Summary
Det nuvarande protokollet beskriver en metod för DNA-isolering från blodprover och tarmbiopsier, generering av TCRβ och IGH PCR-bibliotek för nästa generations sekvensering, prestanda för en NGS-körning och grundläggande dataanalys.
Abstract
Immunologiskt minne, kännetecknet för adaptiv immunitet, orkestreras av T och B lymfocyter. I omlopp och olika organ finns det miljarder unika T- och B-cellkloner, och var och en kan binda ett specifikt antigen, vilket leder till spridning, differentiering och / eller cytokinutsöndring. Den stora heterogeniteten i T- och B-celler genereras av slumpmässig rekombination av olika genetiska segment. Nästa generations sekvenseringsteknologier (NGS), som utvecklats under det senaste decenniet, möjliggör en oöverträffad djupgående syn på T- och B-cellreceptorns immunrepertoar. Studier i olika inflammatoriska tillstånd, immunbrist, infektioner och maligniteter visade markanta förändringar i klonalitet, genanvändning och biofysiska egenskaper hos immunrepertoaren, vilket ger viktiga insikter om rollen av adaptiva immunsvar vid olika sjukdomar.
Här tillhandahåller vi ett detaljerat protokoll för NGS av immunrepertoar av T- och B-celler från blod och vävnad. Vi presenterar en pipeline som utgäcks från DNA-isolering genom biblioteksförberedelse, sekvensering på NGS sequencer och slutar med grundläggande analyser. Denna metod möjliggör utforskning av specifika T- och B-celler på nukleotid- eller aminosyranivå, och kan därmed identifiera dynamiska förändringar i lymfocytpopulationer och mångfaldsparametrar i olika sjukdomar. Denna teknik går långsamt in i klinisk praxis och har potential att identifiera nya biomarkörer, riskstratifiering och precisionsmedicin.
Introduction
Det adaptiva immunsystemet, som består av T- och B-lymfocyter, använder immunologiskt minne för att känna igen ett tidigare påträffat antigen och initiera ett snabbt svar. Lymfocyter genereras i benmärgen och mognar i tymus (T-celler) eller benmärg (B-celler). Både T-cellsreceptorn (TCR) och B-cellreceptorn (BCR) visar unika konfigurationer som möjliggör igenkänning av specifika antigener. I homeostas cirkulerar T- och B-celler ständigt och undersöker biljonerna av olika peptider som presenteras på antigen-presenterande celler. TCR- eller BCR-ligatur av ett specifikt antigen med hög affinitet, tillsammans med lämplig kostimulering, leder till cellaktivering, vilket resulterar i cytokinutsöndring, klonurspansion och generering av antikroppar, när det gäller B-celler.
Det enorma utbudet av de olika T- eller B-cellerna kallas kollektivt immunrepertoar, vilket möjliggör erkännande av otaliga olika epitoper. För att generera en så stor repertoar sker en komplex process av slumpmässig montering av olika gensegment, vilket skapar nästan oändliga kombinationer av receptorer som kan binda unika antigener1. Denna process, kallad V(D)J rekombination, omfattar omorganiseringar av olika variabel (V), mångfald (D) och sammanfogning (J) gener, åtföljd av slumpmässiga borttagningar och införanden av nukleotider i korsningarna2.
Det adaptiva immunsystemets arkitektur har intresserat forskare inom olika områden i många årtionden. Tidigare användes Sanger sekvensering, kompletterande bestämma region 3 (CDR3) spektratypning och flöde cytometri för att karakterisera immun repertoaren, men gav låg upplösning. Under det senaste decenniet möjliggjorde framsteg i nästa generations sekvenseringsmetoder (NGS) djupgående inblick i egenskaperna och sammansättningen av en individs TCR- och BCR-repertoarer3,4. Dessa högupplösta system (HTS) sekvens och bearbeta miljontals omorganiserade TCR- eller BCR-produkter samtidigt och möjliggör en högupplöst analys av specifika T- och B-celler på nukleotid- eller aminosyranivå. NGS ger en ny strategi för att studera immunrepertoaren i både hälsa och sjukdom. Studier med HTS visade ändrade TCR och BCR repertoarer i autoimmunasjukdomar 5,primära immunbrister6,7,och maligniteter, såsom i akut myeloisk leukemi8. Med hjälp av NGS har vi och andra visat oligoklonal expansion av specifika T- och B-cellkloner, hos patienter med inflammatorisk tarmsjukdom (IBD), inklusive ulcerös kolit och Crohns sjukdom9,10,11,12,13,14. Sammantaget tyder studier från olika områden på att förändringar i repertoaren har en avgörande roll i patogenesen vid immunmedierade sjukdomar.
