Summary
Den nåværende protokollen beskriver en metode for DNA-isolasjon fra blodprøver og tarmbiopsier, generering av TCRβ- og IGH PCR-biblioteker for neste generasjons sekvensering, ytelse av en NGS-kjøring og grunnleggende dataanalyse.
Abstract
Immunologisk minne, kjennetegnet på adaptiv immunitet, er orkestrert av T- og B-lymfocytter. I omløp og forskjellige organer er det milliarder av unike T- og B-cellekloner, og hver og en kan binde et bestemt antigen, noe som fører til spredning, differensiering og / eller cytokin sekresjon. Den enorme heterogeniteten i T- og B-celler genereres ved tilfeldig rekombinasjon av forskjellige genetiske segmenter. Neste generasjons sekvenseringsteknologier (NGS), utviklet i løpet av det siste tiåret, muliggjør et enestående dyptgående syn på T- og B-cellereseptorens immunrepertoar. Studier på ulike inflammatoriske tilstander, immunsvikt, infeksjoner og maligniteter viste markerte endringer i klonalitet, genbruk og biofysiske egenskaper til immunrepertoar, noe som gir viktig innsikt om rollen som adaptive immunresponser i forskjellige lidelser.
Her gir vi en detaljert protokoll for NGS av immunrepertoar av T- og B-celler fra blod og vev. Vi presenterer en rørledning som starter fra DNA-isolasjon gjennom bibliotekforberedelse, sekvensering på NGS sequencer og slutter med grunnleggende analyser. Denne metoden muliggjør utforskning av spesifikke T- og B-celler på nukleotid- eller aminosyrenivå, og kan dermed identifisere dynamiske endringer i lymfocyttpopulasjoner og mangfoldsparametere i forskjellige sykdommer. Denne teknikken går sakte inn i klinisk praksis og har potensial for identifisering av nye biomarkører, risikostratifisering og presisjonsmedisin.
Introduction
Det adaptive immunforsvaret, som består av T- og B-lymfocytter, bruker immunologisk minne for å gjenkjenne et tidligere påtruffet antigen og initiere en rask respons. Lymfocytter genereres i benmargen og modnes i tymus (T-celler) eller benmarg (B-celler). Både T-cellereseptoren (TCR) og B-cellereseptoren (BCR) viser unike konfigurasjoner som tillater gjenkjennelse av spesifikke antigener. I homeostase sirkulerer T- og B-celler hele tiden og kartlegger billioner av forskjellige peptider presentert på antigen-presenterende celler. TCR eller BCR ligasjon av et bestemt antigen med høy affinitet, sammen med passende kostimulering, fører til celleaktivering, noe som resulterer i cytokin sekresjon, klonisk ekspansjon og generering av antistoffer, i tilfelle av B-celler.
Det enorme utvalget av de forskjellige T- eller B-cellene kalles kollektivt immunrepertoar, noe som muliggjør anerkjennelse av utallige forskjellige epitoper. For å generere et så stort repertoar foregår en kompleks prosess med tilfeldig montering av forskjellige gensegmenter, og skaper nesten uendelige kombinasjoner av reseptorer som kan binde unike antigener1. Denne prosessen, kalt V(D)J-rekombinasjon, inkluderer omorganiseringer av forskjellige variable (V), mangfoldsgener (D) og sammenføyningsgener (J), ledsaget av tilfeldige slettinger og innsettinger av nukleotider i veikryssene2.
Arkitekturen til det adaptive immunforsvaret har interessert forskere på forskjellige felt i mange tiår. Tidligere ble Sanger-sekvensering, komplementær bestemmelse av region 3 (CDR3) spektratyping og strømningscytometri brukt til å karakterisere immunrepertoaret, men ga lav oppløsning. I løpet av det siste tiåret har fremskritt innen neste generasjons sekvenseringsmetoder (NGS) gjort det mulig med dyptgående innsikt i egenskapene og sammensetningen til en persons TCR- og BCR-repertoarer3,4. Disse høygjennomstrømningssystemene (HTS) sekvenserer og behandler millioner av omorganiserte TCR- eller BCR-produkter samtidig og tillater en høyoppløselig analyse av spesifikke T- og B-celler på nukleotid- eller aminosyrenivå. NGS gir en ny strategi for å studere immunrepertoaret i både helse og sykdom. Studier som benytter HTS viste endrede TCR- og BCR-repertoarer ved autoimmune sykdommer5, primær immunsvikt6,7og malignitet, som i akutt myeloid leukemi8. Ved hjelp av NGS har vi og andre vist oligoklonal utvidelse av spesifikke T- og B-cellekloner, hos pasienter med inflammatorisk tarmsykdom (IBD), inkludert ulcerøs kolitt og Crohns sykdom9,10,11,12,13,14. Samlet sett tyder studier fra ulike felt på at endringer i repertoaret har en avgjørende rolle i patogenesen av immunmediede lidelser.
