Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

T- og B-cellereceptor immunrepertoireanalyse ved hjælp af næste generations sekventering

Published: January 12, 2021 doi: 10.3791/61792
Automatic Translation
1,2, 3,4, 1, 3,4, 1,2
1Pediatric Gastroenterology Unit, Edmond and Lily Safra Children's Hospital, Sheba Medical Center, 2Sackler Faculty of Medicine, Tel Aviv University, 3Cancer Research Center, Sheba Medical Center, 4Molecular Hematology Laboratory, Sheba Medical Center

Summary

Den nuværende protokol beskriver en metode til DNA-isolering fra blodprøver og tarmbiopsier, generering af TCRβ- og IGH PCR-biblioteker til næste generations sekventering, udførelse af en NGS-kørsel og grundlæggende dataanalyse.

Abstract

Immunologisk hukommelse, kendetegnende for adaptiv immunitet, er orkestreret af T og B lymfocytter. I omløb og forskellige organer er der milliarder af unikke T- og B-cellekloner, og hver enkelt kan binde et specifikt antigen, hvilket fører til spredning, differentiering og / eller cytokin sekretion. Den enorme heterogenitet i T- og B-celler genereres ved tilfældig rekombination af forskellige genetiske segmenter. Næste generations sekventeringsteknologier (NGS), der er udviklet i det sidste årti, muliggør et hidtil uset dybtgående billede af T- og B-cellereceptorens immunrepertoire. Undersøgelser i forskellige inflammatoriske tilstande, immundefekt, infektioner og maligniteter viste markante ændringer i kloning, genbrug og biofysiske egenskaber ved immunrepertoire, hvilket giver vigtig indsigt i den rolle, adaptive immunrespons i forskellige lidelser.

Her giver vi en detaljeret protokol for NGS af immunrepertoire af T- og B-celler fra blod og væv. Vi præsenterer en pipeline, der starter fra DNA-isolation gennem biblioteksforberedelse, sekventering på NGS sequencer og slutter med grundlæggende analyser. Denne metode muliggør udforskning af specifikke T- og B-celler på nukleotid- eller aminosyreniveau og kan således identificere dynamiske ændringer i lymfocytpopulationer og mangfoldighedsparametre i forskellige sygdomme. Denne teknik går langsomt ind i klinisk praksis og har potentiale til identifikation af nye biomarkører, risiko stratificering og præcisionsmedicin.

Introduction

Det adaptive immunsystem, der består af T- og B-lymfocytter, bruger immunologisk hukommelse til at genkende et tidligere stødt antigen og indlede en hurtig reaktion. Lymfocytter genereres i knoglemarven og modnes i thymus (T-celler) eller knoglemarv (B-celler). Både T-cellereceptoren (TCR) og B-cellereceptoren (BCR) viser unikke konfigurationer, der tillader genkendelse af specifikke antigener. I homeostase cirkulerer T- og B-celler konstant og undersøger billionerne af forskellige peptider præsenteret på antigen-præsenterende celler. TCR eller BCR ligation af et specifikt antigen med høj affinitet, sammen med passende co-stimulation, fører til celleaktivering, hvilket resulterer i cytokin sekretion, klonisk ekspansion og generering af antistoffer, i tilfælde af B-celler.

Det enorme udvalg af de forskellige T- eller B-celler kaldes kollektivt immunrepertoire, hvilket muliggør anerkendelse af utallige forskellige epitoper. For at generere et så stort repertoire finder en kompleks proces med tilfældig samling af forskellige gensegmenter sted, hvilket skaber næsten uendelige kombinationer af receptorer, der kan binde unikke antigener1. Denne proces, kaldet V(D)J rekombination, omfatter omlægninger af forskellige variable (V), mangfoldighed (D) og sammenføjning (J) gener, ledsaget af tilfældige sletninger og indsættelser af nukleotider i vejkryds2.

