Summary
El protocolo actual describe un método para el aislamiento del ADN de muestras de sangre y biopsias intestinales, la generación de bibliotecas de TCRβ y IGH PCR para la secuenciación de próxima generación, la realización de una ejecución de NGS y el análisis de datos básicos.
Abstract
La memoria inmunológica, el sello distintivo de la inmunidad adaptativa, es orquestada por linfocitos T y B. En la circulación y diferentes órganos, hay miles de millones de clones únicos de células T y B, y cada uno puede unirse a un antígeno específico, lo que lleva a la proliferación, diferenciación y / o secreción de citoquinas. La gran heterogeneidad en las células T y B es generada por la recombinación aleatoria de diferentes segmentos genéticos. Las tecnologías de secuenciación de próxima generación (NGS), desarrolladas en la última década, permiten una visión en profundidad sin precedentes del repertorio inmunológico de los receptores de células T y B. Los estudios en varias condiciones inflamatorias, inmunodeficiencias, infecciones y malignidades demostraron cambios marcados en clonality, uso del gen, y propiedades biofísicas del repertorio inmune, proporcionando penetraciones importantes sobre el papel de inmunorespuestas adaptante en diversos desordenes.
Aquí, proporcionamos un protocolo detallado para NGS del repertorio inmune de las células de T y de B de la sangre y del tejido. Presentamos una tubería a partir del aislamiento de ADN a través de la preparación de la biblioteca, la secuenciación en el secuenciador NGS y terminando con análisis básicos. Este método permite la exploración de células T y B específicas a nivel de nucleótidos o aminoácidos, y por lo tanto puede identificar cambios dinámicos en las poblaciones de linfocitos y parámetros de diversidad en diferentes enfermedades. Esta técnica está entrando lentamente en la práctica clínica y tiene el potencial para la identificación de nuevos biomarcadores, estratificación de riesgos y medicina de precisión.
Introduction
El sistema inmune adaptante, comprendido de linfocitos de T y de B, utiliza memoria inmunológica para reconocer un antígeno previamente encontrado e iniciar una respuesta rápida. Los linfocitos se generan en la médula ósea y maduran en el timo (células T) o la médula ósea (células B). Tanto el receptor de células T (TCR) como el receptor de células B (BCR) muestran configuraciones únicas que permiten el reconocimiento de antígenos específicos. En la homeostasis, las células T y B circulan y examinan constantemente los billones de péptidos diferentes presentados en las células presentadoras de antígenos. La ligadura TCR o BCR de un antígeno específico con alta afinidad, junto con la coestimulación adecuada, conduce a la activación celular, lo que resulta en la secreción de citoquinas, la expansión clonal y la generación de anticuerpos, en el caso de las células B.
La enorme variedad de las diferentes células T o B se denomina colectivamente repertorio inmune, lo que permite el reconocimiento de innumerables epítopos diferentes. Para generar un repertorio tan vasto, se lleva a cabo un complejo proceso de ensamblaje aleatorio de diferentes segmentos de genes, creando combinaciones casi infinitas de receptores que pueden unirse a antígenos únicos1. Este proceso, denominado recombinación V(D)J, incluye reordenamientos de diferentes genes variables (V), diversidad (D) y unión (J), acompañados de deleciones aleatorias e inserciones de nucleótidos en las uniones2.
La arquitectura del sistema inmune adaptativo ha interesado a científicos en diferentes campos durante muchas décadas. En el pasado, la secuenciación de Sanger, la determinación complementaria de espectros de la región 3 (CDR3) y la citometría de flujo se utilizaron para caracterizar el repertorio inmunológico, pero proporcionaron baja resolución. En la última década, los avances en los métodos de secuenciación de próxima generación (NGS) permitieron una visión profunda de las características y la composición de los repertorios de TCR y BCR de un individuo3,4. Estos sistemas de alto rendimiento (HTS) secuencian y procesan millones de productos TCR o BCR reorganizados simultáneamente y permiten un análisis de alta resolución de células T y B específicas a nivel de nucleótidos o aminoácidos. Ngs proporciona una nueva estrategia para estudiar el repertorio inmune en salud y enfermedad. Los estudios que utilizaron HTS demostraron repertorios alterados de TCR y BCR en enfermedades autoinmunes5,inmunodeficiencias primarias6,7,y malignidades, tales como en leucemia mieloide aguda8. Usando NGS, nosotros y otros hemos mostrado la extensión oligoclonal de las copias específicas de la célula de T y de B, en pacientes con la enfermedad de intestino inflamatoria (IBD), incluyendo colitis ulcerosa y la enfermedad de Crohn9,10,11,12,13,14. En general, los estudios de diferentes campos sugieren que los cambios en el repertorio tienen un papel crucial en la patogénesis de los trastornos inmuno-mediados.
