Summary
Ici, nous présentons un protocole pour profiler l’interaction entre l’hôte et l’agent pathogène pendant l’infection par protéomique basée sur la spectrométrie de masse. Ce protocole utilise une quantification sans étiquette pour mesurer les changements dans l’abondance des protéines de l’hôte (p. ex., macrophages) et de l’agent pathogène (p. ex., cryptococcus néoformans)en une seule expérience.
Abstract
Les réalisations technologiques de la protéomique quantitative basée sur la spectrométrie de masse (SP) ouvrent de nombreuses voies inconnues pour analyser le protéome global d’un organisme dans des conditions variables. Cette stratégie puissante appliquée aux interactions des pathogènes microbiens avec l’hôte désiré caractérise globalement les deux perspectives vers l’infection. Dans ce cas, le flux de travail décrit la quantification sans étiquette (LFQ) de l’infectome des néoformans Cryptococcus, un pathogène intracellulaire fongique qui est l’agent causal de la cryptococcose mortelle de la maladie, en présence de cellules macrophages immortalisées. Le protocole détaille les techniques appropriées de préparation des protéines pour les cellules pathogènes et mammifères au cours d’une seule expérience, ce qui donne lieu à une soumission appropriée de peptides pour l’analyse liquide-chromatographie (LC)-MS/SP. La nature générique à haut débit de LFQ permet une large gamme dynamique d’identification et de quantification des protéines, ainsi que la transférabilité à n’importe quel paramètre d’infection hôte-pathogène, maintenant une sensibilité extrême. La méthode est optimisée pour cataloguer des profils étendus et impartiaux d’abondance de protéines d’un agent pathogène dans des conditions imitant l’infection. Plus précisément, la méthode démontrée ici fournit des informations essentielles sur la pathogénie c. néoformans, telles que la production de protéines nécessaires à la virulence et identifie les protéines hôtes critiques répondant à l’invasion microbienne.
Introduction
La prévalence des infections fongiques invasives augmente considérablement et est corrélée avec des taux de mortalité inacceptablement élevés, le plus souvent signalés chez les personnes ayant des prédispositions immunodéficientes1. Cryptococcus neoformans est un pathogène fongique opportuniste notoire capable de survie intracellulaire dans les cellules macrophages hôtes. L’intervention antifongique inadéquate a comme résultat la diffusion fongique et les manifestations représentant un danger pour la vie de la méningite cryptococcique et de la méningoencéphalite2,3. L’augmentation mondiale du statut immunocompromisé a exigé une augmentation parallèle de l’utilisation d’agents antifongiques, dans laquelle de nombreuses espèces fongiques, y compris les néoformans C. ont de plus en plus évolué résistance vers4,5,6. Par conséquent, il est impératif de mettre en œuvre des technologies robustes et efficaces pour répondre aux questions biologiques vitales concernant la réponse de la défense de l’hôte et la pathogénie microbienne.
La nouvelle ère du progrès technologique en spectrométrie de masse (SP), y compris la génération de puissants pipelines informatiques et bioinformatiques, fournit les bases d’une vision intégrative pour l’analyse à grande échelle de la recherche sur les pathogèneshôtes 7,8. L’analyse protéomique conventionnelle axée sur la pathogénie dresse généralement le portrait de l’infection du point de vue de l’hôte ou de l’agent pathogène, y compris des méthodologies complètes telles que le profilage de corrélation protéique, la chromatographie par affinité combinée à la protéomique et l’interactomique9. Les études sur la virulence des agents pathogènes dangereux dans un système hôte sont d’une immense importance clinique; toutefois, l’application d’une analyse à double perspective dans une seule expérience était autrefois considérée comme inaccessible. Par exemple, la perspective de l’agent pathogène à l’égard de l’infection est souvent submergée par des protéines hôtes très abondantes, ce qui réduit la sensibilité à la détection de protéines fongiquesfaiblement abondantes 7. En outre, la grande complexité de l’échantillon invite de nombreuses cibles à étudier dans un seul système expérimental et s’avère difficile à élucider les mécanismes d’action pour une protéine pathogène spécifique.
La protéomique ascendante est une technique populaire de SP qui permet une préparation gérable de l’échantillon, dans laquelle les peptides sont générés par digestion enzymatique spécifique à la séquence suivie d’une séparation, d’une identification et d’une quantification de la chromatographie liquide par MS10,11. Ici, nous présentons une méthode démontrant une stratégie d’acquisition dépendante des données visant à atteindre une couverture impartiale d’un protéome ou d’un « infectome » basé sur l’infection. Plus précisément, la quantification sans étiquette (LFQ) réduit la dépendance à l’égard des étiquettes chimiques ou métaboliques pour une identification robuste et précise des changements de niveau de protéines à travers de multiples protéomes, réduisant ainsi les étapes de manipulation et de traitementdes échantillons 12,13. Cette application universelle interroge les protéines produites à un moment donné au sein d’une cellule indépendante de toute production de protéines attendue; ainsi, de nouvelles idées peuvent être découvertes qui sont critiques à l’infection.
Le flux de travail décrit ci-après est optimisé pour explorer les changements de niveau de protéines des néoformans C. pendant les conditions d’imitation de l’infection avec les cellules immunitaires hôtes ( figure1). Plutôt que de s’appuyer sur l’isolement et la séparation des types de cellules, cette approche extrait ensemble le protéome de l’hôte et de l’agent pathogène, et utilise la séparation bioinformatique à l’aide de deux bases de données spécifiques à l’organisme pour distinguer la production de protéines propres à chaque espèce. Cette méthode offre des avantages pour un nombre illimité d’échantillons à traiter sans les étapes de préparation supplémentaires coûteuses nécessaires dans les études d’étiquetage à base d’isotopes ou la fractionnement. En outre, ce flux de travail prend en charge des protocoles optimisés d’extraction de protéines transférables à un large éventail d’agents pathogènes fongiques et bactériens capables de cibler et d’infecter les cellules immunitaires hôtes. Dans l’ensemble, ce protocole décrit les étapes à suivre pour effectuer une extraction impartiale des protéines et le traitement de l’échantillon pour la SP à haute résolution, suivi de données et d’analyses statistiques, capables de fournir une mine de connaissances sur les protéines fongiques importantes pour l’infection combinées à un profilage complet de la réponse de la défense de l’hôte.