Arkitekturen i det adaptive immunsystem har interesseret forskere på forskellige områder i mange årtier. Tidligere blev Sanger sekventering, komplementær bestemmelse region 3 (CDR3) spektring og flowcytometri brugt til at karakterisere immunrepertoiret, men gav lav opløsning. I det sidste årti har fremskridt inden for næste generations sekventeringsmetoder (NGS) muliggjort dybdegående indsigt i karakteristika og sammensætning af en persons TCR- og BCR-repertoirer3,4. Disse HTS-sekvens (High-ThroughPut Systems) sekvens og behandler millioner af omarrangerede TCR- eller BCR-produkter samtidigt og muliggør en analyse med høj opløsning af specifikke T- og B-celler på nukleotid- eller aminosyreniveau. NGS giver en ny strategi for at studere immunrepertoiret i både sundhed og sygdom. Undersøgelser, der anvendte HTS, påviste ændrede TCR- og BCR-repertoirer i autoimmune sygdomme5, primære immundefekt6,7og maligniteter, såsom i akut myeloid leukæmi8. Ved hjælp af NGS har vi og andre vist oligoklonal ekspansion af specifikke T- og B-cellekloner hos patienter med inflammatorisk tarmsygdom (IBD), herunder colitis ulcerosa og Crohns sygdom9,10,11,12,13,14. Samlet set tyder undersøgelser fra forskellige områder på, at ændringer i repertoiret spiller en afgørende rolle i patogenese af immunmedierede lidelser.

Den nuværende protokol beskriver en metode til isolering af DNA fra tarmbiopsier og blod, generering af TCRβ- og IGH PCR-biblioteker til NGS og udførelse af sekventeringskørsel. Vi leverer også grundlæggende trin i immunrepertoire dataanalyse. Denne protokol kan også anvendes til generering af TCRα-, TCRγ- og IGL-biblioteker. Metoden er også kompatibel med andre organer (f.eks. lymfeknuder, tumorer, synovialvæske, fedtvæv osv.), så længe der anvendes vævsspecifikke fordøjelsesprotokoller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Denne undersøgelse blev godkendt af den institutionelle review board på Sheba Medical Center, og informeret skriftligt samtykke blev indhentet fra alle deltagende emner.

1. DNA-isolering og kvantificering

  1. Fordøjelse og celle lysis af tarmbiopsier
    1. Tarmbiopsier, enten friskopsamlet eller dem, der opbevares ved -20 °C eller -80 °C. Hvis du bruger frosne biopsier, optø på is.
    2. Der tilsættes 600 μL nuclei lysisopløsning til et sterilt mikrocentrifugerør på 1,7 mL, kølet på is.
    3. Biopsi anbringes i et mikrocentrifugerør med lysisopløsning, og der inkuberes ved 65 °C i 15-30 min.
    4. Der tilsættes 17,5 μL på 20 mg/mL proteinase K og inkuberes natten over ved 55 °C med skånsom rysten.
    5. Lad prøven afkøle til stuetemperatur i 5 minutter, før du fortsætter til trin 1.3.
  2. Celle lysis af fuldblod
    1. Der opnås 3 mL fuldblod i EDTA-, heparin- eller citratholdigt rør.
    2. Stenrøret blandes forsigtigt, indtil det blandes grundigt, og overfører blod til et sterilt 15 ml centrifugerør, der indeholder 9 ml celle lysisopløsning. Inverter flere gange i løbet af en 10 minutters inkubationstid ved stuetemperatur.
    3. Centrifuge ved 2.000 x g i 10 minutter ved stuetemperatur, og kassér derefter så meget supernatant som muligt uden at forstyrre den synlige hvide pellet. Der vil fortsat være ca. 50-100 μL restvæske tilbage.
    4. Vortex rør kraftigt i 15 s indtil helt genbruges. Der tilsættes 3 ml nuclei lysisopløsning og pipettes flere gange. Opløsningen skal blive tyktflydende.
  3. Proteinudfældning
    1. Der tilsættes 200 μL proteinudfældningsbuffer til vævet eller 1 mL til blodet. Vortex kraftigt i 20 s og inkuberes på is i 5 min. Små proteinklumper kan være synlige efter hvirvelstrømning.
    2. Centrifuge ved 16.000 x g i 4 min. En stram pellet indeholdende udfældede proteiner bør dannes.
    3. Overfør forsigtigt supernatant, uden at forstyrre pellet, til et nyt 1,7 mL rør.
      BEMÆRK: Hvis pellet ikke er stram, overveje en anden centrifuge på 16.000 x g i 4 min.
  4. DNA-nedbør og rehydrering
    1. Der tilsættes 1 mL 2-propanol til rør, der indeholder supernatanten, og bland forsigtigt ved invertering. DNA skal blive synligt som hvidt flydende stof.
    2. Centrifuge ved 16.000 x g i 1 min. Fjern supernatanten helt ved hjælp af en pipette.
    3. Tilsæt 1 mL frisklavet 70% ethanol, og inverter rør flere gange. Centrifuge ved 16.000 x g i 1 min ved stuetemperatur. Kassér supernatant omhyggeligt.
    4. Gentag trin 1.4.3.
    5. Placer åbent rør omvendt på rent absorberende papir i 10-15 min. Re-invertere rør og bekræfte fuldstændig hydrering. Hvis det er nødvendigt, lad det lufttørre i yderligere 10-15 minutter.
      BEMÆRK: Det er afgørende for pellet at tørre helt.
    6. Der tilsættes 50 μL ultrarent vand (UPW). Hvis det er nødvendigt, kan DNA fortyndes mere efter kvantificering.
    7. Inkuber i 1 time på varmeblokken ved 65 °C for DNA-rehydrering.
  5. DNA-kvantificering
    BEMÆRK: DNA blev kvantificeret ved hjælp af et fluorometer og udpegede reagenser som angivet i materialetabellen.
    1. Bring standarder til stuetemperatur og forberede sættet, herunder 0,5 mL udpegede rør.
    2. Forbered buffer og farvestof mix i en 15 mL rør, i henhold til antallet af prøver. Der tilsættes 200 μL buffer og 1 μL farvestof pr. prøve. Medtag 2 prøver til standarder. Det anbefales at beregne en ekstra prøve for at undgå, at bufferen ikke er tilstrækkelig.
      1. For de 2 standarder skal 190 μL af ovennævnte tilberedte blanding anbringes i 0,5 mL rør. Der tilsættes 10 μL af standarden.
      2. For hver prøve anbringes 199 μL af ovennævnte blandede blanding i 0,5 mL rør. Der tilsættes 1 μL dna'et.
    3. Læs prøverne. Resultatet indikerer DNA-koncentrationen af prøven.
    4. Hvis prøverne overskrider grænsen, fortyndes DNA 1:10 med UPW, og gentages læse.

