Summary
Mevcut protokol, kan örnekleri ve bağırsak biyopsilerinden DNA izolasyonu, yeni nesil sıralama için TCRβ ve IGH PCR kütüphanelerinin üretimi, bir NGS çalışmasının performansı ve temel veri analizi için bir yöntem tanımlamaktadır.
Abstract
Adaptif bağışıklığın ayırt edici özelliği olan immünolojik hafıza, T ve B lenfositleri tarafından düzenlenmiştir. Dolaşımda ve farklı organlarda milyarlarca benzersiz T ve B hücre klonu vardır ve her biri belirli bir antijeni bağlayarak çoğalmaya, farklılaşmaya ve/veya sitokin salgılanmasına yol açabilir. T ve B hücrelerindeki geniş heterojenlik, farklı genetik segmentlerin rastgele rekombinasyonu ile oluşur. Son on yılda geliştirilen yeni nesil dizileme (NGS) teknolojileri, T ve B hücre reseptör immün repertuarının eşi görülmemiş bir derinlemesine görünümünü sağlıyor. Çeşitli inflamatuar durumlar, immün yetmezlikler, enfeksiyonlar ve malignitelerde yapılan çalışmalar, bağışıklık repertuarının klonalite, gen kullanımı ve biyofiziksel özelliklerinde belirgin değişiklikler göstererek, adaptif immün yanıtların farklı bozukluklardaki rolü hakkında önemli bilgiler sağlamıştır.
Burada, kan ve dokudan T ve B hücrelerinin bağışıklık repertuarının NGS için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Kütüphane hazırlığı, NGS sıralayıcı üzerinde sıralama ve temel analizlerle biten DNA izolasyonundan başlayarak bir boru hattı sunuyoruz. Bu yöntem, nükleotid veya amino-asit düzeyinde spesifik T ve B hücrelerinin araştırılmasını sağlar ve böylece lenfosit popülasyonlarındaki dinamik değişiklikleri ve farklı hastalıklardaki çeşitlilik parametrelerini tanımlayabilir. Bu teknik yavaş yavaş klinik uygulamaya giriyor ve yeni biyobelirteçlerin tanımlanması, risk tabakalaşması ve hassas tıp potansiyeline sahip.
Introduction
T ve B lenfositlerden oluşan adaptif bağışıklık sistemi, daha önce karşılaşılan bir antijeni tanımak ve hızlı bir yanıt başlatmak için immünolojik hafızayı kullanır. Lenfositler kemik iliğinde üretilir ve timusta (T hücreleri) veya kemik iliğinde (B hücreleri) olgunlaşır. Hem T hücre reseptörü (TCR) hem de B hücre reseptörü (BCR), belirli antijenlerin tanınmasını sağlayan benzersiz konfigürasyonlar görüntüler. Homeostazda, T ve B hücreleri antijen sunan hücrelerde sunulan trilyonlarca farklı peptidi sürekli dolaşıma sokar ve inceler. Yüksek benzeşimli belirli bir antijenin TCR veya BCR ligasyonu, uygun ko-stimülasyon ile birlikte hücre aktivasyonuna yol açar ve B hücreleri durumunda sitokin salgılanması, klonal genişleme ve antikorların üretilmesine neden olur.
Farklı T veya B hücrelerinin muazzam dizisi, sayısız farklı epitopun tanınmasını sağlayan toplu olarak bağışıklık repertuarı olarak adlandırılmıştır. Böylesine geniş bir repertuar oluşturmak için, farklı gen segmentlerinin rastgele montajının karmaşık bir süreci gerçekleşir ve benzersiz antijenleri bağlayabilen reseptörlerin neredeyse sonsuz kombinasyonları oluşturulur1. V(D)J rekombinasyonu olarak adlandırılan bu işlem, kavşaklarda rastgele silmeler ve nükleotid eklemeleri eşliğinde farklı değişken (V), çeşitlilik (D) ve birleştirme (J) genlerinin yeniden düzenlenmesini içerir2.
