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Immunology and Infection

टी और बी सेल रिसेप्टर प्रतिरक्षा प्रदर्शनों की सूची विश्लेषण अगली पीढ़ी अनुक्रमण का उपयोग कर

Published: January 12, 2021 doi: 10.3791/61792
Automatic Translation
1,2, 3,4, 1, 3,4, 1,2
1Pediatric Gastroenterology Unit, Edmond and Lily Safra Children's Hospital, Sheba Medical Center, 2Sackler Faculty of Medicine, Tel Aviv University, 3Cancer Research Center, Sheba Medical Center, 4Molecular Hematology Laboratory, Sheba Medical Center

Summary

वर्तमान प्रोटोकॉल रक्त के नमूनों और आंतों की बायोप्सी से डीएनए अलगाव, अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के लिए टीसीआरएनए और आईएच पीसीआर पुस्तकालयों की पीढ़ी, एक एनजीएस रन के प्रदर्शन और बुनियादी डेटा विश्लेषण के लिए एक विधि का वर्णन करता है ।

Abstract

प्रतिरक्षा स्मृति, अनुकूली प्रतिरक्षा की पहचान, टी और बी लिम्फोसाइट्स द्वारा करवाया जाता है। संचलन और विभिन्न अंगों में, अरबों अद्वितीय टी और बी सेल क्लोन हैं, और हर एक एक विशिष्ट एंटीजन को बांध सकता है, जिससे प्रसार, भेदभाव और/या साइटोकिन स्राव होता है । टी और बी कोशिकाओं में विशाल विषमता विभिन्न आनुवंशिक खंडों के यादृच्छिक पुनर्संयोजन द्वारा उत्पन्न होती है। पिछले दशक में विकसित अगली पीढ़ी की अनुक्रमण (एनजीएस) प्रौद्योगिकियां टी और बी सेल रिसेप्टर प्रतिरक्षा प्रदर्शनों की सूची के अभूतपूर्व गहन दृष्टिकोण को सक्षम करती हैं । विभिन्न भड़काऊ स्थितियों, इम्यूनोडेफिसिएन्स, संक्रमण और घातक में अध्ययनों ने क्लोनलिटी, जीन उपयोग और प्रतिरक्षा प्रदर्शनों की सूची के जैव भौतिक गुणों में उल्लेखनीय परिवर्तन का प्रदर्शन किया, जो विभिन्न विकारों में अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं की भूमिका के बारे में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान करता है।

यहां, हम रक्त और ऊतक से टी और बी कोशिकाओं के प्रतिरक्षा प्रदर्शनों की सूची के NGS के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं । हम पुस्तकालय की तैयारी के माध्यम से डीएनए अलगाव से शुरू एक पाइपलाइन पेश करते हैं, NGS सीक्वेंसर पर अनुक्रमण और बुनियादी विश्लेषणों के साथ समाप्त होता है। यह विधि न्यूक्लियोटाइड या अमीनो-एसिड स्तर पर विशिष्ट टी और बी कोशिकाओं की खोज में सक्षम बनाती है, और इस प्रकार विभिन्न रोगों में लिम्फोसाइट आबादी और विविधता मापदंडों में गतिशील परिवर्तनों की पहचान कर सकती है। यह तकनीक धीरे-धीरे नैदानिक अभ्यास में प्रवेश कर रही है और इसमें उपन्यास बायोमार्कर, जोखिम स्तरीकरण और सटीक दवा की पहचान करने की क्षमता है।

Introduction

अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली, टी और बी लिम्फोसाइट्स के शामिल, इम्यूनोलॉजिकल स्मृति का उपयोग करने के लिए एक पहले का सामना करना पड़ा एंटीजन पहचान और एक तेजी से प्रतिक्रिया शुरू । लिम्फोसाइट्स बोन मैरो में उत्पन्न होते हैं और थाइमस (टी कोशिकाओं) या बोन मैरो (बी कोशिकाओं) में परिपक्व होते हैं। टी सेल रिसेप्टर (टीसीआर) और बी सेल रिसेप्टर (बीसीआर) दोनों अद्वितीय विन्यास प्रदर्शित करते हैं जो विशिष्ट एंटीजन की मान्यता की अनुमति देते हैं। होमोस्टेसिस में, टी और बी कोशिकाएं एंटीजन-पेश कोशिकाओं पर प्रस्तुत अरबों विभिन्न पेप्टाइड्स को लगातार प्रसारित और सर्वेक्षण करती हैं। उच्च आत्मीयता के साथ एक विशिष्ट एंटीजन का टीसीआर या बीसीआर लिगेशन, उचित सह-उत्तेजना के साथ, सेल सक्रियण की ओर जाता है, जिसके परिणामस्वरूप बी कोशिकाओं के मामले में साइटोकिन स्राव, क्लोनल विस्तार और एंटीबॉडी का उत्पादन होता है।