2. Biblioteksforberedelse

BEMÆRK: Den nuværende protokol bruger en multiplex, PCR-baseret assay kit kompatibel med NGS sequencere. Sættet indeholder 24 forskellige indekser, der hver især er rettet mod bevarede regioner inden forV-β og Jβ-regionerne. Dette muliggør en et-trins PCR reaktion og samling af forskellige prøver. Se materialeoversigten for at få flere oplysninger.

  1. Gør DNA-prøver klar. Der opnås 150 ng DNA, og der tilsættes UPW til i alt 5 μL.
    BEMÆRK: Det er muligt at bruge mindre end 150 ng DNA til biblioteksforberedelse med en koncentration på mindst 10 ng/μL.
  2. Placer pipetter og spidser i emhætten med UV-lys i 15 minutter for at nedbryde rest-DNA. I mellemtiden tillader forskellige indeks rør (til bibliotek forberedelse) og DNA polymerase at tø på is.
  3. I en biologisk hætte tilsættes 45 μL fra de forskellige indeksrør i PCR-rør. Til følge tilsættes 0,2 μL dna-polymerase og 5 μL DNA tilberedt i trin 2.1 i PCR-rør.
  4. Kør PCR-reaktion ved hjælp af et forudindstillet program i overensstemmelse med producentens anvisninger.