Det nuvarande protokollet beskriver en metod för isolering av DNA från intestinala tarmbiopsier och blod, generering av TCRβ och IGH PCR bibliotek för NGS och prestanda av sekvensering kör. Vi tillhandahåller också grundläggande steg i immunrepertoardataanalys. Detta protokoll kan också tillämpas för generering av TCRα-, TCRγ- och IGL-bibliotek. Metoden är också kompatibel med andra organ (t.ex. lymfkörtlar, tumörer, synovialvätska, fettvävnad etc.) så länge vävnadsspecifika matsmältningsprotokoll används.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denna studie godkändes av den institutionella granskningsnämnden vid Sheba Medical Center, och informerat skriftligt samtycke erhölls från alla deltagande ämnen.
1. DNA-isolering och kvantifiering
- Matsmältning och celllys av tarmbiopsier
- Hämta tarmbiopsier, antingen nyinsamlade eller de som lagras vid -20 °C eller -80 °C. Om du använder frysta tarmbiopsier, tina på is.
- Tillsätt 600 μL nuklei lysislösning till ett sterilt 1,7 ml mikrocentrifugrör, kylt på is.
- Placera biopsin i ett mikrocentrifugrör med lyslösning och inkubera vid 65 °C i 15-30 min.
- Tillsätt 17,5 μL 20 mg/ml proteinas K och inkubera över natten vid 55 °C, med skonsam skakning.
- Låt provet svalna till rumstemperatur i 5 minuter innan du fortsätter till steg 1.3.
- Celllys av helblod
- Få 3 ml helblod i EDTA- eller heparin- eller citratinnehållande rör.
- Häll försiktigt i bergröret tills det blandas noggrant och överför blod till ett sterilt 15 ml centrifugeringsrör som innehåller 9 ml celllyslösning. Vänd flera gånger under en inkubationstid på 10 minuter vid rumstemperatur.
- Centrifug vid 2 000 x g i 10 min vid rumstemperatur och kassera sedan så mycket supernatant som möjligt utan att störa den synliga vita pelleten. Cirka 50–100 μL restvätska kommer att finnas kvar.
- Virvelröret kraftigt i 15 s tills det är helt återanvänds. Tillsätt 3 ml nuklei lysislösning och rörledning flera gånger. Lösningen ska bli trögflytande.
- Protein nederbörd
- Tillsätt 200 μL proteinutfällningsbuffert till vävnaden, eller 1 ml till blodet. Virvel kraftigt i 20 s och inkubera på is i 5 min. Små proteinklumpar kan vara synliga efter virvel.
- Centrifugera vid 16 000 x g i 4 min. En stram pellet som innehåller fällda proteiner bör bildas.
- Överför försiktigt supernatant, utan att störa pelleten, till ett nytt 1,7 ml-rör.
OBS: Om pelleten inte är tät, överväg en annan centrifuge vid 16 000 x g i 4 min.
- DNA-utfällning och rehydrering
- Tillsätt 1 ml 2-propanol till röret som innehåller supernaten och blanda försiktigt genom invertering. DNA bör synliggöras som vit flytande substans.
- Centrifugera vid 16 000 x g i 1 minut. Ta bort supernaten helt med en pipett.
- Tillsätt 1 ml nylagad 70% etanol och invertera rör flera gånger. Centrifugera vid 16 000 x g i 1 minut vid rumstemperatur. Kassera supernatanten försiktigt.
- Upprepa steg 1.4.3.
