Summary
O protocolo atual descreve um método de isolamento de DNA a partir de amostras de sangue e biópsias intestinais, geração de bibliotecas TCRβ e IGH PCR para sequenciamento de próxima geração, desempenho de uma execução de NGS e análise de dados básicos.
Abstract
A memória imunológica, a marca registrada da imunidade adaptativa, é orquestrada por linfócitos T e B. Em circulação e diferentes órgãos, há bilhões de clones de células T e B únicos, e cada um pode ligar um antígeno específico, levando à proliferação, diferenciação e/ou secreção de citocinas. A grande heterogeneidade nas células T e B é gerada pela recombinação aleatória de diferentes segmentos genéticos. As tecnologias de sequenciamento de última geração (NGS), desenvolvidas na última década, permitem uma visão aprofundada sem precedentes do repertório imunológico do receptor de células T e B. Estudos em várias condições inflamatórias, imunodeficiências, infecções e malignidades demonstraram mudanças acentuadas na clonalidade, uso genético e propriedades biofísicas do repertório imunológico, fornecendo importantes insights sobre o papel das respostas imunes adaptativas em diferentes distúrbios.
Aqui, fornecemos um protocolo detalhado para NGS de repertório imunológico de células T e B a partir de sangue e tecido. Apresentamos um pipeline a partir do isolamento do DNA através da preparação da biblioteca, sequenciamento no sequenciador NGS e terminando com análises básicas. Este método permite a exploração de células T e B específicas no nível nucleotídeo ou aminoácido, podendo assim identificar mudanças dinâmicas nas populações de linfócitos e parâmetros de diversidade em diferentes doenças. Esta técnica está entrando lentamente na prática clínica e tem potencial para identificação de novos biomarcadores, estratificação de risco e medicina de precisão.
Introduction
O sistema imunológico adaptativo, composto por linfócitos T e B, utiliza memória imunológica para reconhecer um antígeno previamente encontrado e iniciar uma resposta rápida. Os linfócitos são gerados na medula óssea e maduros nas células timo (células T) ou medula óssea (células B). Tanto o receptor de células T (TCR) quanto o receptor de células B (BCR) exibem configurações únicas que permitem o reconhecimento de antígenos específicos. Na homeostase, as células T e B circulam constantemente e pesquisam os trilhões de peptídeos diferentes apresentados em células que apresentam antígenos. A ligadura TCR ou BCR de um antígeno específico com alta afinidade, juntamente com a co-estimulação adequada, leva à ativação celular, resultando em secreção de citocinas, expansão clonal e geração de anticorpos, no caso de células B.
A enorme matriz das diferentes células T ou B é coletivamente denominada repertório imunológico, permitindo o reconhecimento de incontáveis epítopos diferentes. A fim de gerar um repertório tão vasto, ocorre um complexo processo de montagem aleatória de diferentes segmentos genéticos, criando combinações quase infinitas de receptores que podem ligar antígenos únicos1. Esse processo, chamado de recombinação V(D)J, inclui rearranjos de diferentes genes variáveis (V), diversidade (D) e junção (J), acompanhados de supressões aleatórias e inserções de nucleotídeos nas junções2.
A arquitetura do sistema imunológico adaptativo tem interessado cientistas em diferentes campos por muitas décadas. No passado, o sequenciamento de Sanger, a especificação da região 3 (CDR3) complementar e a citometria de fluxo foram utilizados para caracterizar o repertório imunológico, mas proporcionavam baixa resolução. Na última década, os avanços nos métodos de sequenciamento de próxima geração (NGS) permitiram uma visão aprofundada das características e composição dos repertórios TCR e BCR de um indivíduo3,4. Esses sistemas de alta produtividade (HTS) sequenciam e processam milhões de produtos TCR ou BCR reorganizados simultaneamente e permitem uma análise de alta resolução de células T e B específicas no nível nucleotídeo ou aminoácido. A NGS fornece uma nova estratégia para estudar o repertório imunológico tanto na saúde quanto na doença. Estudos utilizando HTS demonstraram repertórios alterados de TCR e BCR em doenças autoimunes5, imunodeficiências primárias6,7e malignidades, como na leucemia mielóide aguda8. Utilizando NGS, nós e outros mostramos expansão oligoclonal de clones específicos de células T e B, em pacientes com doença inflamatória intestinal (DII), incluindo colite ulcerativa e doença de Crohn9,10,11,12,13,14. No geral, estudos de diferentes campos sugerem que mudanças no repertório têm um papel crucial na patogênese de distúrbios imunomu mediados.