3. Rensning og kvantificering af amplicon

  1. Brug magnetiske perler til fjernelse af overskydende primere, nukleotider og enzymer.
    1. Varm perlerne mindst 30 minutter til stuetemperatur. Der fremstilles nok frisk ethanol på 80 % til 400 μL pr. prøve.
    2. Der tilsættes 50 μL (IGH) eller 35 μL (TCRβ) af perlerne til hvert PCR-rør og blandes ved pipettering 10 gange. Inkuber 10 min ved stuetemperatur.
    3. Den blandede prøve anbringes på magnetstativet i 5 min.
    4. Aspirat 95 μL (IGH) eller 80 μL (TCRβ) af den klare væske og kassér. Aspirat resterende væske ved hjælp af en 10 μL spids.
    5. Der tilsættes 200 μL 80% ethanol til hver prøve. Inkuber 30 s. Aspirat 195 μL ethanol og kassér. Aspirat resterende væske med 10 μL spids.
    6. Gentag trin 3.1.5. Åbn rørenes hætter og lad luften tørre i 5 minutter.
    7. Umiddelbart efter 5 min. fjernes fra magnetstativ og tilsættes 25 μL elueringsbuffer (10 mM Tris-HCl, pH 8.0). Bland ved pipettering indtil homogen. Inkuber ved stuetemperatur i 2 min.
    8. Placer rørene på magnetstativet i 5 min. 22 μL overføres til et nyt PCR-rør. DNA-koncentrationen måles (trin 1.5).
  2. Amplicon kvantificering
    BEMÆRK: Den nuværende protokol bruger en automatiseret elektroforesemaskine til kvalitetskontrol af DNA-koncentration, størrelse og integritet. Se materialeoversigten for at få flere oplysninger.
    1. Placer reagenser og screentape ved stuetemperatur i mindst 30 min.
    2. I et nyt mikrocentrifugerør på 1,7 mL foretages en 1 ng/μL fortynding af DNA-prøverne kvantificeret i trin 3.1.8 med UPW for et samlet volumen på mindst 3 μL.
    3. Vortex fortyndet DNA før brug. 2 μL buffer sammen med 2 μL af det fortyndede DNA anbringes i de formærkede specialiserede PCR-strimler (i sættet) og hætterne placeres. Placer på shaker i 1 min, efterfulgt af spin ned af PCR strimler.
      BEMÆRK: På grund af bufferens viskositet skal du sikre dig, at overskydende buffer fjernes fra spidsen, før den overføres til prøverørene.
    4. Placer i maskinen, screentape og PCR strimler uden hætter. Åbn låget på tipboksen inde i maskinen. Tildel stillingen med de relevante etiketter. Start maskinen.
      BEMÆRK: Output histogrammet skal være en enkelt top i den ønskede størrelse af ampliconer (Figur 1A). I prøver af dårlig kvalitet vil der blive observeret yderligere toppe (figur 1B), hvilket indikerer dårlig oprydning af perler eller dannelse af primer dimers.

4. Næste generations rækkefølge

  1. Kvantificering og samling af bibliotek
    1. Den endelige DNA-koncentration i nM beregnes ved hjælp af DNA-værdien fra trin 3.1.8 og størrelsen i basispar (bp) af produktets top, opnået ved hjælp af elektroforesemaskinens resultater (se figur 1).
    2. For hver prøve beregnes DNA-volumenet for en endelig koncentration på 4 nM i et slutvolumen på 10-20 μL elutionsbuffer.
    3. Der fremstilles en ny fortyndingsblanding for hver prøve, og der udtages 2 μL fra den til en ny poolblanding.
      BEMÆRK: For prøver, der har mindre end 4 nM, tilsættes den maksimale mulige mængde prøve.
  2. NGS-kørsel af bibliotek
    BEMÆRK: Den nuværende protokol bruger en bænk-top sequencer platform. Se materialeoversigten for at få flere oplysninger.
    1. Forbered en frisk opløsning på 0,2 N NaOH. Der tilsættes 10 μL 0,2 N NaOH til det fortyndede bibliotek, der er udarbejdet i trin 4.1.3. Tilsæt 5% PhiX til rør og vortex kort. Drej røret ned for at sikre, at hele opløsningen er faldet til bunden af røret.
    2. Inkuber i 5 minutter ved stuetemperatur for at denaturere det dobbelte strandede DNA. Der tilsættes 980 μL forkølet buffer fra sættet til røret, der kort indeholder DNA og vortex.
    3. Placer det fortyndede bibliotek på is, og forbered biblioteket på følgende måde. For en blanding på 17 pM tilsættes 425 μL DNA fra trin 4.2.2 og 575 μL buffer. Inverter biblioteket flere gange og spin ned. Læg 600 μL af det endelige bibliotek på den udpegede patron, og læg prøverne i maskinen.
    4. Start kørslen ved at følge softwarevejledningen.