- Placera öppet rör inverterat på rent absorberande papper i 10-15 min. Vänd om röret och bekräfta fullständig hydrering. Om det behövs, låt lufttorka i ytterligare 10-15 min.
OBS: Det är viktigt att pelleten torkar helt. - Tillsätt 50 μL ultrarent vatten (UPW). Vid behov kan DNA spädas ut mer efter kvantifiering.
- Inkubera i 1 timme på värmeblock vid 65 °C, för DNA-rehydrering.
- DNA-kvantifiering
OBS: DNA kvantifierades med hjälp av en fluorometer och utsedda reagenser, enligt specifikerade i materialförteckningen.- Bringa standarder till rumstemperatur och förbered satsen, inklusive 0,5 ml utsedda rör.
- Förbered buffert- och färgblandning i ett 15 ml-rör, beroende på antalet prover. Tillsätt 200 μL buffert och 1 μL färgämne per prov. Inkludera 2 prover för standarder. Det rekommenderas att beräkna ytterligare ett prov för att undvika att bufferten inte är tillräcklig.
- För de 2 standarderna, placera 190 μL av den ovan beredda blandningen i 0,5 ml-rör. Tillsätt 10 μL av standarden.
- För varje prov, placera 199 μL av den ovan beredda blandningen i 0,5 ml-rör. Tillsätt 1 μL av DNA:t.
- Läs proverna. Resultatet indikerar DNA-koncentration av provet.
- Om proverna är över gränsen, späd DNA 1:10 med UPW och upprepa läsning.
2. Biblioteksförberedelser
OBS: Det aktuella protokollet använder ett multiplex, PCR-baserat analyskit som är kompatibelt med NGS-sequencers. Satsen innehåller 24 olika index som var och en riktar sig tillbevarade regioner inom V β och Jβ regioner. Detta möjliggör en PCR-reaktion i ett steg och sammanslagning av olika prover. Se tabell med material för mer information.
- Förbered DNA-prover. Få 150 ng DNA och tillsätt UPW för totalt 5 μL.
OBS: Det är möjligt att använda mindre än 150 ng DNA för biblioteksberedning, med en minsta koncentration på 10 ng/μL. - Placera pipetter och spetsar i huva med UV-ljus i 15 minuter för att bryta ner kvarvarande DNA. Låt under tiden olika indexrör (för biblioteksberedning) och DNA-polymeras tina på is.
- I en biologisk huva, tillsätt 45 μL från de olika indexrören i PCR-rör. För att följa, tillsätt 0,2 μL DNA-polymeras och 5 μL DNA som bereds i steg 2.1 i PCR-rör.
- Kör PCR-reaktion med ett förinställt program, enligt tillverkarens instruktioner.
3. Ampliconrening och kvantifiering
- Använd magnetiska pärlor för avlägsnande av överskott av primers, nukleotider och enzymer.
- Värm pärlorna minst 30 min till rumstemperatur. Förbered tillräckligt med färsk 80% etanol för 400 μL per prov.
- Tillsätt 50 μL (IGH) eller 35 μL (TCRβ) av pärlorna till varje PCR-rör och blanda genom att pipetting 10 gånger. Inkubera 10 min vid rumstemperatur.
- Placera det blandade provet på magnetstativet i 5 minuter.
- Aspirera 95 μL (IGH) eller 80 μL (TCRβ) av den klara vätskan och kassera. Aspirera återstående vätska med en 10 μL spets.
- Tillsätt 200 μL 80 % etanol till varje prov. Inkubera 30 s. Aspirera 195 μL etanol och kassera. Aspirera återstående vätska med 10 μL spets.
- Upprepa steg 3.1.5. Öppna rörens lock och låt luften torka i 5 minuter.
- Omedelbart efter 5 min, ta bort från magnetstativ och tillsätt 25 μL elueringsbuffert (10 mM Tris-HCl, pH 8.0). Blanda genom pipetting tills de är homogena. Inkubera i rumstemperatur i 2 min.