Adaptif bağışıklık sisteminin mimarisi, bilim insanlarını uzun yıllardır farklı alanlarda ilgilendirmektedir. Geçmişte, Sanger dizilimi, tamamlayıcı belirleyici bölge 3 (CDR3) spektratilleme ve akış sitometrisi bağışıklık repertuarını karakterize etmek için kullanıldı, ancak düşük çözünürlük sağladı. Son on yılda, yeni nesil dizileme (NGS) yöntemlerindeki gelişmeler, bireyin TCR ve BCR repertuarlarının özellikleri ve kompozisyonu hakkında derinlemesine içgörü sağladı3,4. Bu yüksek verimli sistemler (HTS) milyonlarca yeniden düzenlenmiş TCR veya BCR ürününü aynı anda sıralar ve işler ve nükleotid veya amino asit seviyesindeki belirli T ve B hücrelerinin yüksek çözünürlüklü analizine izin verir. NGS, hem sağlık hem de hastalıkta bağışıklık repertuarını incelemek için yeni bir strateji sağlar. HTS kullanılarak yapılan çalışmalarda otoimmün hastalıklar5,primer immün yetmezlikler6,7ve akut miyeloid lösemi8gibi malignitelerde değişen TCR ve BCR repertuarları gösterilmiştir. NGS kullanarak, biz ve diğerleri, ülseratifkolit ve Crohn hastalığı 9 , 10 , 11, 12,13,14dahil olmak üzere enflamatuar bağırsak hastalığı (IBD) olan hastalarda spesifik T ve B hücre klonlarının oligoklonal genişlemesini gösterdik. Genel olarak, farklı alanlardan yapılan çalışmalar, repertuardaki değişikliklerin bağışıklık aracılı bozuklukların patogenezinde çok önemli bir role sahip olduğunu göstermektedir.
Mevcut protokol, DNA'nın bağırsak biyopsilerinden ve kanından izole edilmesini, NGS için TCRβ ve IGH PCR kütüphanelerinin üretilmesini ve sıralama çalışmasının performansını açıklar. Ayrıca bağışıklık repertuar veri analizinde temel adımlar sağlıyoruz. Bu protokol TCRα, TCRφ ve IGL kitaplıklarının üretimi için de uygulanabilir. Yöntem, dokuya özgü sindirim protokolleri kullanıldığı sürece diğer organlarla (örneğin lenf düğümleri, tümörler, sinovyal sıvı, yağ dokusu vb.) uyumludur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu çalışma Sheba Tıp Merkezi'ndeki kurumsal inceleme kurulu tarafından onaylanmış ve tüm katılımcı konulardan yazılı onay alınmıştır.
1. DNA izolasyonu ve nicelleştirme
- Bağırsak biyopsilerinin sindirimi ve hücre lizisi
- Yeni toplanan veya -20 °C veya -80 °C'de depolanan bağırsak biyopsilerini alın. Donmuş biyopsi kullanıyorsanız, buzda çözün.
- Buz üzerinde soğutulmuş steril 1,7 mL mikro santrifüj tüpüne 600 μL çekirdek liziz çözeltisi ekleyin.
- Biyopsiyi lizis çözeltili bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin ve 65 °C'de 15-30 dakika kuluçkaya yatırın.
- 17,5 μL 20 mg/mL proteinaz K ekleyin ve hafifçe sallanarak 55 °C'de gece boyunca kuluçkaya yatırın.
- 1.3. basamağa geçmeden önce numunenin oda sıcaklığına 5 dakika soğumasını bekleyin.
- Tam kanın hücre lizisi
- EDTA, heparin veya sitrat içeren tüpte 3 mL tam kan elde edin.
- Tüpü iyice karışana kadar hafifçe sallayın ve kanı 9 mL hücre liziz çözeltisi içeren steril 15 mL santrifüj tüpüne aktarın. Oda sıcaklığında 10 dakikalık bir kuluçka süresi boyunca birkaç kez ters çevirin.
- Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 2.000 x g'da santrifüjlayın ve ardından görünür beyaz peletin rahatsız edilmeden mümkün olduğunca fazla süpernatant atın. Yaklaşık 50-100 μL artık sıvı kalacaktır.
- Vortex tüpü tamamen yeniden dirilene kadar 15 sn boyunca kuvvetlice. Birkaç kez 3 mL çekirdek liziz çözeltisi ve pipet ekleyin. Çözelti viskoz hale gelmelidir.
- Protein yağışı
- Dokuya 200 μL protein çökeltme tamponu veya kana 1 mL ekleyin. Vortex 20 s için kuvvetlice ve 5 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yaslanın. Girdaplamadan sonra küçük protein kümeleri görülebilir.
- 4 dakika boyunca 16.000 x g'da santrifüj. Çökemiş proteinler içeren sıkı bir pelet oluşturmalıdır.
- Peletin rahatsız etmeden süpernatant'ı yeni bir 1,7 mL tüpe dikkatlice aktarın.
NOT: Pelet sıkı değilse, 4 dakika boyunca 16.000 x g'da başka bir santrifüj düşünün.
- DNA çökeltma ve rehidrasyon
- Üst kısmı içeren tüpe 1 mL 2 propanol ekleyin ve ters çevirerek hafifçe karıştırın. DNA beyaz yüzen madde olarak görünür hale gelmelidir.
- 1 dakika boyunca 16.000 x g'da santrifüj. Bir pipet kullanarak süpernatant tamamen çıkarın.
