Summary
הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה לבידוד DNA מדגימות דם וביופסיות מעיים, יצירת ספריות TCRβ ו- IGH PCR לריצוף הדור הבא, ביצועים של ריצת NGS וניתוח נתונים בסיסי.
Abstract
זיכרון אימונולוגי, סימן ההיכר של חסינות אדפטיבית, מתוזמר על ידי לימפוציטים T ו- B. במחזור ובאיברים שונים, ישנם מיליארדי שיבוטים ייחודיים של תאי T ו- B, וכל אחד מהם יכול לקשור אנטיגן ספציפי, המוביל לשגשוג, בידול ו/או הפרשת ציטוקינים. ההטרוגניות העצומה בתאי T ו- B נוצרת על ידי שילוב אקראי של מקטעים גנטיים שונים. טכנולוגיות רצף הדור הבא (NGS), שפותחו בעשור האחרון, מאפשרות מבט מעמיק וחסר תקדים על הרפרטואר החיסוני של קולטן תאי T ו-B. מחקרים במצבים דלקתיים שונים, כשל חיסוני, זיהומים וממאירות הראו שינויים ניכרים בשיבוטיות, בשימוש בגנים ובתכונות ביופיזיות של רפרטואר מערכת החיסון, וסיפקו תובנות חשובות על תפקידן של תגובות חיסוניות מסתגלות בהפרעות שונות.
כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט עבור NGS של רפרטואר המערכת החיסונית של תאי T ו- B מן הדם והרקמות. אנו מציגים צינור החל מבידוד DNA דרך הכנת הספרייה, רצף על רצף NGS וכלה בניתוחים בסיסיים. שיטה זו מאפשרת לחקור תאי T ו- B ספציפיים ברמת הנוקלאוטידים או חומצות האמינו, ובכך לזהות שינויים דינמיים באוכלוסיות לימפוציטים ופרמטרים של גיוון במחלות שונות. טכניקה זו נכנסת לאט לפרקטיקה הקלינית ויש לה פוטנציאל לזיהוי סמנים ביולוגיים חדשניים, ריבוד סיכונים ורפואה מדויקת.
Introduction
המערכת החיסונית האדפטיבית, המורכבת מלטמפוציטים T ו- B, משתמשת בזיכרון אימונולוגי כדי לזהות אנטיגן שנתקל בעבר וליזום תגובה מהירה. לימפוציטים נוצרים במח העצם ומתבגרים בתימוס (תאי T) או במח העצם (תאי B). הן קולטן תאי T (TCR) והן קולטן תא B (BCR) מציגים תצורות ייחודיות המאפשרות זיהוי של אנטיגנים ספציפיים. בתאי הומאוסטזיס, תאי T ו- B מסתובבים כל הזמן וסוקרים את טריליוני הפפטידים השונים המוצגים על תאים המציגים אנטיגן. TCR או קשירת BCR של אנטיגן מסוים עם זיקה גבוהה, יחד עם גירוי משותף מתאים, מוביל להפעלת תאים, וכתוצאה מכך הפרשת ציטוקינים, הרחבת שיבוטים ויצירת נוגדנים, במקרה של תאי B.
המערך העצום של תאי T או B השונים נקרא באופן קולקטיבי רפרטואר חיסוני, המאפשר הכרה באינספור אפיטופים שונים. על מנת ליצור רפרטואר כה עצום, מתרחש תהליך מורכב של הרכבה אקראית של מקטעי גנים שונים, ויוצר שילובים כמעט אינסופיים של קולטנים שיכולים לקשור אנטיגנים ייחודיים1. תהליך זה, הנקרא V(D)J recombination, כולל סידורים מחדש של משתנים שונים (V), גיוון (D) והצטרפות (J) גנים, מלווה מחיקות אקראיות והכנסות של נוקלאוטידים בצמתים2.