O protocolo atual descreve um método de isolamento do DNA de biópsias intestinais e sangue, geração de bibliotecas TCRβ e IGH PCR para NGS, e desempenho de sequenciamento executado. Também fornecemos passos básicos na análise de dados do repertório imunológico. Este protocolo também pode ser aplicado para a geração de bibliotecas TCRα, TCRγ e IGL. O método também é compatível com outros órgãos (por exemplo, linfonodos, tumores, fluido sinovial, tecido adiposo, etc.) desde que sejam utilizados protocolos de digestão específicos do tecido.
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Protocol
Este estudo foi aprovado pelo conselho de revisão institucional do Sheba Medical Center, e o consentimento por escrito informado foi obtido de todos os sujeitos participantes.
1. Isolamento e quantificação do DNA
- Digestão e lise celular de biópsias intestinais
- Recuperar biópsias intestinais, coletadas recentemente ou armazenadas a -20 °C ou -80 °C. Se usar biópsias congeladas, descongele no gelo.
- Adicione 600 μL de solução de lise nuclei a um tubo de microcentrífugo estéril de 1,7 mL, refrigerado no gelo.
- Coloque a biópsia em um tubo de microcentrifusagem com solução de lise e incubar a 65 °C por 15-30 min.
- Adicione 17,5 μL de 20 mg/mL proteinase K e incubar durante a noite a 55 °C, com agitação suave.
- Deixe a amostra esfriar até a temperatura ambiente por 5 minutos antes de passar para a etapa 1.3.
- Lise celular de sangue inteiro
- Obtenha 3 mL de sangue inteiro em EDTA-, heparina ou tubo contendo citrato.
- Tubo de rocha suavemente misturado, e transfira sangue para um tubo de centrífuga de 15 mL estéril contendo 9 mL de solução de lise celular. Inverta várias vezes durante um período de incubação de 10 minutos à temperatura ambiente.
- Centrifugar a 2.000 x g por 10 minutos à temperatura ambiente, e depois descartar o máximo de supernanato possível sem perturbar a pelota branca visível. Aproximadamente 50-100 μL de líquido residual permanecerão.
- Tubo de vórtice vigorosamente para 15 s até que completamente resuspended. Adicione 3 mL de solução de lise nuclei e pipet várias vezes. A solução deve se tornar viscosa.
- Precipitação proteica
- Adicione 200 μL de tampão de precipitação proteica ao tecido, ou 1 mL ao sangue. Vórtice vigorosamente para 20 s e incubar no gelo por 5 minutos. Pequenas proteínas podem ser visíveis após o vórtice.
- Centrifugar a 16.000 x g por 4 min. Uma pelota apertada contendo proteínas precipitadas deve se formar.
- Transfira cuidadosamente o supernante, sem perturbar a pelota, para um novo tubo de 1,7 mL.
NOTA: Se a pelota não estiver apertada, considere outra centrífuga a 16.000 x g por 4 min.
- Precipitação e reidratação de DNA
- Adicione 1 mL de 2-propanol ao tubo contendo o supernascimento, e misture suavemente invertendo. O DNA deve se tornar visível como substância flutuante branca.
- Centrifugar a 16.000 x g por 1 min. Remova o supernatante completamente usando uma pipeta.
- Adicione 1 mL de etanol recém-preparado e inverta o tubo várias vezes. Centrífuga a 16.000 x g por 1 min a temperatura ambiente. Descarte o supernaspeuta cuidadosamente.
- Repita o passo 1.4.3.
- Coloque o tubo aberto invertido em papel absorvente limpo por 10-15 min. Inverter o tubo e confirmar a hidratação completa. Se necessário, deixe secar ao ar por mais 10-15 min.
NOTA: É crucial que a pelota seque completamente. - Adicione 50 μL de água ultra-pura (UPW). Se necessário, o DNA pode ser diluído mais após a quantificação.
- Incubar por 1h no bloco de calor a 65 °C, para reidratação de DNA.
- Quantificação de DNA
NOTA: O DNA foi quantificado por meio de um fluorômetro e reagentes designados, conforme especificado na tabela de materiais.- Leve os padrões à temperatura ambiente e prepare o kit, incluindo tubos designados de 0,5 mL.
- Prepare a mistura de tampão e corante em um tubo de 15 mL, de acordo com o número de amostras. Adicione 200 μL de tampão e 1 μL de corante por amostra. Inclua 2 amostras para padrões. Recomenda-se calcular uma amostra adicional para evitar que o buffer não seja suficiente.