Den nåværende protokollen beskriver en metode for isolering av DNA fra tarmbiopsier og blod, generering av TCRβ- og IGH PCR-biblioteker for NGS, og utførelse av sekvenseringsløp. Vi tilbyr også grunnleggende trinn i immunrepertoardataanalyse. Denne protokollen kan også brukes for generering av TCRα-, TCRγ- og IGL-biblioteker. Metoden er også kompatibel med andre organer (f.eks. lymfeknuter, svulster, synovialvæske, fettvev, etc.) så lenge vevsspesifikke fordøyelsesprotokoller brukes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne studien ble godkjent av institusjonsstyret ved Sheba Medical Center, og informert skriftlig samtykke ble innhentet fra alle deltakende.
1. DNA-isolasjon og kvantifisering
- Fordøyelse og cellelys av tarmbiopsier
- Hent intestinale biopsier, enten ferskt samlet eller de som er lagret ved -20 °C eller -80 °C. Hvis du bruker frosne biopsier, tine på is.
- Tilsett 600 μL nuklei lysis-oppløsning til et sterilt mikrosentrifugerør på 1,7 ml, kjølt på is.
- Plasser biopsi i et mikrocentrifugerør med lysisoppløsning og inkuber ved 65 °C i 15–30 minutter.
- Tilsett 17,5 μL 20 mg/ml proteinase K og inkuber over natten ved 55 °C, med skånsom risting.
- La prøven avkjøles til romtemperatur i 5 minutter før du går videre til trinn 1.3.
- Cellelys av fullblod
- Få 3 ml fullblod i EDTA-, heparin- eller sitratholdig rør.
- Gyngerøret forsiktig til det er grundig blandet, og overfør blod til et sterilt 15 ml sentrifugerør som inneholder 9 ml cellelysoppløsning. Inverter flere ganger i løpet av en 10 min inkubasjonsperiode ved romtemperatur.
- Sentrifuge ved 2000 x g i 10 minutter ved romtemperatur, og kast deretter så mye supernatant som mulig uten å forstyrre den synlige hvite pelletsen. Omtrent 50–100 μL restvæske vil forbli.
- Virvelrør kraftig i 15 s til det er helt resuspendert. Tilsett 3 ml nuklei lysis-oppløsning og pipet flere ganger. Løsningen skal bli viskøs.
- Protein nedbør
- Tilsett 200 μL proteinutfellingsbuffer til vevet, eller 1 ml til blodet. Virvel kraftig i 20 s og inkuberer på is i 5 min. Små proteinklumper kan være synlige etter virveling.
- Sentrifuge ved 16.000 x g i 4 min. En tett pellets som inneholder utfelte proteiner bør dannes.
- Overfør forsiktig supernatant, uten å forstyrre pelletsen, til et nytt 1,7 ml rør.
MERK: Hvis pelletsen ikke er stram, bør du vurdere en annen sentrifuge på 16 000 x g i 4 minutter.
- DNA-nedbør og rehydrering
- Tilsett 1 ml 2-propanol i røret som inneholder supernatanten, og bland forsiktig ved å invertere. DNA skal bli synlig som hvit flytende substans.
- Sentrifuge ved 16.000 x g i 1 min. Fjern supernatanten helt ved hjelp av en pipette.
- Tilsett 1 ml nylaget 70% etanol, og inverter røret flere ganger. Sentrifuge ved 16.000 x g i 1 min ved romtemperatur. Kast supernatanten forsiktig.