El protocolo actual describe un método para el aislamiento del ADN de las biopsias intestinales y la sangre, la generación de bibliotecas de TCRβ y IGH PCR para NGS, y la realización de la secuenciación de ejecución. También proporcionamos pasos básicos en el análisis de datos del repertorio inmunológico. Este protocolo también se puede aplicar para la generación de bibliotecas TCRα, TCRγ e IGL. El método también es compatible con otros órganos (por ejemplo, ganglios linfáticos, tumores, líquido sinovial, tejido graso, etc.) siempre y cuando se utilicen protocolos de digestión específicos de tejidos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Este estudio fue aprobado por la junta de revisión institucional del Sheba Medical Center, y se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los sujetos participantes.
1. Aislamiento y cuantificación del ADN
- Digestión y lisis celular de biopsias intestinales
- Recuperar biopsias intestinales, ya sean recién recogidas o almacenadas a -20 °C u -80 °C. Si usa biopsias congeladas, descongele sobre hielo.
- Añadir 600 μL de solución de lisis de núcleos a un tubo de microcentrifuga estéril de 1,7 mL, refrigerado sobre hielo.
- Coloque la biopsia en un tubo de microcentrífuga con solución de lisis e incube a 65 °C durante 15-30 min.
- Añadir 17,5 μL de 20 mg/mL de proteinasa K e incubar durante la noche a 55 °C, con temblores suaves.
- Deje que la muestra se enfríe a temperatura ambiente durante 5 minutos antes de proceder al paso 1.3.
- Lisis celular de la sangre entera
- Obtenga 3 mL de sangre entera en un tubo que contiene EDTA, heparina o citrato.
- Rocíe suavemente el tubo hasta que se mezcle bien y transfiera sangre a un tubo de centrífuga estéril de 15 mL que contenga 9 mL de solución de lisis celular. Invertir varias veces durante un período de incubación de 10 min a temperatura ambiente.
- Centrífuga a 2.000 x g durante 10 min a temperatura ambiente, y luego deseche tanto sobrenadante como sea posible sin alterar el pellet blanco visible. Aproximadamente 50–100 μL de líquido residual permanecerán.
- Tubo de vórtice vigorosamente durante 15 s hasta que se resuspended completamente. Añadir 3 mL de solución de lisis de núcleos y pipeta varias veces. La solución debe volverse viscosa.
- Precipitación de proteínas
- Agregue 200 μL de tampón de precipitación de proteínas al tejido, o 1 mL a la sangre. Vórtice vigorosamente durante 20 s e incubar sobre hielo durante 5 min. Pequeños grupos de proteínas pueden ser visibles después del vórtice.
- Centrífuga a 16.000 x g durante 4 min. Se debe formar un pellet apretado que contenga proteínas precipitadas.
- Transfiera cuidadosamente el sobrenadante, sin molestar el pellet, a un nuevo tubo de 1,7 mL.
NOTA: Si el pellet no está apretado, considere otra centrífuga a 16,000 x g durante 4 min.
- Precipitación y rehidratación del ADN
- Añadir 1 mL de 2-propanol al tubo que contiene el sobrenadante, y mezclar suavemente invirtiendo. El ADN debe hacerse visible como sustancia flotante blanca.
- Centrífuga a 16.000 x g durante 1 min. Retire el sobrenadante completamente con una pipeta.
- Añadir 1 mL de etanol al 70% recién preparado, e invertir el tubo varias veces. Centrífuga a 16.000 x g durante 1 min a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante con cuidado.
- Repita el paso 1.4.3.