- 1 mL taze hazırlanmış% 70 etanol ekleyin ve tüpü birkaç kez ters çevirin. Oda sıcaklığında 1 dakika boyunca 16.000 x g'da santrifüj. Üstnatant dikkatlice atın.
- 1.4.3.
- Açık tüpü 10-15 dakika boyunca temiz emici kağıda ters yerleştirin. Tüpü yeniden ters çevirin ve tam hidrasyonunu onaylayın. Gerekirse, 10-15 dakika daha havayla kurumaya bırakın.
NOT: Peletin tamamen kurumasını sağlamak çok önemlidir. - 50 μL ultra saf su (UPW) ekleyin. Gerekirse, DNA nicelleştirmeden sonra daha fazla seyreltilebilir.
- DNA rehidrasyonu için 65 °C'de ısı bloğunda 1 saat kuluçkaya yatırın.
- DNA nicelemesi
NOT: DNA, malzeme tablosunda belirtildiği gibi bir florometre ve belirlenmiş reaktifler kullanılarak ölçüldü.- Standartları oda sıcaklığına getirin ve 0,5 mL belirlenmiş tüpler de dahil olmak üzere kiti hazırlayın.
- Numune sayısına göre 15 mL'lik bir tüpte tampon ve boya karışımı hazırlayın. Numune başına 200 μL tampon ve 1 μL boya ekleyin. Standartlar için 2 örnek ekleyin. Arabelleğin yeterli olmayacağından kaçınmak için ek bir örnek hesaplamanız önerilir.
- 2 standart için, yukarıda hazırlanan karışımın 190 μL'yi 0,5 mL tüpe yerleştirin. Standardın 10 μL'sini ekleyin.
- Her numune için, yukarıda hazırlanan karışımın 199 μL'lik kısmını 0,5 mL'lik tüpe yerleştirin. DNA'nın 1 μL'sini ekleyin.
- Örnekleri oku. Sonuç, numunenin DNA konsantrasyonuna işaret eder.
- Örnekler sınırın üzerindeyse, DNA 1:10'ı UPW ile seyreltin ve okumayı tekrarlayın.
2. Kütüphane hazırlığı
NOT: Mevcut protokol, NGS sıralayıcılarıyla uyumlu çok katlı, PCR tabanlı bir test kiti kullanır. Kit, V β veJ β bölgelerindeki korunmuş bölgeleri hedefleyen her biri 24 farklı endeks içerir. Bu, tek adımlı pcr reaksiyon ve farklı örneklerin birikmesini sağlar. Ayrıntılar için malzeme tablosuna bakın.
- DNA örnekleri hazırlayın. 150 ng DNA elde edin ve toplam 5 μL için UPW ekleyin.
NOT: Kütüphane hazırlığı için en az 10 ng/μL konsantrasyonda 150 ng'den az DNA kullanmak mümkündür. - Artık DNA'yı parçalamak için pipetleri ve uçları 15 dakika boyunca UV ışıklı davlumbaz içine yerleştirin. Bu arada, farklı indeks tüplerinin (kütüphane hazırlığı için) ve DNA polimerazlarının buz üzerinde çözülmesine izin verin.
- Biyolojik bir başlıkta, PCR tüplerine farklı indeks tüplerinden 45 μL ekleyin. Takip etmek için, PCR tüplerine 0,2 μL DNA polimerazını ve 2,1 adımda hazırlanan 5 μL DNA'yı ekleyin.
- Üreticinin talimatlarına göre önceden ayarlanmış bir program kullanarak PCR reaksiyonlarını çalıştırın.
3. Amplicon saflaştırma ve nicelleştirme
- Fazla astarların, nükleotitlerin ve enzimlerin uzaklaştırılması için manyetik boncuklar kullanın.
- Boncukları oda sıcaklığına en az 30 dakika ısıtın. Numune başına 400 μL için yeterli taze % 80 etanol hazırlayın.
- Her PCR tüpüne boncukların 50 μL (IGH) veya 35 μL 'sini (TCRβ) ekleyin ve 10 kez pipetleme yaparak karıştırın. Oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yatır.
- Karışık numuneyi manyetik standa 5 dakika yerleştirin.
- Berrak sıvının 95 μL (IGH) veya 80 μL (TCRβ) aspiratını çıkarın ve atın. Kalan sıvıyı 10 μL uç kullanarak aspire edin.
- Her numuneye 200 μL% 80 etanol ekleyin. 30 sn kuluçkaya yatır. 195 μL etanol epirat ve atın. Kalan sıvıyı 10 μL uç kullanarak aspire edin.
- 3.1.5 adımlarını yineleyin. Tüplerin kapaklarını açın ve havanın 5 dakika kurumasına izin verin.