- Gjenta trinn 1.4.3.
- Plasser åpent rør invertert på rent absorberende papir i 10-15 min. Snu røret igjen og bekreft fullstendig hydrering. Om nødvendig, la det lufttørke i ytterligere 10-15 min.
MERK: Det er avgjørende for pellets å tørke helt. - Tilsett 50 μL ultra-rent vann (UPW). Om nødvendig kan DNA fortynnes mer etter kvantifisering.
- Inkuber i 1 time på varmeblokk ved 65 °C, for DNA-rehydrering.
- DNA-kvantifisering
MERK: DNA ble kvantifisert ved hjelp av et fluorometer og utpekte reagenser, som spesifisert i materialtabellen.- Ta med standarder for romtemperatur og klargjør settet, inkludert 0,5 ml utpekte rør.
- Forbered buffer og fargeblanding i et 15 ml rør, i henhold til antall prøver. Tilsett 200 μL buffer og 1 μL fargestoff per prøve. Ta med to eksempler for standarder. Det anbefales å beregne et ekstra utvalg for å unngå at bufferen ikke vil være tilstrekkelig.
- For de 2 standardene, plasser 190 μL av den overlagde blandingen i 0,5 ml rør. Tilsett 10 μL av standarden.
- For hver prøve plasserer du 199 μL av den ovennevnte blandingen i 0,5 ml rør. Tilsett 1 μL av DNA-et.
- Les prøvene. Resultatet indikerer DNA-konsentrasjon av prøven.
- Hvis prøver er over grensen, fortynn DNA 1:10 med UPW, og gjenta lesing.
2. Forberedelse av bibliotek
MERK: Den nåværende protokollen bruker et MULTIPLEX, PCR-basert analysesett som er kompatibelt med NGS-sequencere. Settet inneholder 24 forskjellige indekser som hver er rettet mot bevarte regioner iV-β og J β-regionene. Dette muliggjør en ett-trinns PCR-reaksjon og sammenslåing av forskjellige prøver. Se tabell over materialer for mer informasjon.
- Forbered DNA-prøver. Oppnå 150 ng DNA og tilsett UPW for totalt 5 μL.
MERK: Det er mulig å bruke mindre enn 150 ng DNA til biblioteksforberedelse, med en minimumskonsentrasjon på 10 ng/μL. - Plasser pipetter og spisser i hetten med UV-lys i 15 minutter for å bryte ned gjenværende DNA. I mellomtiden tillater forskjellige indeksrør (for bibliotekforberedelse) og DNA-polymerase å tine på is.
- I en biologisk hette, tilsett 45 μL fra de forskjellige indeksrørene i PCR-rør. For å følge, legg til 0,2 μL av DNA-polymerasen og 5 μL DNA fremstilt i trinn 2.1 i PCR-rør.
- Kjør PCR-reaksjon ved hjelp av et forhåndsinnstilt program, i henhold til produsentens instruksjoner.
3. Forsterkning og kvantifisering
- Bruk magnetiske perler for fjerning av overflødige primere, nukleotider og enzymer.
- Varm perlene minst 30 min til romtemperatur. Forbered nok frisk 80% etanol for 400 μL per prøve.
- Tilsett 50 μL (IGH) eller 35 μL (TCRβ) av perlene til hvert PCR-rør og bland ved pipettering 10 ganger. Inkuber 10 min ved romtemperatur.
- Plasser den blandede prøven på det magnetiske stativet i 5 min.
- Aspirer 95 μL (IGH) eller 80 μL (TCRβ) av den klare væsken og kast. Aspirer gjenværende væske ved hjelp av en 10 μL spiss.
- Tilsett 200 μL 80 % etanol i hver prøve. Inkuber 30 s. Aspirat 195 μL etanol og kast. Aspirer gjenværende væske ved hjelp av 10 μL spiss.
- Gjenta trinn 3.1.5. Åpne hettene på rørene og la luften tørke i 5 min.
- Umiddelbart etter 5 min, fjern fra magnetisk stativ og tilsett 25 μL elutionbuffer (10 mM Tris-HCl, pH 8.0). Bland ved pipettering til homogen. Inkuber ved romtemperatur i 2 min.