הארכיטקטורה של מערכת החיסון האדפטיבית עניינה מדענים בתחומים שונים במשך עשורים רבים. בעבר, רצף סנגר, קביעת אזור משלים 3 (CDR3) ספקטרtyping, ואת cytometry זרימה שימשו כדי לאפיין את הרפרטואר החיסוני, אבל סיפק רזולוציה נמוכה. בעשור האחרון, ההתקדמות בשיטות רצף הדור הבא (NGS) אפשרה תובנה מעמיקה על המאפיינים וההרכב של רפרטואר TCR ו- BCR של הפרט3,4. מערכות תפוקה גבוהה אלה (HTS) רצף ומעבד מיליוני מוצרי TCR או BCR מסודרים מחדש בו זמנית ולאפשר ניתוח ברזולוציה גבוהה של תאי T ו- B ספציפיים ברמת נוקלאוטידים או חומצת אמינו. NGS מספק אסטרטגיה חדשה לחקר הרפרטואר החיסוני הן בבריאות והן במחלות. מחקרים העושים שימוש ב- HTS הדגימו רפרטואר TCR ו- BCR שונה במחלות אוטואימוניות5, כשל חיסוני ראשוני6,7, וממאירות, כגון לוקמיה מיאלואידית חריפה8. באמצעות NGS, אנו ואחרים הראו התרחבות אוליגוקלונית של שיבוטים ספציפיים של תאי T ו- B, בחולים עם מחלות מעי דלקתיות (IBD), כולל קוליטיס כיבית ומחלת קרוהן9,10,11,12,13,14. בסך הכל, מחקרים מתחומים שונים מראים שלשינויים ברפרטואר יש תפקיד מכריע בפתוגנזה של הפרעות בתיווך חיסוני.
הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה לבידוד דנ"א מביופסיות מעיים ודם, יצירת ספריות TCRβ ו- IGH PCR עבור NGS וביצוע ריצוף ריצה. אנו מספקים גם שלבים בסיסיים בניתוח נתונים של רפרטואר חיסוני. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם עבור הדור של ספריות TCRα, TCRγ, ו IGL גם כן. השיטה תואמת גם לאיברים אחרים (למשל, בלוטות לימפה, גידולים, נוזל סינוביאלי, רקמת שומן וכו ') כל עוד נעשה שימוש בפרוטוקולי עיכול ספציפיים לרקמות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
מחקר זה אושר על ידי ועדת הביקורת המוסדית במרכז הרפואי שיבא, והושגה הסכמה מדעת בכתב מכל הנושאים המשתתפים.
1. בידוד וכימות DNA
- עיכול ותא תמוגה של ביופסיות מעיים
- יש לאחזר ביופסיות מעיים, שנאספו זה עתה או כאלה המאוחסנות ב-20°C או -80 °C (60 °F). אם משתמשים בביופסיות קפואות, מפשירים על קרח.
- הוסף 600 μL של תמיסת תמוגה גרעינית לצינור מיקרו צנטריפוגה סטרילי 1.7 מ"ל, מקורר על קרח.
- מניחים ביופסיה לתוך צינור microcentrifuge עם פתרון תמיסת תמוגה דגירה ב 65 °C (65 °F) במשך 15-30 דקות.
- יש להוסיף 17.5 מיקרו-ל' של 20 מ"ג/מ"ל חלבון K ולהדגיר במשך הלילה ב-55°C, עם רעידות עדינות.
- אפשר מדגם להתקרר לטמפרטורת החדר במשך 5 דקות לפני שתמשיך לשלב 1.3.
- תמוגה תאית של דם שלם
- השג 3 מ"ל של דם שלם בצינור המכיל EDTA, הפרין או ציטראט.
- בעדינות צינור רוק עד מעורבב ביסודיות, ולהעביר דם צינור סטרילי 15 מ"ל צנטריפוגה המכיל 9 מ"ל של פתרון תמוגה התא. הפוך מספר פעמים במהלך תקופת דגירה של 10 דקות בטמפרטורת החדר.
- צנטריפוגה ב 2,000 x g במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן להשליך כמה שיותר supernatant ככל האפשר מבלי להפריע גלולה לבנה גלוי. כ 50-100 μL של שאריות נוזל יישאר.
- צינור וורטקס במרץ במשך 15 שניות עד לשימוש חוזר לחלוטין. הוסף 3 מ"ל של תמיסת תמוגה גרעינית ו pipet מספר פעמים. הפתרון צריך להיות צמיג.
- משקעים בחלבון
- הוסף 200 μL של מאגר משקעים חלבון לרקמה, או 1 מ"ל לדם. וורטקס במרץ במשך 20 s ודגר על קרח במשך 5 דקות. גושי חלבון קטנים עשויים להיות גלויים לאחר מערבולת.
- צנטריפוגה ב 16,000 x g במשך 4 דקות. גלולה הדוקה המכילה חלבונים מזורזים צריכה להיווצר.
- בזהירות להעביר supernatant, מבלי להפריע גלולה, לצינור חדש 1.7 מ"ל.
הערה: אם גלולה אינה הדוקה, לשקול צנטריפוגה אחרת ב 16,000 x g במשך 4 דקות.
- משקעים והתייבשות DNA
- מוסיפים 1 מ"ל של 2-propanol לצינור המכיל את supernatant, בעדינות לערבב על ידי היפוך. הדנ"א צריך להיות גלוי כחומר צף לבן.