- Para as 2 normas, coloque 190 μL da mistura acima preparada em tubo de 0,5 mL. Adicione 10 μL do padrão.
- Para cada amostra, coloque 199 μL da mistura acima preparada em tubo de 0,5 mL. Adicione 1 μL do DNA.
- Leia as amostras. O resultado indica concentração de DNA da amostra.
- Se as amostras estiverem acima do limite, dilui o DNA 1:10 com UPW e repita a leitura.
2. Preparação da biblioteca
NOTA: O protocolo atual utiliza um kit de ensaio baseado em multiplex, baseado em PCR, compatível com sequenciadores NGS. O kit contém 24 índices diferentes cada uma visando regiões conservadas dentro doV β e das regiões Jβ. Isso permite uma reação pcr de uma etapa e agrupamento de diferentes amostras. Veja a tabela de materiais para obter detalhes.
- Prepare amostras de DNA. Obtenha 150 ng de DNA e adicione UPW para um total de 5 μL.
NOTA: É possível usar menos de 150 ng de DNA para preparação da biblioteca, com concentração mínima de 10 ng/μL. - Coloque pipetas e pontas no capô com luz UV por 15 minutos para quebrar o DNA residual. Enquanto isso, permita que diferentes tubos de índice (para preparação da biblioteca) e polimerase de DNA descongelem no gelo.
- Em uma capa biológica, adicione 45 μL dos diferentes tubos de índice em tubos PCR. A seguir, adicione 0,2 μL da polimerase de DNA e os 5 μL de DNA preparados na etapa 2.1 em tubos PCR.
- Execute a reação do PCR usando um programa pré-definido, de acordo com as instruções do fabricante.
3. Purificação e quantificação de amplicon
- Use contas magnéticas para remoção de primers em excesso, nucleotídeos e enzimas.
- Aqueça as contas com pelo menos 30 minutos a temperatura ambiente. Prepare 80% de etanol fresco suficiente para 400 μL por amostra.
- Adicione 50 μL (IGH) ou 35 μL (TCRβ) das contas a cada tubo PCR e misture por pipetação 10 vezes. Incubar 10 min em temperatura ambiente.
- Coloque a amostra mista no suporte magnético por 5 minutos.
- Aspire 95 μL (IGH) ou 80 μL (TCRβ) do líquido claro e descarte. Aspirar líquido restante usando uma ponta de 10 μL.
- Adicione 200 μL de 80% de etanol a cada amostra. Incubar 30 s. Aspirar 195 μL de etanol e descartar. Aspirar líquido restante usando ponta de 10 μL.
- Repita o passo 3.1.5. Abra as tampas dos tubos e deixe o ar secar por 5 minutos.
- Imediatamente após os 5 minutos, remova do suporte magnético e adicione 25 μL de tampão de elução (10 mM Tris-HCl, pH 8.0). Misture por pipetação até ficar homogêneo. Incubar em temperatura ambiente por 2 minutos.
- Coloque os tubos no suporte magnético por 5 minutos. Transfira 22 μL para um novo tubo PCR. Meça a concentração de DNA (etapa 1,5).
- Quantificação de amplicon
NOTA: O protocolo atual usa uma máquina de eletroforese automatizada para controle de qualidade da concentração, tamanho e integridade do DNA. Veja a tabela de materiais para obter detalhes.- Coloque reagentes e fita de tela em temperatura ambiente por pelo menos 30 minutos.
- Em um novo tubo de microcrífugas de 1,7 mL, faça uma diluição de 1ng/μL das amostras de DNA quantificadas na etapa 3.1.8 com UPW para um volume total de pelo menos 3 μL.
- Vórtice diluído DNA antes do uso. Coloque 2 μL de tampão, juntamente com 2 μL do DNA diluído nas tiras PCR especializadas pré-rotuladas (fornecidas no kit) e coloque as tampas. Coloque no shaker por 1 min, seguido de girar para baixo de tiras PCR.
NOTA: Devido à viscosidade do buffer, certifique-se de que o excesso de tampão seja removido da ponta antes de transferir para os tubos de amostra. - Coloque na máquina, a fita de tela e as tiras PCR sem as tampas. Abra a tampa da caixa de ponta dentro da máquina. Atribua a posição com rótulos apropriados. Ligue a máquina.