5. Sekventeringsanalyse

  1. Hent sekventeringsmålinger fra sequencer, og kontroller, at sekventeringsdata er inden for følgende intervaller (specifikt for det sæt, der bruges i den aktuelle protokol). Eksempler, der ikke opfylder disse kriterier, kan gentages:
    Klyngetæthed (tæthed (K/mm2)): 945K – 1800K
    Procent af aflæsninger, der passerer filter (Klynger PF (%)): >90%
    Kvalitetsresultat (%>=Q30): >85%
    PhiX-justering (justeret %): 1,5 % - 10 %
    PhiX-fejlfrekvens (%): <1,0%

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Heri beskriver vi en metode til DNA-isolering fra tarmvæv og blod, forberedelse af biblioteker til NGS og grundlæggende trin i en sekventeringskørsel til immunrepertoiresekvensering. Kørslen genererer fastq-filer, som yderligere kan konverteres til fasta-filer til brug i den internationale ImMunoGeneTics (IMGT)/HighV-QUEST-platform. Denne HTS udfører og administrerer mange analyser af titusinder af omarrangerede TCRβ- og IGH-sekvenser på nukleotidniveau15. IMGT/HighV-QUEST muliggør analyse af forskellige TKR og IGH repertoirer i både sundhed og sygdom. Dette kan føre til identifikation af nye "sygdomsspecifikke" kloner, analyse af klon ekspansion og mangfoldighed parametre, afgrænsning af differentialE V (D) J brug, analyse af somatiske hyper-mutationer, og meget mere. IMGT/HighV-QUEST leverer CSV-filer, som indeholder specifikke sekvenser og deres overflod. Brug af genomisk DNA som udgangsmateriale giver sekvensnumre, der er repræsentative for cellenumre. Hvis den oprindelige DNA-mængde er lig med, kan procentdelen af T-celler i en given prøve således også beregnes.

Vi inkluderer en grundlæggende analyse fra repræsentative, autologe blod- og rektalprøver af en patient med IL10-receptormangel og historie af svær infantil-debut IBD, som følge af en skadelig IL10RA-mutation. Prøver blev analyseret for både TCRβ og IGH repertoire. Den intestinale TCRβ-prøve gav i alt 12.450 sekvenser, hvoraf 9.050 sekvenser var unikke. TCRβ-blodprøven i blodet havde i alt 54.880 sekvenser, hvoraf 35.110 var unikke. I tarm-IGH-prøven blev der opnået i alt 49.070 sekvenser, hvoraf 23.670 var unikke. I blodet IGH prøve, i alt 13.710 sekvenser blev opnået, hvoraf 13.540 var unikke. Alle kloner kan identificeres ved deres unikke sekvens både på nukleotid eller aminosyre niveau. Disse sekvenser kan sammenlignes mellem forskellige patienter, i søgen efter delte kloner eller hos den samme patient mellem forskellige anatomiske steder (f.eks. blod vs. tarm). Vi præsenterer for hver af prøverne de 5 hyppigste kloner(tabel 1).

For at kvantificere graden af klonisk ekspansion kan der anvendes forskellige indekser, herunder Shannon's H, Gini-Simpson, entropi og kloning. Som et eksempel, Shannon's H, som tager hensyn til antallet af unikke sekvenser (rigdom af repertoiret), og hvordan jævnt de er fordelt viste sig at være faldet i patientens tarm IGH vs blod (8,3 vs 9,5), hvilket tyder på klonisk udvidelse af B-celler i den betændte tarm.

For at få et bredt overblik over repertoiret blev der genereret Treemap-billeder (www.treemap.com) (Figur 2). Hver farvet firkant repræsenterer en anden klon, og størrelsen korrelerer med dens frekvens. Disse Treemap billeder viser klonisk ekspansion i tarmen IGH repertoire sammenlignet med blodet. I modsætning hertil observeres der i TCRβ-repertoiret markant klonisk ekspansion i blodet sammenlignet med autolog tarm.

På genniveau giver NGS oplysninger om V- D- og J-brug på niveau med enten gen, familie eller allel, som vist i tabel 1. Desuden kan specifikke V(D)J kombinationer udledes af data for TCRβ og IGH repertoirer (Figur 3A, B), som kan afsløre differentierede genbrugsmønstre under forskellige forhold. Biofysiske egenskaber i CDR3-området,f.eks. Vigtigere er det, CDR3 længde distribution er ændret i forskellige immun-medierede lidelser10,16,17. For eksempel har i IL10R mangelfulde patienter, blod-afledte T-celler, men ikke B-celler, kortere CDR3 længde, og differentialhydrobiicitet, sammenlignet med sunde kontroller7.