विभिन्न टी या बी कोशिकाओं की विशाल सरणी को सामूहिक रूप से प्रतिरक्षा प्रदर्शनों की सूची कहा जाता है, जिससे अनगिनत विभिन्न एपिटोप्स की मान्यता मिलती है। इस तरह के विशाल प्रदर्शनों की सूची उत्पन्न करने के लिए, विभिन्न जीन खंडों की यादृच्छिक असेंबली की एक जटिल प्रक्रिया होती है, जो रिसेप्टर्स के लगभग अंतहीन संयोजन पैदा करती है जो अद्वितीय एंटीजन1को बांध सकती है। वी (डी) जे पुनर्संयोजन नामक इस प्रक्रिया में विभिन्न चर (वी), विविधता (डी) और जॉइनिंग (जे) जीन की पुनर्व्यवस्था शामिल है, जिसमें जंक्शनों2में न्यूक्लियोटाइड के यादृच्छिक विलोपन और सम्मिलन शामिल हैं।

अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली की वास्तुकला कई दशकों के लिए विभिन्न क्षेत्रों में रुचि वैज्ञानिकों है। अतीत में, सेंगर अनुक्रमण, पूरक निर्धारण क्षेत्र 3 (सीडीआर 3) स्पेक्ट्राटाइटिंग, और प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग प्रतिरक्षा प्रदर्शनों की सूची की विशेषता के लिए किया जाता था, लेकिन कम रिज़ॉल्यूशन प्रदान किया जाता था। पिछले दशक में, अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (एनजीएस) विधियों में प्रगति ने किसी व्यक्ति की टीसीआर और बीसीआर प्रदर्शन3,4की विशेषताओं और संरचना में गहराई से अंतर्दृष्टि प्राप्त की। ये उच्च-थ्रूपुट सिस्टम (एचटीएस) अनुक्रम और लाखों पुनर्व्यवस्थित टीसीआर या बीसीआर उत्पादों को एक साथ संसाधित करते हैं और न्यूक्लियोटाइड या अमीनो एसिड स्तर पर विशिष्ट टी और बी कोशिकाओं के उच्च-संकल्प विश्लेषण की अनुमति देते हैं। NGS स्वास्थ्य और रोग दोनों में प्रतिरक्षा प्रदर्शनों की सूची का अध्ययन करने के लिए एक नई रणनीति प्रदान करता है । एचटीएस का उपयोग करने वाले अध्ययनों में ऑटोइम्यून रोगों में टीसीआर और बीसीआर प्रदर्शनों का प्रदर्शन किया गया5,प्राथमिक इम्यूनोडेफिसिएंसी6,7और घातक, जैसे कि एक्यूट माइलॉयड ल्यूकेमिया8। एनजीएस का उपयोग करते हुए, हमने और अन्य लोगों ने भड़काऊ आंत्र रोग (आईबीडी) वाले रोगियों में विशिष्ट टी और बी सेल क्लोन का अल्पाधिकार विस्तार दिखाया है, जिसमें अल्सर कोलाइटिस और क्रोन की बीमारी9,10,11,12, 13,14शामिल हैं। कुल मिलाकर, विभिन्न क्षेत्रों के अध्ययनों से पता चलता है कि प्रदर्शनों की सूची में परिवर्तन प्रतिरक्षा मध्यस्थता विकारों के रोगजनन में एक महत्वपूर्ण भूमिका है ।

वर्तमान प्रोटोकॉल आंतों की बायोप्सी और रक्त से डीएनए के अलगाव के लिए एक विधि, TCRο और घा पीसीआर पुस्तकालयों के उत्पादन के लिए NGS के लिए, और अनुक्रमण रन के प्रदर्शन का वर्णन करता है । हम प्रतिरक्षा प्रदर्शनों की सूची डेटा विश्लेषण में बुनियादी कदम भी प्रदान करते हैं। इस प्रोटोकॉल के रूप में अच्छी तरह से TCRα, TCRγ, और IGL पुस्तकालयों की पीढ़ी के लिए लागू किया जा सकता है। विधि अन्य अंगों (जैसे, लिम्फ नोड्स, ट्यूमर, सिनोवियल तरल पदार्थ, वसा ऊतक, आदि) के साथ भी संगत है जब तक कि ऊतक-विशिष्ट पाचन प्रोटोकॉल का उपयोग किया जाता है।

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Protocol

इस अध्ययन को शेबा मेडिकल सेंटर में संस्थागत समीक्षा बोर्ड द्वारा अनुमोदित किया गया था, और सभी प्रतिभागी विषयों से सूचित लिखित सहमति प्राप्त की गई थी।