- צנטריפוגה ב 16,000 x g במשך 1 דקות. הסר את supernatant לחלוטין באמצעות פיפטה.
- מוסיפים 1 מ"ל של 70% אתנול טרי, והפך צינור מספר פעמים. צנטריפוגה ב 16,000 x g במשך 1 דקות בטמפרטורת החדר. השלך על טבעי בזהירות.
- חזור על שלב 1.4.3.
- מניחים צינור פתוח הפוך על נייר סופג נקי במשך 10-15 דקות. הפוך מחדש את הצינור ואשר הידרציה מלאה. במידת הצורך, השאירו לייבוש אוויר למשך 10-15 דקות נוספות.
הערה: זה חיוני עבור גלולה להתייבש לחלוטין. - הוסף 50 μL של מים טהורים במיוחד (UPW). במידת הצורך, ניתן לדלל את הדנ"א יותר לאחר כימות.
- דגירה במשך 1 שעות על בלוק חום ב 65 מעלות צלזיוס, עבור התייבשות DNA.
- כימות דנ"א
הערה: הדנ"א כומת באמצעות מד פלואורומטר וריאנטים ייעודיים, כפי שצוין בטבלת החומרים.- הביאו תקנים לטמפרטורת החדר והכינו את הערכה, כולל צינורות ייעודיים של 0.5 מ"ל.
- מכינים תערובת חיץ וצבע בצינור של 15 מ"ל, לפי מספר הדגימות. הוסף 200 μL של חוצץ ו 1 μL של צבע לכל מדגם. כלול 2 דגימות עבור תקנים. מומלץ לחשב מדגם נוסף כדי למנוע שהמאגר לא יספיק.
- עבור 2 סטנדרטים, מקום 190 μL של תערובת מעל מוכן בצינור 0.5 מ"ל. הוסף 10 μL של התקן.
- עבור כל מדגם, מקום 199 μL של תערובת שהוכנה לעיל בצינור 0.5 מ"ל. הוסף μL אחד של ה-DNA.
- קרא את הדגימות. התוצאה מצביעה על ריכוז הדנ"א של הדגימה.
- אם הדגימות נמצאות מעבר לגבול, לדלל את ה-DNA 1:10 עם UPW, ולחזור לקרוא.
2. הכנת הספרייה
הערה: הפרוטוקול הנוכחי משתמש בערכת מבחנים מבוססת PCR מרובת-פיקסלים התואמת לרצפי NGS. הערכה מכילה 24 מדדים שונים שכל אחד מהם מכוון לאזורים שמורים בתוךV β ובאזורי Jβ. פעולה זו מאפשרת תגובת PCR חד-שלבית ואיגום של דגימות שונות. עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים.
- הכינו דגימות דנ"א. להשיג 150 ng של DNA ולהוסיף UPW עבור סך של 5 μL.
הערה: ניתן להשתמש פחות מ 150 ng של DNA להכנת הספרייה, עם ריכוז מינימלי של 10 ng / μL. - מניחים פיפטות וטיפים במכסה המנוע עם אור UV במשך 15 דקות כדי לשבור את ה-DNA שיורית. בינתיים, לאפשר צינורות אינדקס שונים (להכנת הספרייה) ופולימראז DNA להפשיר על קרח.
- במכסה המנוע הביולוגי, להוסיף 45 μL מצינורות אינדקס שונים לתוך צינורות PCR. כדי לעקוב, להוסיף 0.2 μL של פולימראז DNA ו 5 μL של DNA מוכן בשלב 2.1 לתוך צינורות PCR.
- הפעל תגובת PCR באמצעות תוכנית מוגדרת מראש, בהתאם להוראות היצרן.
3. טיהור וכימות הגברה
- השתמש חרוזים מגנטיים להסרת פרייומרים עודפים, נוקלאוטידים, ואנזימים.
- מחממים את החרוזים לפחות 30 דקות לטמפרטורת החדר. הכן מספיק טרי 80% אתנול עבור 400 μL לכל מדגם.
- הוסף 50 μL (IGH) או 35 μL (TCRβ) של החרוזים לכל צינור PCR ומערבבים על ידי pipetting 10 פעמים. דגירה 10 דקות בטמפרטורת החדר.
- מניחים את המדגם המעורב על המעמד המגנטי במשך 5 דקות.
- לשאוף 95 μL (IGH) או 80 μL (TCRβ) של נוזל שקוף להשליך. לשאוף נוזל שנותר באמצעות קצה μL 10.
- הוסף 200 μL של 80% אתנול לכל מדגם. דגירה 30 שניות. לשאוף 195 μL של אתנול ולהשליך. לשאוף נוזל שנותר באמצעות קצה μL 10.