NOTA: O histograma de saída deve ser um único pico no tamanho desejado dos amplicons(Figura 1A). Em amostras de má qualidade, serão observados picos adicionais(Figura 1B),indicando má limpeza de contas ou formação de primer dimers.
4. Sequenciamento de próxima geração
- Quantificação e agrupamento de biblioteca
- Calcule a concentração final de DNA em nM, utilizando o valor do DNA da etapa 3.1.8, e o tamanho dos pares de base (bp) do pico do produto, obtidos a partir dos resultados da máquina de eletroforese (ver Figura 1).
- Para cada amostra, calcule o volume de DNA para tomar para uma concentração final de 4 nM, em um volume final de 10-20 μL tampão de eluição.
- Prepare uma nova mistura de diluição para cada amostra e retire 2 μL dela para uma nova mistura de piscina.
NOTA: Para amostras com menos de 4 nM, adicione a quantidade máxima de amostra possível.
- NGS executado de biblioteca
NOTA: O protocolo atual usa uma plataforma de sequenciador de bancada. Veja a tabela de materiais para obter detalhes.- Prepare uma nova solução de 0.2 N NaOH. Adicione 10 μL de 0,2 N NaOH à biblioteca diluída preparada na etapa 4.1.3. Adicione 5% de PhiX ao tubo e ao vórtice brevemente. Gire o tubo para garantir que toda a solução tenha se acomodado na parte inferior do tubo.
- Incubar por 5 minutos à temperatura ambiente para desnaturar o DNA duplo encalhado. Adicione 980 μL de tampão pré-refrigerado do kit ao tubo contendo DNA e vórtice brevemente.
- Coloque a biblioteca diluída no gelo e prepare a biblioteca da seguinte forma. Para uma mistura de 17 pM, adicione 425 μL de DNA da etapa 4.2.2 e 575 μL de tampão. Inverter biblioteca várias vezes e girar para baixo. Carregue 600 μL da biblioteca final no cartucho designado e coloque amostras na máquina.
- Inicie a execução seguindo as instruções de software.
5. Análise de sequenciamento
- Baixe métricas de sequenciamento do sequencer e verifique se os dados de sequenciamento estão dentro das seguintes faixas (específica para o kit usado no protocolo atual). As amostras que não atendem a esses critérios estão sujeitas a repetição:
Densidade do cluster (Densidade (K/mm2)): 945K – 1800K
Percentual de leituras do filtro de passagem (Clusters PF (%)): >90%
Escores de qualidade (%>=Q30): >85%
Alinhamento PhiX (Alinhado%): 1,5% - 10%
Taxa de erro phix (%): <1,0%
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Representative Results
Aqui, descrevemos um método para isolamento do DNA do tecido intestinal e sangue, preparação de bibliotecas para NGS, e etapas básicas de um sequenciamento para sequenciamento do repertório imunológico. A execução gerará arquivos fastq, que podem ser convertidos em arquivos fasta para uso na plataforma internacional IMGT)/HighV-QUEST. Este HTS realiza e gerencia muitas análises de dezenas de milhares de sequências TCRβ e IGH reorganizadas, no nível nucleotídeo15. O IMGT/HighV-QUEST permite a análise de diferentes repertórios de TCRs e IGH tanto na saúde quanto na doença. Isso pode levar à identificação de novos clones "específicos da doença", análise de parâmetros de expansão clonal e diversidade, delineamento do uso diferencial de V(D)J, análise de hipermo mutações somáticas e muito mais. O IMGT/HighV-QUEST fornece arquivos CSV, que contêm sequências específicas e sua abundância. Usar DNA genômico como material inicial produz números de sequência que são representativos dos números celulares. Assim, se a quantidade original de DNA for igual, a porcentagem de células T em uma determinada amostra também pode ser calculada.
Incluímos uma análise básica de amostras representativas, autólogas de sangue e retal de um paciente com deficiência de receptor IL10 e histórico de IBD de início infantil grave, resultante de uma mutação il10RA deletéria. As amostras foram avaliadas tanto para o repertório TCRβ quanto para o IGH. A amostra tcrβ intestinal produziu um total de 12.450 sequências, das quais 9.050 sequências foram únicas. A amostra de TCRβ de sangue teve um total de 54.880 sequências, das quais 35.110 eram únicas. Na amostra intestinal IGH, foram obtidas 49.070 sequências, das quais 23.670 foram únicas. Na amostra de sangue IGH, foram obtidas 13.710 sequências, das quais 13.540 foram únicas. Todos os clones podem ser identificados por sua sequência única tanto no nível nucleotídeo ou aminoácido. Essas sequências podem ser comparadas entre diferentes pacientes, em busca de clones compartilhados, ou no mesmo paciente entre diferentes locais anatômicos (por exemplo, sangue vs. intestino). Apresentamos para cada uma das amostras os 5 clones mais frequentes(Tabela 1).