1. डीएनए अलगाव और परिमाणीकरण

  1. आंतों की बायोप्सी का पाचन और कोशिका लाइसिस
    1. आंतों की बायोप्सी को पुनः प्राप्त करें, या तो हौसले से एकत्र किए गए या -20 डिग्री सेल्सियस या -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत। यदि जमे हुए बायोप्सी का उपयोग कर रहे हैं, तो बर्फ पर गल जाएं।
    2. बर्फ पर ठंडा एक बाँझ 1.7 एमएल माइक्रो-सेंट्रलाइज ट्यूब के लिए नाभिक लाइसिस समाधान के 600 μL जोड़ें।
    3. बायोप्सी को लाइसिस समाधान के साथ एक माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में रखें और 15-30 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    4. 20 मिलीग्राम/एमएल प्रोटीन के 17.5 माइक्रोन जोड़ें और कोमल झटकों के साथ 55 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें।
    5. नमूना 1.3 कदम करने के लिए आगे बढ़ने से पहले 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान को ठंडा करने के लिए अनुमति दें।
  2. पूरे रक्त की कोशिका लाइसिस
    1. EDTA-, हेपरिन-, या साइट्रेट युक्त ट्यूब में पूरे रक्त के 3 एमएल प्राप्त करें।
    2. धीरे-धीरे रॉक ट्यूब को अच्छी तरह से मिश्रित होने तक, और रक्त को एक बाँझ 15 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें सेल लाइसिस समाधान के 9 एमएल होते हैं। कमरे के तापमान पर 10 मिनट इनक्यूबेशन अवधि के दौरान कई बार उलटा।
    3. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 2,000 x ग्राम पर सेंट्रलाइज, और फिर दिखाई देने वाले सफेद गोली को परेशान किए बिना जितना संभव हो उतना सुपरनैंट को त्यागें। अवशिष्ट तरल के लगभग 50-100 माइक्रोन रहेंगे।
    4. भंवर ट्यूब सख्ती से 15 एस के लिए जब तक पूरी तरह से निलंबित कर दिया । नाभिक लाइसिस समाधान और पिप्ट के 3 एमएल को कई बार जोड़ें। समाधान चिपचिपा बनना चाहिए।
  3. प्रोटीन वर्षा
    1. ऊतक, या रक्त के लिए 1 एमएल करने के लिए प्रोटीन वर्षा बफर के 200 μL जोड़ें। भंवर 20 एस के लिए सख्ती और 5 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट । भंवर के बाद छोटे प्रोटीन झुरमुट दिखाई दे सकते हैं।
    2. 4 मिनट के लिए 16,000 x ग्राम पर सेंट्रलाइज। एक तंग गोली जिसमें उपजी प्रोटीन होता है, वह बनता है।
    3. ध्यान से सुपरनेट को स्थानांतरित करें, गोली को परेशान किए बिना, एक नई 1.7 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।
      नोट: यदि गोली तंग नहीं है, तो 4 मिनट के लिए 16,000 x ग्राम पर एक और अपकेंद्रित्र पर विचार करें।
  4. डीएनए वर्षा और रिहाइड्रेशन
    1. सुपरनैंट युक्त ट्यूब में 2-प्रोपेनोल का 1 एमएल जोड़ें, और उलटा करके धीरे-धीरे मिलाएं। डीएनए सफेद तैरते पदार्थ के रूप में दिखाई देना चाहिए।
    2. 1 मिनट के लिए 16,000 x ग्राम पर सेंट्रलाइज। एक पिपेट का उपयोग करके सुपरनैट पूरी तरह से हटा दें।
    3. हौसले से तैयार 70% इथेनॉल, और उलटा ट्यूब कई बार की 1 मिलील जोड़ें। कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए 16,000 x ग्राम पर सेंट्रलाइज। सुपरनेटेंट को सावधानी से छोड़ दें।
    4. दोहराएं चरण 1.4.3।
    5. 10-15 मिनट के लिए स्वच्छ शोषक कागज पर उलटा ट्यूब रखें। फिर से उलटा ट्यूब और पूर्ण जलयोजन की पुष्टि करें। यदि आवश्यक हो, तो अतिरिक्त 10-15 मिनट के लिए हवा-शुष्क पर छोड़ दें।
      नोट: यह गोली के लिए महत्वपूर्ण है पूरी तरह से सूखी ।
    6. अल्ट्रा-प्योर वाटर (यूपीडब्ल्यू) के 50 माइक्रोन जोड़ें। यदि आवश्यक हो, तो डीएनए को परिमाणीकरण के बाद अधिक पतला किया जा सकता है।
    7. डीएनए रिहाइड्रेशन के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर हीट ब्लॉक पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट।
  5. डीएनए मात्राकरण
    नोट: डीएनए को फ्लोरोमीटर और नामित अभिकर्षकों का उपयोग करके निर्धारित किया गया था, जैसा कि सामग्रियों की तालिका में निर्दिष्ट है।
    1. कमरे के तापमान के लिए मानकों को लाने और 0.5 एमएल नामित ट्यूबों सहित किट तैयार करते हैं।
    2. नमूनों की संख्या के अनुसार, 15 एमएल ट्यूब में बफर और डाई मिक्स तैयार करें। प्रति नमूना बफर के 200 माइक्रोन और डाई के 1 माइक्रोन जोड़ें। मानकों के लिए 2 नमूने शामिल करें। यह एक अतिरिक्त नमूने की गणना करने के लिए से बचने के लिए कि बफर पर्याप्त नहीं होगा की सिफारिश की है ।
      1. 2 मानकों के लिए, 0.5 एमएल ट्यूब में उपरोक्त तैयार मिश्रण के 190 माइक्रोन रखें। मानक के 10 माइक्रोन जोड़ें।
      2. प्रत्येक नमूने के लिए, 0.5 एमएल ट्यूब में उपरोक्त तैयार मिश्रण के 199 माइक्रोन रखें। डीएनए का 1 माइक्रोल जोड़ें।
    3. नमूने पढ़ें। परिणाम नमूने की डीएनए एकाग्रता को इंगित करता है।
    4. यदि नमूने सीमा से अधिक हैं, तो डीएनए 1:10 को UPW के साथ पतला करें, और दोहराएं।