- Placera rören på magnetstativet i 5 minuter. Överför 22 μL till ett nytt PCR-rör. Mät DNA-koncentrationen (steg 1.5).
- Amplicon kvantifiering
OBS: Det nuvarande protokollet använder en automatiserad elektroforesmaskin för kvalitetskontroll av DNA-koncentration, storlek och integritet. Se tabell med material för mer information.- Placera reagenser och screentape i rumstemperatur i minst 30 minuter.
- I ett nytt mikrocentrifugrör på 1,7 ml, gör du en utspädning på 1 ng/μL av DE DNA-prover som kvantifieras i steg 3.1.8 med UPW för en total volym på minst 3 μL.
- Vortex spädde ut DNA före användning. Placera 2 μL buffert tillsammans med 2 μL av det utspädda DNA:t i de förmärkta specialiserade PCR-remsorna (som finns i satsen) och placera locken. Placera på shaker i 1 min, följt av spinn ner PCR-remsor.
OBS: På grund av buffertens viskositet, se till att överskottsbufferten avlägsnas från spetsen innan du överför till provrören. - Placera i maskinen, skärmbandet och PCR-remsorna utan locken. Öppna locket på tippboxen inuti maskinen. Tilldela positionen med lämpliga etiketter. Starta maskinen.
OBS: Utgångsfetogrammet ska vara en enda topp med önskad storlek på ampliconerna(figur 1A). I prover av dålig kvalitet observeras ytterligare toppar (figur 1B), vilket indikerar dålig rensning eller bildning av primer dimers.
4. Nästa generations sekvensering
- Kvantifiering och sammanslagning av bibliotek
- Beräkna den slutliga DNA-koncentrationen i nM med hjälp av DNA-värde från steg 3.1.8 och storleken i baspar (bp) på produktens topp, erhållna från elektroforesmaskinens resultat (se figur 1).
- För varje prov, beräkna DNA-volymen för att ta för en slutlig koncentration på 4 nM, i en slutlig volym på 10-20 μL elueringsbuffert.
- Förbered en ny utspädningsblandning för varje prov och ta 2 μL från den till en ny poolblandning.
OBS: För prover som har mindre än 4 nM, tillsätt största möjliga mängd prov.
- NGS-körning av arkiv
OBS: Det aktuella protokollet använder en bänk-top sequencer plattform. Se tabell med material för mer information.- Förbered en ny lösning på 0,2 N NaOH. Tillsätt 10 μL 0,2 N NaOH till det utspädda biblioteket som bereds i steg 4.1.3. Tillsätt 5% PhiX till rör och virvel kort. Snurra ner röret för att säkerställa att all lösning har lagt sig till botten av röret.
- Inkubera i 5 minuter vid rumstemperatur för att denaturera det dubbelsträngade DNA: t. Tillsätt 980 μL förkyld buffert från satsen till röret som innehåller DNA och virvel kort.
- Placera det utspädda biblioteket på is och förbered biblioteket enligt följande. För en blandning på 17 pM, tillsätt 425 μL DNA från steg 4.2.2 och 575 μL buffert. Invertera biblioteket flera gånger och snurra ner. Ladda 600 μL av det slutliga biblioteket på den avsedda patronen och placera prover i maskinen.
- Starta körningen enligt programvaruinstruktionerna.