Para quantificar o grau de expansão clonal, diferentes índices podem ser usados, incluindo H de Shannon, Gini-Simpson, entropia e clonalidade. Como exemplo, o H de Shannon, que leva em conta o número de sequências únicas (riqueza do repertório) e a forma como elas são distribuídas foi encontrada para ser diminuída no IGH intestinal do paciente vs. sangue (8,3 vs. 9,5), sugerindo expansão clonal de células B no intestino inflamado.
Para uma visão geral ampla do repertório, foram geradas imagens do Treemap (www.treemap.com)(Figura 2). Cada quadrado colorido representa um clone diferente, e o tamanho se correlaciona com sua frequência. Estas imagens do Treemap demonstram expansão clonal no repertório igh intestinal em comparação com o sangue. Em contraste, no repertório TCRβ, observa-se expansão clonal acentuada no sangue, em comparação com o intestino autólogo.
No nível genético, o NGS fornece informações sobre o uso de V-D e J no nível de gene, família ou alelo, conforme mostrado na Tabela 1. Além disso, combinações específicas de V(D)J podem ser inferidas a partir dos dados para repertórios TCRβ e IGH (Figura 3A,B), que podem revelar padrões diferenciais de uso de genes em várias condições. Também podem ser analisadas propriedades biofísicas da região da CDR3, como comprimento (Tabela 1) ou hidroofobidade. É importante ressaltar que a distribuição de comprimento cdr3 é alterada em diferentes distúrbios imuno-mediados10,16,17. Por exemplo, em pacientes deficientes do IL10R, as células T derivadas do sangue, mas não as células B, têm menor comprimento de CDR3 e hidroofobidade diferencial, em comparação com controles saudáveis7.
Figura 1: Dados bioanalises representativos. Imagens representativas de amostras de TCRβ intestinais mostrando ótimos resultados(A)com o pico desejado de 400 bp. Um exemplo de uma biblioteca de baixa qualidade (B)com picos adicionais de 179bp e 114bp (marcado *). Os picos vistos nas extremidades são marcadores superiores e inferiores da tira de eletroforese. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Visão geral do repertório imunológico das células T e B. Diagramas de arbólicos de amostras de sangue e intestino TCRβ e IGH. Cada quadrado colorido representa um clone diferente, e o tamanho se correlaciona com sua frequência. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Gráficos representativos do uso de TCRβ e IGH V-J. Uma amostra intestinal representativa representando o número total de sequências para cada combinação V-J em TCRβ (A) ou IGH(B). Os dados não são mostrados para uso D. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Alterações na abundância e função de linfócitos B e T são frequentemente encontradas em diferentes malignidades18, distúrbios inflamatórios crônicos (por exemplo, colite ulcerativa e artrite reumatoide)10,19, e em várias imunodeficiências17,20. O método atual utiliza o NGS para facilitar uma visão aprofundada dos repertórios TCR e BCR, permitindo a detecção de alterações sutis na clonalidade celular T e B, compartilhamento de clones, uso do gene V(D)J e informações sobre o grau de hiper-mutações somáticas no caso das células B.
O método de isolamento do DNA foi descrito para biópsias intestinais e amostras de sangue. No entanto, com modificações de lise e extração de DNA, o método pode ser aplicado a outros tecidos como tumores, linfonodos, fluido sinovial, etc. É importante durante a preparação da biblioteca não contaminar os diferentes conjuntos de primer. Na limpeza das contas, deve-se tomar cuidado para deixar tubos no ímã em todos os momentos de incubação. Para amostras de DNA de baixas concentrações, os estoques podem ser concentrados a 65 °C por 10-20 minutos. Além disso, os amplicons podem ser elucidos de contas em apenas 20 μL tampão de eluição.