2. पुस्तकालय की तैयारी

नोट: वर्तमान प्रोटोकॉल एनजीएस सीक्वेंसर्स के साथ संगत एक मल्टीप्लेक्स, पीसीआर आधारित परख किट का उपयोग करता है। इस किट में वी β औरजे β क्षेत्रों के भीतर संरक्षित क्षेत्रों को लक्षित करने वाले 24 विभिन्न सूचकांक शामिल हैं । यह एक कदम पीसीआर प्रतिक्रिया और विभिन्न नमूनों की पूलिंग सक्षम बनाता है। विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें।

  1. डीएनए सैंपल तैयार करें। डीएनए के 150 एनजी प्राप्त करें और कुल 5 माइक्रोन के लिए यूपीडब्ल्यू जोड़ें।
    नोट: पुस्तकालय की तैयारी के लिए डीएनए के १५० एनजी से कम का उपयोग करना संभव है, जिसमें न्यूनतम एकाग्रता 10 एनजी/μL है ।
  2. अवशिष्ट डीएनए को तोड़ने के लिए 15 मिनट के लिए यूवी लाइट के साथ हुड में पिपेट और टिप्स रखें। इस बीच, विभिन्न सूचकांक ट्यूब (पुस्तकालय तैयार करने के लिए) और डीएनए बहुलक बर्फ पर गल करने के लिए अनुमति दें ।
  3. एक जैविक हुड में, पीसीआर ट्यूबों में विभिन्न सूचकांक ट्यूबों से 45 माइक्रोन जोड़ें। पालन करने के लिए, डीएनए पॉलीमरेज के 0.2 माइक्रोन और पीसीआर ट्यूबों में चरण 2.1 में तैयार डीएनए के 5 माइक्रोन जोड़ें।
  4. निर्माता के निर्देशों के अनुसार, प्री-सेट प्रोग्राम का उपयोग करके पीसीआर प्रतिक्रिया चलाएं।

3. एम्प्लिकॉन शुद्धिकरण और परिमाणीकरण

  1. अतिरिक्त प्राइमर, न्यूक्लियोटाइड और एंजाइमों को हटाने के लिए चुंबकीय मोतियों का उपयोग करें।
    1. मोतियों को कमरे के तापमान में कम से कम 30 मिनट गर्म करें। प्रति नमूना 400 माइक्रोल के लिए पर्याप्त ताजा 80% इथेनॉल तैयार करें।
    2. प्रत्येक पीसीआर ट्यूब में मोतियों के 50 माइक्रोन (IGH) या 35 μL (TCRο) जोड़ें और 10 बार पाइपिंग करके मिलाएं। कमरे के तापमान पर 10 मिनट इनक्यूबेट।
    3. मिश्रित नमूने को 5 मिनट के लिए चुंबकीय स्टैंड पर रखें।
    4. स्पष्ट तरल के 95 माइक्रोन (आईएच) या 80 माइक्रोन (टीसीआरआर) को एस्पिरेट करें और त्यागें। 10 माइक्रोल टिप का उपयोग करके शेष तरल को एस्पिरेट करें।
    5. प्रत्येक नमूने में 80% इथेनॉल के 200 माइक्रोन जोड़ें। इनक्यूबेट 30 एस एथेनॉल के 195 माइक्रोन को एस्पिरेट करें और त्यागें। 10 माइक्रोन टिप का उपयोग करके शेष तरल को एस्पिरेट करें।
    6. दोहराएं चरण 3.1.5। ट्यूबों की टोपियां खोलें और हवा को 5 मिनट के लिए सूखने दें।
    7. 5 मिनट के तुरंत बाद, चुंबकीय स्टैंड से हटा दें और 25 माइक्रोन एल्यूशन बफर (10 mM Tris-HCl, पीएच 8.0) जोड़ें। सजातीय होने तक पाइपिंग करके मिलाएं। 2 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट।
    8. ट्यूबों को 5 मिनट के लिए चुंबकीय स्टैंड पर रखें। एक नई पीसीआर ट्यूब के लिए 22 μL स्थानांतरित करें। डीएनए एकाग्रता (चरण 1.5) को मापें।
  2. एम्प्लिकॉन क्वांटिफिकेशन
    नोट: वर्तमान प्रोटोकॉल डीएनए एकाग्रता, आकार और अखंडता के गुणवत्ता नियंत्रण के लिए एक स्वचालित इलेक्ट्रोफोरेसिस मशीन का उपयोग करता है। विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें।
    1. कम से कम 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर अभिकर् ती और स्क्रीनटेप रखें।
    2. एक नई 1.7 एमएल माइक्रो-सेंट्रलाइज ट्यूब में, कम से कम 3 माइक्रोल की कुल मात्रा के लिए यूपीडब्ल्यू के साथ चरण 3.1.8 में निर्धारित डीएनए नमूनों का 1 एनजी/μL कमजोर कर दें।
    3. भंवर उपयोग से पहले डीएनए पतला। बफर के 2 माइक्रोन रखें, एक साथ पूर्व लेबल विशेष पीसीआर स्ट्रिप्स में पतला डीएनए के 2 μL के साथ (किट में प्रदान की) और टोपियां जगह है । 1 मिनट के लिए शेखर पर रखें, पीसीआर स्ट्रिप्स के नीचे स्पिन के बाद।
      नोट: बफर की चिपचिपाहट के कारण, यह सुनिश्चित करें कि नमूना ट्यूबों में स्थानांतरित होने से पहले टिप से अतिरिक्त बफर हटा दिया जाता है।
    4. मशीन में रखें, बिना कैप के स्क्रीनटेप और पीसीआर स्ट्रिप्स। मशीन के अंदर टिप बॉक्स का ढक्कन खोलें। उचित लेबल के साथ स्थिति असाइन करें। मशीन शुरू करें।
      नोट: आउटपुट हिस्टोग्राम एम्प्लिकोन्स(चित्रा 1 ए)के वांछित आकार में एक ही चोटी होना चाहिए। खराब गुणवत्ता के नमूनों में, अतिरिक्त चोटियों(चित्रा 1 बी)देखा जाएगा, जो खराब मनका सफाई या प्राइमर डिमर्स के गठन का संकेत देता है।

