Summary
Текущий протокол описывает метод выделения ДНК из образцов крови и биопсии кишечника, генерацию библиотек TCRβ и IGH PCR для секвенирования следующего поколения, производительность запуска NGS и анализ основных данных.
Abstract
Иммунологическая память, отличительная черта адаптивного иммунитета, управляется Т- и В-лимфоцитами. В кровообращении и различных органах существуют миллиарды уникальных клонов Т- и В-клеток, и каждый из них может связывать определенный антиген, что приводит к пролиферации, дифференцировке и / или секреции цитокинов. Огромная гетерогенность т- и в-в-клеток порождается случайной рекомбинацией различных генетических сегментов. Технологии секвенирования следующего поколения (NGS), разработанные в последнее десятилетие, позволяют беспрецедентно глубоко взглянуть на иммунный репертуар рецепторов Т- и В-клеток. Исследования различных воспалительных состояний, иммунодефициентов, инфекций и злокачественных новообразований продемонстрировали заметные изменения в клональности, использовании генов и биофизических свойствах иммунного репертуара, предоставляя важную информацию о роли адаптивных иммунных реакций при различных расстройствах.
Здесь мы предоставляем подробный протокол для NGS иммунного репертуара Т- и В-клеток из крови и тканей. Мы представляем конвейер, начиная от выделения ДНК через подготовку библиотеки, секвенирование на секвенсоре NGS и заканчивая базовыми анализами. Этот метод позволяет исследовать специфические Т- и В-клетки на нуклеотидном или аминокислотном уровне и, таким образом, может идентифицировать динамические изменения в популяциях лимфоцитов и параметры разнообразия при различных заболеваниях. Этот метод медленно входит в клиническую практику и имеет потенциал для идентификации новых биомаркеров, стратификации риска и точной медицины.
Introduction
Адаптивная иммунная система, состоящая из Т- и В-лимфоцитов, использует иммунологическую память для распознавания ранее встречавщегося антигена и инициирования быстрого ответа. Лимфоциты генерируются в костном мозге и созревают в тимусе (Т-клетки) или костном мозге (В-клетки). Как рецептор Т-клеток (TCR), так и рецептор B-клеток (BCR) демонстрируют уникальные конфигурации, которые позволяют распознать специфические антигены. В гомеостазе Т- и В-клетки постоянно циркулируют и исследуют триллионы различных пептидов, представленных на антигенпрезентирующих клетках. TCR или BCR лигирование специфического антигена с высоким сродством вместе с соответствующей костимуляцией приводит к активации клеток, что приводит к секреции цитокинов, клональной экспансии и генерации антител, в случае В-клеток.
Огромный массив различных Т- или В-клеток в совокупности называется иммунным репертуаром, что позволяет распознавать бесчисленное множество различных эпитопов. Для того, чтобы сформировать такой обширный репертуар, происходит сложный процесс случайной сборки различных сегментов генов, создавая почти бесконечные комбинации рецепторов, которые могут связывать уникальные антигены1. Этот процесс, называемый рекомбинацией V(D)J, включает в себя перегруппировки различных переменных (V), разнообразия (D) и соединения (J) генов, сопровождающиеся случайными делециями и вставками нуклеотидов в соединения2.
Архитектура адаптивной иммунной системы интересует ученых в разных областях на протяжении многих десятилетий. В прошлом секвенирование Сэнгера, комплементарное определение области 3 (CDR3) спектротипирование и проточная цитометрия использовались для характеристики иммунного репертуара, но обеспечивали низкое разрешение. В последнее десятилетие достижения в методах секвенирования следующего поколения (NGS) позволили глубоко понять характеристики и состав репертуаров TCR и BCR человека3,4. Эти высокопроизводительные системы (HTS) последовательно и обрабатывают миллионы перестроенные продукты TCR или BCR одновременно и позволяют проводить анализ с высоким разрешением конкретных Т- и В-клеток на уровне нуклеотидов или аминокислот. NGS предоставляет новую стратегию для изучения иммунного репертуара как в здоровье, так и в болезни. Исследования с использованием HTS продемонстрировали измененные репертуары TCR и BCR при аутоиммунных заболеваниях5,первичных иммунодефициозах6,7и злокачественных новообразованиях, таких как острый миелоидный лейкоз8. Используя NGS, мы и другие показали олигоклональное расширение специфических Т- и В-клеточных клонов у пациентов с воспалительным заболеванием кишечника (ВЗК), включая язвенный колит и болезнь Крона9,10,11,12,13,14. В целом, исследования из разных областей показывают, что изменения в репертуаре играют решающую роль в патогенезе иммуноопосредованных расстройств.
