cell receptor beta repertoires as novel diagnostic markers for systemic lupus erythematosus and rheumatoid arthritis. Annual Rheumatic Diseases. 78 (8), 1070-1078 (2019).
- Wong, G. K., Heather, J. M., Barmettler, S., Cobbold, M. Immune dysregulation in immunodeficiency disorders: The role of T-cell receptor sequencing. Journal of Autoimmunity. 80, 1-9 (2017).
- Delhalle, S., Bode, S. F. N., Balling, R., Ollert, M., He, F. Q. A roadmap towards personalized immunology. NPJ System Biology and Applications. 4, 9 (2018).
- Laubli, H., et al. The T cell repertoire in tumors overlaps with pulmonary inflammatory lesions in patients treated with checkpoint inhibitors. Oncoimmunology. 7 (2), 1386962 (2018).
- Hogan, S. A., et al. Peripheral Blood TCR Repertoire Profiling May Facilitate Patient Stratification for Immunotherapy against Melanoma. Cancer Immunology Research. 7 (1), 77-85 (2019).
- Aversa, I., Malanga, D., Fiume, G., Palmieri, C. Molecular T-Cell Repertoire Analysis as Source of Prognostic and Predictive Biomarkers for Checkpoint Blockade Immunotherapy. International Journal of Molecular Sciences. 21 (7), (2020).
- Hirsch, P., et al. Precision and prognostic value of clone-specific minimal residual disease in acute myeloid leukemia. Haematologica. 102 (7), 1227-1237 (2017).
- De Simone, M., Rossetti, G., Pagani, M. Single Cell T Cell Receptor Sequencing: Techniques and Future Challenges. Frontiers Immunology. 9, 1638 (2018).
- Zemmour, D., et al. Single-cell gene expression reveals a landscape of regulatory T cell phenotypes shaped by the TCR. Nature Immunology. 19 (3), 291-301 (2018).
- Zheng, C., et al. Landscape of Infiltrating T Cells in Liver Cancer Revealed by Single-Cell Sequencing. Cell. 169 (7), 1342-1356 (2017).