- Plasser rørene på det magnetiske stativet i 5 min. Overfør 22 μL til et nytt PCR-rør. Mål DNA-konsentrasjonen (trinn 1.5).
- Amplicon kvantifisering
MERK: Den nåværende protokollen bruker en automatisert elektroforesemaskin for kvalitetskontroll av DNA-konsentrasjon, størrelse og integritet. Se tabell over materialer for mer informasjon.- Plasser reagenser og skjermbånd ved romtemperatur i minst 30 minutter.
- I et nytt mikrosentrifugerør på 1,7 ml gjør du en 1 ng/μL fortynning av DNA-prøvene kvantifisert i trinn 3.1.8 med UPW for et totalt volum på minst 3 μL.
- Virvel fortynnet DNA før bruk. Plasser 2 μL buffer, sammen med 2 μL av det fortynnede DNA i de forhåndsmerkede spesialiserte PCR-stripene (som følger med i settet) og plasser hettene. Plasser på shaker i 1 min, etterfulgt av spin down av PCR strimler.
MERK: På grunn av viskositeten til bufferen må du sørge for at overflødig buffer fjernes fra spissen før du overfører til prøverørene. - Plasser i maskinen, skjermbåndet og PCR-stripene uten hettene. Åpne lokket på spissboksen inne i maskinen. Tilordne posisjonen med riktige etiketter. Start maskinen.
MERK: Utgangs histogrammet skal være en enkelt topp på ønsket størrelse på amlikonene (Figur 1A). I prøver av dårlig kvalitet vil ytterligere topper bli observert (Figur 1B), noe som indikerer dårlig bead opprydding eller dannelse av primer dimers.
4. Neste generasjons sekvensering
- Kvantifisering og sammenslåing av bibliotek
- Beregn endelig DNA-konsentrasjon i nM ved hjelp av DNA-verdi fra trinn 3.1.8, og størrelsen i basispar (bp) av produktets topp, hentet fra elektroforesemaskinresultater (se figur 1).
- For hver prøve beregner du DNA-volum for å ta en endelig konsentrasjon på 4 nM, i et sluttvolum på 10-20 μL elutionbuffer.
- Forbered en ny fortynningsblanding for hver prøve og ta 2 μL fra den til en ny bassengblanding.
MERK: For prøver som har mindre enn 4 nM, legger du til maksimal mengde prøve som er mulig.
- NGS-kjøring av bibliotek
MERK: Den gjeldende protokollen bruker en benk-topp sequencer plattform. Se tabell over materialer for mer informasjon.- Forbered en ny løsning på 0,2 N NaOH. Tilsett 10 μL 0,2 N NaOH i det fortynnede biblioteket som ble utarbeidet i trinn 4.1.3. Tilsett 5% PhiX kort i rør og virvel. Snurr ned røret for å sikre at all løsningen har lagt seg til bunnen av røret.
- Inkuber i 5 min ved romtemperatur for å tette det dobbeltstrengede DNA-et. Tilsett 980 μL forhåndskjølt buffer fra settet til røret som inneholder DNA og virvel kort.
- Plasser det fortynnede biblioteket på is, og forbered biblioteket som følger. For en blanding av 17 pM, tilsett 425 μL DNA fra trinn 4.2.2 og 575 μL buffer. Inverter biblioteket flere ganger og spinn ned. Legg 600 μL av det endelige biblioteket på den angitte patronen, og plasser prøver i maskinen.
- Start kjøringen ved å følge programvareinstruksjonene.