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Protocol
Une lignée immortalisée de macrophages dérivés de souris BALB/c a été utilisée pour le protocole suivant approuvé par le Protocole d’utilisation des animaux 4193 de l’Université de Guelph. Notamment, d’autres souches de souris ou d’autres sources de cellules immortalisées peuvent être appliquées au protocole décrit avec des tests suffisants pour optimiser les paramètres détaillés. Le protocole suivant naviguera dans les étapes commençant par un flacon gelé de cellules macrophages. Les cellules sont stockées dans 10 % de FBS (sérum bovin fœtal), 1 % de L-glutamine et 5 % de mélange Pen/Strep (Pénicilline-Streptomycine) au DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) et 20 % au DMSO (diméthyl sulfoxide).
1. Culture des néoformans C.
- À l’aide d’un stock de glycérol, strier la souche de type sauvage C. neoformans (H99) sur la plaque d’agar peptone dextrose (YPD) extraite de levure pour isoler les colonies simples.
- Incuber toute la nuit pendant 16 h à 37 °C dans un incubateur statique.
- Choisissez une seule colonie de souches et de cultures de néoformans de type sauvage C. dans 5 mL de bouillon YPD dans un tube à essai de 10 mL lâchement plafonné. Effectuer en quadruplicate.
- Incuber toute la nuit pendant 16 h à 37 °C dans un incubateur secouant à 200 rpm.
- Le lendemain, sous-culture chaque culture du jour au lendemain dans une dilution de 1:100 en bouillon YPD de 3 mL.
- Mesurer les valeurs de densité optique (OD600nm)de la culture fongique pour déterminer la phase médiane du journal. Selon le spectrophotomètre, la souche de type sauvage C. neoformans atteint la phase médiane du rondins généralement après 6 à 8 h d’incubation dans la DPJ avec des valeurs générales de600 nm d’OD allant de 1,0 à 1,5.
- Une fois que les cellules atteignent la phase médiane, prendre un aliquot de 10 μL de suspension de cellules fongiques dans un tube de microcentrifugeuse propre de 1,5 mL et diluer 1:100 dans stérile 1x phosphate salin tamponné (PBS). Comptez le nombre de cellules à l’aide d’un hémocytomètre.
2. Culture des cellules macrophages
REMARQUE : Assurez-vous que l’environnement de travail est stérilisé avant le travail de culture cellulaire.
- Préparation du milieu de culture cellulaire
- Milieu complété par antibiotique : Ajouter 10 % de FBS (sérum bovin fœtal), 1 % de L-glutamine et 5 % de mélange Pen/Strep (pénicilline-streptomycine) au DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium). Filtrer le milieu à travers un système de filtre complet de 0,2 μm et le stocker à 4 °C.
- Milieu sans antibiotiques : Suivez un protocole identique mais omettez le mélange Pen/Strep.
- Cellules macrophages d’ensemencement
REMARQUE : Le milieu complété par antibiotique (2,1,1.) doit être réchauffé à 37 °C avant le travail de culture cellulaire.- Décongeler rapidement le flacon de cellules macrophages dans un bain de perles à 37 °C.
- Lavez les cellules de la solution de congélation en réutilisant les cellules dans un milieu complété par des antibiotiques de 1 mL.
REMARQUE : Des précautions supplémentaires sont nécessaires pour s’assurer que les cellules ne lysent pas en raison d’un tuyautage rigoureux. - Transférer les cellules résuspendées dans un tube stérile de 15 mL.
- Pelleter les cellules en centrifugant à 400 × g pendant 5 min à température ambiante.
- Retirer délicatement le supernatant à l’l’l’instigateur sérologique ou aspirateur sous vide.
- Resuspendez doucement la pastille dans 10 mL de milieu complété antibiotique.
- Pipette doucement resuspendait les cellules dans un plat traité par culture cellulaire de 60 x 15 mm.
- Incuber le plat à 37 °C avec 5 % de CO2 pendant la nuit.
- Passage initial des cellules macrophages
REMARQUE : Les stocks de cellules congelées contiennent généralement entre 5 et 10 millions de cellules par flacon (environ 1 mL). Le jour suivant, les cellules macrophages qui ont survécu au protocole d’ensemencement adhéreront au fond du plat de culture cellulaire et seront prêtes à passer.- Milieu chaud complété par antibiotiques (étape 2.1.1) à 37 °C avant le travail de culture cellulaire. S’assurer que l’environnement de travail est stérilisé avant le travail de culture cellulaire. Visualisez les cellules à l’aide d’un microscope léger pour vous assurer que les cellules sont respectées et saines.
- Retirer le milieu de culture cellulaire du plat soit à l’aide d’une pipette sérologique, soit d’un aspirateur à vide.
- Ajouter délicatement 5-7 mL de PBS stérile à température ambiante (saline tamponnée de phosphate) au plat de 60 x 15 mm.
- Inclinez doucement le plat pour laver les cellules adhérentes.
- Retirez PBS à l’aide d’une pipette sérologique ou d’un aspirateur sous vide.
- Ajouter 1 mL de PBS froid (stocké à 4 °C) dans les cellules, incliner le plat pour répartir le PBS sur toutes les cellules et laisser reposer à température ambiante pendant 1 min.
- Relâchez les cellules en tapotant doucement le plat, en pipetting PBS froid contre les cellules, ou en utilisant un grattoir cellulaire.
- Ajouter 9 mL de milieu complété par antibiotique au plat.