- Coloque el tubo abierto invertido sobre papel absorbente limpio durante 10-15 min. Vuelva a invertir el tubo y confirme la hidratación completa. Si es necesario, dejar secar al aire durante 10-15 min adicionales.
NOTA: Es crucial que el pellet se seque por completo. - Añadir 50 μL de agua ultra pura (UPW). Si es necesario, el ADN se puede diluir más después de la cuantificación.
- Incubar durante 1 h en bloque de calor a 65 °C, para la rehidratación del ADN.
- Cuantificación del ADN
NOTA: El ADN se cuantificó utilizando un fluorómetro y reactivos designados, como se especifica en la tabla de materiales.- Lleve los estándares a temperatura ambiente y prepare el kit, incluidos los tubos designados de 0.5 mL.
- Prepare la mezcla del almacenador intermediario y del tinte en un tubo de 15 mL, según el número de muestras. Añadir 200 μL de tampón y 1 μL de colorante por muestra. Incluya 2 muestras para los estándares. Se recomienda calcular una muestra adicional para evitar que el búfer no sea suficiente.
- Para los 2 estándares, coloque 190 μL de la mezcla preparada anteriormente en un tubo de 0.5 mL. Añadir 10 μL de la norma.
- Para cada muestra, coloque 199 μL de la mezcla preparada anteriormente en un tubo de 0,5 mL. Añadir 1 μL del ADN.
- Lea los ejemplos. El resultado indica la concentración de ADN de la muestra.
- Si las muestras están por encima del límite, diluya el ADN 1:10 con UPW y repita la lectura.
2. Preparación de la biblioteca
NOTA: El protocolo actual utiliza un múltiplex, kit de ensayo basado en PCR compatible con secuenciadores NGS. El kit contiene 24 índices diferentes, cada uno dirigido a regiones conservadas dentro de las regiones Vβ y Jβ. Esto permite una reacción de PCR de un solo paso y la agrupación de diferentes muestras. Consulte la tabla de materiales para obtener más detalles.
- Prepare las muestras de la DNA. Obtener 150 ng de ADN y añadir UPW para un total de 5 μL.
NOTA: Es posible utilizar menos de 150 ng de ADN para la preparación de la biblioteca, con una concentración mínima de 10 ng/μL. - Coloque pipetas y puntas en la campana con luz UV durante 15 minutos para descomponer el ADN residual. Mientras tanto, permita que diferentes tubos de índice (para la preparación de la biblioteca) y la ADN polimerasa se descongele en el hielo.
- En una campana biológica, agregue 45 μL de los diferentes tubos índice en los tubos de PCR. A continuación, añadir 0,2 μL de la ADN polimerasa y los 5 μL de ADN preparados en el paso 2,1 en tubos de PCR.
- Ejecute la reacción de PCR utilizando un programa preestablecido, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
3. Purificación y cuantificación de amplicones
- Utilice perlas magnéticas para la eliminación del exceso de cebadores, nucleótidos y enzimas.
- Caliente las cuentas al menos 30 minutos a temperatura ambiente. Prepare suficiente etanol fresco al 80% para 400 μL por muestra.
- Añadir 50 μL (IGH) o 35 μL (TCRβ) de las perlas a cada tubo de PCR y mezclar pipeteando 10 veces. Incubar 10 min a temperatura ambiente.
- Coloque la muestra mixta en el soporte magnético durante 5 min.
- Aspirar 95 μL (IGH) u 80 μL (TCRβ) del líquido transparente y desechar. Aspirar el líquido restante usando una punta de 10 μL.
- Añadir 200 μL de etanol al 80% a cada muestra. Incubar 30 s. Aspirar 195 μL de etanol y desechar. Aspirar el líquido restante usando una punta de 10 μL.
- Repita el paso 3.1.5. Abra las tapas de los tubos y deje secar al aire durante 5 min.
- Inmediatamente después de los 5 min, retirar del soporte magnético y añadir 25 μL de tampón de elución (10 mM Tris-HCl, pH 8.0). Mezclar por pipeteo hasta que sea homogéneo. Incubar a temperatura ambiente durante 2 min.
- Coloque los tubos en el soporte magnético durante 5 min. Transferir 22 μL a un nuevo tubo de PCR. Medir la concentración de ADN (paso 1.5).