- חזור על שלב 3.1.5. פותחים את כובעי הצינורות ומניחים לאוויר להתייבש במשך 5 דקות.
- מיד לאחר 5 דקות, להסיר מעמד מגנטי ולהוסיף 25 μL של מאגר elution (10 mM Tris-HCl, pH 8.0). מערבבים על ידי pipetting עד הומוגני. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 2 דקות.
- מניחים את הצינורות על המעמד המגנטי במשך 5 דקות. העבר 22 μL לצינור PCR חדש. למדוד את ריכוז ה-DNA (שלב 1.5).
- כימות אמפרליקון
הערה: הפרוטוקול הנוכחי משתמש במכונת אלקטרופורזה אוטומטית לבקרת איכות של ריכוז DNA, גודל ושלמות. עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים.- מניחים ריאגנטים וקלטת מסך בטמפרטורת החדר לפחות 30 דקות.
- בצינור מיקרו-צנטריפוגה חדש של 1.7 מ"ל, בצע דילול של 1 ng/μL של דגימות הדנ"א שכומתו בשלב 3.1.8 עם UPW בנפח כולל של לפחות 3 μL.
- דנ"א מדולל של וורטקס לפני השימוש. מניחים 2 μL של חוצץ, יחד עם 2 μL של ה- DNA מדולל ברצועות PCR מיוחדות שכותרתו מראש (מסופק בערכה) ומניחים את הכובעים. מניחים על שייקר במשך דקה, ואחריו ספין למטה של רצועות PCR.
הערה: בשל צמיגות המאגר, ודא שהמאגר העודף מוסר מהקצה לפני ההעברה לצינורות המדגם. - במקום במכונה, רצועת המסך וה- PCR ללא הכובעים. פתח את המכסה של תיבת קצה בתוך המכונה. הקצה את המשרה עם התוויות המתאימות. תפעיל את המכונה.
הערה: היסטוגרמה הפלט צריכה להיות שיא יחיד בגודל הרצוי של האמפליקונים (איור 1A). בדגימות באיכות ירודה, יצפו פסגות נוספות (איור 1B), המצביעות על ניקוי חרוזים לקוי או היווצרות של דימרים ראשוניים.
4. רצף הדור הבא
- כימות ואיגום של ספריה
- חשב את ריכוז הדנ"א הסופי ב- nM, באמצעות ערך DNA משלב 3.1.8, ואת הגודל בזוגות בסיסים (bp) של שיא המוצר, המתקבל מתוצאות מכונת אלקטרופורזה (ראה איור 1).
- עבור כל דגימה, לחשב את נפח ה-DNA לקחת עבור ריכוז סופי של 4 nM, בנפח הסופי של 10-20 מאגר elution μL.
- הכינו תערובת דילול חדשה לכל דגימה וקחו ממנה 2 μL לתערובת בריכה חדשה.
הערה: עבור דגימות הכוללות פחות מ- 4 ננומטר, הוסף את כמות הדגימה המרבית האפשרית.
- הפעלת ספריה של NGS
הערה: הפרוטוקול הנוכחי משתמש בפלטפורמת רצף ספסל עליון. עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים.- הכינו פתרון טרי של 0.2 N NaOH. הוסף 10 μL של 0.2 N NaOH לספריה מדוללת מוכן בשלב 4.1.3. הוסף 5% PhiX לצינור ומערבולת בקצרה. סובבו את הצינור כדי להבטיח שכל הפתרון התיישב בתחתית הצינור.
- דגירה במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי denature את ה-DNA תקוע כפול. הוסף 980 μL של חיץ מצונן מראש מן הערכה לצינור המכיל DNA ומערבולת בקצרה.
- מניחים את הספרייה המדוללת על הקרח, ומכינים את הספרייה כדלקמן. לקבלת שילוב של 17 pM, להוסיף 425 μL של DNA משלב 4.2.2 ו 575 μL של חוצץ. הפוך את הספריה מספר פעמים וסובב למטה. טען 600 μL של הספריה הסופית על המחסנית המיועדת, והנח דגימות במכונה.
- הפעל את ההפעלה בהתאם להוראות התוכנה.