4. अगली पीढ़ी के अनुक्रमण

  1. पुस्तकालय की मात्राकरण और पूलिंग
    1. एनएम में अंतिम डीएनए एकाग्रता की गणना करें, चरण 3.1.8 से डीएनए मूल्य का उपयोग करके, और उत्पाद के शिखर के आधार जोड़े (बीपी) में आकार, इलेक्ट्रोफोरेसिस मशीन परिणामों से प्राप्त (चित्र 1देखें)।
    2. प्रत्येक नमूने के लिए, 10-20 μL elution बफर की अंतिम मात्रा में, 4 एनएम की अंतिम एकाग्रता के लिए लेने के लिए डीएनए की मात्रा की गणना करें।
    3. प्रत्येक नमूने के लिए एक नया कमजोर पड़ने मिश्रण तैयार करें और इसे से एक नए पूल मिश्रण में 2 माइक्रोल लें।
      नोट: जिन नमूनों में 4 एनएम से कम है, उनके लिए अधिकतम नमूने संभव जोड़ें।
  2. पुस्तकालय के NGS भागो
    नोट: वर्तमान प्रोटोकॉल एक बेंच-टॉप सीक्वेंसर प्लेटफॉर्म का उपयोग करता है। विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें।
    1. 0.2 एन NaOH का एक नया समाधान तैयार करें। चरण 4.1.3 में तैयार पतला पुस्तकालय में 0.2 एन नाओएच के 10 माइक्रोन जोड़ें। ट्यूब और भंवर में 5% PhiX संक्षेप में जोड़ें। ट्यूब को स्पिन करें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि सभी समाधान ट्यूब के नीचे बस गए हैं।
    2. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट डबल फंसे डीएनए को विकृत करने के लिए । किट से डीएनए और भंवर युक्त ट्यूब के लिए पूर्व ठंडा बफर के ९८० μL संक्षेप में जोड़ें ।
    3. बर्फ पर पतला पुस्तकालय रखें, और पुस्तकालय को इस प्रकार तैयार करें। 17 पीएम के मिश्रण के लिए, चरण 4.2.2 और बफर के 575 माइक्रोन से डीएनए के 425 माइक्रोन जोड़ें। उलटा पुस्तकालय कई बार और नीचे स्पिन। निर्धारित कारतूस पर अंतिम पुस्तकालय के 600 μL लोड, और मशीन में नमूने जगह है।
    4. सॉफ्टवेयर निर्देशों का पालन करते हुए रन शुरू करें।

5. अनुक्रमण विश्लेषण

  1. सीक्वेंसर से अनुक्रमण मीट्रिक डाउनलोड करें, और सत्यापित करें कि अनुक्रमण डेटा निम्नलिखित श्रेणियों के भीतर है (वर्तमान प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली किट के लिए विशिष्ट)। इन मानदंडों को पूरा नहीं करने वाले नमूने दोहराने के अधीन हैं:
    क्लस्टर घनत्व (घनत्व (K/mm2)): 945K - 1800K
    पढ़ता है का प्रतिशत गुजर फिल्टर (क्लस्टर पीएफ (%)): >90%
    गुणवत्ता स्कोर (%> = Q30): >85%
    PhiX संरेखण (गठबंधन%): 1.5% - 10%
    PhiX त्रुटि दर (%): <1.0%

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Representative Results

इसके साथ में, हम आंतों के ऊतकों और रक्त से डीएनए अलगाव के लिए एक विधि का वर्णन करते हैं, एनजी के लिए पुस्तकालयों की तैयारी, और प्रतिरक्षा प्रदर्शनों की सूची अनुक्रमण के लिए अनुक्रमण रन के बुनियादी कदम। इस रन से फास्टक्यू फाइलें जेनरेट होंगी, जिन्हें आगे इंटरनेशनल इम्यूनोजेनेटिक्स (आईएमजीटी)/हाईवी-क्वेस्ट प्लेटफॉर्म में इस्तेमाल के लिए फास्टा फाइल्स में बदला जा सकता है । यह एचटीएस न्यूक्लियोटाइड स्तर15पर हजारों पुनर्व्यवस्थित टीसीआरआर और आईएच दृश्यों के कई विश्लेषणों का प्रदर्शन और प्रबंधन करता है। आईएमजीटी/हाईवी-क्वेस्ट स्वास्थ्य और रोग दोनों में विभिन्न टीसीआर और आईएच प्रदर्शनों के विश्लेषण को सक्षम बनाता है । इससे नए "रोग-विशिष्ट" क्लोन, क्लोनल विस्तार और विविधता मापदंडों का विश्लेषण, अंतर वी (डी) जे उपयोग, दैहिक हाइपर-म्यूटेशन का विश्लेषण, और अधिक की पहचान हो सकती है। आईएमजीटी/हाईवी-क्वेस्ट सीएसवी फाइलें प्रदान करता है, जिसमें विशिष्ट दृश्य और उनकी बहुतायत होती है । एक प्रारंभिक सामग्री के रूप में जीनोमिक डीएनए का उपयोग अनुक्रम संख्या है कि सेल संख्या के प्रतिनिधि हैं पैदावार। इस प्रकार, यदि मूल डीएनए मात्रा बराबर है, तो दिए गए नमूने में टी कोशिकाओं के प्रतिशत की भी गणना की जा सकती है।