- Cuantificación de Amplicon
NOTA: El protocolo actual utiliza una máquina de electroforesis automatizada para el control de calidad de la concentración de ADN, el tamaño y la integridad. Consulte la tabla de materiales para obtener más detalles.- Coloque los reactivos y la cinta de cribar a temperatura ambiente durante al menos 30 min.
- En un nuevo tubo de microcentrifugación de 1,7 mL, realice una dilución de 1 ng/μL de las muestras de ADN cuantificadas en el paso 3.1.8 con UPW para un volumen total de al menos 3 μL.
- Adn diluido de vórtice antes de su uso. Coloque 2 μL de tampón, junto con 2 μL del ADN diluido en las tiras de PCR especializadas preetiquetados (proporcionadas en el kit) y coloque las tapas. Colocar en la coctelera durante 1 min, seguido de girar hacia abajo de las tiras de PCR.
NOTA: Debido a la viscosidad del tampón, asegúrese de que el exceso de tampón se elimine de la punta antes de transferirlo a los tubos de muestra. - Coloque en la máquina, la cinta de pantalla y las tiras de PCR sin las tapas. Abra la tapa de la caja de la punta dentro de la máquina. Asigne la posición con las etiquetas adecuadas. Inicie la máquina.
NOTA: El histograma de salida debe ser un solo pico en el tamaño deseado de los amplicones (Figura 1A). En muestras de mala calidad, se observarán picos adicionales (Figura 1B), indicando mala limpieza de perlas o formación de dímeros de cebadores.
4. Secuenciación de próxima generación
- Cuantificación y puesta en común de la biblioteca
- Calcular la concentración final de ADN en nM, utilizando el valor de ADN del paso 3.1.8, y el tamaño en pares de bases (bp) del pico del producto, obtenido a partir de los resultados de la máquina de electroforesis (ver Figura 1).
- Para cada muestra, calcular el volumen de ADN a tomar para una concentración final de 4 nM, en un volumen final de 10-20 μL de tampón de elución.
- Prepare una nueva mezcla de dilución para cada muestra y tome 2 μL de ella a una nueva mezcla de piscina.
Nota : para las muestras que tienen menos de 4 nM, agregue la cantidad máxima de muestra posible.
- Ngs funcionamiento de la biblioteca
Nota : el protocolo actual utiliza una plataforma de secuenciador de sobremesa. Consulte la tabla de materiales para obtener más detalles.- Preparar una solución fresca de 0,2 N NaOH. Añadir 10 μL de 0,2 N NaOH a la biblioteca diluida preparada en el paso 4.1.3. Agregue 5% PhiX al tubo y al vórtice brevemente. Gire hacia abajo el tubo para asegurarse de que toda la solución se ha asentado en la parte inferior del tubo.
- Incubar durante 5 min a temperatura ambiente para desnaturalizar el ADN de doble cadena. Agregue 980 μL de tampón pre-refrigerado del kit al tubo que contiene ADN y vórtice brevemente.
- Coloque la biblioteca diluida sobre hielo y prepare la biblioteca de la siguiente manera. Para una mezcla de 17 pM, añadir 425 μL de ADN del paso 4.2.2 y 575 μL de tampón. Invertir la biblioteca varias veces y girar hacia abajo. Cargue 600 μL de la biblioteca final en el cartucho designado y coloque muestras en la máquina.
- Inicie la ejecución siguiendo las instrucciones del software.