5. ניתוח רצף
- הורד מדדי רצף מרצף וודא כי נתוני רצף נמצאים בטווחים הבאים (ספציפיים לערכה המשמשת בפרוטוקול הנוכחי). דוגמאות שאינן עומדות בקריטריונים אלה כפופות להפעלה חוזרת:
צפיפות אשכול (צפיפות (K/mm2)): 945K – 1800K
אחוז הקריאות העוברות מסנן (אשכולות PF (%)): >90%
ציוני איכות (%>=Q30): >85%
יישור PhiX (מיושר%): 1.5% - 10%
שיעור שגיאות PhiX (%): <1.0%
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בזאת, אנו מתארים שיטה לבידוד DNA מרקמת המעי והדם, הכנת ספריות עבור NGS, וצעדים בסיסיים של ריצוף לרצף רפרטואר חיסוני. הריצה תיצור קבצים fastq, אשר ניתן להמיר עוד יותר קבצי fasta לשימוש בפלטפורמת ImMunoGeneTics הבינלאומית (IMGT)/HighV-QUEST. HTS זה מבצע ומנהל ניתוחים רבים של עשרות אלפי רצפי TCRβ ו- IGH מסודרים מחדש, ברמת הנוקלאוטידים15. IMGT/HighV-QUEST מאפשר ניתוח של TCRs שונים ורפרטואר IGH הן בבריאות והן במחלות. זה יכול להוביל לזיהוי של שיבוטים "ספציפיים למחלה" חדשים, ניתוח של התרחבות שיבוטים ופרמטרים גיוון, תיוג של שימוש V(D)J דיפרנציאלי, ניתוח של מוטציות היפר סומטיות, ועוד. IMGT / HighV-QUEST מספק קבצי CSV, אשר מכילים רצפים ספציפיים ואת השפע שלהם. שימוש בדנ"א גנומי כחומר פותח מניב מספרי רצף המייצגים מספרי תאים. לכן, אם כמות הדנ"א המקורית שווה, ניתן לחשב גם את אחוז תאי T במדגם נתון.
אנו כוללים ניתוח בסיסי מדגימות דם ופי הטבעת מייצגות, אוטולוגיות ורקטליות של חולה עם מחסור בקולטן IL10 והיסטוריה של מחלת מין אינפנטילית חמורה, הנובעת ממוטציה IL10RA מזיקה. דגימות הונחו הן עבור TCRβ והן עבור רפרטואר IGH. מדגם TCRβ במעיים הניב בסך הכל 12,450 רצפים, מתוכם 9,050 רצפים היו ייחודיים. מדגם TCRβ הדם היה בסך הכל 54,880 רצפים, מתוכם 35,110 היו ייחודיים. במדגם IGH המעי, בסך הכל התקבלו 49,070 רצפים, מתוכם 23,670 היו ייחודיים. בדגימת הדם IGH התקבלו בסך הכל 13,710 רצפים, מתוכם 13,540 היו ייחודיים. כל השיבוטים ניתן לזהות על ידי הרצף הייחודי שלהם הן ברמת נוקלאוטידים או חומצת אמינו. רצפים אלה ניתן להשוות בין חולים שונים, בחיפוש אחר שיבוטים משותפים, או באותו חולה בין אתרים אנטומיים שונים (למשל, דם לעומת המעי). אנו מציגים עבור כל אחת מהדגימות את 5 השיבוטים השכיחים ביותר(טבלה 1).
כדי לכמת את מידת ההתפשטות של שיבוט ניתן להשתמש במדדים שונים, כולל H של שאנון, ג'יני-סימפסון, אנטרופיה ושיבוט. כדוגמה, H של שאנון, אשר לוקח בחשבון את מספר הרצפים הייחודיים (עושר של הרפרטואר) וכמה באופן שווה הם מופצים נמצאה להיות מופחתת במעיים של המטופל IGH לעומת דם (8.3 לעומת 9.5), מה שמרמז על התרחבות שיבוטים של תאי B במעיים מודלקים.
לקבלת סקירה רחבה של הרפרטואר, נוצרו תמונות מפת עץ (www.treemap.com) (איור 2). כל ריבוע צבעוני מייצג שיבוט שונה, והגודל תואם לתדר שלו. תמונות מפת עץ אלה מדגימות התרחבות שיבוט ברפרטואר IGH במעיים בהשוואה לדם. לעומת זאת, ברפרטואר TCRβ, התרחבות שיבוט מסומן נצפתה בדם, בהשוואה למעי אוטולוגי.
ברמת הגנים, NGS מספק מידע לגבי V- D- ו- J- שימוש ברמה של גן, משפחה, או אלל, כפי שמוצג בטבלה 1. יתר על כן, ניתן להסיק מנתונים ספציפיים של רפרטואר TCRβ ו-IGH(איור 3A,B),שיכולים לחשוף דפוסי שימוש דיפרנציאליים בגנים בתנאים שונים. ניתן גם לנתח תכונות ביופיזיות של אזור CDR3 כגון אורך (טבלה 1) או הידרופוביות. חשוב לציין, הפצת אורך CDR3 משתנה בהפרעות שונות בתיווך מערכת החיסון10,16,17. לדוגמה, בחולים לקוי IL10R, תאי T שמקורם בדם, אך לא תאי B, יש אורך CDR3 קצר יותר, הידרופוביות דיפרנציאלית, בהשוואה לבקרות בריאות7.