हम प्रतिनिधि, ऑटोलॉगस रक्त और IL10 रिसेप्टर की कमी और गंभीर शिशु शुरुआत IBD के इतिहास के साथ एक मरीज के गुदा नमूनों से एक बुनियादी विश्लेषण शामिल हैं, एक हानिकारक IL10RA उत्परिवर्तन के परिणामस्वरूप । नमूनों को टीसीआरआर और आइजीएच प्रदर्शनों की सूची दोनों के लिए आसक्त किया गया था । आंतों के टीसीआरआर के नमूने में कुल 12,450 दृश्य ों का परिणाम आया, जिनमें से 9,050 दृश्य अद्वितीय थे। रक्त टीसीआर के नमूने में कुल 54,880 दृश्य थे, जिनमें से 35,110 अद्वितीय थे। आंतों के IGH नमूने में, कुल 49,070 दृश्य प्राप्त किए गए थे, जिनमें से 23,670 अद्वितीय थे। रक्त घाघ नमूने में कुल 13,710 दृश्य प्राप्त किए गए, जिनमें से 13,540 अद्वितीय थे। सभी क्लोन ों को न्यूक्लियोटाइड या अमीनो एसिड स्तर दोनों पर उनके अनूठे अनुक्रम द्वारा पहचाना जा सकता है। इन दृश्यों की तुलना विभिन्न रोगियों के बीच, साझा क्लोन की खोज में, या विभिन्न शारीरिक साइटों (जैसे, रक्त बनाम आंत) के बीच एक ही रोगी में की जा सकती है। हम 5 सबसे लगातार क्लोन(तालिका 1)के नमूनों में से प्रत्येक के लिए मौजूद हैं।

क्लोनल विस्तार की डिग्री को निर्धारित करने के लिए विभिन्न सूचकांकों का उपयोग किया जा सकता है, जिसमें शैनन के एच, गिनी-सिम्पसन, एंट्रोपी और क्लोनिटी शामिल हैं। एक उदाहरण के रूप में, शांनोन एच, जो अद्वितीय दृश्यों (प्रदर्शनों की सूची की समृद्धि) की संख्या को ध्यान में रखता है और कैसे समान रूप से उन्हें वितरित किया जाता है, रोगी की आंतों के आईएच बनाम रक्त (8.3 बनाम 9.5) में कमी पाई गई, सूजन वाले आंत में बी कोशिकाओं के क्लोनल विस्तार का सुझाव दिया गया था।

प्रदर्शनों की सूची के व्यापक अवलोकन के लिए, ट्रीमैप छवियां (www.treemap.com) उत्पन्न हुईं(चित्रा 2)। प्रत्येक रंगीन वर्ग एक अलग क्लोन का प्रतिनिधित्व करता है, और आकार इसकी आवृत्ति से संबंधित है। ये ट्रीमैप छवियां रक्त की तुलना में आंतों के घाघ प्रदर्शनों की सूची में क्लोनल विस्तार प्रदर्शित करते हैं। इसके विपरीत, टीसीआरआरओ प्रदर्शनों की सूची में, ऑटोलॉगस आंत की तुलना में रक्त में चिह्नित क्लोनल विस्तार देखा जाता है।

जीन स्तर पर, एनजीएस वी-डी-और जे-उपयोग के बारे में जानकारी प्रदान करता है, जैसा कि तालिका 1में दिखाया गया है। इसके अलावा, विशिष्ट वी (डी) जे संयोजनों को टीसीआरएनए और आईएच रिस्पोइरेस(चित्रा 3ए, बी)के लिए डेटा से अनुमानित किया जा सकता है, जो विभिन्न स्थितियों में अंतर जीन उपयोग पैटर्न को प्रकट कर सकता है। सीडीआर 3 क्षेत्र के जैव भौतिक गुणों जैसे लंबाई(तालिका 1)या हाइड्रोफोबिकिटी का भी विश्लेषण किया जा सकता है। महत्वपूर्ण बात यह है कि सीडीआर 3 लंबाई वितरण को विभिन्न प्रतिरक्षा-मध्यस्थता विकारों10,16, 17में बदल दियाजाताहै। उदाहरण के लिए, IL10R कमी वाले रोगियों में, रक्त-व्युत्पन्न टी कोशिकाएं, लेकिन बी कोशिकाएं नहीं, स्वस्थ नियंत्रण 7 की तुलना में कम सीडीआर3लंबाई और अंतर हाइड्रोफोबसिटी होती है।

Figure 1
चित्रा 1: प्रतिनिधि बायोएनालाइजर डेटा। आंतों के टीसीआरआर के नमूनों की प्रतिनिधि छवियां 400 बीपी पर वांछित चोटी के साथ इष्टतम परिणाम(ए)दिखाती हैं। 179bp और 114bp (चिह्नित *) पर अतिरिक्त चोटियों के साथ एक कम गुणवत्ता वाली पुस्तकालय(बी)का एक उदाहरण। सिरों पर देखी गई चोटियां इलेक्ट्रोफोरेसिस पट्टी के ऊपरी और निचले मार्कर हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: टी और बी सेल प्रतिरक्षा प्रदर्शनों की सूची का अवलोकन। टीसीआरआर और आईएच रक्त और आंतों के नमूनों के ट्रीमैप आरेख। प्रत्येक रंगीन वर्ग एक अलग क्लोन का प्रतिनिधित्व करता है, और आकार इसकी आवृत्ति से संबंधित है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: TCRο और IGH V-J उपयोग के प्रतिनिधि रेखांकन। एक प्रतिनिधि आंतों का नमूना जो टीसीआरआर(ए)या आईएच(बी)में प्रत्येक वी-जे संयोजन के लिए दृश्यों की कुल संख्या को दर्शाता है। डेटा डी उपयोग के लिए नहीं दिखाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

बी और टी लिम्फोसाइट्स के बहुतायत और कार्य में परिवर्तन अक्सर विभिन्न घातक18,पुराने भड़काऊ विकारों (जैसे, अल्सर कोलाइटिस और रूमेटॉयड गठिया)10,19और विभिन्न इम्यूनोडेफिसिएंसी17,20में सामने आते हैं। वर्तमान विधि टीसीआर और बीसीआर प्रदर्शनों के गहन दृष्टिकोण को सुविधाजनक बनाने के लिए एनजीएस का उपयोग करती है, जिससे टी और बी सेल क्लोनिटी में सूक्ष्म परिवर्तनों का पता लगाया जा सके, क्लोन का आदान-प्रदान, वी (डी) जे जीन उपयोग, और बी कोशिकाओं के मामले में दैहिक हाइपर-म्यूटेशन की डिग्री के बारे में जानकारी मिल सके ।

आंतों की बायोप्सी और ब्लड सैंपल के लिए डीएनए आइसोलेशन की विधि बताई गई। हालांकि, लाइसिस और डीएनए निष्कर्षण के संशोधनों के साथ, विधि को ट्यूमर, लिम्फ नोड्स, सिनोवियल तरल पदार्थ आदि जैसे अन्य ऊतकों पर लागू किया जा सकता है। पुस्तकालय की तैयारी के दौरान यह महत्वपूर्ण है कि विभिन्न प्राइमर सेटों को क्रॉस-दूषित न करें। मनका सफाई में, इनक्यूबेशन के हर समय चुंबक पर ट्यूब छोड़ने के लिए देखभाल की जानी चाहिए। कम सांद्रता के डीएनए नमूनों के लिए, स्टॉक को 10-20 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर केंद्रित किया जा सकता है। इसके अलावा, एम्प्लिकॉन को मोतियों से 20 माइक्रोन एल्यूशन बफर के रूप में कम किया जा सकता है।

टी और बी सेल संरचना के परिदृश्य की विशेषता के लिए अतीत में उपयोग की जाने वाली विभिन्न तकनीकों ने प्रतिरक्षा प्रदर्शनों की सूची का केवल एक सतही अवलोकन प्रदान किया। प्रतिरक्षा प्रदर्शनों की सूची विश्लेषण के लिए एनजीएस के सबसे बड़े फायदों में से एक अद्वितीय क्लोन की पहचान करने की क्षमता है, और फलस्वरूप उन्हें विभिन्न शारीरिक साइटों (जैसे, आंत बनाम रक्त बनाम लिम्फ नोड) या विभिन्न व्यक्तियों में ट्रैक करें। इस तरह की तकनीक के नैदानिक निहितार्थ महत्वपूर्ण हैं, और विभिन्न प्रतिरक्षा-मध्यस्थता रोगों या घातक21में टी या बी कोशिकाओं की भूमिका की समझ को बढ़ाने से परे जाते हैं। ऑन्कोलॉजी में, एनजी का उपयोग विशिष्ट क्लोनों की पहचान करने के लिए किया जाता है जो उन रोगियों के लिए भविष्य कहनेवाला बायोमार्कर हो सकते हैं, जिन्हें वर्तमान इम्यूनोथेरपी22,23, 24से सबसे अधिक लाभ होगा। ल्यूकेमिया में, एनजी का उपयोग अवशिष्ट ल्यूकेमिक क्लोन का पता लगाकर कैंसर कोशिकाओं के पूर्ण उन्मूलन की पुष्टि करने के लिए किया जाता है जो उपचार के बाद एक रोगी में रहते हैं25।