5. Análisis de secuenciación
- Descargue las métricas de secuenciación del secuenciador y compruebe que los datos de secuenciación están dentro de los siguientes intervalos (específicos para el kit utilizado en el protocolo actual). Los ejemplos que no cumplen estos criterios están sujetos a repetición de ejecución:
Densidad de clúster (Densidad (K/mm2)): 945K – 1800K
Porcentaje de filtro de paso de lecturas (clústeres PF (%)): >90%
Puntuaciones de calidad (%>=Q30): >85%
Alineación PhiX (alineada %): 1.5% - 10%
Tasa de error de PhiX (%): <1,0%
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Adjunto, describimos un método para el aislamiento de la DNA del tejido y de la sangre intestinales, la preparación de las bibliotecas para ngs, y los pasos básicos de un funcionamiento de la secuenciación para la secuencia del repertorio inmune. La ejecución generará archivos fastq, que se pueden convertir en archivos fasta para su uso en la plataforma internacional ImMunoGeneTics (IMGT) / HighV-QUEST. Este HTS realiza y gestiona muchos análisis de decenas de miles de secuencias tcrβ y IGH reorganizadas, a nivel de nucleótidos15. IMGT/HighV-QUEST permite el análisis de diferentes repertorios de TCRs y IGH tanto en salud como en enfermedad. Esto puede conducir a la identificación de nuevos clones "específicos de la enfermedad", el análisis de los parámetros clonales de expansión y diversidad, la delineación del uso diferencial de V (D) J, el análisis de hiper-mutaciones somáticas y más. El IMGT/HighV-QUEST proporciona archivos CSV, que contienen secuencias específicas y su abundancia. El uso del ADN genómico como material de partida produce números de secuencia que son representativos de los números celulares. Por lo tanto, si la cantidad de ADN original es igual, también se puede calcular el porcentaje de células T en una muestra dada.
Incluimos un análisis básico de la sangre representativa, autóloga y de muestras rectales de un paciente con deficiencia del receptor IL10 y la historia del infantil-inicio severo IBD, resultando de una mutación deletérea de IL10RA. Las muestras fueron ensayadas para el repertorio tcrβ y igh. La muestra de TCRβ intestinal produjo un total de 12.450 secuencias, de las cuales 9.050 secuencias fueron únicas. La muestra de TCRβ de sangre tuvo un total de 54.880 secuencias, de las cuales 35.110 fueron únicas. En la muestra de CIB intestinal se obtuvieron un total de 49.070 secuencias, de las cuales 23.670 fueron únicas. En la muestra de IGH de sangre se obtuvieron un total de 13.710 secuencias, de las cuales 13.540 fueron únicas. Todos los clones pueden ser identificados por su secuencia única tanto a nivel de nucleótidos como de aminoácidos. Estas secuencias se pueden comparar entre diferentes pacientes, en busca de clones compartidos, o en el mismo paciente entre diferentes sitios anatómicos (por ejemplo, sangre frente a intestino). Presentamos para cada una de las muestras los 5 clones más frecuentes(Tabla 1).
Para cuantificar el grado de expansión clonal se pueden utilizar diferentes índices, incluyendo H de Shannon, Gini-Simpson, entropía y clonalidad. Como ejemplo, shannon' S H, que toma en cuenta el número de secuencias únicas (riqueza del repertorio) y cómo se distribuyen uniformemente fue encontrado para ser disminuido en el IGH intestinal del paciente contra la sangre (8,3 contra 9,5), sugiriendo la extensión clónica de las células de B en la tripa inflamada.
Para una amplia visión general del repertorio, se generaron imágenes de Treemap (www.treemap.com) (Figura 2). Cada cuadrado de color representa un clon diferente, y el tamaño se correlaciona con su frecuencia. Estas imágenes de Treemap demuestran la extensión clónica en el repertorio intestinal de IGH comparado con la sangre. En contraste, en el repertorio TCRβ, se observa una marcada expansión clonal en la sangre, en comparación con el intestino autólogo.
A nivel de genes, NGS proporciona información sobre el uso de V-D- y J- a nivel de cualquiera de los genes, familias o alelos, como se muestra en la Tabla 1. Además, se pueden inferir combinaciones específicas de V(D)J de los datos de los repertorios TCRβ y IGH(Figura 3A,B),que pueden revelar patrones diferenciales de uso de genes en diversas condiciones. También se pueden analizar las propiedades biofísicas de la región CDR3, como la longitud(Tabla 1)o la hidrofobicidad. Es importante destacar que la distribución de la longitud de CDR3 se altera en diferentes trastornos inmuno-mediados10,16,17. Por ejemplo, en pacientes deficientes en IL10R, las células T derivadas de la sangre, pero no las células B, tienen una longitud de CDR3 más corta, e hidrofobicidad diferencial, en comparación con los controles sanos7.