5. Sekvenseringsanalys
- Hämta sekvenserings mått från sequencer och kontrollera att sekvenserings data ligger inom följande intervall (specifika för det kit som används i det aktuella protokollet). Prover som inte uppfyller dessa kriterier kan komma att upprepas:
Klusterdensitet (densitet (K/mm2)): 945K – 1800K
Procent av läsar som passerar filter (kluster PF (%)): >90%
Kvalitetspoäng (%>=Q30): >85%
PhiX-justering (justerad %): 1,5% - 10%
PhiX-felfrekvens (%): <1,0%
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Här beskriver vi en metod för DNA-isolering från tarmvävnad och blod, förberedelse av bibliotek för NGS och grundläggande steg i en sekvenseringskörning för immunrepertoarsekvensering. Körningen kommer att generera fastq-filer, som kan konverteras ytterligare till fasta filer för användning i den internationella ImMunoGeneTics (IMGT)/HighV-QUEST-plattformen. Denna HTS utför och hanterar många analyser av tiotusentals omorganiserade TCRβ och IGH sekvenser, på nukleotid nivå15. IMGT/HighV-QUEST möjliggör analys av olika TCR och IGH repertoarer i både hälsa och sjukdom. Detta kan leda till identifiering av nya "sjukdomsspecifika" kloner, analys av klonexpansion och mångfaldsparametrar, avgränsning av differential V(D)J-användning, analys av somatiska hypermutationer och mer. IMGT/HighV-QUEST tillhandahåller CSV-filer, som innehåller specifika sekvenser och deras överflöd. Att använda genomiskt DNA som utgångsmaterial ger sekvensnummer som är representativa för cellnummer. Om den ursprungliga DNA-kvantiteten är lika kan alltså procentandelen T-celler i ett visst prov också beräknas.
Vi inkluderar en grundläggande analys från representativa, autologa blod och rektalkapslar prover av en patient med IL10 receptor brist och historia av allvarliga infantil-inset IBD, som härrör från en skadliga IL10RA mutation. Prover analyserades för både TCRβ och IGH repertoar. Intestinala TCRβ prov gav totalt 12,450 sekvenser, varav 9,050 sekvenser var unika. Blodprovet hade totalt 54 880 sekvenser, varav 35 110 var unika. I intestinala IGH prov erhölls totalt 49,070 sekvenser, varav 23,670 var unika. I blodprovet erhölls totalt 13 710 sekvenser, varav 13 540 var unika. Alla kloner kan identifieras genom sin unika sekvens både på nukleotid- eller aminosyranivå. Dessa sekvenser kan jämföras mellan olika patienter, på jakt efter delade kloner eller hos samma patient mellan olika anatomiska platser (t.ex. blod kontra tarmar). Vi presenterar för vart och ett av proverna de 5 vanligaste klonerna(tabell 1).
För att kvantifiera graden av klonurför expansion kan olika index användas, inklusive Shannons H, Gini-Simpson, entropi och klonalitet. Som ett exempel, Shannons H, som tar hänsyn till antalet unika sekvenser (rikedom av repertoaren) och hur jämnt de fördelas konstaterades minskas i patientens intestinala IGH vs. blod (8,3 vs. 9,5), vilket tyder på klonurmlig expansion av B-celler i den inflammerade tarmen.
För en bred översikt över repertoaren genererades Treemap-bilder (www.treemap.com) (figur 2). Varje färgad kvadrat representerar en annan klon, och storleken korrelerar med dess frekvens. Dessa Treemap bilder visar klonurlig expansion i intestinala IGH repertoaren jämfört med blodet. I TCRβ repertoaren observeras däremot markant klonurförökning i blodet, i jämförelse med autolog tarm.
På gennivå ger NGS information om V- D- och J- användning på nivån för antingen gen, familj eller allel, som visas i tabell 1. Dessutom kan specifika V(D)J-kombinationer härledas från data för TCRβ- och IGH-repertoarer(figur 3A,B),som kan avslöja olika genanvändningsmönster under olika förhållanden. Biofysiska egenskaper i CDR3-regionen, såsom längd (tabell 1) eller hydrofobi kan också analyseras. Viktigt är att CDR3-längdfördelningen ändras vid olika immunmedieradesjukdomar 10,16,17. Till exempel, hos IL10R-bristfälliga patienter, blodbaserade T-celler, men inte B-celler, har kortare CDR3-längd och differentiell hydrofobi, i jämförelse med friska kontroller7.