पूरे ऊतक या रक्त के नमूनों के प्रतिरक्षा प्रदर्शनों की सूची विश्लेषण की मुख्य सीमाओं में से एक कम लगातार आबादी में प्रदर्शनों की सूची परिवर्तन की पहचान करने में असमर्थता है । उदाहरण के लिए, यदि नियामक टी कोशिकाओं, जो कुल CD4+ टी कोशिकाओं के केवल कुछ प्रतिशत शामिल हैं, एक अद्वितीय प्रदर्शनों की सूची प्रोफ़ाइल व्यक्त करते हैं, यह अगर पूरे रक्त पर इन अध्ययनों का आयोजन याद किया जाएगा । इस समस्या को हल प्रतिरक्षा आबादी पर इन अध्ययनों का आयोजन करके संबोधित किया जा सकता है । वैकल्पिक रूप से, हाल के वर्षों में प्रौद्योगिकी टीसीआर या घाघ प्रदर्शनों की सूची प्रोफाइल26के साथ एकल सेल आरएनए डेटा के युग्मन की सुविधा के लिए विकसित की गई है । यह टी या बी कोशिकाओं की कार्यक्षमता का एक और स्तर प्रदान करता है, क्योंकि प्रत्येक क्लोन के ट्रांसक्रिप्शनल परिदृश्य की विशेषता हो सकती है। एक उदाहरण के रूप में, Zemmour et al. scRNAseq TCRseq का इस्तेमाल किया प्रदर्शित करने के लिए कि मानव रक्त से नियामक टी कोशिकाओं, एक सक्रिय उपआबादी है कि ट्रांसक्रिप्शन रूप से पारंपरिक टी कोशिकाओं27से संबंधित है के साथ व्यापक विषमता प्रदर्शित करते हैं । इसी तरह, हेपेटोसेलुलर कार्सिनोमा वाले रोगियों में इस विधि ने ट्यूमर में घुसपैठ करने वाले 11 अलग-अलग टी सेल सबसेट की पहचान की, प्रत्येक एक अद्वितीय ट्रांसक्रिप्शनल और प्रदर्शनों की सूची प्रोफ़ाइल28के साथ। इस तरह के अध्ययन विशेष रूप से दुर्लभ आबादी का अध्ययन करते समय सहायक होंगे, और विशिष्ट क्लोन की महत्वपूर्ण कार्यात्मक जानकारी प्रदान करेंगे।

प्रतिरक्षा प्रदर्शनों की सूची के NGS एक नया अनुसंधान क्षेत्र है कि अनुकूली प्रतिरक्षा समारोह और विभिन्न रोगों में टी और बी कोशिकाओं की भूमिका के बारे में उपंयास अंतर्दृष्टि प्रदान करता है । इसके अलावा, यह रोग से जुड़े क्लोनोटाइप को ट्रैक करके, विभिन्न विषयों में नैदानिक दुनिया में तेजी से प्रवेश कर रहा है। वर्तमान में प्रतिरक्षा प्रदर्शनों की सूची के लिए कई उपलब्ध किट हैं। ये इसी तरह की कार्यप्रणाली पर आधारित हैं, भले ही वे स्रोत के रूप में आरएनए या डीएनए का उपयोग करें। वे अंशांकन, पूर्वाग्रह सुधार और विश्लेषण उपकरणों के लिए इसी तरह की तकनीकों का उपयोग करते हैं; और इस प्रकार विशिष्ट मांगों के अनुसार ठीक से चुने जाने की आवश्यकता है। वर्तमान किट के महान फायदों में से एक यह है कि यह एक तैयार करने के लिए उपयोग और मानव प्रतिरक्षा प्रदर्शनों की सूची के लिए अनुकूलित है, अंशांकन के लिए की जरूरत के बिना । भविष्य में हम विभिन्न रोग के लिए बायोमार्कर के रूप में प्रदर्शनों की सूची सुविधाओं का उपयोग कर और अधिक अध्ययन देखेंगे, संभवतः भी इन क्लोन के खिलाफ लक्षित चिकित्सा के विकास के लिए अग्रणी । हमारा मानना है कि शोधकर्ताओं को विभिन्न विकारों में अनुकूली प्रतिरक्षा परिदृश्य का अध्ययन करने के लिए इन तरीकों को लागू करने पर विचार करना चाहिए ।

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Disclosures

सभी लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

कोई नहीं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-propanol Sigma I9516-500ML
1.7 mL micro-centrifuge tubes Axygen 8187631104051
15 mL centrifuge tubes Greiner 188261
Absolute ethanol Merck 1.08543.0250
Amplitaq Gold Thermo Fisher N8080241
AMPure XP Beads Beckman Coulter A63881
Heat block Bioer Not applicable
High Sensitivity D1000 Sample Buffer Agilent 5067-5603 For Tapestation
High Sensitivity D1000 ScreenTape Agilent 5067-5584 For Tapestation. Tubes sold seperately
Lymphotrack Assay kit Invivoscribe TRB: 70-91210039 IGH: 70-92250019 Each includes 24 indexes
MiSeq Reagent Kit v2 (500 cycle) Illumina MS-102-2003 Includes standard flow cell type and all reagents required
MiSeq Sequencer Illumina SY-410-1003
PCR strips 4titude 4ti-0792
Proteinase K Invitrogen EO0491
Qubit 4 Fluorometer Thermo Fisher Q33226
Qubit dsDNA HS Assay Kit Thermo Fisher Q32854 Includes buffer, dye, standards, and specialized tubes
Shaker Biosan Not applicable
Tapestation 2100 Bioanalyzer Agilent G2940CA
ultra pure water Bio-lab 7501
Wizard DNA isolation kit Promega A1120 Includes cell lysis solution, nuclei lysis solution, and protein precipitation buffer

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References

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Werner, L., Dor, C., Salamon, N., Nagar, M., Shouval, D. S. T and B Cell Receptor Immune Repertoire Analysis using Next-generation Sequencing. J. Vis. Exp. (167), e61792, doi:10.3791/61792 (2021).

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