Figura 1: Datos representativos del bioanizador. Imágenes representativas de muestras de TCRβ intestinales que muestran resultados óptimos(A)con el pico deseado a 400 pb. Un ejemplo de una biblioteca de baja calidad(B)con picos adicionales en 179bp y 114bp (marcado *). Los picos vistos en los extremos son marcadores superiores e inferiores de la tira de electroforesis. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Figura 2: Visión general del repertorio inmune de células T y B. Diagramas treemap de muestras de sangre e intestinales de TCRβ y IGH. Cada cuadrado de color representa un clon diferente, y el tamaño se correlaciona con su frecuencia. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Figura 3: Gráficos representativos del uso de TCRβ y IGH V-J. Una muestra intestinal representativa que representa el número total de secuencias para cada combinación V-J en TCRβ(A)o IGH(B). Los datos no se muestran para el uso de D. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Los cambios en la abundancia y la función de los linfocitos B y T se encuentran a menudo en diferentes neoplasias malignas18,trastornos inflamatorios crónicos (por ejemplo, colitis ulcerosa y artritis reumatoide)10,19,y en diversas inmunodeficiencias17,20. El método actual utiliza NGS para facilitar una visión en profundidad de los repertorios de TCR y BCR, lo que permite la detección de cambios sutiles en la clonalidad de las células T y B, el intercambio de clones, el uso del gen V (D) J, y la información sobre el grado de hiper-mutaciones somáticas en el caso de las células B.
El método de aislamiento de la DNA fue descrito para las biopsias intestinales y las muestras de sangre. Sin embargo, con modificaciones de lisis y extracción de ADN, el método se puede aplicar a otros tejidos como tumores, ganglios linfáticos, líquido sinovial, etc. Es importante durante la preparación de la biblioteca no contaminar los diferentes juegos de imprimación. En la limpieza de cuentas, se debe tener cuidado de dejar los tubos en el imán en todo momento de la incubación. Para muestras de ADN de bajas concentraciones, las existencias se pueden concentrar a 65 °C durante 10-20 minutos. Además, los amplicones se pueden eluer de perlas en tan solo 20 μL de búfer de elución.
Diversas técnicas usadas en el pasado para caracterizar el paisaje de la composición de la célula de T y de B proporcionaron solamente una descripción superficial del repertorio inmune. Una de las mayores ventajas de NGS para el análisis del repertorio inmunológico es la capacidad de identificar clones únicos y, en consecuencia, rastrearlos en diferentes sitios anatómicos (por ejemplo, intestino vs. sangre vs. ganglio linfático) o en diferentes individuos. Las implicaciones clínicas de tal técnica son significativas, y van más allá de mejorar la comprensión del papel de las células T o B en diferentes enfermedades inmunomediadas o neoplasias malignas21. En oncología, ngs se utiliza para identificar clones específicos que pueden ser biomarcadores predictivos para los pacientes que muy probablemente se beneficiarán de las inmunoterapias actuales22,23,24. En la leucemia, el NGS se utiliza para confirmar la erradicación completa de las células cancerosas mediante la detección de clones leucémicos residuales que permanecen en un paciente después del tratamiento25.
Una de las principales limitaciones del análisis del repertorio inmune de muestras de tejido entero o sangre es la incapacidad de identificar cambios en el repertorio en poblaciones menos frecuentes. Por ejemplo, si las células T reguladoras, que comprenden sólo unos pocos porcentajes del total de células T CD4+, expresan un perfil de repertorio único, esto se perdería si se realizan estos estudios en sangre entera. Este problema podría abordarse mediante la realización de estos estudios en poblaciones inmunitarias clasificadas. Alternativamente, en los últimos años se ha desarrollado tecnología para facilitar el acoplamiento de datos de ARN unicelular con perfiles de repertorio TCR o IGH26. Esto proporciona otro nivel de funcionalidad de las células T o B, ya que se puede caracterizar el paisaje transcripcional de cada clon. Como ejemplo, Zemmour et al. utilizaron scRNAseq TCRseq para demostrar que las células T reguladoras de la sangre humana, muestran una amplia heterogeneidad con una subpoblación activada que está relacionada transcripcionalmente con las células T convencionales27. Del mismo modo, en pacientes con carcinoma hepatocelular este método identificó 11 subconjuntos distintos de células T que se infiltran en el tumor, cada uno con un perfil transcripcional y de repertorio único28. Estudios como estos serán útiles especialmente cuando se estudian poblaciones raras, y proporcionarán información funcional importante de clones específicos.