Figur 1: Representativa bioanalysatorns uppgifter. Representativa bilder av intestinala TCRβ prover som visar optimala resultat (A) med önskad topp på 400 bp. Ett exempel på ett bibliotek av låg kvalitet (B) med ytterligare toppar på 179bp och 114bp (markerat *). Toppar som ses i ändarna är övre och nedre markörer för elektroforesremsan. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2: Översikt över T- och B-cellsrepertoaren. Treemap diagram över TCRβ och IGH blod och intestinala prover. Varje färgad kvadrat representerar en annan klon, och storleken korrelerar med dess frekvens. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3: Representativa grafer över användningen av TCRβ och IGH V-J. Ett representativt tarmprov som visar det totala antalet sekvenser för varje V-J kombination i TCRβ (A) eller IGH (B). Data visas inte för D-användning. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Förändringar i överflöd och funktion av B och T lymfocyter påträffas ofta i olika maligniteter18,kronisk inflammatoriska störningar (t.ex. ulcerös kolit och reumatoid artrit)10,19, och i olika immunbrister17,20. Den nuvarande metoden använder NGS för att underlätta en djupgående vy av TCR- och BCR-repertoarer, vilket möjliggör upptäckt av subtila förändringar i T- och B-cellens klonalitet, delning av kloner, V(D)J-genanvändning och information om graden av somatiska hypermutationer när det gäller B-celler.
Metoden för DNA-isolering beskrevs för intestinala tarmbiopsier och blodprover. Men med modifieringar av lys och DNA-extraktion kan metoden tillämpas på andra vävnader som tumörer, lymfkörtlar, synovialvätska etc. Det är viktigt under biblioteksberedningen att inte korskontaminera de olika primeruppsättningarna. Vid rensning av pärlor bör man vara noga med att lämna rör på magneten hela tiden för inkubation. För DNA-prover med låga koncentrationer kan lagren koncentreras till 65 °C i 10-20 minuter. Dessutom kan ampliconer elueras från pärlor i så lite som 20 μL elueringsbuffert.
Olika tekniker som användes tidigare för att karakterisera landskapet av T- och B-cellsammansättning gav endast en ytlig översikt över immunrepertoaren. En av de största fördelarna med NGS för immunrepertoaranalys är förmågan att identifiera unika kloner och följaktligen spåra dem på olika anatomiska platser (t.ex. tarm kontra blod kontra lymfkörtel) eller hos olika individer. De kliniska konsekvenserna av en sådan teknik är betydande och går utöver att förbättra förståelsen av T- eller B-cellers roll i olika immunmedmerade sjukdomar eller maligniteter21. Inom onkologi används NGS för att identifiera specifika kloner som kan vara prediktiva biomarkörer för de patienter som sannolikt kommer att dra nytta av nuvarande immunterapier22,23,24. Vid leukemi används NGS för att bekräfta fullständig utrotning av cancerceller genom påvisande av kvarvarande leukemiska kloner som finns kvar hos en patient efter behandling25.
En av de viktigaste begränsningarna i immunrepertoaranalys av helvävnad eller blodprover är oförmågan att identifiera repertoarförändringar i mindre frekventa populationer. Om till exempel regulatoriska T-celler, som endast består av några procent av de totala CD4+ T-cellerna, uttrycker en unik repertoarprofil, skulle detta missas om dessa studier på helblod utfördes. Detta problem skulle kunna åtgärdas genom att genomföra dessa studier på sorterade immunpopulationer. Alternativt, under de senaste åren teknik har utvecklats för att underlätta koppling av encelliga RNA-data med TCR eller IGH repertoarprofiler26. Detta ger en annan funktionalitetsnivå för T- eller B-cellerna, eftersom transkriptionslandskapet för varje klon kan karakteriseras. Som ett exempel använde Zemmour et al. scRNAseq TCRseq för att visa att regulatoriska T-celler från mänskligt blod, visar bred heterogenitet med en aktiverad subpopulation som är transkriptionellt relaterad till konventionella T-celler27. På samma sätt, hos patienter med hepatocellulär carcinom identifierade denna metod 11 distinkta T-cellsundergrupper som infiltrerar tumören, var och en med en unik transkriptionell och repertoar profil28. Studier som dessa kommer att vara till hjälp, särskilt när man studerar sällsynta populationer, och kommer att ge viktig funktionell information om specifika kloner.