Diferentes técnicas utilizadas no passado para caracterizar a paisagem da composição celular T e B forneceram apenas uma visão superficial do repertório imunológico. Uma das maiores vantagens da NGS para a análise do repertório imunológico é a capacidade de identificar clones únicos e, consequentemente, rastreá-los em diferentes locais anatômicos (por exemplo, intestino vs. sangue vs. linfonodo) ou em diferentes indivíduos. As implicações clínicas de tal técnica são significativas, e vão além de melhorar a compreensão do papel das células T ou B em diferentes doenças imuno-mediadas ou malignidades21. Na oncologia, o NGS é usado para identificar clones específicos que podem ser biomarcadores preditivos para os pacientes que provavelmente se beneficiarão das imunoterapias atuais22,23,24. Na leucemia, o NGS é usado para confirmar a erradicação total de células cancerosas pela detecção de clones leucínmicos residuais que permanecem em um paciente após o tratamento25.
Uma das principais limitações da análise do repertório imunológico de amostras de tecido inteiro ou sangue é a incapacidade de identificar alterações de repertório em populações menos frequentes. Por exemplo, se as células T regulatórias, que compreendem apenas algumas porcentagens do total de células CD4+ T, expressem um perfil de repertório único, isso seria perdido se a realização desses estudos sobre sangue inteiro. Esse problema poderia ser resolvido com a realização desses estudos sobre populações imunes classificadas. Alternativamente, nos últimos anos a tecnologia desenvolveu-se para facilitar o acoplamento de dados de RNA de célula única com perfis de repertório TCR ou IGH26. Isso fornece outro nível de funcionalidade das células T ou B, uma vez que a paisagem transcricional de cada clone pode ser caracterizada. Como exemplo, Zemmour et al. usaram scRNAseq TCRseq para demonstrar que células T regulatórias do sangue humano, exibem uma heterogeneidade ampla com uma subpopulação ativada que está transcricionáriamente relacionada às células T convencionais27. Da mesma forma, em pacientes com carcinoma hepatocelular, este método identificou 11 subconjuntos de células T distintos que se infiltram no tumor, cada um com perfil transcricional e de repertório único28. Estudos como esses serão úteis especialmente quando estudam populações raras, e fornecerão informações funcionais importantes de clones específicos.
NGS do repertório imunológico é um novo campo de pesquisa que fornece novas percepções sobre a função imunológica adaptativa e o papel das células T e B em várias doenças. Além disso, está entrando rapidamente no mundo clínico em diferentes disciplinas, rastreando clonótipos associados à doença. Atualmente existem vários kits disponíveis para repertório imunológico. Estes são baseados em metodologia semelhante, independentemente de usarem RNA ou DNA como fonte. Eles usam técnicas semelhantes para calibração, correções de viés e ferramentas de análise; e, portanto, precisa ser adequadamente escolhido de acordo com demandas específicas. Uma das grandes vantagens do kit atual é que ele é um pronto para uso e otimizado para repertório imunológico humano, sem necessidade de calibração. No futuro, veremos mais estudos usando características de repertório como biomarcadores para diferentes doenças, potencialmente também levando ao desenvolvimento de terapias-alvo contra esses clones. Acreditamos que os pesquisadores devem considerar a aplicação desses métodos para estudar a paisagem imune adaptativa em diferentes distúrbios.
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Disclosures
Todos os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
nenhum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-propanol | Sigma | I9516-500ML | |
| 1.7 mL micro-centrifuge tubes | Axygen | 8187631104051 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Greiner | 188261 | |
| Absolute ethanol | Merck | 1.08543.0250 | |
| Amplitaq Gold | Thermo Fisher | N8080241 | |
| AMPure XP Beads | Beckman Coulter | A63881 | |
| Heat block | Bioer | Not applicable | |
| High Sensitivity D1000 Sample Buffer | Agilent | 5067-5603 | For Tapestation |
| High Sensitivity D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5584 | For Tapestation. Tubes sold seperately |
| Lymphotrack Assay kit | Invivoscribe | TRB: 70-91210039 IGH: 70-92250019 | Each includes 24 indexes |
| MiSeq Reagent Kit v2 (500 cycle) | Illumina | MS-102-2003 | Includes standard flow cell type and all reagents required |
| MiSeq Sequencer | Illumina | SY-410-1003 | |
| PCR strips | 4titude | 4ti-0792 | |
| Proteinase K | Invitrogen | EO0491 | |
| Qubit 4 Fluorometer | Thermo Fisher | Q33226 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher | Q32854 | Includes buffer, dye, standards, and specialized tubes |
| Shaker | Biosan | Not applicable | |
| Tapestation 2100 Bioanalyzer | Agilent | G2940CA | |
| ultra pure water | Bio-lab | 7501 | |
| Wizard DNA isolation kit | Promega | A1120 | Includes cell lysis solution, nuclei lysis solution, and protein precipitation buffer |
References
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