Текущий протокол описывает метод выделения ДНК из биопсии кишечника и крови, генерацию библиотек TCRβ и IGH PCR для NGS и выполнение секвенирования. Мы также предоставляем основные этапы анализа данных иммунного репертуара. Этот протокол также может применяться для генерации библиотек TCRα, TCRγ и IGL. Метод также совместим с другими органами (например, лимфатическими узлами, опухолями, синовиальной жидкостью, жировой тканью и т. д.), если используются тканеспецифические протоколы пищеварения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Это исследование было одобрено институциональным наблюдательным советом в Медицинском центре Шиба, и было получено информированное письменное согласие от всех участвующих субъектов.
1. Выделение и количественная оценка ДНК
- Пищеварение и лизис клеток биопсии кишечника
- Извлеките биопсии кишечника, либо свежевыбранные, либо хранящиеся при -20 °C или -80 °C. Если используют замороженные биопсии, оттаивайте на льду.
- Добавьте 600 мкл раствора лизиса ядер в стерильную микроцентрифужную трубку 1,7 мл, охлажденный на льду.
- Поместите биопсию в микроцентрифужную трубку с раствором лизиса и инкубируют при 65 °C в течение 15-30 мин.
- Добавьте 17,5 мкл 20 мг/мл протеиназы К и инкубируют в течение ночи при 55 °C, с легким встряхиванием.
- Дайте образцу остыть до комнатной температуры в течение 5 мин, прежде чем перейти к шагу 1.3.
- Лизис клеток цельной крови
- Получить 3 мл цельной крови в ЭДТА-, гепарин- или цитратсодержащей пробирке.
- Осторожно раскачивают трубку до тщательного перемешивания и переложат кровь в стерильную центрифужную трубку 15 мл, содержащую 9 мл раствора лизиса клеток. Инвертировать несколько раз в течение 10-минутного инкубационного периода при комнатной температуре.
- Центрифугу при 2000 х г в течение 10 мин при комнатной температуре, а затем выбросьте как можно больше супернатанта, не нарушая видимую белую гранулу. Останется примерно 50–100 мкл остаточной жидкости.
- Вихревую трубку энергично в течение 15 с до полного повторного суспендирований. Добавьте 3 мл раствора лизиса ядер и несколько раз пипетку. Раствор должен стать вязким.
- Осаждение белка
- Добавьте 200 мкл буфера осаждения белка в ткань или 1 мл в кровь. Вихрь энергично в течение 20 с и насиживающий на льду в течение 5 мин. Небольшие белковые сгустки могут быть видны после вихря.
- Центрифуга при 16 000 х г в течение 4 мин. Должна образоваться плотная гранула, содержащая осажденные белки.
- Осторожно перенесите супернатант, не нарушая гранулу, в новую трубку 1,7 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если гранулы не плотные, рассмотрите другую центрифугу при 16 000 х г в течение 4 мин.
- Осаждение и регидратация ДНК
- Добавьте 1 мл 2-пропанола в пробирку, содержащую надводный материал, и осторожно перемешайте путем инвертирования. ДНК должна стать видимой как белое плавающее вещество.
- Центрифуга при 16 000 х г в течение 1 мин. Удалите супернатант полностью с помощью пипетки.
- Добавьте 1 мл свежеприготовленного 70% этанола и несколько раз переверняйте пробирку. Центрифуга при 16 000 х г в течение 1 мин при комнатной температуре. Осторожно выбрасывайте супернатант.
- Повторите шаг 1.4.3.