איור 1: נתוני ביואנליצר מייצגים. תמונות מייצגות של דגימות TCRβ מעיים המראות תוצאות אופטימליות (A) עם השיא הרצוי ב 400 bp. דוגמה לספריה באיכות נמוכה (B) עם פסגות נוספות ב- 179bp ו- 114bp (מסומן *). פסגות שנראות בקצוות הן סמנים עליונים ותחתונים של רצועת האלקטרופורזה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: סקירה כללית של רפרטואר חיסוני של תאי T ו- B. דיאגרמות מפת עץ של דגימות דם ומעיים TCRβ ו- IGH. כל ריבוע צבעוני מייצג שיבוט שונה, והגודל תואם לתדר שלו. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: גרפים מייצגים של השימוש ב- TCRβ וב- IGH V-J. מדגם מעיים מייצג המתאר את המספר הכולל של רצפים עבור כל שילוב V-J ב- TCRβ (A) או IGH (B). הנתונים אינם מוצגים לשימוש D. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שינויים בשפע ובתפקוד של לימפוציטים B ו- T נתקלים לעתים קרובות בממאירות שונות18, הפרעות דלקתיות כרוניות (למשל, קוליטיס כיבית ודלקת מפרקים שגרונית)10,19, וב immunodeficiencies שונים17,20. השיטה הנוכחית משתמשת ב- NGS כדי להקל על תצוגה מעמיקה של רפרטואר TCR ו- BCR, ומאפשרת זיהוי של שינויים עדינים בשיבוט תאי T ו- B, שיתוף שיבוטים, שימוש בגנים V(D)J ומידע על מידת מוטציות ההיפר-מוטציות הסומטיות במקרה של תאי B.
שיטת בידוד הדנ"א תוארה לביופסיות מעיים ודגימות דם. עם זאת, עם שינויים של תמוגה מיצוי DNA, השיטה יכולה להיות מיושמת על רקמות אחרות כגון גידולים, בלוטות הלימפה, נוזל סינוביאלי, וכו '. חשוב במהלך הכנת הספרייה לא להצליב את סטים פריימר שונים. בניקוי חרוזים, יש להקפיד להשאיר צינורות על המגנט בכל עת של הדגירה. עבור דגימות DNA של ריכוזים נמוכים, מניות ניתן להתרכז ב 65 °C (65 °F) במשך 10-20 דקות. יתר על כן, אמפליקונים ניתן eluted מן החרוזים ב מעט כמו 20 μL elution חוצץ.
טכניקות שונות ששימשו בעבר לאפיון הנוף של הרכב תאי T ו- B סיפקו רק סקירה שטחית של הרפרטואר החיסוני. אחד היתרונות הגדולים ביותר של NGS לניתוח רפרטואר חיסוני הוא היכולת לזהות שיבוטים ייחודיים, וכתוצאה מכך לעקוב אחריהם באתרים אנטומיים שונים (למשל, מעי לעומת דם לעומת בלוטות לימפה) או אצל אנשים שונים. ההשלכות הקליניות של טכניקה כזו הן משמעותיות, ומעבר להבנת התפקיד של תאי T או B במחלות שונות בתיווך חיסוני או ממאירות21. באונקולוגיה, NGS משמש לזיהוי שיבוטים ספציפיים שיכולים להיות סמנים ביולוגיים חזויים עבור החולים אשר ככל הנראה ייהנו האימונותרפיות הנוכחיות22,23,24. בלוקמיה, NGS משמש כדי לאשר חיסול מלא של תאים סרטניים על ידי זיהוי של שיבוטים לויקמיים שיורית שנותרו בחולה לאחר הטיפול25.
אחת המגבלות העיקריות של ניתוח רפרטואר חיסוני של דגימות רקמה שלמה או דם היא חוסר היכולת לזהות שינויים רפרטואר באוכלוסיות בתדירות נמוכה יותר. לדוגמה, אם תאי T רגולטוריים, המהווים רק אחוזים בודדים מכלל תאי CD4+ T, מבטאים פרופיל רפרטואר ייחודי, הדבר יחסר אם יבצעו מחקרים אלה על דם שלם. בעיה זו יכולה להיות מטופלת על ידי ביצוע מחקרים אלה על אוכלוסיות חיסוניות ממוינות. לחלופין, בשנים האחרונות הטכנולוגיה התפתחה כדי להקל על צימוד של נתוני RNA של תא יחיד עם פרופילי TCR או רפרטואר IGH26. פעולה זו מספקת רמה נוספת של פונקציונליות של תאי T או B, שכן ניתן לאפיין את הנוף התמלולי של כל שיבוט. כדוגמה, Zemmour et al. השתמשו scRNAseq TCRseq כדי להדגים כי תאי T רגולטוריים מדם אנושי, להציג הטרוגניות רחבה עם תת-אוכלוסין מופעל כי הוא קשור שעתוק לתאי T קונבנציונליים27. באופן דומה, בחולים עם קרצינומה hepatocellular שיטה זו זיהתה 11 subsets תא T נפרדים לחדור את הגידול, כל אחד עם פרופיל שעתוק ורפרטואר ייחודי28. מחקרים כאלה יועילו במיוחד כאשר לומדים אוכלוסיות נדירות, ויספקו מידע תפקודי חשוב של שיבוטים ספציפיים.
NGS של רפרטואר מערכת החיסון הוא תחום מחקר חדש המספק תובנות חדשניות על תפקוד מערכת החיסון האדפטיבית ותפקידם של תאי T ו- B במחלות שונות. בנוסף, הוא נכנס במהירות לעולם הקליני בדיסציפלינות שונות, על ידי מעקב אחר מחלות הקשורות קלונוטיפים. כיום ישנן מספר ערכות זמינות לרפרטואר חיסוני. אלה מבוססים על מתודולוגיה דומה, ללא קשר אם הם משתמשים RNA או DNA כמקור. הם משתמשים בטכניקות דומות לכיול, תיקוני הטיה וכלי ניתוח; ולכן צריך להיבחר כראוי על פי דרישות ספציפיות. אחד היתרונות הגדולים של הערכה הנוכחית הוא שהיא מוכנה לשימוש וממוטבת לרפרטואר חיסוני אנושי, ללא צורך בכיול. בעתיד נראה מחקרים נוספים באמצעות תכונות רפרטואר כמו סמנים ביולוגיים למחלות שונות, פוטנציאל גם מוביל לפיתוח של טיפולים ממוקדים נגד שיבוטים אלה. אנו מאמינים כי על החוקרים לשקול ליישם שיטות אלה לחקר הנוף החיסוני ההסתגלותי בהפרעות שונות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
לכל המחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
ללא.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-propanol | Sigma | I9516-500ML | |
| 1.7 mL micro-centrifuge tubes | Axygen | 8187631104051 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Greiner | 188261 | |
| Absolute ethanol | Merck | 1.08543.0250 | |
| Amplitaq Gold | Thermo Fisher | N8080241 | |
| AMPure XP Beads | Beckman Coulter | A63881 | |
| Heat block | Bioer | Not applicable | |
| High Sensitivity D1000 Sample Buffer | Agilent | 5067-5603 | For Tapestation |
| High Sensitivity D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5584 | For Tapestation. Tubes sold seperately |
| Lymphotrack Assay kit | Invivoscribe | TRB: 70-91210039 IGH: 70-92250019 | Each includes 24 indexes |
| MiSeq Reagent Kit v2 (500 cycle) | Illumina | MS-102-2003 | Includes standard flow cell type and all reagents required |
| MiSeq Sequencer | Illumina | SY-410-1003 | |
| PCR strips | 4titude | 4ti-0792 | |
| Proteinase K | Invitrogen | EO0491 | |
| Qubit 4 Fluorometer | Thermo Fisher | Q33226 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher | Q32854 | Includes buffer, dye, standards, and specialized tubes |
| Shaker | Biosan | Not applicable | |
| Tapestation 2100 Bioanalyzer | Agilent | G2940CA | |
| ultra pure water | Bio-lab | 7501 | |
| Wizard DNA isolation kit | Promega | A1120 | Includes cell lysis solution, nuclei lysis solution, and protein precipitation buffer |
References
- Bassing, C. H., Swat, W., Alt, F. W. The mechanism and regulation of chromosomal V(D)J recombination. Cell. 109, Suppl 45-55 (2002).
- Roth, D. B. V(D)J Recombination: Mechanism, Errors, and Fidelity. Microbiology Spectrum. 2 (6), (2014).
- Heather, J. M., Ismail, M., Oakes, T., Chain, B. High-throughput sequencing of the T-cell receptor repertoire: pitfalls and opportunities. Brief Bioinformatics. 19 (4), 554-565 (2018).
- Pabst, O., Hazanov, H., Mehr, R. Old questions, new tools: does next-generation sequencing hold the key to unraveling intestinal B-cell responses. Mucosal Immunology. 8 (1), 29-37 (2015).
- Bashford-Rogers, R. J. M., Smith, K. G. C., Thomas, D. C. Antibody repertoire analysis in polygenic autoimmune diseases. Immunology. 155 (1), 3-17 (2018).
- Lee, Y. N., et al. Characterization of T and B cell repertoire diversity in patients with RAG deficiency. Science Immunology. 1 (6), (2016).
- Werner, L., et al. Alterations in T and B Cell Receptor Repertoires Patterns in Patients With IL10 Signaling Defects and History of Infantile-Onset IBD. Frontiers Immunology. 11, 109 (2020).
- Zhang, J., et al. Immune receptor repertoires in pediatric and adult acute myeloid leukemia. Genome Medicine. 11 (1), 73 (2019).
- Chapman, C. G., et al. Characterization of T-cell Receptor Repertoire in Inflamed Tissues of Patients with Crohn's Disease Through Deep Sequencing. Inflammatory Bowel Diseases. 22 (6), 1275-1285 (2016).
- Werner, L., et al. Altered T cell receptor beta repertoire patterns in pediatric ulcerative colitis. Clinical and Experimental Immunology. 196 (1), 1-11 (2019).
- Bashford-Rogers, R. J. M., et al. Analysis of the B cell receptor repertoire in six immune-mediated diseases. Nature. 574 (7776), 122-126 (2019).
- Wu, J., et al. Expanded TCRbeta CDR3 clonotypes distinguish Crohn's disease and ulcerative colitis patients. Mucosal Immunology. 11 (5), 1487-1495 (2018).
- Rosati, E., et al. Identification of disease-associated traits and clonotypes in the T-cell receptor repertoire of monozygotic twins affected by inflammatory bowel diseases. Journam of Crohn's and Colitis. , (2019).
- Allez, M., et al. T cell clonal expansions in ileal Crohn's disease are associated with smoking behaviour and postoperative recurrence. Gut. 68 (11), 1961-1970 (2019).
- Li, S., et al. IMGT/HighV QUEST paradigm for T cell receptor IMGT clonotype diversity and next generation repertoire immunoprofiling. Nature Communications. 4, 2333 (2013).
- H, I. J., et al. Strategies for B-cell receptor repertoire analysis in primary immunodeficiencies: from severe combined immunodeficiency to common variable immunodeficiency. Frontiers Immunology. 6, 157 (2015).
- Ghraichy, M., Galson, J. D., Kelly, D. F., Truck, J. B-cell receptor repertoire sequencing in patients with primary immunodeficiency: a review. Immunology. 153 (2), 145-160 (2018).
- Zhuang, Y., et al. Application of immune repertoire sequencing in cancer immunotherapy. International Immunopharmacology. 74, 105688 (2019).
- Liu, X., et al. T cell receptor beta repertoires as novel diagnostic markers for systemic lupus erythematosus and rheumatoid arthritis. Annual Rheumatic Diseases. 78 (8), 1070-1078 (2019).
- Wong, G. K., Heather, J. M., Barmettler, S., Cobbold, M. Immune dysregulation in immunodeficiency disorders: The role of T-cell receptor sequencing. Journal of Autoimmunity. 80, 1-9 (2017).
- Delhalle, S., Bode, S. F. N., Balling, R., Ollert, M., He, F. Q. A roadmap towards personalized immunology. NPJ System Biology and Applications. 4, 9 (2018).
- Laubli, H., et al. The T cell repertoire in tumors overlaps with pulmonary inflammatory lesions in patients treated with checkpoint inhibitors. Oncoimmunology. 7 (2), 1386962 (2018).
- Hogan, S. A., et al. Peripheral Blood TCR Repertoire Profiling May Facilitate Patient Stratification for Immunotherapy against Melanoma. Cancer Immunology Research. 7 (1), 77-85 (2019).
- Aversa, I., Malanga, D., Fiume, G., Palmieri, C. Molecular T-Cell Repertoire Analysis as Source of Prognostic and Predictive Biomarkers for Checkpoint Blockade Immunotherapy. International Journal of Molecular Sciences. 21 (7), (2020).
- Hirsch, P., et al. Precision and prognostic value of clone-specific minimal residual disease in acute myeloid leukemia. Haematologica. 102 (7), 1227-1237 (2017).
- De Simone, M., Rossetti, G., Pagani, M. Single Cell T Cell Receptor Sequencing: Techniques and Future Challenges. Frontiers Immunology. 9, 1638 (2018).
- Zemmour, D., et al. Single-cell gene expression reveals a landscape of regulatory T cell phenotypes shaped by the TCR. Nature Immunology. 19 (3), 291-301 (2018).
- Zheng, C., et al. Landscape of Infiltrating T Cells in Liver Cancer Revealed by Single-Cell Sequencing. Cell. 169 (7), 1342-1356 (2017).