- 5 dakikadan hemen sonra manyetik standdan çıkarın ve 25 μL elution tamponu ekleyin (10 mM Tris-HCl, pH 8.0). Homojen olana kadar pipetleme ile karıştırın. Oda sıcaklığında 2 dakika kuluçkaya yatır.
- Tüpleri manyetik standa 5 dakika yerleştirin. 22 μL'yi yeni bir PCR tüpüne aktarın. DNA konsantrasyonu ölçün (adım 1.5).
- Amplicon nicelleştirme
NOT: Mevcut protokol, DNA konsantrasyonunun, boyutunun ve bütünlüğünün kalite kontrolü için otomatik bir elektroforezi makinesi kullanır. Ayrıntılar için malzeme tablosuna bakın.- Reaktifleri ve ekran kaydını oda sıcaklığına en az 30 dakika yerleştirin.
- Yeni bir 1,7 mL mikro santrifüj tüpünde, toplam en az 3 μL hacim için UPW ile 3,1,8 adımda ölçülen DNA örneklerinin 1 ng/μL seyreltilmesini yapın.
- Vortex kullanmadan önce DNA'yı seyreltmiş. Önceden etiketlenmiş özel PCR şeritlerine (kitte verilen) 2 μL seyreltilmiş DNA ile birlikte 2 μL tampon yerleştirin ve kapakları yerleştirin. Çalkalayıcıya 1 dakika yerleştirin, ardından PCR şeritlerinin aşağı doğru dönmesi.
NOT: Tamponun viskozitesi nedeniyle, numune tüplerine aktarılmadan önce fazla tamponun uçtan çıkarıldığından emin olun. - Kapaklar olmadan makineye, ekran kaydına ve PCR şeritlerine yerleştirin. Makinenin içindeki uç kutusunun kapağını açın. Pozisyonu uygun etiketlerle atayın. Makineyi çalıştırın.
NOT: Çıkış histogramı, ampliconların istenen boyutunda tek bir tepe noktası olmalıdır (Şekil 1A). Düşük kalite örneklerinde, zayıf boncuk temizleme veya astar dimer oluşumunu gösteren ek tepeler gözlenecektir (Şekil 1B).
4. Yeni nesil sıralama
- Kütüphanenin nicelleştirilmesi ve havuzalenmesi
- 3.1.8 adımındaki DNA değerini ve elektroforez makinesi sonuçlarından elde edilen ürünün zirvesinin temel çiftlerindeki (bp) boyutu kullanarak nM'deki nihai DNA konsantrasyonu hesaplamak (bkz. Şekil 1).
- Her örnek için, 10-20 μL elütion tamponunun son hacminde 4 nM'lik son konsantrasyon için alacak DNA hacmini hesaplayın.
- Her numune için yeni bir seyreltme karışımı hazırlayın ve ondan yeni bir havuz karışımına 2 μL alın.
NOT: 4 nM'den az olan numuneler için mümkün olan en fazla numune miktarını ekleyin.
- NGS kütüphane çalışması
NOT: Geçerli protokol bir tezgah üstü sıralayıcı platformu kullanır. Ayrıntılar için malzeme tablosuna bakın.- 0.2 N NaOH taze bir çözelti hazırlayın. Adım 4.1.3'te hazırlanan seyreltilmiş kütüphaneye 10 μL 0.2 N NaOH ekleyin. Tüp ve girdaplara kısaca% 5 PhiX ekleyin. Tüm çözeltinin tüpün dibine yerleştiğinden emin olmak için tüpü aşağı çevirin.
- Çift iplikli DNA'yı denatüre etmek için oda sıcaklığında 5 dakika kuluçkaya yatırın. Kısaca DNA ve girdap içeren tüpe kitten 980 μL önceden soğutulmuş tampon ekleyin.
- Seyreltilmiş kütüphaneyi buza yerleştirin ve kütüphaneyi aşağıdaki gibi hazırlayın. 17 pM'lik bir karışım için, 4.2.2 ve 575 μL tampon adımından 425 μL DNA ekleyin. Kütüphaneyi birkaç kez ters çevirin ve aşağı dönün. Son kütüphanenin 600 μL'lik kısmını belirlenen kartuşa yükleyin ve numuneleri makineye yerleştirin.
- Yazılım yönergelerini izleyerek çalıştırmayı başlatın.