NGS of immune repertoar är ett nytt forskningsområde som ger nya insikter om adaptiv immunfunktion och T- och B-cellers roll i olika sjukdomar. Dessutom går det snabbt in i den kliniska världen i olika discipliner, genom att spåra sjukdomsrelaterade clonotyper. Det finns för närvarande flera tillgängliga kit för immunrepertoar. Dessa är baserade på liknande metodik, oavsett om de använder RNA eller DNA som källa. De använder liknande tekniker för kalibrering, biaskorrigeringar och analysverktyg; och måste därför väljas korrekt enligt specifika krav. En av de stora fördelarna med det nuvarande kitet är att det är en färdig att använda och optimerad för mänsklig immunrepertoar, utan behov av kalibrering. I framtiden kommer vi att se fler studier med repertoarfunktioner som biomarkörer för olika sjukdomar, vilket potentiellt också leder till utveckling av riktade terapier mot dessa kloner. Vi anser att forskare bör överväga att tillämpa dessa metoder för att studera det adaptiva immunlandskapet vid olika sjukdomar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alla författare har inget att avslöja.
Acknowledgments
ingen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-propanol | Sigma | I9516-500ML | |
| 1.7 mL micro-centrifuge tubes | Axygen | 8187631104051 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Greiner | 188261 | |
| Absolute ethanol | Merck | 1.08543.0250 | |
| Amplitaq Gold | Thermo Fisher | N8080241 | |
| AMPure XP Beads | Beckman Coulter | A63881 | |
| Heat block | Bioer | Not applicable | |
| High Sensitivity D1000 Sample Buffer | Agilent | 5067-5603 | For Tapestation |
| High Sensitivity D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5584 | For Tapestation. Tubes sold seperately |
| Lymphotrack Assay kit | Invivoscribe | TRB: 70-91210039 IGH: 70-92250019 | Each includes 24 indexes |
| MiSeq Reagent Kit v2 (500 cycle) | Illumina | MS-102-2003 | Includes standard flow cell type and all reagents required |
| MiSeq Sequencer | Illumina | SY-410-1003 | |
| PCR strips | 4titude | 4ti-0792 | |
| Proteinase K | Invitrogen | EO0491 | |
| Qubit 4 Fluorometer | Thermo Fisher | Q33226 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher | Q32854 | Includes buffer, dye, standards, and specialized tubes |
| Shaker | Biosan | Not applicable | |
| Tapestation 2100 Bioanalyzer | Agilent | G2940CA | |
| ultra pure water | Bio-lab | 7501 | |
| Wizard DNA isolation kit | Promega | A1120 | Includes cell lysis solution, nuclei lysis solution, and protein precipitation buffer |
References
- Bassing, C. H., Swat, W., Alt, F. W. The mechanism and regulation of chromosomal V(D)J recombination. Cell. 109, Suppl 45-55 (2002).
- Roth, D. B. V(D)J Recombination: Mechanism, Errors, and Fidelity. Microbiology Spectrum. 2 (6), (2014).
- Heather, J. M., Ismail, M., Oakes, T., Chain, B. High-throughput sequencing of the T-cell receptor repertoire: pitfalls and opportunities. Brief Bioinformatics. 19 (4), 554-565 (2018).
- Pabst, O., Hazanov, H., Mehr, R. Old questions, new tools: does next-generation sequencing hold the key to unraveling intestinal B-cell responses. Mucosal Immunology. 8 (1), 29-37 (2015).
- Bashford-Rogers, R. J. M., Smith, K. G. C., Thomas, D. C. Antibody repertoire analysis in polygenic autoimmune diseases. Immunology. 155 (1), 3-17 (2018).
- Lee, Y. N., et al. Characterization of T and B cell repertoire diversity in patients with RAG deficiency. Science Immunology. 1 (6), (2016).
- Werner, L., et al. Alterations in T and B Cell Receptor Repertoires Patterns in Patients With IL10 Signaling Defects and History of Infantile-Onset IBD. Frontiers Immunology. 11, 109 (2020).
- Zhang, J., et al. Immune receptor repertoires in pediatric and adult acute myeloid leukemia. Genome Medicine. 11 (1), 73 (2019).