- Поместите открытую трубку перевернутой на чистую абсорбивную бумагу на 10-15 мин. Реинвертировать трубку и подтвердить полную гидратацию. При необходимости оставьте на воздухе-сухость еще на 10-15 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Крайне важно, чтобы пеллеты полностью высохли. - Добавьте 50 мкл сверхчистой воды (UPW). При необходимости ДНК может быть разбавлена больше после количественной оценки.
- Инкубировать в течение 1 ч на тепловом блоке при 65 °C, для регидратации ДНК.
- Количественная оценка ДНК
ПРИМЕЧАНИЕ: ДНК количественно оценивали с помощью флуорометра и назначенных реагентов, как указано в таблице материалов.- Доведите стандарты до комнатной температуры и подготовьте комплект, включающий специальные трубки по 0,5 мл.
- Приготовьте буферную и красяную смесь в пробирке 15 мл, в зависимости от количества образцов. Добавьте 200 мкл буфера и 1 мкл красителя на образец. Включите 2 образца для стандартов. Рекомендуется рассчитать дополнительную выборку, чтобы избежать того, что буфера будет недостаточно.
- Для 2 стандартов поместите 190 мкл вышеприготовленной смеси в пробирку 0,5 мл. Добавьте 10 мкл стандарта.
- Для каждого образца поместите 199 мкл вышеприготовленной смеси в пробирку 0,5 мл. Добавьте 1 мкл ДНК.
- Ознакомьтесь с примерами. Результат указывает на концентрацию ДНК образца.
- Если образцы превысили лимит, разбавьте ДНК 1:10 с помощью UPW и повторите чтение.
2. Подготовка библиотеки
ПРИМЕЧАНИЕ: Текущий протокол использует мультиплексный набор для анализа на основе ПЦР, совместимый с секвенсорами NGS. Комплект содержит 24 различных индекса, каждый из которых ориентирован на сохраненные регионы врегионах V β и Jβ. Это позволяет проводить одношаговую реакцию ПЦР и объединение различных образцов. Подробности смотрите в таблице материалов.
- Подготовьте образцы ДНК. Получите 150 нг ДНК и добавьте UPW в общей сложности 5 мкл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для библиотечного приготовления можно использовать менее 150 нг ДНК с минимальной концентрацией 10 нг/мкл. - Поместите пипетки и наконечники в капюшон с ультрафиолетовым светом на 15 минут, чтобы разрушить остаточную ДНК. Между тем, позволяют различным индексным пробиркам (для библиотечной подготовки) и ДНК-полимеразе оттаивать на льду.
- В биологической вытяжке добавьте 45 мкл из различных индексных пробирок в пробирки ПЦР. Для последующего добавьте 0,2 мкл ДНК-полимеразы и 5 мкл ДНК, приготовленной на этапе 2,1, в пробирки ПЦР.
- Запустите реакцию ПЦР с помощью предуставляемой программы, согласно инструкции производителя.
3. Очистка и количественная оценка ампликона
- Используйте магнитные шарики для удаления излишков праймеров, нуклеотидов и ферментов.
- Прогреть бусины не менее 30 мин до комнатной температуры. Приготовьте достаточно свежего 80% этанола для 400 мкл на образец.
- Добавьте 50 мкл (IGH) или 35 мкл (TCRβ) шариков в каждую трубку ПЦР и перемешайте путем пипетки 10 раз. Инкубировать 10 мин при комнатной температуре.
- Поместите смешанный образец на магнитную подставку на 5 мин.
- Аспират 95 мкл (IGH) или 80 мкл (TCRβ) прозрачной жидкости и выброса. Аспират оставшейся жидкости с использованием наконечника 10 мкл.
- Добавьте 200 мкл 80% этанола к каждому образцу. Инкубировать 30 с. Аспират 195 мкл этанола и выброс. Аспират оставшейся жидкости с использованием наконечника 10 мкл.
- Повторите шаг 3.1.5. Откройте колпачки трубок и дайте воздуху высохнуть в течение 5 минут.
- Сразу через 5 мин вынимают из магнитного стенда и добавляют 25 мкл буфера элюдения (10 мМ Tris-HCl, рН 8,0). Перемешать путем пипетки до однородного уровня. Инкубировать при комнатной температуре в течение 2 мин.
- Поместите трубки на магнитную подставку на 5 мин. Перенесите 22 мкл в новую ПЦР-трубку. Измерьте концентрацию ДНК (шаг 1.5).
- Количественная оценка ампликона
ПРИМЕЧАНИЕ: Текущий протокол использует автоматизированную машину электрофореза для контроля качества концентрации, размера и целостности ДНК. Подробности смотрите в таблице материалов.- Поместите реагенты и просеивку при комнатной температуре не менее 30 мин.
- В новой микроцентрифужной трубке объемом 1,7 мл сделайте разбавление образцами ДНК, количественно оцененными на этапе 3.1.8, 1,8 с UPW для общего объема не менее 3 мкл.
- Вихрь разбавляет ДНК перед использованием. Поместите 2 мкл буфера вместе с 2 мкл разбавленной ДНК в предварительно меченые специализированные полоски ПЦР (входят в комплект) и поместите колпачки. Поместите на шейкер на 1 мин, после чего открутите ПЦР-полоски.
ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за вязкости буфера убедитесь, что избыточный буфер удален из наконечника перед передачей в пробоотборники. - Поместите в машину, скринт и полоски ПЦР без колпачков. Откройте крышку наконечника внутри устройства. Назначьте позицию с соответствующими метками. Запустите машину.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выходная гистограмма должна быть одним пиком при желаемом размере ампликонов(рисунок 1А). В образцах низкого качества будут наблюдаться дополнительные пики(рисунок 1В),указывающие на плохую очистку бусин или образование праймерных димеров.
4. Секвенирование нового поколения
- Количественная оценка и объединение библиотек
- Рассчитайте конечную концентрацию ДНК в nM, используя значение ДНК из шага 3.1.8, и размер в парах оснований (bp) пика продукта, полученный из результатов электрофореза машины (см. Рисунок 1).
- Для каждого образца рассчитайте объем ДНК для получения конечной концентрации 4 нМ в конечном объеме 10-20 мкл элюационного буфера.
- Подготовьте новую смесь для разбавления для каждого образца и возьмите из нее 2 мкл в новую смесь для бассейна.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для образцов, которые имеют менее 4 нМ, добавьте максимально возможное количество образца.
- NGS запуск библиотеки
ПРИМЕЧАНИЕ: Текущий протокол использует настольная секвенсорная платформа. Подробности смотрите в таблице материалов.- Готовят свежий раствор 0,2 Н NaOH. Добавить 10 мкл 0,2 Н NaOH в разбавленный библиотеку, подготовленную на этапе 4.1.3. Добавьте 5% PhiX в трубку и кратковременно вихрь. Открутите трубку, чтобы убедиться, что весь раствор осеял на дне трубки.
- Инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре для хинатации двухцепочечной ДНК. Добавьте 980 мкл предварительно охлажденного буфера из набора в трубку, содержащую ДНК и вихрь ненадолго.
- Поместите разбавленный библиотеку на лед и подготовьте библиотеку следующим образом. Для смеси 17 пМ добавьте 425 мкл ДНК со ступени 4.2.2 и 575 мкл буфера. Инвертировать библиотеку несколько раз и вращаться вниз. Загрузите 600 мкл конечной библиотеки на назначенный картридж и поместите образцы в машину.
- Запустите запуск, следуя инструкциям программного обеспечения.
5. Анализ последовательности
- Загрузите метрики виртуализации из секвенсора и убедитесь, что данные виртуализации находятся в следующих диапазонах (специфичных для комплекта, используемого в текущем протоколе). Образцы, не отвечающие этим критериям, подлежат повторному запуску:
Плотность кластера (K/mm2)): 945K – 1800K
Процент прохождения фильтра чтения (Кластеры PF (%)): >90%
Показатели качества (%>=Q30): >85%
Выравнивание PhiX (выравнивание %): 1,5% - 10%
Частота ошибок PhiX (%): <1,0%
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Здесь мы описываем метод выделения ДНК из кишечной ткани и крови, подготовку библиотек для NGS и основные этапы секвенирования для секвенирования для секвенирования иммунного репертуара. Запуск будет генерировать файлы fastq, которые могут быть в дальнейшем преобразованы в файлы fasta для использования в международной платформе ImMunoGeneTics (IMGT)/HighV-QUEST. Эта HTS выполняет и управляет многими анализами десятков тысяч перестроеностей TCRβ и IGH на нуклеотидном уровне15. IMGT/HighV-QUEST позволяет анализировать различные TTCR и репертуары IGH как в области здоровья, так и в области заболеваний. Это может привести к выявлению новых «специфических для заболевания» клонов, анализу параметров клонального расширения и разнообразия, разграничению дифференциального использования V(D)J, анализу соматических гипермюгаций и многому другому. IMGT/HighV-QUEST предоставляет CSV-файлы, которые содержат определенные последовательности и их обилие. Использование геномной ДНК в качестве исходного материала дает порядковые номера, которые являются репрезентативными для номеров клеток. Таким образом, если исходное количество ДНК равно, процент Т-клеток в данном образце также может быть рассчитан.
Мы включаем базовый анализ репрезентативных, аутологических образцов крови и прямой кишки пациента с дефицитом рецептора IL10 и историей тяжелого инфантильного начала ВЗК, вызванного вредным мутацией IL10RA. Сэмплы были проанализированы как для репертуара TCRβ, так и для репертуара IGH. Образец TCRβ кишечника дал в общей сложности 12 450 последовательностей, из которых 9 050 последовательностей были уникальными. Образец крови TCRβ имел в общей сложности 54 880 последовательностей, из которых 35 110 были уникальными. В образце IGH кишечника было получено в общей сложности 49 070 последовательностей, из которых 23 670 были уникальными. В образце IGH крови было получено в общей сложности 13 710 последовательностей, из которых 13 540 были уникальными. Все клоны могут быть идентифицированы по их уникальной последовательности как на нуклеотидном, так и на аминокислотном уровне. Эти последовательности можно сравнивать между разными пациентами, в поисках общих клонов или у одного и того же пациента между различными анатомическими участками (например, кровь против кишечника). Представляем для каждого из образцов 5 наиболее частых клонов(таблица 1).
Для количественной оценки степени клонального расширения могут быть использованы различные индексы, в том числе H Шеннона, Джини-Симпсона, энтропия и клональность. В качестве примера можно привести H Шеннона, который учитывает количество уникальных последовательностей (богатство репертуара) и то, насколько равномерно они распределены, был обнаружен уменьшающимся в кишечном IGH пациента по сравнению с кровью (8,3 против 9,5), что свидетельствует о клональном расширении В-клеток в воспаленном кишечнике.
Для широкого обзора репертуара были сгенерированы изображения Treemap (www.treemap.com)(рисунок 2). Каждый цветной квадрат представляет собой свой клон, а размер коррелирует с его частотой. Эти изображения Treemap демонстрируют клональное расширение в кишечном репертуаре IGH по сравнению с кровью. Напротив, в репертуаре TCRβ в крови наблюдается выраженное расширение клонов, по сравнению с аутологичной кишками.
На генном уровне NGS предоставляет информацию об использовании V-D- и J- на уровне гена, семейства или аллеля, как показано в таблице 1. Кроме того, конкретные комбинации V(D)J могут быть выведены из данных для репертуаров TCRβ и IGH(рисунок 3A,B),которые могут выявить дифференциальные модели использования генов в различных условиях. Биофизические свойства области CDR3, такие как длина(таблица 1)или гидрофобность, также могут быть проанализированы. Важно отметить, что распределение длины CDR3 изменяется при различных иммуноопосредованных расстройствах10,16,17. Например, у пациентов с дефицитом IL10R Т-клетки, полученные из крови, но не В-клетки, имеют более короткую длину CDR3 и дифференциальную гидрофобность по сравнению со здоровыми контрольными7.
Рисунок 1: Репрезентативные данные биоанализатора. Репрезентативные изображения образцов TCRβ кишечника, показывающие оптимальные результаты(A)с желаемым пиком в 400 bp. Пример низкокачественная библиотека(B)с дополнительными пиками на 179bp и 114bp (отмечено *). Пики, видимые на концах, являются верхними и нижними маркерами полосы электрофореза. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Обзор иммунного репертуара Т- и В-клеток. Древовидные диаграммы образцов крови и кишечника TCRβ и IGH. Каждый цветной квадрат представляет собой свой клон, а размер коррелирует с его частотой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Репрезентативные графики использования TCRβ и IGH V-J. Репрезентативный кишечный образец, изображающий общее количество последовательностей для каждой комбинации V-J в TCRβ(A)или IGH(B). Данные не отображаются для использования D. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Изменения в обилии и функции В- и Т-лимфоцитов часто встречаются при различных злокачественных новообразованиях18,хронических воспалительных заболеваниях (например, язвенном колите и ревматоидном артрите)10,19,а при различных иммунодефицитах17,20. Текущий метод использует NGS для облегчения углубленного просмотра репертуаров TCR и BCR, что позволяет обнаруживать тонкие изменения в клональности Т- и В-клеток, совместное использование клонов, использование генов V(D)J и информацию о степени соматических гипермюлет в случае В-клеток.
Описан способ выделения ДНК для биопсии кишечника и образцов крови. Однако при модификациях лизиса и экстракции ДНК метод может быть применен к другим тканям, таким как опухоли, лимфатические узлы, синовиальная жидкость и т. Д. Важно во время подготовки библиотеки не загрязнять перекрестно различные наборы грунтовок. При очистке бисера следует позаботиться о том, чтобы оставлять трубки на магните во все время инкубации. Для образцов ДНК низких концентраций запасы могут быть сконцентрированы при 65 °C в течение 10-20 минут. Кроме того, ампликоны могут быть элюированы из шариков всего в 20 мкл буфере элюдения.
Различные методы, используемые в прошлом для характеристики ландшафта композиции Т- и В-клеток, давали лишь поверхностный обзор иммунного репертуара. Одним из самых больших преимуществ NGS для анализа иммунного репертуара является способность идентифицировать уникальные клоны и, следовательно, отслеживать их в разных анатомических местах (например, кишечник против крови против лимфатических узлов) или у разных людей. Клинические последствия такого метода значительны и выходят за рамки улучшения понимания роли Т- или В-клеток в различных иммуноопосредованных заболеваниях или злокачественных новообразованиях21. В онкологии NGS используется для идентификации специфических клонов, которые могут быть прогностическими биомаркерами для пациентов, которые, скорее всего, выиграют от современных иммунотерапий22,23,24. При лейкемии NGS используется для подтверждения полной эрадикации раковых клеток путем обнаружения остаточных лейкемических клонов, которые остаются у пациента послелечения 25.
Одним из основных ограничений анализа иммунного репертуара цельной ткани или образцов крови является неспособность идентифицировать изменения репертуара в менее частых популяциях. Например, если регуляторные Т-клетки, которые составляют всего несколько процентов от общего количества CD4+ Т-клеток, экспрессирует уникальный профиль репертуара, это будет упущено при проведении этих исследований на цельной крови. Эта проблема может быть решена путем проведения этих исследований на отсортированных иммунных популяциях. В качестве альтернативы, в последние годы была разработана технология, облегчающая соединение данных одноклеточной РНК с репертуарными профилями TCR илиIGH 26. Это обеспечивает еще один уровень функциональности Т- или В-клеток, поскольку транскрипционный ландшафт каждого клона может быть охарактеризован. В качестве примера Zemmour et al. использовали scRNAseq TCRseq для демонстрации того, что регуляторные Т-клетки из крови человека проявляют широкую гетерогенность с активированной субпопуляцией, которая транскрипционно связана с обычными Т-клетками27. Аналогичным образом, у пациентов с гепатоцеллюлярной карциномой этот метод идентифицировал 11 различных подмножеств Т-клеток, которые проникают в опухоль, каждый из которых имеет уникальный транскрипционный и репертуарный профиль28. Подобные исследования будут полезны, особенно при изучении редких популяций, и предоставят важную функциональную информацию о конкретных клонах.
NGS иммунного репертуара - это новая область исследований, которая дает новое представление об адаптивной иммунной функции и роли Т- и В-клеток в различных заболеваниях. Кроме того, он быстро входит в клинический мир в различных дисциплинах, отслеживая связанные с болезнью клонотипы. В настоящее время существует несколько доступных наборов для иммунного репертуара. Они основаны на аналогичной методологии, независимо от того, используют ли они РНК или ДНК в качестве источника. Они используют аналогичные методы для калибровки, коррекции смещения и инструментов анализа; и, следовательно, должны быть правильно подобраны в соответствии с конкретными требованиями. Одним из больших преимуществ текущего комплекта является то, что он является готовым к использованию и оптимизированным для иммунного репертуара человека, без необходимости калибровки. В будущем мы увидим больше исследований, использующих репертуарные функции в качестве биомаркеров для различных заболеваний, что потенциально также приведет к разработке таргетной терапии против этих клонов. Мы считаем, что исследователи должны рассмотреть возможность применения этих методов для изучения адаптивного иммунного ландшафта при различных расстройствах.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Всем авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
никакой.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-propanol | Sigma | I9516-500ML | |
| 1.7 mL micro-centrifuge tubes | Axygen | 8187631104051 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Greiner | 188261 | |
| Absolute ethanol | Merck | 1.08543.0250 | |
| Amplitaq Gold | Thermo Fisher | N8080241 | |
| AMPure XP Beads | Beckman Coulter | A63881 | |
| Heat block | Bioer | Not applicable | |
| High Sensitivity D1000 Sample Buffer | Agilent | 5067-5603 | For Tapestation |
| High Sensitivity D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5584 | For Tapestation. Tubes sold seperately |
| Lymphotrack Assay kit | Invivoscribe | TRB: 70-91210039 IGH: 70-92250019 | Each includes 24 indexes |
| MiSeq Reagent Kit v2 (500 cycle) | Illumina | MS-102-2003 | Includes standard flow cell type and all reagents required |
| MiSeq Sequencer | Illumina | SY-410-1003 | |
| PCR strips | 4titude | 4ti-0792 | |
| Proteinase K | Invitrogen | EO0491 | |
| Qubit 4 Fluorometer | Thermo Fisher | Q33226 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher | Q32854 | Includes buffer, dye, standards, and specialized tubes |
| Shaker | Biosan | Not applicable | |
| Tapestation 2100 Bioanalyzer | Agilent | G2940CA | |
| ultra pure water | Bio-lab | 7501 | |
| Wizard DNA isolation kit | Promega | A1120 | Includes cell lysis solution, nuclei lysis solution, and protein precipitation buffer |
References
- Bassing, C. H., Swat, W., Alt, F. W. The mechanism and regulation of chromosomal V(D)J recombination. Cell. 109, Suppl 45-55 (2002).
- Roth, D. B. V(D)J Recombination: Mechanism, Errors, and Fidelity. Microbiology Spectrum. 2 (6), (2014).
- Heather, J. M., Ismail, M., Oakes, T., Chain, B. High-throughput sequencing of the T-cell receptor repertoire: pitfalls and opportunities. Brief Bioinformatics. 19 (4), 554-565 (2018).
- Pabst, O., Hazanov, H., Mehr, R. Old questions, new tools: does next-generation sequencing hold the key to unraveling intestinal B-cell responses. Mucosal Immunology. 8 (1), 29-37 (2015).
- Bashford-Rogers, R. J. M., Smith, K. G. C., Thomas, D. C. Antibody repertoire analysis in polygenic autoimmune diseases. Immunology. 155 (1), 3-17 (2018).
- Lee, Y. N., et al. Characterization of T and B cell repertoire diversity in patients with RAG deficiency. Science Immunology. 1 (6), (2016).
- Werner, L., et al. Alterations in T and B Cell Receptor Repertoires Patterns in Patients With IL10 Signaling Defects and History of Infantile-Onset IBD. Frontiers Immunology. 11, 109 (2020).
- Zhang, J., et al. Immune receptor repertoires in pediatric and adult acute myeloid leukemia. Genome Medicine. 11 (1), 73 (2019).
- Chapman, C. G., et al. Characterization of T-cell Receptor Repertoire in Inflamed Tissues of Patients with Crohn's Disease Through Deep Sequencing. Inflammatory Bowel Diseases. 22 (6), 1275-1285 (2016).
- Werner, L., et al. Altered T cell receptor beta repertoire patterns in pediatric ulcerative colitis. Clinical and Experimental Immunology. 196 (1), 1-11 (2019).
- Bashford-Rogers, R. J. M., et al. Analysis of the B cell receptor repertoire in six immune-mediated diseases. Nature. 574 (7776), 122-126 (2019).
- Wu, J., et al. Expanded TCRbeta CDR3 clonotypes distinguish Crohn's disease and ulcerative colitis patients. Mucosal Immunology. 11 (5), 1487-1495 (2018).
- Rosati, E., et al. Identification of disease-associated traits and clonotypes in the T-cell receptor repertoire of monozygotic twins affected by inflammatory bowel diseases. Journam of Crohn's and Colitis. , (2019).
- Allez, M., et al. T cell clonal expansions in ileal Crohn's disease are associated with smoking behaviour and postoperative recurrence. Gut. 68 (11), 1961-1970 (2019).
- Li, S., et al. IMGT/HighV QUEST paradigm for T cell receptor IMGT clonotype diversity and next generation repertoire immunoprofiling. Nature Communications. 4, 2333 (2013).
- H, I. J., et al. Strategies for B-cell receptor repertoire analysis in primary immunodeficiencies: from severe combined immunodeficiency to common variable immunodeficiency. Frontiers Immunology. 6, 157 (2015).
- Ghraichy, M., Galson, J. D., Kelly, D. F., Truck, J. B-cell receptor repertoire sequencing in patients with primary immunodeficiency: a review. Immunology. 153 (2), 145-160 (2018).
- Zhuang, Y., et al. Application of immune repertoire sequencing in cancer immunotherapy. International Immunopharmacology. 74, 105688 (2019).
- Liu, X., et al. T cell receptor beta repertoires as novel diagnostic markers for systemic lupus erythematosus and rheumatoid arthritis. Annual Rheumatic Diseases. 78 (8), 1070-1078 (2019).
- Wong, G. K., Heather, J. M., Barmettler, S., Cobbold, M. Immune dysregulation in immunodeficiency disorders: The role of T-cell receptor sequencing. Journal of Autoimmunity. 80, 1-9 (2017).
- Delhalle, S., Bode, S. F. N., Balling, R., Ollert, M., He, F. Q. A roadmap towards personalized immunology. NPJ System Biology and Applications. 4, 9 (2018).
- Laubli, H., et al. The T cell repertoire in tumors overlaps with pulmonary inflammatory lesions in patients treated with checkpoint inhibitors. Oncoimmunology. 7 (2), 1386962 (2018).
- Hogan, S. A., et al. Peripheral Blood TCR Repertoire Profiling May Facilitate Patient Stratification for Immunotherapy against Melanoma. Cancer Immunology Research. 7 (1), 77-85 (2019).
- Aversa, I., Malanga, D., Fiume, G., Palmieri, C. Molecular T-Cell Repertoire Analysis as Source of Prognostic and Predictive Biomarkers for Checkpoint Blockade Immunotherapy. International Journal of Molecular Sciences. 21 (7), (2020).
- Hirsch, P., et al. Precision and prognostic value of clone-specific minimal residual disease in acute myeloid leukemia. Haematologica. 102 (7), 1227-1237 (2017).
- De Simone, M., Rossetti, G., Pagani, M. Single Cell T Cell Receptor Sequencing: Techniques and Future Challenges. Frontiers Immunology. 9, 1638 (2018).
- Zemmour, D., et al. Single-cell gene expression reveals a landscape of regulatory T cell phenotypes shaped by the TCR. Nature Immunology. 19 (3), 291-301 (2018).
- Zheng, C., et al. Landscape of Infiltrating T Cells in Liver Cancer Revealed by Single-Cell Sequencing. Cell. 169 (7), 1342-1356 (2017).