5. Sıralama analizi
- Sıralayıcıdan sıralama ölçümlerini indirin ve sıralama verilerinin aşağıdaki aralıklarda olduğunu doğrulayın (geçerli protokolde kullanılan kit için özel). Bu ölçütleri karşılamayan örnekler yinele çalıştırmaya tabidir:
Küme Yoğunluğu (Yoğunluk (K/mm2)): 945K – 1800K
Okuma geçiş filtresi yüzdesi (Kümeler PF (%):%>90
Kalite puanları (%>=Q30): >85%
PhiX hizalaması (Hizalanmış %): %1,5 - %10
PhiX Hata Oranı (%): <1.0%
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada, bağırsak dokusu ve kandan DNA izolasyonu, NGS için kütüphanelerin hazırlanması ve bağışıklık repertuar dizilimi için bir sıralama çalışmasının temel adımları için bir yöntem açıklıyoruz. Çalıştırma, uluslararası ImMunoGeneTics (IMGT)/HighV-QUEST platformunda kullanılmak üzere fasta dosyalarına daha fazla dönüştürülebilen fastq dosyaları oluşturacaktır. Bu HTS, nükleotid seviyesi15'teon binlerce yeniden düzenlenmiş TCRβ ve IGH dizisinin birçok analizini gerçekleştirir ve yönetir. IMGT/HighV-QUEST, hem sağlık hem de hastalıkta farklı TCR'lerin ve IGH repertuarlarının analizini sağlar. Bu, yeni "hastalığa özgü" klonların tanımlanmasına, klonal genişleme ve çeşitlilik parametrelerinin analizine, diferansiyel V(D)J kullanımının tanımlanmasına, somatik hiper mutasyonların analizine ve daha fazlasına yol açabilir. IMGT/HighV-QUEST, belirli dizileri ve bunların bolluğunu içeren CSV dosyaları sağlar. Genomik DNA'nın başlangıç malzemesi olarak kullanılması, hücre numaralarını temsil eden sıra numaralarını verir. Bu nedenle, orijinal DNA miktarı eşitse, belirli bir örnekteki T hücrelerinin yüzdesi de hesaplanabilir.
Il10 reseptör eksikliği ve ciddi infantil başlangıçlı IBD öyküsü olan bir hastanın, zararlı bir IL10RA mutasyonundan kaynaklanan temsili, otolog kan ve rektal örneklerinden temel bir analize yer veriyoruz. Örnekler hem TCRβ hem de IGH repertuarı için test edilmiştir. Bağırsak TCRβ örneği toplam 12.450 dizi verdi ve bunların 9.050 dizisi benzersizdi. Kan TCRβ örneğinde toplam 54.880 dizi vardı ve bunların 35.110'u benzersizdi. Bağırsak IGH örneğinde, 23.670'i benzersiz olmak üzere toplam 49.070 dizi elde edildi. Kan IGH örneğinde, 13.540'ı benzersiz olmak üzere toplam 13.710 dizi elde edildi. Tüm klonlar hem nükleotid hem de amino asit seviyesinde benzersiz dizileriyle tanımlanabilir. Bu diziler farklı hastalar arasında, paylaşılan klonları aramak için veya aynı hastada farklı anatomik bölgeler (örneğin, kan ve bağırsak) arasında karşılaştırılabilir. Örneklerin her biri için en sık kullanılan 5 klonu sunuyoruz (Tablo 1).
Klonal genişleme derecesini ölçmek için Shannon'ın H, Gini-Simpson, entropi ve klonalite dahil olmak üzere farklı endeksler kullanılabilir. Örnek olarak, shannon'ın benzersiz dizilerin sayısını (repertuarın zenginliğini) ve ne kadar eşit dağıtıldığını dikkate alan H'nin hastanın bağırsak IGH'sinde kana karşı azaldığı bulunmuştur (8.3'e karşı 9.5), iltihaplı bağırsaktaki B hücrelerinin klonal genişlemesini düşündürmektedir.
Repertuara geniş bir genel bakış için Treemap görüntüleri (www.treemap.com) oluşturulmuştır (Şekil 2). Her renkli kare farklı bir klonu temsil eder ve boyut sıklığıyla ilişkilidir. Bu Treemap görüntüleri, bağırsak IGH repertuarında kanla karşılaştırıldığında klonal genişleme olduğunu göstermektedir. Buna karşılık, TCRβ repertuarında, otolog bağırsağın yanına kıyasla kanda belirgin klonal genişleme gözlenir.
Gen düzeyinde NGS, Tablo 1'degösterildiği gibi gen, aile veya alele düzeyinde V-D ve J kullanımı hakkında bilgi sağlar. Ayrıca, çeşitli koşullarda diferansiyel gen kullanım kalıplarını ortaya çıkarabilen TCRβ ve IGH repertuarları (Şekil 3A,B) verilerinden spesifik V(D)J kombinasyonları çıkarılabilir. CDR3 bölgesinin uzunluk (Tablo 1) veya hidrofobiklik gibi biyofiziksel özellikleri de analiz edilebilir. Daha da önemlisi, CDR3 uzunluk dağılımı farklı immün aracılı bozukluklarda10 , 16,17.000. Örneğin, IL10R eksik hastalarda, kan türevi T hücreleri, ancak B hücreleri değil, sağlıklı kontrollere kıyasla daha kısa CDR3 uzunluğuna ve ayırıcı hidrofobikliğe sahiptir7.