- Chapman, C. G., et al. Characterization of T-cell Receptor Repertoire in Inflamed Tissues of Patients with Crohn's Disease Through Deep Sequencing. Inflammatory Bowel Diseases. 22 (6), 1275-1285 (2016).
- Werner, L., et al. Altered T cell receptor beta repertoire patterns in pediatric ulcerative colitis. Clinical and Experimental Immunology. 196 (1), 1-11 (2019).
- Bashford-Rogers, R. J. M., et al. Analysis of the B cell receptor repertoire in six immune-mediated diseases. Nature. 574 (7776), 122-126 (2019).
- Wu, J., et al. Expanded TCRbeta CDR3 clonotypes distinguish Crohn's disease and ulcerative colitis patients. Mucosal Immunology. 11 (5), 1487-1495 (2018).
- Rosati, E., et al. Identification of disease-associated traits and clonotypes in the T-cell receptor repertoire of monozygotic twins affected by inflammatory bowel diseases. Journam of Crohn's and Colitis. , (2019).
- Allez, M., et al. T cell clonal expansions in ileal Crohn's disease are associated with smoking behaviour and postoperative recurrence. Gut. 68 (11), 1961-1970 (2019).
- Li, S., et al. IMGT/HighV QUEST paradigm for T cell receptor IMGT clonotype diversity and next generation repertoire immunoprofiling. Nature Communications. 4, 2333 (2013).
- H, I. J., et al. Strategies for B-cell receptor repertoire analysis in primary immunodeficiencies: from severe combined immunodeficiency to common variable immunodeficiency. Frontiers Immunology. 6, 157 (2015).
- Ghraichy, M., Galson, J. D., Kelly, D. F., Truck, J. B-cell receptor repertoire sequencing in patients with primary immunodeficiency: a review. Immunology. 153 (2), 145-160 (2018).
- Zhuang, Y., et al. Application of immune repertoire sequencing in cancer immunotherapy. International Immunopharmacology. 74, 105688 (2019).
- Liu, X., et al. T cell receptor beta repertoires as novel diagnostic markers for systemic lupus erythematosus and rheumatoid arthritis. Annual Rheumatic Diseases. 78 (8), 1070-1078 (2019).
- Wong, G. K., Heather, J. M., Barmettler, S., Cobbold, M. Immune dysregulation in immunodeficiency disorders: The role of T-cell receptor sequencing. Journal of Autoimmunity. 80, 1-9 (2017).
- Delhalle, S., Bode, S. F. N., Balling, R., Ollert, M., He, F. Q. A roadmap towards personalized immunology. NPJ System Biology and Applications. 4, 9 (2018).
- Laubli, H., et al. The T cell repertoire in tumors overlaps with pulmonary inflammatory lesions in patients treated with checkpoint inhibitors. Oncoimmunology. 7 (2), 1386962 (2018).
- Hogan, S. A., et al. Peripheral Blood TCR Repertoire Profiling May Facilitate Patient Stratification for Immunotherapy against Melanoma. Cancer Immunology Research. 7 (1), 77-85 (2019).
- Aversa, I., Malanga, D., Fiume, G., Palmieri, C. Molecular T-Cell Repertoire Analysis as Source of Prognostic and Predictive Biomarkers for Checkpoint Blockade Immunotherapy. International Journal of Molecular Sciences. 21 (7), (2020).
- Hirsch, P., et al. Precision and prognostic value of clone-specific minimal residual disease in acute myeloid leukemia. Haematologica. 102 (7), 1227-1237 (2017).
- De Simone, M., Rossetti, G., Pagani, M. Single Cell T Cell Receptor Sequencing: Techniques and Future Challenges. Frontiers Immunology. 9, 1638 (2018).
- Zemmour, D., et al. Single-cell gene expression reveals a landscape of regulatory T cell phenotypes shaped by the TCR. Nature Immunology. 19 (3), 291-301 (2018).
- Zheng, C., et al. Landscape of Infiltrating T Cells in Liver Cancer Revealed by Single-Cell Sequencing. Cell. 169 (7), 1342-1356 (2017).