- Dans un nouveau plat de 60 x 15 mm, ajouter 9 mL de milieu frais complété par antibiotiques et 1 mL de cellules résuspendées du plat d’origine.
- Une fois que le nombre de plaques de passage désirées a été rempli, les cellules résuspendées du plat d’origine peuvent être jetées.
- Incubez le nouveau plat aux réglages mentionnés ci-dessus (étape 2.2.8).
- Effectuer un passage ultérieur lorsque les cellules ont atteint 70-80% de confluence (environ tous les 2 jours selon la lignée cellulaire et le milieu utilisé).
REMARQUE : Les cellules macrophages doivent être acédées au moins cinq fois avant les expériences d’infection. Selon la lignée cellulaire, les expériences d’infection doivent être effectuées par 25 à 30 passages. Après 25 à 30 passages, les cellules doivent être congelées ou jetées. L’article 2.4 ou 2.5 peut être choisi en fonction des plans expérimentaux. L’article 2.4 sera utilisé pour les sections suivantes.
- Cellules macrophages d’ensemencement avant l’infection
- Effectuez des étapes de protocole de passage 2.3.1 à 2.3.7.
- À l’aide d’un hémocytomètre ou d’un compteur cellulaire automatisé, déterminer la densité cellulaire (cellules/mL).
- Transférer 0,3 x 10cellules macrophages dans un seul puits d’une plaque de culture cellulaire de 6 puits.
- Ajuster le volume total du puits à 1 mL à l’aide d’un milieu complété par antibiotiques (étape 2.1.1).
- Répétez les étapes 2.4.3 et 2.4.4 jusqu’à ce que 8 puits aient été remplis (4 puits remplis dans deux assiettes séparées).
- En option, remplissez les deux autres puits de 1 mL de PBS à température ambiante pour maintenir les niveaux d’humidité pendant l’incubation.
- Permettre aux cellules de croître dans des conditions d’incubation mentionnées à l’étape 2.2.8 pour 2 d avant l’infection.
- Cellules macrophages d’ensemencement le jour de l’infection
- Effectuez des étapes de protocole de passage 2.3.1 à 2.3.7.
- À l’aide d’un hémocytomètre ou d’un compteur cellulaire automatisé, déterminer la densité cellulaire (cellules/mL).
- Graine 1,2 x 106 cellules macrophages dans un seul puits d’une plaque de culture cellulaire de 6 puits.
- Ajuster le volume total du puits à 1 mL à l’aide d’un milieu complété par antibiotiques (2,1,1).
- Répétez 2,4,3 et 2,4,4 jusqu’à ce que 8 puits aient été remplis (4 puits remplis dans deux assiettes distinctes).
- En option, remplissez les deux autres puits de 1 mL de PBS à température ambiante pour maintenir les niveaux d’humidité pendant l’incubation.
- Incuber les cellules dans des conditions mentionnées à l’étape 2.2.8 pendant 3 h pour permettre aux cellules d’adhérer aux puits.
3. Infection des cellules de macrophage avec C. neoformans
REMARQUE : Après avoir atteint 70-80% de confluence, il y aura environ 1,2 x 10cellules macrophages par puits. Pour atteindre la multiplicité désirée de l’infection (MOI) de 100:1, 1,2 x 108 cellules fongiques sont nécessaires pour chaque réaction. Les cultures doivent être définies en conséquence dans le quadruplicate biologique.
AVERTISSEMENT: Un MOI de 100:1 a obtenu des résultats souhaitables dans notre groupe de recherche et se veut une suggestion pour les lecteurs. Un MOI inférieur peut être nécessaire pour les souches c. néoformans plus infectieuses ou pour les lignées cellulaires macrophages moins résilientes. La vérification de l’infection (section 3.5) peut être utilisée pour déterminer l’I MOI idéal pour certaines combinaisons de C. neoformans – macrophages.
- Préparation de cellules fongiques
- Suivez l’étape 1 pour la croissance des néoformans C. jusqu’à la phase médiane.
- Recueillir et centrifuger les cellules à 1 500 x g pendant 10 min, laver délicatement les granulés avec du PBS stérile à température ambiante et répéter pendant un total de trois lavages.
- Resuspendez les cellules dans le milieu de culture cellulaire sans antibiotiques (étape 2.1.2) pour atteindre une concentration de 1,2 x 108 cellules/mL.
- Préparation des cellules macrophages
- Visualisez chaque puits dans la plaque de 6 puits pour s’assurer que les cellules ont atteint 70-80% de confluence. Alternativement, les cellules peuvent être mesurées pour atteindre environ 1,2 x 106 cellules macrophages par puits.
- Suivez les étapes 2.3.1 à 2.3.4.
- Co-culture des néoformans C. et des cellules macrophages
- Ajouter 1 mL des cellules C. néoformans résuspendées (étape 3.1.3) à 4 puits contenant des cellules macrophages préparées dans la section 3.2.
REMARQUE : Le nombre de plaques requises devra être calculé avant le début de l’expérience. Ajouter 1 mL de milieu sans antibiotiques (étape 2.1.2) aux puits vides. - Permettre aux cellules d’incuber dans des conditions énumérées (étape 2.2.8) pendant 3 h.
- Retirez le milieu de culture cellulaire de la plaque soit à l’aide d’une pipette sérologique, soit d’un aspirateur à vide.
- Ajouter délicatement 1 mL de PBS stérile à température ambiante.
- Inclinez doucement la plaque pour laver les cellules extracellulaires C. néoformans non attachées ou non phagocytosed.
- Retirer le PBS à l’aide d’une pipette sérologique ou d’un aspirateur sous vide, répéter pendant un total de trois lavages. Répétez 3,3,4 à 3,3,5 deux fois de plus.
- Ajouter 1 mL des cellules C. néoformans résuspendées (étape 3.1.3) à 4 puits contenant des cellules macrophages préparées dans la section 3.2.
- Macrophages non infectés
- De même, utilisez 4 puits d’une plaque de puits de 6 puits pour servir d’échantillons de macrophages seulement. Ajouter 1 mL de milieu sans antibiotiques (étape 2.1.2) à ces puits.
- Répétez les étapes 3.3.2 à 3.3.6.
- Vérification de l’infection
REMARQUE : À l’aide d’un test de cytotoxicité, la maîtrise de l’infection peut être mesurée. Le protocole suivant mettra en évidence l’application d’un produit de cytotoxicité pour mesurer la libération de LDH (déshydrogénase lactate). D’autres produits de cytotoxicité peuvent également être utilisés.- Préparation de l’infection de C. neoformans des cellules de macrophage
- Répète les étapes 1, 2 et 3 (jusqu’à 3,5). L’analyse LDH peut être effectuée en triplicate, si vous préférez.
- Après l’étape 3.3.6, ajouter 1 mL de milieu sans antibiotiques (2.1.2) à chaque puits dans la plaque de 6 puits.
- Répétez les étapes 2.4.3 et 2.4.4 jusqu’à ce que 3 puits plus 3n puits aient été remplis (où n est le nombre de points de temps mesurés).
- Incuber les cellules dans des conditions énumérées à l’étape 2.2.8.
- À certains moments (p. ex., 1, 3, 6, 12 et 24 heures) recueillez le surnatant pour mesurer la libération de LDH selon les instructions du fabricant
- Dans le même temps, les cellules macrophages non infectées seront lysées à la valeur déterminée pour la cytotoxicité maximale.
- Calculez la cytotoxicité comme suit :
- Préparation de l’infection de C. neoformans des cellules de macrophage
4. Collecte d’échantillons
- Co-culture et collection de macrophages non infectés
- Ajouter 1 mL de PBS froid aux cellules (de 3,3,6 et 3,4,2) et laisser reposer à température ambiante pendant 1 min.
- Libérez les cellules de la plaque en tapant doucement de la plaque ou en tapant doucement pbs froid contre les cellules.
REMARQUE : Le grattoir de cellules devrait être évité car ceci pourrait causer la lyse des cellules. - Pipette a réutilisé les cellules dans un tube de 15 mL.
- Centrifugeuses à 400 x g pendant 5 min à température ambiante, et enlever le supernatant.
- Traiter les cellules (détaillées à l’étape 5) immédiatement ou flasher congelées dans de l’azote liquide et stockées à -80 °C pour un traitement ultérieur.
5. Protéome cellulaire
REMARQUE : Une lyse suffisante doit être optimisée pour le type de cellule analysé (c.-à-d. que la quantité de cycles et d’amplitudes dépend de la taille des granulés cellulaires et du pourcentage de puissance du modèle de sonicateur de sonde).
- Lyse infectée de cellules de macrophage
- Resuspendez les cellules granulées (étape 4.1.5) dans 300 μL de 100 mM Tris-HCl (pH 8.5) se composant d’un comprimé de cocktail inhibiteur de protéase fraîchement dissous.
REMARQUE : Un comprimé de cocktail inhibiteur de la protéase est ajouté à 10 mL de glace froide 100 mM Tris-HCl (pH 8,5) avant le début de l’expérience. - Sondez les cellules sonicates dans un bain de glace pendant 15 cycles de 30 s sur et 30 s éteints, pour lyser les cellules.
- Cellules centrifugeuses brièvement pendant 30 s à 400 x g, attentionà ne pas former une pastille, juste pour enlever le liquide sur les côtés des tubes suivi du transfert de l’échantillon à un tube de microcentrifugeuse lo-bind de 2 mL.
- Ajouter 1:10 volume de 20% SDS à une concentration finale de 2%.
- Ajouter 1:100 volume de 1 M dithiothreitol (DTT) à une concentration finale de 10 mM et bien mélanger l’échantillon par pipetting, suivi de l’incubation sur un bloc de chauffage thermique à 95 °C pendant 10 min à 800 rpm d’agitation. Ensuite, laisser refroidir à température ambiante (le refroidissement peut se faire sur la glace).
- Ajouter 1:10 volume de 0,55 M d’iodoacetamide (IAA) pour obtenir une concentration finale de 55 mM et bien mélanger l’échantillon par pipetting. Incuber à température ambiante dans l’obscurité pendant 20 min.
- Ajouter 100% d’acétone pour obtenir une concentration finale de 80% d’acétone et conserver l’échantillon pendant la nuit à -20°C pour précipiter les protéines.
- Resuspendez les cellules granulées (étape 4.1.5) dans 300 μL de 100 mM Tris-HCl (pH 8.5) se composant d’un comprimé de cocktail inhibiteur de protéase fraîchement dissous.
- Digestion des protéines
- Le lendemain, recueillir la pastille précipitée par centrifugation pendant 10 min à 10 000 x g et 4 °C. Jeter le supernatant et laver les granulés avec 500 μL d’acétone à 80 %. Répétez l’répétition pour un total de deux lavages. Air granulé sec à température ambiante après les lavages.
- Resolubiliser les granulés protéiques en 100 μL de 8 M urée/40 mM HEPES, afin d’assurer une solubilisation complète, un vortex ou un sonicate dans un bain d’eau glacée pendant 15 cycles de 30 s et 30 s éteints.
REMARQUE : L’ajustement du volume d’urée/HEPES est déterminé sur la taille de la pastille cellulaire précipitée, si des altérations se produisent, tous les volumes en aval doivent être ajustés de façon appropriée. - Quantifier la concentration en protéines à l’aide d’un test protéique (p. ex., analyse des protéines BCA) selon les instructions du fabricant et ajuster pour la mesure de fond par normalisation vierge avec 8 M urée/40 mM HEPES.
- Ajouter 300 μL de bicarbonate d’ammonium de 50 mM pour obtenir une concentration finale de 2 M d’urée.
REMARQUE : Possibilité de normaliser la concentration en protéines pour les mesures en aval, suggérée de digérer 100 μg de protéines et de stocker le reste de l’échantillon non digéré par congélation éclair dans de l’azote liquide, puis de les conserver à -20 °C à court terme ou à -80 °C à long terme. - Ajouter 2:50 (v/w) rapport enzyme-protéine du mélange trypsine/Lys-C protéase sur la glace et tapoter doucement le tube pour mélanger, incuber toute la nuit à température ambiante.
- Après l’incubation, arrêter la digestion en ajoutant 1:10 solution d’arrêt de volume (20% d’acétylonitrile, 6% d’acide trifluoroacétique) et des échantillons de centrifugeuses à 10 000 x g pendant 5 min à température ambiante.
- Recueillir le supernatant(se compose de peptides digérés)et jeter les débris granulés ou précipiter.
- Peptide desalting
- Activez une pointe D’extraction stop and go (STAGE) C18 (composée de 3 couches de résine C18 dans une pointe pipette de 200 μL) en ajoutant 100 μL d’acétyonitrile et de centrifugeuse à 1 000 x g pendant 2 min.
- Equilibrer la pointe C18 STAGE en ajoutant 50 μL d’acétyl tampon B (80 % (v/v) d’acétytrile, 0,5 % (v/v) d’acide acétique) et centrifugeuse à 1 000 x g pendant 2 min.
- Equilibrer la pointe C18 STAGE en ajoutant 200 μL d’acide trifluoroacétique tampon A (v/v), 0,1 % (v/v) d’acide trifluoroacétique, 0,5 % (v/v) d’acide acétique) et centrifugeuse à 1 000 x g pendant 3 à 5 minutes.
- Ajouter ~50 μg d’échantillon digéré sur la pointe C18 STAGE et la centrifugeuse à 1 000 x g pendant 3 à 5 minutes, ou jusqu’à ce que l’échantillon ait traversé la colonne de rotation. Congelez flash le reste de l’échantillon digéré dans de l’azote liquide et conservez-le à -20 °C, jusqu’à ce que nécessaire.
- Laver la pointe C18 STAGE avec 200 μL de tampon A et centrifugeuse à 1 000 x g pendant 3 à 5 min.
- Ajouter 50 μL tampon B à la pointe C18 STAGE et centrifugeuse à 500 x g pendant 2 min. Recueillir les peptides élitérés dans des tubes PCR de 0,2 mL.
- Sécher les peptides élitérés dans une centrifugeuse sous vide pendant 30-40 min à vitesse maximale. Les échantillons complètement séchés peuvent être conservés à température ambiante ou à -20 °C jusqu’à ce qu’ils soient traités.
REMARQUE : Les peptides séchés et dessalés sont des soumissions d’échantillons appropriées aux installations de spectrométrie de masse pour traitement et peuvent être expédiés à température ambiante.
6. Spectrométrie de masse
- Reconstituer les peptides dans 10 μL Tampon A et mesurer la concentration nécessaire pour injecter ~1.5 à 3 peptides μg sur la colonne MS. La quantité d’échantillon dépendra de l’instrumentation.
- Utiliser un gradient prédéterminé d’acétylonitrile (environ 5-60%) 0,5 % d’acide acétique sur une période désirée (p. ex., 2 h) pour séparer les peptides par chromatographie liquide haute performance, suivie de l’ionisation par électrospray dans le spectromètre de masse.
- Acquérir des scans ms à l’aide d’un spectromètre de masse haute résolution en mode d’acquisition dépendant desdonnées (m/z 300 à 1650).
REMARQUE : Le pourcentage et la longueur du gradient sont déterminés par l’expérience et l’utilisateur. Les paramètres précis du spectromètre de masse dépendent de l’instrumentation, de l’expérience et de la préférence de l’utilisateur.
7. Analyse des données
REMARQUE : Les données sur la SP peuvent être traitées avec de nombreux pipelines de bioinformatique. Dans ce protocole, nous décrivons le traitement à l’aide des plateformes MaxQuant et Perseus accessibles au public, mais recommandons aux utilisateurs individuels d’évaluer les outils bioinformatiques appropriés à l’analyse, aux préférences et à l’utilisation.
- Chargez les fichiers de données non traités (directement à partir de l’instrument MS) à l’aide du logiciel MaxQuant. Identifier les protéines sous les paramètres de recherche MaxQuant modifiés; minimum de deux peptides uniques nécessaires à l’identification des protéines à l’aide d’une approche de leurre cible pour un faux taux de découverte de 1 %, mettre en œuvre une quantification sans étiquette avec correspondance entre les courses, incorporer les organismes fichier FASTA obtenus à partir de la base de données UniProt (c.-à-Cryptococcus neoformans H99, Mus musculus)pour identifier et quantifier les peptides présents avec le moteur de recherche Andromeda. Consultez les outils en ligne MaxQuant publics pour obtenir des tutoriels détaillés (voir tableau des matériaux).
- Téléchargez le fichier de sortie MaxQuant ('proteingroups.txt') dans Persée.
- Filtrer les lignes contenant de faux positifs et contaminants potentiels, ainsi que seulement modifiées par des peptides de site avec les « lignes de filtre basées sur la colonne catégorique ».
- Transformez les valeurs de données surl’échelle log 2.
- Créez des groupes d’ensembles de données en fournissant une annotation catégorique aux lignes.
- Filtrez l’ensemble de données par valeurs valides pour définir un cut-off pour la détection des protéines.
REMARQUE : Pour une analyse rigoureuse et robuste, un taux d’identification de 50 % est suggéré. Par exemple, si quatre répliques étaient traitées, un nombre minimum de trois valeurs valides serait sélectionné. - Si vous préférez, imputez les données en remplaçant les valeurs manquantes de la distribution normale.
REMARQUE : Les valeurs imputées sont optimisées en fonction de la distribution normale et fournissent une intensité aléatoire de LFQ pour remplacer les espaces réservés « NaN » pour simuler les mesures typiques de l’abondance. Cette imputation fournit une plate-forme pour l’analyse statistique en aval qui nécessitent des données quantifiables. - Ajouter des annotations aux rangs protéiques (p. ex. noms de protéines, termes d’ontologie génétique).
REMARQUE : Ce flux de travail Persée généré est maintenant un cadre solide pour le traitement bioinformatique, l’analyse statistique et la visualisation des données, consultez les outils publics en ligne Perseus pour obtenir des didacticiels détaillés (voir tableau des matériaux).
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Representative Results
Le protocole décrit ci-dessus permet l’identification et la quantification des protéines dérivées à la fois de l’agent pathogène fongique, C. neoformans,et de l’hôte, les cellules macrophages, en une seule expérience. Après la co-culture, les cellules sont collectées et traitées ensemble et séparées bioinformatiquement à partir de profils peptidiques spécifiques à chaque espèce. Il s’agit d’une approche puissante pour définir l’interaction de la relation hôte-pathogène pendant l’infection. Le nombre de protéines identifiées à partir de l’expérience dépend du matériau de départ, de la préparation de l’échantillon, de la longueur du gradient, de l’instrumentation de la SP et du flux de travail bioinformatique. En utilisant le protocole décrit ci-après, nous identifions généralement environ 8 000 protéines de l’expérience avec 1 500 protéines C. néoformans et 6 500 protéines hôtes. Après le traitement des ensembles de données, nous générons un tracé d’analyse des composants principaux (APC) pour observer les facteurs critiques qui déterminent notre analyse (figure 2A). Ici, nous observons que la plus grande composante de la séparation entre les données est infectée par rapport aux échantillons non infectés, comme nous l’anticipons de la conception expérimentale (composant 1, 79,8 %), et une deuxième caractéristique distinctive des échantillons est la variabilité biologique (composant 2, 5,7 %). Ensuite, une corrélation Pearson combinée à un regroupement hiérarchique par la distance euclidean regroupe les échantillons et permet la quantification de la variabilité entre les répliques (Figure 2B). Dans notre analyse, nous avons observé un regroupement distinct d’échantillons infectés par rapport aux échantillons non infectés et nous avons reproduit une reproductibilité allant de 95 à 96 %, ce qui représente une bonne reproductibilité parmi les répliques. Enfin, nous effectuons un t-test de l’étudiant corrigépour des tests d’hypothèses multiples à l’aide d’un taux de fausse découverte Benjamini-Hochberg (FDR)(p-value ≤ 0,05; FDR = 0,01; s0 = 1) pour identifier les protéines ayant des différences significatives d’abondance pendant l’infection par rapport aux témoins non infectés (figure 2C). Ici, nous identifions 760 protéines avec des changements significatifs dans l’abondance, y compris 117 protéines hôtes avec 86 montrant une diminution significative et 31 montrant une augmentation significative sur l’infection. Nous observons également des augmentations significatives de l’abondance des protéines fongiques, comme prévu pendant l’infection. Grâce à ces données, des analyses ultérieures, y compris la cartographie réseau, dans la caractérisation silico, et des expériences de suivi sont effectuées pour valider les données et explorer les mécanismes moléculaires qui sous-tendent la réponse de l’hôte à la virulence.
Figure 1 : Flux de travail protéomique basé sur la spectrométrie de masse pour l’analyse des macrophages infectés par les néoformans C.. Le flux de travail commence par la collecte de macrophages infectés par des néoformans C. ou des témoins non infectés. Les protéines sont extraites par perturbation mécanique et chimique, suivies de la réduction et de l’alkylation, des précipitations d’acétone et de la digestion enzymatique. Les peptides sont purifiés sur les pointes C18 STAGE, séparés par une chromatographie liquide haute performance, soumis à l’ionisation électrospray et mesurés sur un spectromètre de masse haute résolution. Les données sont traitées, analysées et visualisées dans les plateformes bioinformatiques accessibles au public, MaxQuant (avec Andromède) et Persée14,15,16. Expériences réalisées en quadruplicate biologique. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Données représentatives de l’infection des cellules macrophages par C. neoformans. (A) L’analyse principale des composants démontre la distinction entre le macrophage infecté par rapport au macrophage non infecté (composant 1, 79,8 %) et le regroupement des répliques biologiques (composant 2, 5,7 %). (B) Carte thermique de la corrélation Pearson tracée par regroupement hiérarchique par distance euclidean pour montrer le regroupement d’échantillons (infectés par rapport aux non-infectés) et reproduire la reproductibilité (>95%). (C) Parcelle volcanique de protéines identifiées. Bleu = protéines fongiques avec un changement significatif dans l’abondance; protéines noires = macrophages avec un changement significatif dans l’abondance. T-test de l’étudiant(p-value ≤ 0,05), FDR = 0,01; s0 = 1. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Les étapes critiques du protocole comprennent la préparation des cellules macrophages et la collecte d’échantillons de co-culture pour le traitement des protéines avec une perturbation minimale des cellules. Il est important d’effectuer des étapes de lavage, d’inoculation et d’élimination des cellules macrophages adhérentes doucement et soigneusement pour prévenir la lyse inutile des cellules avant la collecte. Il est également essentiel d’établir le moi correct pour l’expérience, car l’inocculation avec un MOI excessivement élevé peut causer la mort rapide des cellules macrophages et la difficulté de recueillir et de traiter des échantillons pour la SP. Inversement, un faible nombre d’IOS entraînera une diminution du nombre de cellules fongiques phagocytosées et une détection limitée des protéines fongiques dans le système biologique. Pour surmonter ces limitations, nous recommandons d’effectuer des expériences de test avec différents protocoles d’accord, soutenus par des analyses de mort cellulaire (par exemple, la quantification de la LDH) pour définir le nombre de cellules fongiques qui déclenchent une réponse de l’hôte, mais ne tuent pas les cellules hôtes avant la collecte. Pour les expériences, nous visons à identifier les protéines fongiques associées à l’infection, nécessitant un MOI élevé (100:1) pour détecter adéquatement les protéines fongiques parmi les protéines hôtes très abondantes. Nous effectuons régulièrement des analyses de cytotoxicité de macrophage pour évaluer l’impact de MOI sur la mort de cellules d’hôte avant d’exécuter l’expérience entière. Le moment de l’incubation des cellules C. neoformans avec des macrophages est également crucial car les cellules fongiques peuvent posséder de grandes capsules de polysaccharides et, par conséquent, le macrophage nécessitent plus de temps pour l’engloutissement. Nous choisissons d’utiliser un temps d’incubation de co-culture de 3 h pour l’expérience décrite, car nous avons trouvé une bonne couverture du protéome fongique à ce stade et de fournir un « snap-shot » de la réponse de l’hôte; toutefois, les chercheurs peuvent vouloir explorer des points de temps plus tôt et plus tard et observer comment le moment influe sur la production de protéines fongiques et hôtes. Alternativement, l’amorçage du macrophage pour l’opsonisation a été exécuté pour aider le processus phagocytique17,18.
Pour la collecte de l’échantillon, si les échantillons ne sont pas traités immédiatement, la congélation éclair dans l’azote liquide aidera à prévenir la dégradation non désirée des protéines par les protéases présentes dans les échantillons. De plus, pour les analyses protéomiques à base de SP, le risque de contamination par la poussière ou la kératine (p. ex., cellules de la peau et des cheveux) devrait être limité par l’utilisation de gants de nitrile, de manteaux de laboratoire et de lavage de toutes les surfaces avec 70 % d’éthanol avant de commencer les expériences. En outre, les protocoles décrits ci-dessus sont spécifiques à l’ensemble d’échantillons de co-culture décrits, mais peuvent être modifiés pour l’optimisation du flux de travail d’extraction des protéines, aubesoin 19,20. Les possibilités de modifier le flux de travail et d’optimiser pour certains types de cellules comprennent les techniques de perturbation mécaniques et chimiques sélectionnées, la durée et la température de la digestion enzymatique, et la séparation des échantillons. Par exemple, la lyse des cellules de C. neoformans est typiquement exécutée par battement mécanique de perle ; cependant, nous avons observé la couverture accrue de protéome suivant la sonication de sonde et donc, le recommandons pour la perturbation mécanique des cellulesinfectées 19,21,22. Par exemple, la fractionnement des échantillons de peptides en aliquots par fractionnement à pH élevé ou chromatographie d’exclusion de taille peut réduire la complexité de l’échantillon et améliorer la profondeur de la couverture sur le spectromètre de masse9. De plus, pour atteindre la profondeur de la couverture afin d’identifier environ 8 000 protéines hôtes et fongiques, un système de spectrométrie de masse haute résolution est nécessaire (p. ex., QExactive Exploris, Fusion Lumos, timsTOF Pro).
L’utilisation du LFQ pour quantifier les changements dans les niveaux de protéines pendant l’infection est une approche fiable et rentable pour la protéomique à base deSP 12. Il permet la quantification des protéines par abondance relative sans avoir besoin d’étapes supplémentaires de traitement des échantillons. En outre, l’analyse est effectuée après la fin de l’expérience, se prêtant à des applications universelles et une conception d’étude flexible. Toutefois, les limites du LFQ comprennent l’augmentation du temps d’instrumentation, car les échantillons doivent être exécutés séquentiellement et ne peuvent pas être combinés, la comparabilité entre les échantillons peut s’avérer difficile et la nécessité d’imputation pour remplacer les valeurs manquantes peut êtreélevée 23. Les approches alternatives pour quantifier l’abondance des protéines comprennent les techniques d’étiquetage métaboliques (p. ex., étiquetage isotopique stable des acides aminés dans la culture cellulaire) et chimiques (p. ex., étiquettes de masse tandem), qui permettent de combiner des échantillons pour réduire le temps aux instruments, d’assurer une comparabilité fiable entre les échantillons et, généralement, de réduire les valeursmanquantes 24,25. Toutefois, de telles approches nécessitent des étapes supplémentaires de manipulation et de traitement des échantillons, une complexité et un temps accrus des expériences de laboratoire humide, ainsi qu’une conception expérimentale fixe. Pour choisir une méthode de quantification optimale pour les expériences proposées, les utilisateurs devraient tenir compte de la conception et de la comparabilité des échantillons, de la complexité des laboratoires humides et de l’analyse des données, ainsi que de la disponibilité et du coût du temps d’instrumentation.
La nouveauté du protocole présenté est la capacité de définir les changements dans le protéome à la fois du point de vue de l’hôte et de l’agent pathogène en une seule expérience. La profondeur de la couverture des deux protéomes permet un nouvel aperçu de la façon dont l’agent pathogène initie l’infection et comment l’hôte réagit en défense. L’approche se concentre notamment sur l’infection de l’ensemble de la cellule; toutefois, il existe des possibilités de définir des sous-protéomes ou des réponses compartimentées à l’infection par combinaison avec des techniques de localisation spatiale (p. ex., centrifugation, enrichissement, étiquetage)26,27. Ici, nous détaillons l’interaction entre les macrophages et l’agent pathogène fongique, C. neoformans; toutefois, l’approche est universelle et peut être appliquée aux interactions entre un éventail diversifié de systèmes biologiques. Par exemple, nous avons récemment utilisé un flux de travail similaire pour découvrir les réponses générales et spécifiques au site des neutrophiles dérivés d’un modèle murin de kératiteoculaire 28,29,30. En outre, les ensembles de données infectomes générés par ce protocole peuvent être intégrés avec le protéome in vitro et le profilage sécrétome d’un agent pathogène pour détecter les protéines avec une abondance altérée en présence de cellules hôtes. Ces protéines, appelées protéines associées à l’infection, fournissent une pléthore de facteurs de virulence connus et nouveaux pour une caractérisation plus complète, y compris la régulation temporelle, la localisation et les interactions directes protéine-protéine avec l’hôte. Dans l’ensemble, le flux de travail protéomique à base de SP décrit offre une nouvelle occasion d’étudier la relation complexe entre l’hôte et l’agent pathogène dans une seule expérience avec l’universalité et la compréhension qui ne sont pas couramment disponibles.
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Les auteurs remercient le Dr Jonathan Krieger de Bioinformatics Solutions Inc. d’avoir exploité le spectromètre de masse pour des expériences représentatives, ainsi que les membres du groupe Geddes-McAlister pour leur aide à la mise en place expérimentale et à la rétroaction manuscrite. Les auteurs reconnaissent le soutien financier, en partie, de la Banting Research Foundation – The Jarislowsky Fellowship Discovery Award, New Frontiers Research Fund – Exploration (NFRFE-2019-00425), et de la Fondation canadienne pour l’innovation (JELF 38798) pour J.G.M., ainsi que de la Bourse d’études supérieures du CRSN Canada – Maîtrise et bourse d’études supérieures de l’Ontario pour B.B., et bourse d’études supérieures Queen Elizabeth II en sciences et technologie pour les A.S.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mM Tris-HCl, pH 8.5 | Fisher Scientific | BP152-1 | Maintain at 4°C |
| 60 x 15 mm Dish, Nunclon Delta | ThermoFisher Scientific | 174888 | |
| 6-well cell culture plate | ThermoFisher Scientific | 140675 | |
| Acetonitrile, MS grade | Pierce | TS-51101 | |
| Acetic Acid | Sigma Aldrich | 1099510001 | |
| Acetone | Sigma Aldrich | 34850-1L | |
| Ammonium bicarbonate (ABC) | ThermoFisher Scientific | A643-500 | Prepare a stock 50 mM ABC solution, stable at room temperature for up to one month. |
| Bel-Art™ HiFlow Vacuum Aspirator Collection System | Fisher Scientific | 13-717-300 | Not essential, serological pipettes can be used to remove media. |
| C18 resin | 3M Empore | 3M2215 | |
| Cell Scrapers | VWR | 10062-906 | Not essential, other methods to release macrophage cells can be used. |
| Centrifugal vaccuum concentrator | Eppendorf | 07-748-15 | |
| Complete Filtration Unit | VWR | 10040-436 | |
| Conical falcon tubes (15 mL) | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
| Countess II Automated Cell Counter | ThermoFisher Scientific | AMQAX1000 | Not essential, haemocytometer can be used as an alternative. |
| CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay | Promega | G1780 | |
| Dithiothreitol (DTT) | ThermoFisher Scientific | R0861 | Prepare bulk stock solution of 1 M DTT, flash frozen and stored at -20 °C until use. Discard after each use (do not freeze-thaw repeatedly). |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement | ThermoFisher Scientific | 10566016 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher Scientific | 12483020 | Heat inactivate by incubating at 60°C for 30 minutes. Prepare 50 ml aliquots and flash freeze. Thaw prior to media preparation |
| Haemocytometer | VWR | 15170-208 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | Prepare 40 mM HEPES/8 M Urea in bulk stock solution, flash frozen, store at -20°C until use. Discard after each use (do not freeze-thaw repeatedly). |
| High-performance liquid chromatography system | ThermoFisher Scientific | LC140 | Gradient length is based on sample complexity, recommended 120 min gradient for infectome samples. |
| High-resolution mass spectrometer | ThermoFisher Scientific | 726042 | |
| Iodoacetamide (IAA) | Sigma Aldrich | I6125 | Prepare 0.55 M bulk stock solution, flash frozen, store at -20°C until use. Discard after each use (do not freeze-thaw repeatedly). |
| L-glutamine | ThermoFisher Scientific | 25030081 | Can be aliquot and frozen for storage. Thaw prior to media preparation. |
| LoBind Microcentrifuge tubes | Eppendorf | 13-698-794 | |
| MaxQuant | https://maxquant.org/ | MaxQuant is a public platform that offers tutorials, such as the MaxQuant Summer School, outlining the computational analysis steps of large MS data sets | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 13864457 | |
| Penicillin : Streptomycin 10k/10k | VWR | CA12001-692 | Can be aliquot and frozen for storage. Thaw prior to media preparation. |
| Peptide separation columns | ThermoFisher Scientific | ES803 | |
| Perseus Software | http://maxquant.net/perseus/ | ||
| Phosphate Buffered Saline | VWR | CA12001-676 | Puchase not required. PBS can also be prepared but sterile filteration must be performed before use. |
| Pierce BCA Protein Assay | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
| Pipette, Disposable Serological (10 mL) | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
| Pipette, Disposable Serological (25 mL) Basix | Fisher Scientific | 14955235 | |
| Probe sonciator | ThermoFisher Scientific | 100-132-894 | |
| Protease inhibitor cocktail tablet | Roche | 4693159001 | |
| Sodium dodecyl sulfate | ThermoFisher Scientific | 28364 | 20% (w/v) |
| Spectrophotometer (Nanodrop) | ThermoFisher Scientific | ND-2000 | |
| STAGE tipping centrifuge | Sonation | STC-V2 | |
| Thermal Shaker | VWR | NO89232-908 | |
| Trifluoroacetic acid | ThermoFisher Scientific | 85183 | |
| Trypsin/Lys-C protease mix, MS grade | Pierce | A40007 | Maintain at -20 °C. |
| Ultrasonic bath | Bransonic | A89375-450 | Stored in cold room (4C) |
| Urea | Sigma Aldrich | U1250-1KG | Prepare 40 mM HEPES/8 M Urea in bulk stock solution, flash frozen, store at -20 °C until use. Discard after each use (do not freeze-thaw repeatedly). |
| Yeast-extract peptone dextrose broth | BD Difco | BM20 |
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