Figure 1
Figur 1: Repræsentative data fra bioanalyzeren. Repræsentative billeder af tarmprøver af TCRβ, der viser de bedste resultater (A) med den ønskede top på 400 bp. Et eksempel på et bibliotek af lav kvalitet (B) med yderligere toppe ved 179bp og 114bp (markeret *). Toppe set i enderne er øvre og nedre markører af elektroforese strimlen. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Oversigt over T- og B-cellerepertoire. Treemap diagrammer af TCRβ og IGH blod og tarmprøver. Hver farvet firkant repræsenterer en anden klon, og størrelsen korrelerer med dens frekvens. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Repræsentative grafer over brugen af TCRβ og IGH V-J. En repræsentativ tarmprøve, der viser det samlede antal sekvenser for hver V-J-kombination i TCRβ (A) eller IGH (B). Data vises ikke til D-brug. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Ændringer i overflod og funktion af B og T lymfocytter er ofte forekommende i forskellige maligniteter18, kroniske inflammatoriske lidelser (f.eks ulcerativ colitis og leddegigt)10,19, og i forskellige immundefekt17,20. Den nuværende metode bruger NGS til at lette et dybtgående billede af TCR- og BCR-repertoirer, hvilket gør det muligt at opdage subtile ændringer i T- og B-celleklonalitet, deling af kloner, V(D)J-genbrug og information om graden af somatiske hypermutationer i tilfælde af B-celler.

Metoden til DNA-isolation blev beskrevet for tarmbiopsier og blodprøver. Men med modifikationer af lysis og DNA-ekstraktion kan metoden anvendes på andre væv som tumorer, lymfeknuder, synovialvæske osv. Det er vigtigt under biblioteksforberedelse ikke at krydskontaminere de forskellige primersæt. Ved oprydning af perler skal man sørge for at efterlade rør på magneten på alle tidspunkter af inkubation. For DNA-prøver med lave koncentrationer kan lagrene koncentreres ved 65 °C i 10-20 minutter. Desuden kan ampliconer elueres fra perler i så lidt som 20 μL elution buffer.

Forskellige teknikker, der tidligere blev brugt til at karakterisere landskabet i T- og B-cellesammensætningen, gav kun et overfladisk overblik over immunrepertoiret. En af de største fordele ved NGS til immunrepertoireanalyse er evnen til at identificere unikke kloner og dermed spore dem på forskellige anatomiske steder (f.eks. tarm vs. blod vs. lymfeknude) eller hos forskellige individer. De kliniske konsekvenser af en sådan teknik er betydelige og går ud over at forbedre forståelsen af T- eller B-cellernes rolle i forskellige immunmedierede sygdomme eller maligniteter21. I onkologi bruges NGS til at identificere specifikke kloner, der kan være prædiktive biomarkører for de patienter, der sandsynligvis vil drage fordel af nuværende immunterapier22,23,24. I leukæmi anvendes NGS til at bekræfte fuld udryddelse af kræftceller ved påvisning af resterende leukæmiske kloner, der forbliver hos en patient efter behandling25.

En af de vigtigste begrænsninger i immunrepertoireanalysen af hele væv eller blodprøver er manglende evne til at identificere repertoireændringer i mindre hyppige populationer. For eksempel, hvis regulerende T-celler, som kun udgør nogle få procenter af de samlede CD4+ T-celler, udtrykker en unik repertoireprofil, ville dette gå glip af, hvis man udfører disse undersøgelser af fuldblod. Dette problem kunne løses ved at gennemføre disse undersøgelser af sorteret immunpopulationer. Alternativt har teknologien i de senere år udviklet sig for at lette koblingen af enkeltcellede RNA-data med TCR- eller IGH-repertoireprofiler26. Dette giver et andet niveau af funktionalitet af T- eller B-cellerne, da transskriptionslandskabet for hver klon kan karakteriseres. Som et eksempel brugte Zemmour et al. scRNAseq TCRseq til at demonstrere, at regulerende T-celler fra humant blod, viser bred heterogenitet med en aktiveret delpopulation, der er transskriptionelt relateret til konventionelle T-celler27. Tilsvarende, hos patienter med hepatocellulær carcinom denne metode identificeret 11 forskellige T celle delsæt, der infiltrerer tumor, hver med en unik transskription og repertoire profil28. Undersøgelser som disse vil være nyttige, især når man studerer sjældne populationer, og vil give vigtige funktionelle oplysninger om specifikke kloner.