Şekil 1: Temsili biyoanalizör verileri. Bağırsak TCRβ örneklerinin temsili görüntüleri, istenen tepe noktası 400 bp olan optimal sonuçları (A) gösterir. 179bp ve 114bp'de (*işaretli) ek zirvelere sahip düşük kaliteli bir kütüphane (B) örneği. Uçlarda görülen tepeler elektroforez şeridinin üst ve alt belirteçleridir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: T ve B hücre immün repertuarına genel bakış. TCRβ ve IGH kan ve bağırsak örneklerinin ağaç haritası diyagramları. Her renkli kare farklı bir klonu temsil eder ve boyut sıklığıyla ilişkilidir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: TCRβ ve IGH V-J kullanımının temsili grafikleri. TCRβ (A) veya IGH (B) her V-J kombinasyonu için toplam dizi sayısını gösteren temsili bir bağırsak örneği. Veriler D kullanımı için gösterilmez. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
B ve T lenfositlerinin bolluğunda ve işlevinde değişikliklere genellikle farklı malignitelerde rastlanır18, kronik inflamatuar bozukluklar (örneğin, ülseratif kolit ve romatoid artrit)10,19ve çeşitli immün yetmezliklerde17,20. Mevcut yöntem, TCR ve BCR repertuarlarının derinlemesine görünümünü kolaylaştırmak için NGS'yi kullanır, T ve B hücre klonalitesinde ince değişikliklerin tespitini, klonların paylaşımını, V(D)J gen kullanımını ve B hücrelerinde somatik hiper mutasyonların derecesi hakkında bilgi sağlar.
Bağırsak biyopsileri ve kan örnekleri için DNA izolasyonu yöntemi tanımlanmıştır. Bununla birlikte, lizis ve DNA ekstraksiyonu değişiklikleri ile yöntem tümörler, lenf düğümleri, sinovyal sıvı vb. Kütüphane hazırlığı sırasında farklı astar setlerini çapraz kirletmemek önemlidir. Boncuk temizliğinde, her zaman inkübasyonda mıknatıs üzerinde tüp bırakmaya özen edilmelidir. Düşük konsantrasyonlu DNA örnekleri için, stoklar 10-20 dakika boyunca 65 ° C'de yoğunlaştırılabilir. Ayrıca, ampliconlar boncuklardan 20 μL elütion tamponu kadar kısa bir sürede elde edilebilir.
Geçmişte T ve B hücre kompozisyonunun manzarasını karakterize etmek için kullanılan farklı teknikler, bağışıklık repertuarına sadece yüzeysel bir genel bakış sağladı. NGS'nin bağışıklık repertuar analizi için en büyük avantajlarından biri, benzersiz klonları tanımlama ve sonuç olarak bunları farklı anatomik bölgelerde (örneğin, bağırsak ve kan ve lenf nodu) veya farklı bireylerde izleme yeteneğidir. Böyle bir tekniğin klinik etkileri önemlidir ve T veya B hücrelerinin farklı bağışıklık aracılı hastalıklarda veya malignitelerde rolünün anlaşılmasını geliştirmenin ötesine geçer21. Onkolojide NGS, mevcut immünoterapilerden büyük olasılıkla yararlanacak hastalar için tahmine dayalı biyobelirteç olabilecek spesifik klonları tanımlamak için kullanılır22,23,24. Lösemide NGS, tedaviden sonra bir hastada kalan artık lösemik klonların tespit edilmesiyle kanserli hücrelerin tam eradikasyonunu doğrulamak için kullanılır25.
Tüm doku veya kan örneklerinin immün repertuar analizinin ana sınırlamalarından biri, daha az sıklıktaki popülasyonlardaki repertuar değişikliklerinin tanımlanamamasıdır. Örneğin, toplam CD4+ T hücrelerinin sadece birkaç yüzdesini oluşturan düzenleyici T hücreleri benzersiz bir repertuar profili ifade ederse, bu çalışmalar tam kan üzerinde yürütülirse bu kaçırılacaktır. Bu sorun, sıralanmış bağışıklık popülasyonları üzerinde bu çalışmalar yapılarak giderilebilir. Alternatif olarak, son yıllarda teknoloji, tek hücreli RNA verilerinin TCR veya IGH repertuar profilleri ile bire birliğini kolaylaştırmak için geliştirilmiştir26. Bu, T veya B hücrelerinin başka bir işlevsellik düzeyi sağlar, çünkü her klonun transkripsiyonal manzarası karakterize edilebilir. Örnek olarak, Zemmour ve ark. insan kanından düzenleyici T hücrelerinin, transkripsiyonel olarak geleneksel T hücreleri27ile ilişkili aktif bir alt nüfus ile geniş heterojenlik gösterdiğini göstermek için scRNAseq TCRseq'i kullandı. Benzer şekilde, hepatosellüler karsinomlu hastalarda bu yöntem, tümöre sızan, her biri benzersiz transkripsiyonel ve repertuar profili28olan 11 farklı T hücre alt kümesi tanımlamaktadır. Bu gibi çalışmalar özellikle nadir popülasyonları incelerken yardımcı olacak ve belirli klonların önemli işlevsel bilgilerini sağlayacaktır.
NGS of immune repertuarı adaptif immün fonksiyon ve T ve B hücrelerinin çeşitli hastalıklardaki rolü hakkında yeni bilgiler sağlayan yeni bir araştırma alanıdır. Ayrıca hastalık ilişkili klonotipleri takip ederek farklı disiplinlerde klinik dünyaya hızla girmektedir. Şu anda bağışıklık repertuarı için mevcut birkaç kit vardır. Bunlar, kaynak olarak RNA veya DNA kullanıp kullanmadıklarına bakılmaksızın benzer metodolojiye dayanmaktadır. Kalibrasyon, önyargı düzeltmeleri ve analiz araçları için benzer teknikler kullanırlar; ve bu nedenle belirli taleplere göre uygun şekilde seçilmesi gerekir. Mevcut kitin en büyük avantajlarından biri, kalibrasyona gerek kalmadan kullanıma hazır ve insan bağışıklık repertuarı için optimize edilmiş olmasıdır. Gelecekte, repertuar özelliklerini farklı hastalıklar için biyobelirteç olarak kullanarak daha fazla çalışma göreceğiz ve potansiyel olarak bu klonlara karşı hedefe yönelik tedavilerin geliştirilmesine yol açacaktır. Araştırmacıların farklı bozukluklarda adaptif bağışıklık manzarasını incelemek için bu yöntemleri uygulamayı düşünmeleri gerektiğine inanıyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Tüm yazarların açıklayacak bir şeyi yoktur.
Acknowledgments
hiç kimse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-propanol | Sigma | I9516-500ML | |
| 1.7 mL micro-centrifuge tubes | Axygen | 8187631104051 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Greiner | 188261 | |
| Absolute ethanol | Merck | 1.08543.0250 | |
| Amplitaq Gold | Thermo Fisher | N8080241 | |
| AMPure XP Beads | Beckman Coulter | A63881 | |
| Heat block | Bioer | Not applicable | |
| High Sensitivity D1000 Sample Buffer | Agilent | 5067-5603 | For Tapestation |
| High Sensitivity D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5584 | For Tapestation. Tubes sold seperately |
| Lymphotrack Assay kit | Invivoscribe | TRB: 70-91210039 IGH: 70-92250019 | Each includes 24 indexes |
| MiSeq Reagent Kit v2 (500 cycle) | Illumina | MS-102-2003 | Includes standard flow cell type and all reagents required |
| MiSeq Sequencer | Illumina | SY-410-1003 | |
| PCR strips | 4titude | 4ti-0792 | |
| Proteinase K | Invitrogen | EO0491 | |
| Qubit 4 Fluorometer | Thermo Fisher | Q33226 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher | Q32854 | Includes buffer, dye, standards, and specialized tubes |
| Shaker | Biosan | Not applicable | |
| Tapestation 2100 Bioanalyzer | Agilent | G2940CA | |
| ultra pure water | Bio-lab | 7501 | |
| Wizard DNA isolation kit | Promega | A1120 | Includes cell lysis solution, nuclei lysis solution, and protein precipitation buffer |
References
- Bassing, C. H., Swat, W., Alt, F. W. The mechanism and regulation of chromosomal V(D)J recombination. Cell. 109, Suppl 45-55 (2002).
- Roth, D. B. V(D)J Recombination: Mechanism, Errors, and Fidelity. Microbiology Spectrum. 2 (6), (2014).
- Heather, J. M., Ismail, M., Oakes, T., Chain, B. High-throughput sequencing of the T-cell receptor repertoire: pitfalls and opportunities. Brief Bioinformatics. 19 (4), 554-565 (2018).
- Pabst, O., Hazanov, H., Mehr, R. Old questions, new tools: does next-generation sequencing hold the key to unraveling intestinal B-cell responses. Mucosal Immunology. 8 (1), 29-37 (2015).