Ngs del repertorio inmune es un nuevo campo de investigación que proporciona nuevas ideas sobre la función inmune adaptativa y el papel de las células T y B en diversas enfermedades. Además, está entrando rápidamente en el mundo clínico en diferentes disciplinas, mediante el seguimiento de clonotipos asociados a la enfermedad. Actualmente hay varios kits disponibles para el repertorio inmunológico. Estos se basan en una metodología similar, independientemente de si utilizan ARN o ADN como fuente. Utilizan técnicas similares para la calibración, las correcciones de sesgo y las herramientas de análisis; y por lo tanto necesitan ser elegidos adecuadamente de acuerdo con las demandas específicas. Una de las grandes ventajas del kit actual es que es un kit listo para usar y optimizado para el repertorio inmunológico humano, sin necesidad de calibración. En el futuro veremos más estudios que utilicen características del repertorio como biomarcadores para diferentes enfermedades, lo que podría conducir también al desarrollo de terapias dirigidas contra estos clones. Creemos que los investigadores deben considerar la aplicación de estos métodos para estudiar el paisaje inmune adaptativo en diferentes trastornos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Todos los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
ninguno.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-propanol | Sigma | I9516-500ML | |
| 1.7 mL micro-centrifuge tubes | Axygen | 8187631104051 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Greiner | 188261 | |
| Absolute ethanol | Merck | 1.08543.0250 | |
| Amplitaq Gold | Thermo Fisher | N8080241 | |
| AMPure XP Beads | Beckman Coulter | A63881 | |
| Heat block | Bioer | Not applicable | |
| High Sensitivity D1000 Sample Buffer | Agilent | 5067-5603 | For Tapestation |
| High Sensitivity D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5584 | For Tapestation. Tubes sold seperately |
| Lymphotrack Assay kit | Invivoscribe | TRB: 70-91210039 IGH: 70-92250019 | Each includes 24 indexes |
| MiSeq Reagent Kit v2 (500 cycle) | Illumina | MS-102-2003 | Includes standard flow cell type and all reagents required |
| MiSeq Sequencer | Illumina | SY-410-1003 | |
| PCR strips | 4titude | 4ti-0792 | |
| Proteinase K | Invitrogen | EO0491 | |
| Qubit 4 Fluorometer | Thermo Fisher | Q33226 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher | Q32854 | Includes buffer, dye, standards, and specialized tubes |
| Shaker | Biosan | Not applicable | |
| Tapestation 2100 Bioanalyzer | Agilent | G2940CA | |
| ultra pure water | Bio-lab | 7501 | |
| Wizard DNA isolation kit | Promega | A1120 | Includes cell lysis solution, nuclei lysis solution, and protein precipitation buffer |
References
- Bassing, C. H., Swat, W., Alt, F. W. The mechanism and regulation of chromosomal V(D)J recombination. Cell. 109, Suppl 45-55 (2002).
- Roth, D. B. V(D)J Recombination: Mechanism, Errors, and Fidelity. Microbiology Spectrum. 2 (6), (2014).
- Heather, J. M., Ismail, M., Oakes, T., Chain, B. High-throughput sequencing of the T-cell receptor repertoire: pitfalls and opportunities. Brief Bioinformatics. 19 (4), 554-565 (2018).
- Pabst, O., Hazanov, H., Mehr, R. Old questions, new tools: does next-generation sequencing hold the key to unraveling intestinal B-cell responses. Mucosal Immunology. 8 (1), 29-37 (2015).
- Bashford-Rogers, R. J. M., Smith, K. G. C., Thomas, D. C. Antibody repertoire analysis in polygenic autoimmune diseases. Immunology. 155 (1), 3-17 (2018).
- Lee, Y. N., et al. Characterization of T and B cell repertoire diversity in patients with RAG deficiency. Science Immunology. 1 (6), (2016).
- Werner, L., et al. Alterations in T and B Cell Receptor Repertoires Patterns in Patients With IL10 Signaling Defects and History of Infantile-Onset IBD. Frontiers Immunology. 11, 109 (2020).
- Zhang, J., et al. Immune receptor repertoires in pediatric and adult acute myeloid leukemia. Genome Medicine. 11 (1), 73 (2019).
- Chapman, C. G., et al. Characterization of T-cell Receptor Repertoire in Inflamed Tissues of Patients with Crohn's Disease Through Deep Sequencing. Inflammatory Bowel Diseases. 22 (6), 1275-1285 (2016).
- Werner, L., et al. Altered T cell receptor beta repertoire patterns in pediatric ulcerative colitis. Clinical and Experimental Immunology. 196 (1), 1-11 (2019).
- Bashford-Rogers, R. J. M., et al. Analysis of the B cell receptor repertoire in six immune-mediated diseases. Nature. 574 (7776), 122-126 (2019).
- Wu, J., et al. Expanded TCRbeta CDR3 clonotypes distinguish Crohn's disease and ulcerative colitis patients. Mucosal Immunology. 11 (5), 1487-1495 (2018).
- Rosati, E., et al. Identification of disease-associated traits and clonotypes in the T-cell receptor repertoire of monozygotic twins affected by inflammatory bowel diseases. Journam of Crohn's and Colitis. , (2019).
- Allez, M., et al. T cell clonal expansions in ileal Crohn's disease are associated with smoking behaviour and postoperative recurrence. Gut. 68 (11), 1961-1970 (2019).
- Li, S., et al. IMGT/HighV QUEST paradigm for T cell receptor IMGT clonotype diversity and next generation repertoire immunoprofiling. Nature Communications. 4, 2333 (2013).
- H, I. J., et al. Strategies for B-cell receptor repertoire analysis in primary immunodeficiencies: from severe combined immunodeficiency to common variable immunodeficiency. Frontiers Immunology. 6, 157 (2015).
- Ghraichy, M., Galson, J. D., Kelly, D. F., Truck, J. B-cell receptor repertoire sequencing in patients with primary immunodeficiency: a review. Immunology. 153 (2), 145-160 (2018).
- Zhuang, Y., et al. Application of immune repertoire sequencing in cancer immunotherapy. International Immunopharmacology. 74, 105688 (2019).
- Liu, X., et al. T cell receptor beta repertoires as novel diagnostic markers for systemic lupus erythematosus and rheumatoid arthritis. Annual Rheumatic Diseases. 78 (8), 1070-1078 (2019).
- Wong, G. K., Heather, J. M., Barmettler, S., Cobbold, M. Immune dysregulation in immunodeficiency disorders: The role of T-cell receptor sequencing. Journal of Autoimmunity. 80, 1-9 (2017).
- Delhalle, S., Bode, S. F. N., Balling, R., Ollert, M., He, F. Q. A roadmap towards personalized immunology. NPJ System Biology and Applications. 4, 9 (2018).
- Laubli, H., et al. The T cell repertoire in tumors overlaps with pulmonary inflammatory lesions in patients treated with checkpoint inhibitors. Oncoimmunology. 7 (2), 1386962 (2018).
- Hogan, S. A., et al. Peripheral Blood TCR Repertoire Profiling May Facilitate Patient Stratification for Immunotherapy against Melanoma. Cancer Immunology Research. 7 (1), 77-85 (2019).
- Aversa, I., Malanga, D., Fiume, G., Palmieri, C. Molecular T-Cell Repertoire Analysis as Source of Prognostic and Predictive Biomarkers for Checkpoint Blockade Immunotherapy. International Journal of Molecular Sciences. 21 (7), (2020).
- Hirsch, P., et al. Precision and prognostic value of clone-specific minimal residual disease in acute myeloid leukemia. Haematologica. 102 (7), 1227-1237 (2017).
- De Simone, M., Rossetti, G., Pagani, M. Single Cell T Cell Receptor Sequencing: Techniques and Future Challenges. Frontiers Immunology. 9, 1638 (2018).
- Zemmour, D., et al. Single-cell gene expression reveals a landscape of regulatory T cell phenotypes shaped by the TCR. Nature Immunology. 19 (3), 291-301 (2018).
- Zheng, C., et al. Landscape of Infiltrating T Cells in Liver Cancer Revealed by Single-Cell Sequencing. Cell. 169 (7), 1342-1356 (2017).