NGS af immunrepertoire er et nyt forskningsfelt, der giver ny indsigt i adaptiv immunforsvar og T- og B-cellernes rolle i forskellige sygdomme. Derudover kommer det hurtigt ind i den kliniske verden i forskellige discipliner ved at spore sygdomsrelaterede clonotyper. Der er i øjeblikket flere tilgængelige kits til immunrepertoire. Disse er baseret på lignende metode, uanset om de bruger RNA eller DNA som kilde. De bruger lignende teknikker til kalibrering, biaskorrektioner og analyseværktøjer; og skal derfor vælges korrekt i henhold til specifikke krav. En af de store fordele ved det nuværende kit er, at det er en klar til brug og optimeret til humant immunrepertoire uden behov for kalibrering. I fremtiden vil vi se flere undersøgelser ved hjælp af repertoire funktioner som biomarkører for forskellige sygdomme, potentielt også fører til udvikling af målrettede behandlingsformer mod disse kloner. Vi mener, at forskere bør overveje at anvende disse metoder til at studere det adaptive immunlandskab i forskellige lidelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Alle forfattere har intet at afsløre.

Acknowledgments

ingen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-propanol Sigma I9516-500ML
1.7 mL micro-centrifuge tubes Axygen 8187631104051
15 mL centrifuge tubes Greiner 188261
Absolute ethanol Merck 1.08543.0250
Amplitaq Gold Thermo Fisher N8080241
AMPure XP Beads Beckman Coulter A63881
Heat block Bioer Not applicable
High Sensitivity D1000 Sample Buffer Agilent 5067-5603 For Tapestation
High Sensitivity D1000 ScreenTape Agilent 5067-5584 For Tapestation. Tubes sold seperately
Lymphotrack Assay kit Invivoscribe TRB: 70-91210039 IGH: 70-92250019 Each includes 24 indexes
MiSeq Reagent Kit v2 (500 cycle) Illumina MS-102-2003 Includes standard flow cell type and all reagents required
MiSeq Sequencer Illumina SY-410-1003
PCR strips 4titude 4ti-0792
Proteinase K Invitrogen EO0491
Qubit 4 Fluorometer Thermo Fisher Q33226
Qubit dsDNA HS Assay Kit Thermo Fisher Q32854 Includes buffer, dye, standards, and specialized tubes
Shaker Biosan Not applicable
Tapestation 2100 Bioanalyzer Agilent G2940CA
ultra pure water Bio-lab 7501
Wizard DNA isolation kit Promega A1120 Includes cell lysis solution, nuclei lysis solution, and protein precipitation buffer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bassing, C. H., Swat, W., Alt, F. W. The mechanism and regulation of chromosomal V(D)J recombination. Cell. 109, Suppl 45-55 (2002).
  2. Roth, D. B. V(D)J Recombination: Mechanism, Errors, and Fidelity. Microbiology Spectrum. 2 (6), (2014).
  3. Heather, J. M., Ismail, M., Oakes, T., Chain, B. High-throughput sequencing of the T-cell receptor repertoire: pitfalls and opportunities. Brief Bioinformatics. 19 (4), 554-565 (2018).
  4. Pabst, O., Hazanov, H., Mehr, R. Old questions, new tools: does next-generation sequencing hold the key to unraveling intestinal B-cell responses. Mucosal Immunology. 8 (1), 29-37 (2015).
  5. Bashford-Rogers, R. J. M., Smith, K. G. C., Thomas, D. C. Antibody repertoire analysis in polygenic autoimmune diseases. Immunology. 155 (1), 3-17 (2018).
  6. Lee, Y. N., et al. Characterization of T and B cell repertoire diversity in patients with RAG deficiency. Science Immunology. 1 (6), (2016).
  7. Werner, L., et al. Alterations in T and B Cell Receptor Repertoires Patterns in Patients With IL10 Signaling Defects and History of Infantile-Onset IBD. Frontiers Immunology. 11, 109 (2020).
  8. Zhang, J., et al. Immune receptor repertoires in pediatric and adult acute myeloid leukemia. Genome Medicine. 11 (1), 73 (2019).
  9. Chapman, C. G., et al. Characterization of T-cell Receptor Repertoire in Inflamed Tissues of Patients with Crohn's Disease Through Deep Sequencing. Inflammatory Bowel Diseases. 22 (6), 1275-1285 (2016).