5. Sekvenseringsanalyse
- Last ned sekvenseringsmålinger fra sequencer, og kontroller at sekvenseringsdata er innenfor følgende områder (spesifikk for settet som brukes i gjeldende protokoll). Eksempler som ikke oppfyller disse kriteriene, kan gjentas:
Klyngetetthet (tetthet (K/mm2)): 945 K – 1800 K
Prosent av leseoperasjoner som passerer filter (Clusters PF (%)): >90%
Kvalitetspoeng (%>=Q30): >85%
PhiX-justering (justert %): 1,5 % - 10 %
PhiX-feilfrekvens (%): <1,0 %
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her beskriver vi en metode for DNA-isolasjon fra tarmvev og blod, utarbeidelse av biblioteker for NGS, og grunnleggende trinn i et sekvenseringsløp for immunrepertoarsekvensering. Kjøringen vil generere fastq-filer, som kan konverteres ytterligere til fasta-filer for bruk i den internasjonale ImMunoGeneTics (IMGT)/HighV-QUEST-plattformen. Denne HTS utfører og administrerer mange analyser av titusenvis av omorganiserte TCRβ- og IGH-sekvenser, på nukleotidnivå15. IMGT/HighV-QUEST muliggjør analyse av ulike TCR-er og IGH-repertoarer i både helse og sykdom. Dette kan føre til identifisering av nye "sykdomsspesifikke" kloner, analyse av kloniske ekspansjons- og mangfoldsparametere, avgrensning av differensial V (D)J-bruk, analyse av somatiske hypermutasjoner og mer. IMGT / HighV-QUEST gir CSV-filer, som inneholder spesifikke sekvenser og deres overflod. Bruk av genomisk DNA som startmateriale gir sekvensnumre som er representative for cellenumre. Således, hvis original DNA-mengde er lik, kan prosentandelen av T-celler i en gitt prøve også beregnes.
Vi inkluderer en grunnleggende analyse fra representative, autologe blod- og rektalprøver av en pasient med IL10-reseptormangel og historie med alvorlig infantil-utbrudd IBD, som følge av en skadelig IL10RA-mutasjon. Prøver ble analysert for både TCRβ og IGH repertoar. Intestinal TCRβ-prøve ga totalt 12 450 sekvenser, hvorav 9050 sekvenser var unike. TCRβ-prøven i blodet hadde totalt 54 880 sekvenser, hvorav 35 110 var unike. I intestinal IGH-prøve ble det oppnådd totalt 49 070 sekvenser, hvorav 23 670 var unike. I blodet IGH prøve, totalt 13,710 sekvenser ble oppnådd, hvorav 13,540 var unike. Alle kloner kan identifiseres av deres unike sekvens både på nukleotid- eller aminosyrenivå. Disse sekvensene kan sammenlignes mellom ulike pasienter, på jakt etter delte kloner, eller i samme pasient mellom forskjellige anatomiske steder (f.eks. blod vs. tarm). Vi presenterer for hver av prøvene de 5 hyppigste klonene (Tabell 1).
For å kvantifisere graden av klonisk ekspansjon kan forskjellige indekser brukes, inkludert Shannons H, Gini-Simpson, entropi og klonalitet. Som et eksempel ble Shannons H, som tar hensyn til antall unike sekvenser (repertoarets rikdom) og hvor jevnt de fordeles, funnet å være redusert i pasientens tarm-IGH vs. blod (8,3 vs. 9,5), noe som tyder på klonisk utvidelse av B-celler i den betente tarmen.
For en bred oversikt over repertoaret ble Treemap-bilder (www.treemap.com) generert (figur 2). Hver farget firkant representerer en annen klone, og størrelsen korrelerer med frekvensen. Disse Treemap-bildene viser klonisk ekspansjon i tarm-IGH-repertoaret sammenlignet med blodet. I motsetning, i TCRβ-repertoaret, observeres markert klonisk ekspansjon i blodet, i forhold til autolog tarm.
På gennivå gir NGS informasjon om V- D- og J-bruk på nivået av enten gen, familie eller allel, som vist i tabell 1. Videre kan spesifikke V(D)J-kombinasjoner utledes fra dataene for TCRβ- og IGH-repertoarer (figur 3A, B), som kan avsløre differensialgenbruksmønstre under ulike forhold. Biofysiske egenskaper til CDR3-regionen, for eksempel lengde (tabell 1) eller hydrofobitet, kan også analyseres. Det er viktig at CDR3-lengdefordelingen endres i forskjellige immunmediede lidelser10,16,17. For eksempel, hos IL10R mangelfulle pasienter, blodavledede T-celler, men ikke B-celler, har kortere CDR3-lengde og differensialhydrofobitet, sammenlignet med sunne kontroller7.
Figur 1: Representative bioanalysedata. Representative bilder av intestinale TCRβ-prøver som viser optimale resultater (A) med ønsket topp på 400 bp. Et eksempel på et bibliotek med lav kvalitet (B) med ekstra topper på 179bp og 114bp (merket *). Topper sett i ender er øvre og nedre markører av elektroforesestripen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Oversikt over T- og B-celleimmunrepertoar. Trekartdiagrammer av TCRβ- og IGH-blod- og tarmprøver. Hver farget firkant representerer en annen klone, og størrelsen korrelerer med frekvensen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Representative grafer over bruk av TCRβ og IGH V-J. En representativ tarmprøve som viser totalt antall sekvenser for hver V-J-kombinasjon i TCRβ (A) eller IGH (B). Data vises ikke for D-bruk. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Endringer i overflod og funksjon av B- og T-lymfocytter oppstår ofte i forskjellige maligniteter18, kroniske inflammatoriske lidelser (f.eks. ulcerøs kolitt og revmatoid artritt)10,19, og i ulike immunsvikt17,20. Den nåværende metoden benytter NGS for å lette en grundig visning av TCR- og BCR-repertoarer, noe som muliggjør deteksjon av subtile endringer i T- og B-celleklonalitet, deling av kloner, V(D)J genbruk og informasjon om graden av somatiske hypermutasjoner når det gjelder B-celler.
Metoden for DNA-isolasjon ble beskrevet for tarmbiopsier og blodprøver. Men med modifikasjoner av lysis og DNA-ekstraksjon kan metoden brukes på andre vev som svulster, lymfeknuter, synovialvæske, etc. Det er viktig under bibliotekforberedelse ikke å krysskontaminere de forskjellige primersettene. Ved bead opprydding bør det tas hensyn til å forlate rør på magneten til enhver tid med inkubasjon. For DNA-prøver med lave konsentrasjoner kan lagrene konsentreres ved 65 °C i 10-20 minutter. Videre kan amlikoner unngås fra perler i så lite som 20 μL elutionbuffer.
Ulike teknikker som tidligere ble brukt for å karakterisere landskapet i T- og B-cellesammensetningen, ga bare en overfladisk oversikt over immunrepertoaret. En av de største fordelene med NGS for immunrepertoaranalyse er evnen til å identifisere unike kloner, og følgelig spore dem på forskjellige anatomiske steder (f.eks. tarm vs. blod vs. lymfeknute) eller hos forskjellige individer. De kliniske implikasjonene av en slik teknikk er signifikante, og går utover å forbedre forståelsen av T- eller B-cellenes rolle i forskjellige immunmediede sykdommer eller maligniteter21. I onkologi brukes NGS til å identifisere spesifikke kloner som kan være prediktive biomarkører for pasientene som mest sannsynlig vil dra nytte av nåværende immunterapier22,23,24. I leukemi brukes NGS til å bekrefte full utryddelse av kreftceller ved påvisning av gjenværende leukemiske kloner som forblir hos en pasient etter behandling25.
En av de viktigste begrensningene ved immunrepertoaranalyse av hele vev eller blodprøver er manglende evne til å identifisere repertoarendringer i mindre hyppige populasjoner. For eksempel, hvis regulatoriske T-celler, som bare utgjør noen få prosenter av totale CD4+ T-celler, uttrykker en unik repertoarprofil, vil dette gå glipp av hvis du utfører disse studiene på fullblod. Dette problemet kan løses ved å gjennomføre disse studiene på sorterte immunpopulasjoner. Alternativt har teknologien de siste årene utviklet seg for å lette kobling av enkeltcellede RNA-data med TCR- eller IGH-repertoarprofiler26. Dette gir et annet nivå av funksjonalitet i T- eller B-cellene, siden transkripsjonslandskapet til hver klone kan karakteriseres. Som et eksempel brukte Zemmour et al. scRNAseq TCRseq for å demonstrere at regulatoriske T-celler fra humant blod, viser bred heterogenitet med en aktivert subpopulering som er transkripsjonelt relatert til konvensjonelle T-celler27. På samme måte, hos pasienter med hepatocellulært karsinom, identifiserte denne metoden 11 forskjellige T-celleundergrupper som infiltrerer svulsten, hver med en unik transkripsjons- og repertoarprofil28. Studier som disse vil være nyttige spesielt når du studerer sjeldne populasjoner, og vil gi viktig funksjonell informasjon om spesifikke kloner.
NGS av immunrepertoar er et nytt forskningsfelt som gir ny innsikt om adaptiv immunfunksjon og T- og B-cellenes rolle i ulike sykdommer. I tillegg kommer den raskt inn i den kliniske verden i forskjellige disipliner, ved å spore sykdomsrelaterte clonotyper. Det er for tiden flere tilgjengelige sett for immunrepertoar. Disse er basert på lignende metodikk, uavhengig av om de bruker RNA eller DNA som kilde. De bruker lignende teknikker for kalibrering, biaskorreksjoner og analyseverktøy; og må derfor velges riktig i henhold til spesifikke krav. En av de store fordelene med det nåværende settet er at det er en klar til bruk og optimalisert for menneskelig immunrepertoar, uten behov for kalibrering. I fremtiden vil vi se flere studier ved hjelp av repertoarfunksjoner som biomarkører for ulike sykdommer, noe som potensielt også fører til utvikling av målrettede terapier mot disse klonene. Vi mener forskere bør vurdere å bruke disse metodene for å studere det adaptive immunlandskapet i ulike lidelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle forfattere har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
ingen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-propanol | Sigma | I9516-500ML | |
| 1.7 mL micro-centrifuge tubes | Axygen | 8187631104051 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Greiner | 188261 | |
| Absolute ethanol | Merck | 1.08543.0250 | |
| Amplitaq Gold | Thermo Fisher | N8080241 | |
| AMPure XP Beads | Beckman Coulter | A63881 | |
| Heat block | Bioer | Not applicable | |
| High Sensitivity D1000 Sample Buffer | Agilent | 5067-5603 | For Tapestation |
| High Sensitivity D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5584 | For Tapestation. Tubes sold seperately |
| Lymphotrack Assay kit | Invivoscribe | TRB: 70-91210039 IGH: 70-92250019 | Each includes 24 indexes |
| MiSeq Reagent Kit v2 (500 cycle) | Illumina | MS-102-2003 | Includes standard flow cell type and all reagents required |
| MiSeq Sequencer | Illumina | SY-410-1003 | |
| PCR strips | 4titude | 4ti-0792 | |
| Proteinase K | Invitrogen | EO0491 | |
| Qubit 4 Fluorometer | Thermo Fisher | Q33226 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher | Q32854 | Includes buffer, dye, standards, and specialized tubes |
| Shaker | Biosan | Not applicable | |
| Tapestation 2100 Bioanalyzer | Agilent | G2940CA | |
| ultra pure water | Bio-lab | 7501 | |
| Wizard DNA isolation kit | Promega | A1120 | Includes cell lysis solution, nuclei lysis solution, and protein precipitation buffer |
References
- Bassing, C. H., Swat, W., Alt, F. W. The mechanism and regulation of chromosomal V(D)J recombination. Cell. 109, Suppl 45-55 (2002).
- Roth, D. B. V(D)J Recombination: Mechanism, Errors, and Fidelity. Microbiology Spectrum. 2 (6), (2014).
- Heather, J. M., Ismail, M., Oakes, T., Chain, B. High-throughput sequencing of the T-cell receptor repertoire: pitfalls and opportunities. Brief Bioinformatics. 19 (4), 554-565 (2018).
- Pabst, O., Hazanov, H., Mehr, R. Old questions, new tools: does next-generation sequencing hold the key to unraveling intestinal B-cell responses. Mucosal Immunology. 8 (1), 29-37 (2015).
- Bashford-Rogers, R. J. M., Smith, K. G. C., Thomas, D. C. Antibody repertoire analysis in polygenic autoimmune diseases. Immunology. 155 (1), 3-17 (2018).
- Lee, Y. N., et al. Characterization of T and B cell repertoire diversity in patients with RAG deficiency. Science Immunology. 1 (6), (2016).
- Werner, L., et al. Alterations in T and B Cell Receptor Repertoires Patterns in Patients With IL10 Signaling Defects and History of Infantile-Onset IBD. Frontiers Immunology. 11, 109 (2020).
- Zhang, J., et al. Immune receptor repertoires in pediatric and adult acute myeloid leukemia. Genome Medicine. 11 (1), 73 (2019).
- Chapman, C. G., et al. Characterization of T-cell Receptor Repertoire in Inflamed Tissues of Patients with Crohn's Disease Through Deep Sequencing. Inflammatory Bowel Diseases. 22 (6), 1275-1285 (2016).
- Werner, L., et al. Altered T cell receptor beta repertoire patterns in pediatric ulcerative colitis. Clinical and Experimental Immunology. 196 (1), 1-11 (2019).
- Bashford-Rogers, R. J. M., et al. Analysis of the B cell receptor repertoire in six immune-mediated diseases. Nature. 574 (7776), 122-126 (2019).
- Wu, J., et al. Expanded TCRbeta CDR3 clonotypes distinguish Crohn's disease and ulcerative colitis patients. Mucosal Immunology. 11 (5), 1487-1495 (2018).
- Rosati, E., et al. Identification of disease-associated traits and clonotypes in the T-cell receptor repertoire of monozygotic twins affected by inflammatory bowel diseases. Journam of Crohn's and Colitis. , (2019).
- Allez, M., et al. T cell clonal expansions in ileal Crohn's disease are associated with smoking behaviour and postoperative recurrence. Gut. 68 (11), 1961-1970 (2019).
- Li, S., et al. IMGT/HighV QUEST paradigm for T cell receptor IMGT clonotype diversity and next generation repertoire immunoprofiling. Nature Communications. 4, 2333 (2013).
- H, I. J., et al. Strategies for B-cell receptor repertoire analysis in primary immunodeficiencies: from severe combined immunodeficiency to common variable immunodeficiency. Frontiers Immunology. 6, 157 (2015).
- Ghraichy, M., Galson, J. D., Kelly, D. F., Truck, J. B-cell receptor repertoire sequencing in patients with primary immunodeficiency: a review. Immunology. 153 (2), 145-160 (2018).
- Zhuang, Y., et al. Application of immune repertoire sequencing in cancer immunotherapy. International Immunopharmacology. 74, 105688 (2019).
- Liu, X., et al. T cell receptor beta repertoires as novel diagnostic markers for systemic lupus erythematosus and rheumatoid arthritis. Annual Rheumatic Diseases. 78 (8), 1070-1078 (2019).
- Wong, G. K., Heather, J. M., Barmettler, S., Cobbold, M. Immune dysregulation in immunodeficiency disorders: The role of T-cell receptor sequencing. Journal of Autoimmunity. 80, 1-9 (2017).
- Delhalle, S., Bode, S. F. N., Balling, R., Ollert, M., He, F. Q. A roadmap towards personalized immunology. NPJ System Biology and Applications. 4, 9 (2018).
- Laubli, H., et al. The T cell repertoire in tumors overlaps with pulmonary inflammatory lesions in patients treated with checkpoint inhibitors. Oncoimmunology. 7 (2), 1386962 (2018).
- Hogan, S. A., et al. Peripheral Blood TCR Repertoire Profiling May Facilitate Patient Stratification for Immunotherapy against Melanoma. Cancer Immunology Research. 7 (1), 77-85 (2019).
- Aversa, I., Malanga, D., Fiume, G., Palmieri, C. Molecular T-Cell Repertoire Analysis as Source of Prognostic and Predictive Biomarkers for Checkpoint Blockade Immunotherapy. International Journal of Molecular Sciences. 21 (7), (2020).
- Hirsch, P., et al. Precision and prognostic value of clone-specific minimal residual disease in acute myeloid leukemia. Haematologica. 102 (7), 1227-1237 (2017).
- De Simone, M., Rossetti, G., Pagani, M. Single Cell T Cell Receptor Sequencing: Techniques and Future Challenges. Frontiers Immunology. 9, 1638 (2018).
- Zemmour, D., et al. Single-cell gene expression reveals a landscape of regulatory T cell phenotypes shaped by the TCR. Nature Immunology. 19 (3), 291-301 (2018).
- Zheng, C., et al. Landscape of Infiltrating T Cells in Liver Cancer Revealed by Single-Cell Sequencing. Cell. 169 (7), 1342-1356 (2017).