- Bashford-Rogers, R. J. M., Smith, K. G. C., Thomas, D. C. Antibody repertoire analysis in polygenic autoimmune diseases. Immunology. 155 (1), 3-17 (2018).
- Lee, Y. N., et al. Characterization of T and B cell repertoire diversity in patients with RAG deficiency. Science Immunology. 1 (6), (2016).
- Werner, L., et al. Alterations in T and B Cell Receptor Repertoires Patterns in Patients With IL10 Signaling Defects and History of Infantile-Onset IBD. Frontiers Immunology. 11, 109 (2020).
- Zhang, J., et al. Immune receptor repertoires in pediatric and adult acute myeloid leukemia. Genome Medicine. 11 (1), 73 (2019).
- Chapman, C. G., et al. Characterization of T-cell Receptor Repertoire in Inflamed Tissues of Patients with Crohn's Disease Through Deep Sequencing. Inflammatory Bowel Diseases. 22 (6), 1275-1285 (2016).
- Werner, L., et al. Altered T cell receptor beta repertoire patterns in pediatric ulcerative colitis. Clinical and Experimental Immunology. 196 (1), 1-11 (2019).
- Bashford-Rogers, R. J. M., et al. Analysis of the B cell receptor repertoire in six immune-mediated diseases. Nature. 574 (7776), 122-126 (2019).
- Wu, J., et al. Expanded TCRbeta CDR3 clonotypes distinguish Crohn's disease and ulcerative colitis patients. Mucosal Immunology. 11 (5), 1487-1495 (2018).
- Rosati, E., et al. Identification of disease-associated traits and clonotypes in the T-cell receptor repertoire of monozygotic twins affected by inflammatory bowel diseases. Journam of Crohn's and Colitis. , (2019).
- Allez, M., et al. T cell clonal expansions in ileal Crohn's disease are associated with smoking behaviour and postoperative recurrence. Gut. 68 (11), 1961-1970 (2019).
- Li, S., et al. IMGT/HighV QUEST paradigm for T cell receptor IMGT clonotype diversity and next generation repertoire immunoprofiling. Nature Communications. 4, 2333 (2013).
- H, I. J., et al. Strategies for B-cell receptor repertoire analysis in primary immunodeficiencies: from severe combined immunodeficiency to common variable immunodeficiency. Frontiers Immunology. 6, 157 (2015).
- Ghraichy, M., Galson, J. D., Kelly, D. F., Truck, J. B-cell receptor repertoire sequencing in patients with primary immunodeficiency: a review. Immunology. 153 (2), 145-160 (2018).
- Zhuang, Y., et al. Application of immune repertoire sequencing in cancer immunotherapy. International Immunopharmacology. 74, 105688 (2019).
- Liu, X., et al. T cell receptor beta repertoires as novel diagnostic markers for systemic lupus erythematosus and rheumatoid arthritis. Annual Rheumatic Diseases. 78 (8), 1070-1078 (2019).
- Wong, G. K., Heather, J. M., Barmettler, S., Cobbold, M. Immune dysregulation in immunodeficiency disorders: The role of T-cell receptor sequencing. Journal of Autoimmunity. 80, 1-9 (2017).
- Delhalle, S., Bode, S. F. N., Balling, R., Ollert, M., He, F. Q. A roadmap towards personalized immunology. NPJ System Biology and Applications. 4, 9 (2018).
- Laubli, H., et al. The T cell repertoire in tumors overlaps with pulmonary inflammatory lesions in patients treated with checkpoint inhibitors. Oncoimmunology. 7 (2), 1386962 (2018).
- Hogan, S. A., et al. Peripheral Blood TCR Repertoire Profiling May Facilitate Patient Stratification for Immunotherapy against Melanoma. Cancer Immunology Research. 7 (1), 77-85 (2019).
- Aversa, I., Malanga, D., Fiume, G., Palmieri, C. Molecular T-Cell Repertoire Analysis as Source of Prognostic and Predictive Biomarkers for Checkpoint Blockade Immunotherapy. International Journal of Molecular Sciences. 21 (7), (2020).
- Hirsch, P., et al. Precision and prognostic value of clone-specific minimal residual disease in acute myeloid leukemia. Haematologica. 102 (7), 1227-1237 (2017).
- De Simone, M., Rossetti, G., Pagani, M. Single Cell T Cell Receptor Sequencing: Techniques and Future Challenges. Frontiers Immunology. 9, 1638 (2018).
- Zemmour, D., et al. Single-cell gene expression reveals a landscape of regulatory T cell phenotypes shaped by the TCR. Nature Immunology. 19 (3), 291-301 (2018).
- Zheng, C., et al. Landscape of Infiltrating T Cells in Liver Cancer Revealed by Single-Cell Sequencing. Cell. 169 (7), 1342-1356 (2017).