  10. Werner, L., et al. Altered T cell receptor beta repertoire patterns in pediatric ulcerative colitis. Clinical and Experimental Immunology. 196 (1), 1-11 (2019).
  11. Bashford-Rogers, R. J. M., et al. Analysis of the B cell receptor repertoire in six immune-mediated diseases. Nature. 574 (7776), 122-126 (2019).
  12. Wu, J., et al. Expanded TCRbeta CDR3 clonotypes distinguish Crohn's disease and ulcerative colitis patients. Mucosal Immunology. 11 (5), 1487-1495 (2018).
  13. Rosati, E., et al. Identification of disease-associated traits and clonotypes in the T-cell receptor repertoire of monozygotic twins affected by inflammatory bowel diseases. Journam of Crohn's and Colitis. , (2019).
  14. Allez, M., et al. T cell clonal expansions in ileal Crohn's disease are associated with smoking behaviour and postoperative recurrence. Gut. 68 (11), 1961-1970 (2019).
  15. Li, S., et al. IMGT/HighV QUEST paradigm for T cell receptor IMGT clonotype diversity and next generation repertoire immunoprofiling. Nature Communications. 4, 2333 (2013).
  16. H, I. J., et al. Strategies for B-cell receptor repertoire analysis in primary immunodeficiencies: from severe combined immunodeficiency to common variable immunodeficiency. Frontiers Immunology. 6, 157 (2015).
  17. Ghraichy, M., Galson, J. D., Kelly, D. F., Truck, J. B-cell receptor repertoire sequencing in patients with primary immunodeficiency: a review. Immunology. 153 (2), 145-160 (2018).
  18. Zhuang, Y., et al. Application of immune repertoire sequencing in cancer immunotherapy. International Immunopharmacology. 74, 105688 (2019).
  19. Liu, X., et al. T cell receptor beta repertoires as novel diagnostic markers for systemic lupus erythematosus and rheumatoid arthritis. Annual Rheumatic Diseases. 78 (8), 1070-1078 (2019).
  20. Wong, G. K., Heather, J. M., Barmettler, S., Cobbold, M. Immune dysregulation in immunodeficiency disorders: The role of T-cell receptor sequencing. Journal of Autoimmunity. 80, 1-9 (2017).
  21. Delhalle, S., Bode, S. F. N., Balling, R., Ollert, M., He, F. Q. A roadmap towards personalized immunology. NPJ System Biology and Applications. 4, 9 (2018).
  22. Laubli, H., et al. The T cell repertoire in tumors overlaps with pulmonary inflammatory lesions in patients treated with checkpoint inhibitors. Oncoimmunology. 7 (2), 1386962 (2018).
  23. Hogan, S. A., et al. Peripheral Blood TCR Repertoire Profiling May Facilitate Patient Stratification for Immunotherapy against Melanoma. Cancer Immunology Research. 7 (1), 77-85 (2019).
  24. Aversa, I., Malanga, D., Fiume, G., Palmieri, C. Molecular T-Cell Repertoire Analysis as Source of Prognostic and Predictive Biomarkers for Checkpoint Blockade Immunotherapy. International Journal of Molecular Sciences. 21 (7), (2020).
  25. Hirsch, P., et al. Precision and prognostic value of clone-specific minimal residual disease in acute myeloid leukemia. Haematologica. 102 (7), 1227-1237 (2017).
  26. De Simone, M., Rossetti, G., Pagani, M. Single Cell T Cell Receptor Sequencing: Techniques and Future Challenges. Frontiers Immunology. 9, 1638 (2018).
  27. Zemmour, D., et al. Single-cell gene expression reveals a landscape of regulatory T cell phenotypes shaped by the TCR. Nature Immunology. 19 (3), 291-301 (2018).
  28. Zheng, C., et al. Landscape of Infiltrating T Cells in Liver Cancer Revealed by Single-Cell Sequencing. Cell. 169 (7), 1342-1356 (2017).

Tags

Denne måned i JoVE Næste generation sekventering TCRβ IGH immun repertoire adaptiv immunitet T-celler B-celler
T- og B-cellereceptor immunrepertoireanalyse ved hjælp af næste generations sekventering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Werner, L., Dor, C., Salamon, N.,… More

Werner, L., Dor, C., Salamon, N., Nagar, M., Shouval, D. S. T and B Cell Receptor Immune Repertoire Analysis using Next-generation Sequencing. J. Vis. Exp. (167), e61792, doi:10.3791/61792 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter