Summary
Her presenterer vi en protokoll for å profilere samspillet mellom vert og patogen under infeksjon av massespektrometribaserte proteomics. Denne protokollen bruker etikettfri kvantifisering for å måle endringer i proteinoverflod av både vert (f.eks. makrofager) og patogen (f.eks. Cryptococcus neoformans) i et enkelt eksperiment.
Abstract
De teknologiske prestasjonene til massespektrometri (MS)-baserte kvantitative proteomics åpner mange uoppdagede veier for å analysere kroppens globale proteom under varierende forhold. Denne kraftige strategien brukes på samspillet mellom mikrobielle patogener med ønsket vert karakteriserer omfattende begge perspektiver mot infeksjon. Her beskriver arbeidsflyten etikettfri kvantifisering (LFQ) av infeksiøs av Cryptococcus neoformans, et soppfakultativt intracellulært patogen som er det forårsakende middelet til den dødelige sykdommen kryptokoccosis, i nærvær av udødeliggjorte makrofagceller. Protokollen beskriver de riktige proteinpreparatteknikkene for både patogene og pattedyrceller i et enkelt eksperiment, noe som resulterer i passende peptidinnsending for væskekromatografi (LC)-MS/MS-analyse. Den høye gjennomstrømningen generisk natur LFQ tillater et bredt dynamisk spekter av protein identifikasjon og kvantifisering, samt overføringsevne til enhver vert-patogen infeksjon innstilling, opprettholde ekstrem følsomhet. Metoden er optimalisert for å katalogisere omfattende, objektive proteinoverflodprofiler av et patogen innen infeksjons mimicking forhold. Spesielt gir metoden som er demonstrert her viktig informasjon om C. neoformans patogenese, for eksempel proteinproduksjon som er nødvendig for virulens og identifiserer kritiske vertsproteiner som reagerer på mikrobiell invasjon.
Introduction
Forekomsten av invasive soppinfeksjoner øker i stor grad og er korrelert med uakseptabel høy dødelighet, oftest rapportert hos personer med immunsviktig predisposisjoner1. Cryptococcus neoformans er et beryktet opportunistisk sopppatogen som er i stand til intracellulær overlevelse i vertsmakrofagceller. Utilstrekkelig antifungal intervensjon resulterer i soppformidling og livstruende manifestasjoner av kryptokokkmeningitt og meningoencefalitt2,3. Den globale økningen i immunkompromittert status har krevd en parallell økning i bruken av antifungale midler, der mange sopparter, inkludert C. neoformaner, i økende grad har utviklet motstand mot4,5,6. Derfor er det viktig å implementere robuste og effektive teknologier for å svare på viktige biologiske spørsmål om vertsforsvarsrespons og mikrobiell patogenese.
Den nye alderen av teknologiske fremskritt i massespektrometri (MS), inkludert generering av kraftige beregnings- og bioinformatiske rørledninger, gir grunnlaget for en integrerende visjon for storskala analyse av host-patogen forskning7,8. Konvensjonell patogenese-drevet proteomisk analyse profilerer vanligvis synet på infeksjon fra enten verten eller patogenperspektivet, inkludert omfattende metoder som proteinkorrelasjonsprofilering, affinitetkromatografi kombinert med proteomics og intermatikk9. Undersøkelser av virulens av farlige patogener i et vertssystem er av enorm klinisk betydning; Imidlertid ble anvendelsen av en dobbel perspektivanalyse i et enkelt eksperiment tidligere ansett som uoppnåelig. For eksempel blir patogenets perspektiv mot infeksjon ofte overveldet av svært rikelig vertsproteiner som resulterer i redusert følsomhet for påvisning av lavrike soppproteiner7. Videre inviterer den høye prøvekompleksiteten mange mål å undersøke i et enkelt eksperimentelt system og viser seg utfordrende å belyse virkningsmekanismer for et bestemt patogenprotein.
Bottom-up proteomics er en populær MS-teknikk som muliggjør håndterlig prøveforberedelse, der peptider genereres av sekvensspesifikk enzymatisk fordøyelse etterfulgt av flytende kromatografiseparasjon, identifikasjon og kvantifisering av MS10,11. Her presenterer vi en metode som viser en dataavhengig oppkjøpsstrategi som skal oppnå en objektiv dekning av en infeksjonsbasert proteom eller "infectome". Spesielt, etikettfri kvantifisering (LFQ) kaster avhengigheten av kjemiske eller metabolske etiketter for robust og nøyaktig identifisering av proteinnivåendringer på tvers av flere proteomer, redusere prøvehåndtering og behandling trinn12,13. Denne universelle applikasjonen forhører produserte proteiner på et gitt tidspunkt i en celle uavhengig av forventet proteinproduksjon; Dermed kan ny innsikt oppdages som er avgjørende for infeksjon.
Arbeidsflyten som er beskrevet her, er optimalisert for å utforske endringer på proteinnivå av C. neoformaner under infeksjons-etterlignende forhold med verts immunceller (figur 1). I stedet for å stole på isolasjon og separasjon av celletyper, trekker denne tilnærmingen verten og patogenproteomet sammen, og benytter bioinformatisk separasjon ved hjelp av to organismespesifikke databaser for å skille artsspesifikk proteinproduksjon. Denne metoden gir fordeler for et ubegrenset antall prøver som skal behandles uten de ekstra kostbare forberedelsestrinnene som er nødvendige i isotopbaserte merkingsstudier eller fraksjonering. Videre støtter denne arbeidsflyten optimaliserte proteinutvinningsprotokoller som kan overføres til et bredt spekter av sopp- og bakterielle patogener som er i stand til å målrette og infisere verts immunceller. Samlet sett skisserer denne protokollen trinnene for å fullføre en objektiv proteinutvinning og prøvebehandling for høyoppløselig MS, etterfulgt av data og statistisk analyse, som er i stand til å gi et vell av kunnskap om soppproteiner som er viktige for infeksjon kombinert med omfattende profilering av vertens forsvarsrespons.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En udødeliggjort linje av makrofager avledet fra BALB / c mus ble brukt til følgende protokoll godkjent av University of Guelph Animal Utilization Protocol 4193. Spesielt kan andre stammer av mus eller andre kilder til udødelige celler brukes på den skisserte protokollen med tilstrekkelig testing for å optimalisere de detaljerte parametrene. Følgende protokoll navigerer trinnene som begynner med et frossent hetteglass med makrofagceller. Celler lagres i 10% FBS (føtal storfe serum), 1% L-glutamin og 5% Pen / Strep (Penicillin-Streptomycin) blanding til DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) og 20% DMSO (dimetylsulfoksid).
1. Dyrking av C. neoformans
- Ved hjelp av en glyserol lager, strek wildtype C. neoformans belastning (H99) på gjær-ekstrakt pepton dekstrose (YPD) agar plate for å isolere enkeltkolonier.
- Inkuber over natten i 16 timer ved 37 °C i en statisk inkubator.
- Velg en enkelt koloni av wildtype C. neoformans belastning og kultur i 5 ml YPD kjøttkraft i en løst avkortet 10 ml prøverør. Utfør i quadruplicate.
- Inkuber over natten i 16 timer ved 37 °C i en ristende inkubator ved 200 o/min.
- Dagen etter subkultur hver overnatting kultur i en 1:100 fortynning i 3 ml YPD kjøttkraft.
- Mål optisk tetthet (OD600nm) verdier av soppkultur for å bestemme midtloggfasen. Avhengig av spektrofotometeret når C. neoformans wildtype stamme midt i loggfasen som vanligvis følger 6 til 8 h inkubasjon i YPD med generelle OD600nm-verdier som varierer 1,0 til 1,5.
- Når cellene når midten av logfasen, ta en 10 μL aliquot av soppcelle suspensjon i en ren 1,5 ml mikrocentrifuge rør og fortynne 1:100 i steril 1x fosfat bufret saltvann (PBS). Telle antall celler ved hjelp av et hemocytometer.
2. Dyrking av makrofagceller
MERK: Sørg for at arbeidsmiljøet steriliseres før cellekulturarbeidet.
- Utarbeidelse av cellekulturmedium
- Antibiotika-supplert medium: Tilsett 10% FBS (føtal storfe serum), 1% L-glutamin og 5% Pen / Strep (Penicillin-Streptomycin) blanding til DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium). Filtrer medium gjennom et komplett filtersystem på 0,2 μm og oppbevar ved 4 °C.
- Antibiotikafritt medium: Følg identisk protokoll, men utelater Pen/Strep-blandingen.
- Såing makrofag celler
MERK: Antibiotikasupplert medium (2.1.1.) bør varmes opp til 37 °C før cellekulturarbeidet.- Tin hetteglass med makrofagceller raskt i 37 °C perlebad.
- Vask celler av fryseløsning ved å gjenbruke cellene i 1 ml antibiotikasupplert medium.
MERK: Ekstra forholdsregler er nødvendig for å sikre at cellene ikke lyser på grunn av hard pipettering. - Overfør resuspended celler til et sterilt 15 ml rør.
- Pelletceller ved sentrifugering ved 400 × g i 5 min ved romtemperatur.
- Fjern forsiktig overnatur med en serologisk pipette eller vakuumaspirator.
- Forsiktig resuspend pellet i 10 ml antibiotika supplert medium.
- Pipette resuspended celler forsiktig i en 60 x 15 mm celle kulturbehandlet tallerken.
- Inkuber fatet ved 37 °C med 5 % CO2 over natten.
- Første passasje av makrofagceller
MERK: Frosne cellelagre vil vanligvis inneholde mellom 5 og 10 millioner celler per hetteglass (ca. 1 ml). På den påfølgende dagen vil makrofagceller som har overlevd såingsprotokollen holde seg til bunnen av cellekulturfatet og vil være klare for passaging.- Varm antibiotika-supplert medium (trinn 2.1.1) til 37 °C før cellekulturarbeid. Sørg for at arbeidsmiljøet steriliseres før cellekulturarbeidet. Visualiser celler ved hjelp av et lett mikroskop for å sikre at cellene blir holdt og sunne.
- Fjern cellekulturmedium fra parabolen enten med en serologisk pipette eller en vakuumaspirator.
- Tilsett forsiktig 5-7 ml steril romtemperatur PBS (fosfatbufret saltvann) til 60 x 15 mm parabolen.
- Vipp forsiktig parabolen for å vaske vedlagte celler.
- Fjern PBS med en serologisk pipette eller vakuumaspirator.
- Tilsett 1 ml kald PBS (lagret ved 4 °C) til cellene, vipp parabolen for å distribuere PBS over alle celler, og la det sitte ved romtemperatur i 1 min.
- Slipp celler ved skånsom tapping av parabolen, pipettering kald PBS mot cellene, eller ved hjelp av en celleskraper.
- Tilsett 9 ml antibiotikasupplert medium til parabolen.
- I en ny 60 x 15 mm tallerken, tilsett 9 ml friskt antibiotikasupplert medium og 1 ml resuspended celler fra den opprinnelige parabolen.
- Når antall ønskede passaging plater er fylt, resuspended celler fra den opprinnelige parabolen kan kastes.
- Inkuber den nye retten på innstillingene nevnt ovenfor (trinn 2.2.8).
- Utfør påfølgende passaging når cellene har nådd 70-80% samløpet (omtrent hver 2.
MERK: Makrofagceller bør passeres minst fem ganger før infeksjonseksperimenter. Avhengig av cellelinjen bør infeksjonseksperimenter utføres av 25 til 30 passasjer. Etter 25 til 30 passasjer skal cellene fryses eller kastes. § 2.4 eller 2.5 kan velges basert på eksperimentelle planer. Avsnitt 2.4 vil bli brukt til følgende avsnitt.
- Seeding makrofag celler før infeksjon
- Utfør passaging protokoll trinn 2.3.1 til 2.3.7.
- Ved hjelp av et hemocytometer eller automatisert celleteller bestemmer celletettheten (celler / ml).
- Overfør 0,3 x 106 makrofagceller til en enkelt brønn av en 6-brønns cellekulturplate.
- Juster det totale volumet av godt til 1 ml ved hjelp av antibiotikasupplert medium (trinn 2.1.1).
- Gjenta trinn 2.4.3 og 2.4.4 til 8 brønner er fylt (4 brønner fylt ut to separate plater).
- Eventuelt fylle de resterende to brønnene med 1 ml romtemperatur PBS for å opprettholde fuktighetsnivået under inkubasjon.
- La cellene vokse under inkubasjonsforhold nevnt i trinn 2.2.8 for 2 d før infeksjon.
- Seeding makrofag celler på infeksjonsdagen
- Utfør passaging protokoll trinn 2.3.1 til 2.3.7.
- Ved hjelp av et hemocytometer eller automatisert celleteller bestemmer celletettheten (celler / ml).
- Seed 1,2 x 106 makrofagceller i en enkelt brønn av en 6-brønns cellekulturplate.
- Juster det totale volumet av godt til 1 ml ved hjelp av antibiotikatilsupplert medium (2,1,1).
- Gjenta 2.4.3 og 2.4.4 til 8 brønner er fylt (4 brønner fylt i to separate plater).
- Eventuelt fylle de resterende to brønnene med 1 ml romtemperatur PBS for å opprettholde fuktighetsnivået under inkubasjon.
- Inkuber celler under forhold nevnt i trinn 2.2.8 i 3 timer for å tillate celler å holde seg til brønner.
3. Infeksjon av makrofagceller med C. neoformaner
MERK: Ved å nå 70-80% samløpet, vil det være ca. 1,2 x 106 makrofagceller per brønn. For å oppnå ønsket mangfold av infeksjon (MOI) på 100:1, er 1,2 x 108 soppceller nødvendig for hver reaksjon. Kulturer må settes tilsvarende i biologisk quadruplicate.
ANSVARSFRASKRIVELSE: En MOI på 100:1 har oppnådd ønskelige resultater i vår forskningsgruppe og er ment som et forslag til leserne. En lavere MOI kan være nødvendig for mer smittsomme C. neoformans stammer eller for mindre elastisk makrofag cellelinjer. Verifisering av infeksjon (pkt. 3.5) kan brukes til å bestemme den ideelle MOI for bestemte C. neoformans – makrofagkombinasjoner.
- Tilberedning av soppceller
- Følg trinn 1 for vekst av C. neoformans til midtloggfasen.
- Samle og sentrifuge celler på 1500 x g i 10 min, vask pellet forsiktig med steril romtemperatur PBS, og gjenta for totalt tre vasker.
- Resuspend celler i antibiotikafri cellekultur medium (trinn 2.1.2) for å oppnå en konsentrasjon på 1,2 x 108 celler / ml.
- Utarbeidelse av makrofagceller
- Visualiser hver brønn i 6-brønnsplaten for å sikre at cellene har nådd 70-80% samløpet. Alternativt kan celler måles for å oppnå ca. 1,2 x 106 makrofagceller per brønn.
- Følg trinn 2.3.1 til 2.3.4.
- Co-kultur av C. neoformans og makrofag celler
- Tilsett 1 ml av de resuspended C. neoformans cellene (trinn 3.1.3) til 4 brønner som inneholder makrofagceller utarbeidet i pkt. 3.2.
MERK: Antall nødvendige plater må beregnes før eksperimentet startes. Tilsett 1 ml antibiotikafritt medium (trinn 2.1.2) til tomme brønner. - Tillat celler å inkubere under forhold som er oppført (trinn 2.2.8) i 3 timer.
- Fjern cellekulturmedium fra platen enten med en serologisk pipette eller en vakuumaspirator.
- Tilsett forsiktig 1 ml steril romtemperatur PBS.
- Vipp platen forsiktig for å vaske ikke-festet eller ikke-phagocytosed ekstracellulære C. neoformans celler.
- Fjern PBS ved hjelp av en serologisk pipette eller vakuumaspirator, gjenta for totalt tre vasker. Gjenta 3.3.4 til 3.3.5 to ganger til.
- Tilsett 1 ml av de resuspended C. neoformans cellene (trinn 3.1.3) til 4 brønner som inneholder makrofagceller utarbeidet i pkt. 3.2.
- Uinfiserte makrofager
- På samme måte bruker du 4 brønner av en 6-brønnplate for å fungere som makrofag-bare prøver. Tilsett 1 ml antibiotikafritt medium (trinn 2.1.2) til disse brønnene.
- Gjenta trinn 3.3.2 til 3.3.6.
- Verifisering av infeksjon
MERK: Ved hjelp av en cytotoksisitetsanalyse kan infeksjonsferdigheter måles. Følgende protokoll vil markere anvendelse av et cytotoksisitetsprodukt for å måle LDH (laktatdehydrogenase) utgivelse. Andre cytotoksisitetsprodukter kan også brukes.- Fremstilling av C. neoformans infeksjon av makrofagceller
- Gjentar trinn 1, 2 og 3 (opptil 3,5). LDH-analysen kan utføres i triplikate, hvis ønskelig.
- Etter trinn 3.3.6, tilsett 1 ml antibiotikafritt medium (2.1.2) til hver brønn i 6-brønnsplaten.
- Gjenta trinn 2.4.3 og 2.4.4 til 3 brønner pluss 3n brønner er fylt (der n er antall tidspunkter målt).
- Inkuber celler under forhold som er oppført i trinn 2.2.8.
- Ved valgte tidspunkter (f.eks. 1, 3, 6, 12 og 24 timer) samler du supernatant for måling av LDH-utgivelse i henhold til produsentens instruksjoner
- Samtidig vil uinfiserte makrofagceller bli lyset til bestemt verdi for maksimal cytotoksisitet.
- Beregn cytotoksisitet som følger:
- Fremstilling av C. neoformans infeksjon av makrofagceller
4. Eksempelsamling
- Co-kultur og uinfisert makrofag samling
- Tilsett 1 ml kald PBS til cellene (fra 3.3.6 og 3.4.2) og la det sitte ved romtemperatur i 1 min.
- Slipp celler fra platen ved skånsom tapping av platen eller mild pipettering kald PBS mot cellene.
MERK: Celleskraper bør unngås, da dette kan føre til lysis av celler. - Pipette resuspended celler i en 15 ml rør.
- Sentrifugeceller ved 400 x g i 5 min ved romtemperatur, og fjern supernatanten.
- Behandle celler (som beskrevet i trinn 5) umiddelbart eller blits frosset i flytende nitrogen og lagret ved -80 °C for senere behandling.
5. Cellulær proteom
MERK: Tilstrekkelig lysis må optimaliseres for celletypen som analyseres (det vil si mengden sykluser og amplituder avhenger av cellepelletstørrelse og effektprosenten av sondesonikermodell).
- Infisert makrofag celle lysis
- Resuspend pelleted celler (trinn 4.1.5) i 300 μL av 100 mM Tris-HCl (pH 8.5) bestående av en nyopp oppløst protease hemmer cocktail tablett.
MERK: En proteasehemmer cocktailtablett legges til 10 ml iskald 100 mM Tris-HCl (pH 8.5) før eksperimentet startes. - Sonde sonikere celler i et isbad i 15 sykluser på 30 s på og 30 s av, for å lyse cellene.
- Sentrifugeceller kort for 30 s ved 400 x g, forsiktig så du ikke danner en pellet, bare for å fjerne væske på sidene av rørene etterfulgt av overføring av prøve til et 2 ml Lo-bind mikrocentrifugerør.
- Legg til 1:10 volum på 20% SDS til en endelig konsentrasjon på 2%.
- Tilsett 1:100 volum på 1 M dithiothreitol (DTT) til en endelig konsentrasjon på 10 mM og bland prøven grundig ved pipettering, etterfulgt av inkubasjon på en termisk varmeblokk ved 95 °C i 10 min ved 800 rpm omrøring. Deretter avkjøles til romtemperatur (kjøling kan gjøres på is).
- Tilsett 1:10 volum på 0,55 M iodoacetamid (IAA) for å oppnå en endelig konsentrasjon på 55 mM og bland prøven grundig ved pipettering. Inkuber ved romtemperatur i mørket i 20 min.
- Tilsett 100% aceton for å oppnå en endelig konsentrasjon på 80% aceton og lagre prøve over natten ved -20 ° C for å utløse proteiner.
- Resuspend pelleted celler (trinn 4.1.5) i 300 μL av 100 mM Tris-HCl (pH 8.5) bestående av en nyopp oppløst protease hemmer cocktail tablett.
- Protein fordøyelse
- Neste dag, samle utfelling pellet ved sentrifugering i 10 min ved 10.000 x g og 4 °C. Kast supernatant og vask pellet med 500 μL på 80% aceton. Gjenta for totalt to vasker. Lufttørr pellet ved romtemperatur etter vasker.
- Resolubilize protein pellet i 100 μL av 8 M urea/40 mM HEPES, for å sikre fullstendig løselighet, vortex eller sonikeri i et isvannbad i 15 sykluser på 30 s på og 30 s av.
MERK: Justering av volumet av urea/HEPES bestemmes på størrelsen på utfelt cellepellet, hvis endringer oppstår, må alle nedstrøms volumer justeres på riktig måte. - Kvantifisere proteinkonsentrasjon ved hjelp av en proteinanalyse (f.eks. BCA-proteinanalyse) i henhold til produsentens instruksjoner og juster for bakgrunnsmåling ved tom normalisering med 8 M urea/40 mM HEPES.
- Tilsett 300 μL på 50 mM ammoniumbikarbonat for å oppnå en endelig konsentrasjon på 2 M urea.
MERK: Mulighet til å normalisere proteinkonsentrasjonen for nedstrøms målinger, foreslått å fordøye 100 μg protein og lagre den gjenværende ufordøyde prøven ved å blinke frysing i flytende nitrogen og deretter oppbevares ved -20 °C for kortsiktig, eller ved -80 °C på lengre sikt. - Tilsett 2:50 (v/w) enzym-til-protein-forhold mellom trypsin/Lys-C proteaseblanding på is og trykk forsiktig rør for å blande, inkubere over natten ved romtemperatur.
- Etter inkubasjon, stopp fordøyelsen ved å legge til 1:10 volumstoppende løsning (20% acetonitril, 6% trifluoroacetic acid) og sentrifugeprøver ved 10.000 x g i 5 min ved romtemperatur.
- Samle supernatant (består av fordøyde peptider)og kast eventuelle pelleted rusk eller utfelling.
- Peptid desalting
- Aktiver en C18 Stop And Go Extraction (STAGE) spiss (bestående av 3 lag C18 harpiks i en 200 μL pipettespiss) ved å tilsette 100 μL på 100% acetonitril og sentrifuge ved 1000 x g i 2 min.
- Likevekt C18 STAGE spissen ved å legge til 50 μL buffer B (80% (v / v) acetonitril, 0,5% (v / v) eddiksyre) og sentrifuge på 1000 x g i 2 min.
- Likevekt C18 STAGE spissen ved å legge til 200 μL buffer A (2% (v / v) acetonitril, 0,1% (v / v) trifluorotaktisk syre, 0,5% (v / v) eddiksyre) og sentrifuge på 1000 x g i 3-5 min.
- Legg til ~ 50 μg fordøyd prøve på C18 STAGE-spissen og sentrifuge ved 1000 x g i 3-5 min, eller til prøven har gått gjennom spin-kolonnen. Blitsen fryser den gjenværende fordøyde prøven i flytende nitrogen og oppbevares ved -20 °C, til det er nødvendig.
- Vask C18 STAGE-spissen med 200 μL buffer A og sentrifuge ved 1000 x g i 3-5 min.
- Tilsett 50 μL Buffer B i C18 STAGE-spissen og sentrifugen ved 500 x g i 2 min. Samle eluted peptider i 0,2 ml PCR-rør.
- Tørk de eluted peptider i en vakuum sentrifuge i 30-40 min ved maksimal hastighet. Helt tørkede prøver kan oppbevares ved romtemperatur eller ved -20 °C til de behandles.
MERK: Tørkede og avsaltede peptider er passende prøveinnsendinger til massespektrometrianlegg for behandling og kan sendes ved omgivelsestemperatur.
6. Massespektrometri
- Rekonstituerte peptider i 10 μL Buffer A og måle konsentrasjon som er nødvendig for å injisere ~1,5 til 3 μg peptider på MS-kolonnen. Mengden prøve vil avhenge av instrumentering.
- Bruk en forhåndsbestemt gradient av acetonitril (ca. 5-60 %) i 0,5% eddiksyre over ønsket tid (f.eks. 2 timer) for å skille peptider ved høyytelses flytende kromatografi, etterfulgt av elektrosprayionisering i massespektrometeret.
- Hent MS-skanninger ved hjelp av et massespektrometer med høy oppløsning i dataavhengig anskaffelsesmodus(m/z 300 til 1650).
MERK: Graderingsprosent og lengde bestemmes av eksperimentet og brukeren. Nøyaktige innstillinger for massespektrometer avhenger av instrumentering, eksperiment og brukerpreferanser.
7. Dataanalyse
MERK: MS-data kan behandles med mange bioinformatikkrørledninger. I denne protokollen beskriver vi behandling ved hjelp av de offentlig tilgjengelige MaxQuant- og Perseus-plattformene, men anbefaler individuelle brukere å evaluere bioinformatiske verktøy som passer for analyse, preferanse og bruk.
- Last inn ubehandlede datafiler (direkte fra MS-instrumentet) ved hjelp av MaxQuant-programvaren. Identifisere proteiner under de modifiserte MaxQuant søkeparametrene; minimum to unike peptider som er nødvendige for proteinidentifikasjon ved hjelp av en måldecoy tilnærming for en falsk oppdagelseshastighet på 1%, implementere etikettfri kvantifisering med matchende mellom løp, innlemme organismer FASTA fil hentet fra UniProt database (det vil si Cryptococcus neoformans H99, Mus musculus) for å identifisere og kvantifisere nåværende peptider med Andromeda søkemotor. Se offentlige MaxQuant online verktøy for detaljerte opplæringsprogrammer (se Table of Materials).
- Last opp MaxQuant-utdatafilen ('proteingroups.txt') til Perseus.
- Filtrer rader som inneholder potensielle falske positiver og kontaminanter, samt bare endret av nettstedspeptider med "Filtrer rader basert på kategorisk kolonne".
- Transformer dataverdier på logg2-skala.
- Opprett datasettgrupper ved å gi kategorisk merknad til radene.
- Filtrer datasettet etter gyldige verdier for å definere en cut-off for proteindeteksjon.
MERK: For en streng og robust analyse foreslås en > 50% identifikasjonshastighet. Hvis fire replikeringer for eksempel ble behandlet, velges et minimumsnummer på tre gyldige verdier. - Hvis det er ønskelig, impute data ved å erstatte manglende verdier fra normal distribusjon.
MERK: Imputerte verdier er optimalisert basert på normal distribusjon og gir en tilfeldig LFQ-intensitet for å erstatte 'NaN'-plassholdere for å simulere typiske overflodsmålinger. Denne imputeringen gir en plattform for nedstrøms statistisk analyse som krever kvantifiserbare data. - Legg til merknader i proteinradene (f.eks. proteinnavn, genetopologi termer).
Merk: Denne Perseus-arbeidsflyten som genereres, er nå et robust rammeverk for videre bioinformatisk behandling, statistisk analyse og datavisualisering, se offentlige Perseus-verktøy for detaljerte opplæringsprogrammer (se Materials tabell).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollen som er skissert ovenfor muliggjør identifisering og kvantifisering av proteiner avledet fra både sopppatogenet, C. neoformanerog verten, makrofagceller, i et enkelt eksperiment. Etter samkultur samles celler og behandles sammen og bioinformatisk separert basert på peptidprofiler som er spesifikke for hver art. Dette er en kraftig tilnærming for å definere samspillet mellom vertspatogenforholdet under infeksjon. Antall proteiner identifisert fra eksperimentet avhenger av startmaterialet, prøveforberedelsen, gradientlengde, MS-instrumentering og bioinformatisk arbeidsflyt. Ved hjelp av protokollen som er beskrevet her, identifiserer vi vanligvis ca. 8000 proteiner fra eksperimentet med 1500 C. neoformanproteiner og 6500 vertsproteiner. Etter behandling av datasettene genererer vi et hovedkomponentanalyseplott (PCA) for å observere kritiske faktorer som driver vår analyse (figur 2A). Her observerer vi at den største komponenten av separasjon blant dataene er infisert vs. ikke-infiserte prøver, som vi forventer fra eksperimentell design (komponent 1, 79,8%), og et annet særtrekk ved prøvene er biologisk variasjon (komponent 2, 5,7%). Deretter grupperer en Pearson-korrelasjon kombinert med hierarkisk klynger av Euclidean-avstand prøvene og muliggjør kvantifisering av variabiliteten blant replikeringene (figur 2B). I vår analyse observerte vi distinkt klynger av infiserte vs. ikke-infiserte prøver og replikerer reproduserbarhet fra 95-96%, noe som representerer god reproduserbarhet blant replikeringene. Til slutt utfører vi en student t-testkorrigert for flere hypotese testing ved hjelp av en Benjamini-Hochberg falsk oppdagelsesfrekvens (FDR)(p-verdi≤ 0,05; FDR = 0,01; s0 = 1) for å identifisere proteiner med signifikante forskjeller i overflod under infeksjon sammenlignet med ikke-infiserte kontroller (figur 2C). Her identifiserer vi 760 proteiner med betydelige endringer i overflod, inkludert 117 vertsproteiner med 86 som viser en betydelig reduksjon og 31 viser en betydelig økning på infeksjon. Spesielt observerer vi også betydelige økninger i overflod av soppproteiner, som forventet under infeksjon. Med disse dataene utføres etterfølgende analyser, inkludert nettverkskartlegging, i silico-karakterisering og oppfølgingseksperimenter for å validere dataene og utforske molekylære mekanismer som underbygger vertens respons på virulens.
Figur 1: Massespektrometribasert proteomics arbeidsflyt for analyse av makrofager infisert med C. neoformans. Arbeidsflyten begynner med samling av makrofager som enten er infisert med C. neoformaner eller ikke-infiserte kontroller. Proteiner ekstraheres av mekaniske og kjemiske forstyrrelser, etterfulgt av reduksjon og alkylasjon, acetonnedbør og enzymatisk fordøyelse. Peptider renses på C18 STAGE-spisser, adskilt av høyytelses flytende kromatografi, utsatt for elektrosprayionisering, og målt på et høyoppløselig massespektrometer. Data behandles, analyseres og visualiseres i de offentlig tilgjengelige bioinformatikkplattformene, MaxQuant (med Andromeda) og Perseus14,15,16. Eksperimenter utført i biologisk quadruplicate. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Representative data for C. neoformans infeksjon av makrofagceller. (A)Hovedkomponentanalyse viser skille mellom infisert vs. ikke-infisert makrofag (komponent 1, 79,8%), og klynger av biologiske repliker (komponent 2, 5,7%). (B)Varme kart over Pearson korrelasjon plottet av hierarkisk klynger av Euclidean avstand for å vise klynger av prøver (infisert vs. ikke-infisert) og replikere reproduserbarhet (> 95%). (C) Volcano tomten av identifiserte proteiner. Blå = soppproteiner med betydelig endring i overflod; svart = makrofag proteiner med betydelig endring i overflod. Studentens t-test(p-verdi ≤ 0,05), FDR = 0,01; s0 = 1. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritiske trinn i protokollen inkluderer utarbeidelse av makrofagceller og innsamling av co-kultur prøver for proteinbehandling med minimal forstyrrelse av cellene. Det er viktig å utføre trinn for vasking, inokulering og fjerning av tilbeslutning makrofagceller forsiktig og forsiktig for å forhindre unødvendig lysis av celler før innsamling. Etablering av riktig MOI for eksperimentet er også kritisk da inokulering med en overdreven høy MOI kan forårsake rask makrofagcelledød og vanskeligheter med å samle inn og behandle prøver for MS. Omvendt vil lave MOI-tall føre til færre fagocytosed soppceller og begrenset påvisning av soppproteiner i det biologiske systemet. For å overvinne slike begrensninger anbefaler vi å utføre testeksperimenter med varierende MOIer, støttet av celledødsanalyser (f.eks. LDH-kvantifisering) for å definere antall soppceller som starter en vertsrespons, men ikke drepe vertscellene før innsamling. For eksperimentene tar vi sikte på å identifisere infeksjonsrelaterte soppproteiner, som krever en høy MOI (100:1) for å tilstrekkelig oppdage soppproteiner blant svært rikelig vertsproteiner. Vi utfører rutinemessig makrofagcytoktoksisitetsanalyser for å vurdere MOI-innvirkning på vertscelledød før vi utfører hele eksperimentet. Tidspunktet for inkubasjon av C. neoformansceller med makrofager er også avgjørende da soppcellene kan ha store polysakkarider kapsler og derfor krever makrofag mer tid for engulfment. Vi velger å bruke en co-kultur inkubasjonstid på 3 timer for det skisserte eksperimentet, da vi fant god dekning av soppproteomet på dette tidspunktet og for å gi et "snap-shot" av vertsrespons; Det kan imidlertid være lurt å utforske tidligere og senere tidspunkter og observere hvordan timing påvirker sopp- og vertsproteinproduksjon. Alternativt er det utført grunning av makrofag for opsonisering for å hjelpe den fagocytiskeprosessen 17,18.
For prøveinnsamling, hvis prøver ikke behandles umiddelbart flash frysing i flytende nitrogen vil bidra til å forhindre uønsket nedbrytning av proteiner av proteaser som finnes i prøvene. I tillegg, for MS-baserte proteomiske analyser, bør potensialet for forurensning fra støv eller keratin (f.eks. hud- og hårceller) begrenses gjennom bruk av nitrilhansker, laboratoriefrakker og vasking av alle overflater med 70% etanol før eksperimenteringbegynsett. Videre er protokollene som er beskrevet ovenfor, spesifikke for eksempelsettet for cokultur som er beskrevet, men kan endres for optimalisering av arbeidsflyt for proteinekstraksjon etter behov19,20. Muligheter for å endre arbeidsflyten og optimalisere for bestemte celletyper inkluderer de valgte mekaniske og kjemiske avbruddsteknikkene, varigheten og temperaturen på enzymatisk fordøyelse og separasjon av prøvene. For eksempel utføres lysis av C. neoformanceller vanligvis av mekanisk perleslag; Vi har imidlertid observert økt proteomdekning etter sondesonikering, og anbefaler derfor det for mekanisk forstyrrelse av de infisertecellene 19,21,22. For eksempel kan fraksjonering av peptidprøver i aliquots ved høy pH-fraksjonering eller størrelsesekskludering kromatografi redusere prøvekompleksiteten og forbedre dybden av dekningen på massespektrometeret9. Videre, for å oppnå dybden av dekning for å identifisere ca. 8000 verts- og soppproteiner, er det nødvendig med et høyoppløselig massespektrometrisystem (f.eks. QExactive Exploris, Fusion Lumos, timsTOF Pro).
Bruk av LFQ for kvantifisering av endringer i proteinnivåer under infeksjon er en pålitelig og kostnadseffektiv tilnærming for MS-baserte proteomics12. Det muliggjør kvantifisering av proteiner ved relativ overflod uten behov for ytterligere prøvebehandlingstrinn. I tillegg utføres analysen etter ferdigstillelse av eksperimentet, utlåner seg til universelle applikasjoner og en fleksibel studiedesign. Begrensningene i LFQ inkluderer imidlertid økt instrumenteringstid da prøver må kjøres sekvensielt og kan ikke kombineres, sammenlignbarhet mellom prøver kan være utfordrende, og behovet for imputering for å erstatte manglende verdier kan være høy23. Alternative tilnærminger for kvantifisering av proteinoverflod inkluderer metabolske (f.eks. stabil isotopmerking av aminosyrer i cellekultur) og kjemiske (f.eks. tandemmassekoder) merkingsteknikker, som tillater å kombinere prøver for å redusere instrumenttiden, gi pålitelig sammenlignbarhet blant prøver, og fører ofte til mindre manglendeverdier 24,25. Slike tilnærminger krever imidlertid ytterligere prøvehåndterings- og behandlingstrinn, økt kompleksitet og tid for vått laboratorieforsøk, samt krever en fast eksperimentell design. For å velge en kvantifiseringsmetode optimal for foreslåtte eksperimenter, bør brukerne vurdere studiedesign og sammenlignbarhet av prøver, våt laboratoriekompleksitet og dataanalyse, samt instrumenteringstid tilgjengelighet og kostnader.
Nyheten om protokollen som presenteres er evnen til å definere endringer i proteomet fra både verten og patogeneperspektivene i et enkelt eksperiment. Dybden av dekning av begge proteomer gir ny innsikt i hvordan patogenet initierer infeksjon og hvordan verten reagerer i forsvar. Spesielt fokuserer tilnærmingen på infeksjon i hele cellen; Imidlertid finnes muligheter til å definere sub-proteomer eller kompartaliserte reaksjoner på infeksjon gjennom kombinasjon med romlige lokaliseringsteknikker (f.eks. sentrifugering, berikelse, merking)26,27. Her beskriver vi samspillet mellom makrofager og sopppatogenet C. neoformaner; Tilnærmingen er imidlertid universell, og kan brukes på interaksjoner mellom et variert utvalg av biologiske systemer. For eksempel har vi nylig brukt en lignende arbeidsflyt for å avdekke generelle og stedsspesifikke svar av nøytrofiler avledet fra en murine modell av okulær keratitt28,29,30. Videre kan infeksiomdatasettene som genereres fra denne protokollen integreres med in vitro proteome og sekomprofilering av et patogen for å oppdage proteiner med endret overflod i nærvær av vertsceller. Slike proteiner, referert til som infeksjonsrelaterte proteiner, gir en mengde kjente og nye virulensfaktorer for videre karakterisering, inkludert temporal regulering, lokalisering og direkte protein-protein interaksjoner med verten. Samlet sett gir den skisserte MS-baserte proteomics arbeidsflyten en ny mulighet til å undersøke det intrikate forholdet mellom vert og patogen i et enkelt eksperiment med universalitet og forståelse som ikke er allment tilgjengelig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Forfatterne takker Dr. Jonathan Krieger fra Bioinformatics Solutions Inc. for å ha drevet massespektrometeret for representative eksperimenter, samt medlemmer av Geddes-McAlister-gruppen for deres hjelp med eksperimentell oppsett og manuskripttilbakemelding. Forfatterne anerkjenner støtte fra finansieringen, delvis fra Banting Research Foundation - The Jarislowsky Fellowship Discovery Award, New Frontiers Research Fund - Exploration (NFRFE-2019-00425), og Canadian Foundation for Innovation (JELF 38798) for J.G.M., samt NSERC Canada Graduate Scholarship - Masters og Ontario Graduate Scholarship for B.B., og Queen Elizabeth II Graduate Scholarship i vitenskap og teknologi for A.S..
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mM Tris-HCl, pH 8.5 | Fisher Scientific | BP152-1 | Maintain at 4°C |
| 60 x 15 mm Dish, Nunclon Delta | ThermoFisher Scientific | 174888 | |
| 6-well cell culture plate | ThermoFisher Scientific | 140675 | |
| Acetonitrile, MS grade | Pierce | TS-51101 | |
| Acetic Acid | Sigma Aldrich | 1099510001 | |
| Acetone | Sigma Aldrich | 34850-1L | |
| Ammonium bicarbonate (ABC) | ThermoFisher Scientific | A643-500 | Prepare a stock 50 mM ABC solution, stable at room temperature for up to one month. |
| Bel-Art™ HiFlow Vacuum Aspirator Collection System | Fisher Scientific | 13-717-300 | Not essential, serological pipettes can be used to remove media. |
| C18 resin | 3M Empore | 3M2215 | |
| Cell Scrapers | VWR | 10062-906 | Not essential, other methods to release macrophage cells can be used. |
| Centrifugal vaccuum concentrator | Eppendorf | 07-748-15 | |
| Complete Filtration Unit | VWR | 10040-436 | |
| Conical falcon tubes (15 mL) | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
| Countess II Automated Cell Counter | ThermoFisher Scientific | AMQAX1000 | Not essential, haemocytometer can be used as an alternative. |
| CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay | Promega | G1780 | |
| Dithiothreitol (DTT) | ThermoFisher Scientific | R0861 | Prepare bulk stock solution of 1 M DTT, flash frozen and stored at -20 °C until use. Discard after each use (do not freeze-thaw repeatedly). |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement | ThermoFisher Scientific | 10566016 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher Scientific | 12483020 | Heat inactivate by incubating at 60°C for 30 minutes. Prepare 50 ml aliquots and flash freeze. Thaw prior to media preparation |
| Haemocytometer | VWR | 15170-208 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | Prepare 40 mM HEPES/8 M Urea in bulk stock solution, flash frozen, store at -20°C until use. Discard after each use (do not freeze-thaw repeatedly). |
| High-performance liquid chromatography system | ThermoFisher Scientific | LC140 | Gradient length is based on sample complexity, recommended 120 min gradient for infectome samples. |
| High-resolution mass spectrometer | ThermoFisher Scientific | 726042 | |
| Iodoacetamide (IAA) | Sigma Aldrich | I6125 | Prepare 0.55 M bulk stock solution, flash frozen, store at -20°C until use. Discard after each use (do not freeze-thaw repeatedly). |
| L-glutamine | ThermoFisher Scientific | 25030081 | Can be aliquot and frozen for storage. Thaw prior to media preparation. |
| LoBind Microcentrifuge tubes | Eppendorf | 13-698-794 | |
| MaxQuant | https://maxquant.org/ | MaxQuant is a public platform that offers tutorials, such as the MaxQuant Summer School, outlining the computational analysis steps of large MS data sets | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 13864457 | |
| Penicillin : Streptomycin 10k/10k | VWR | CA12001-692 | Can be aliquot and frozen for storage. Thaw prior to media preparation. |
| Peptide separation columns | ThermoFisher Scientific | ES803 | |
| Perseus Software | http://maxquant.net/perseus/ | ||
| Phosphate Buffered Saline | VWR | CA12001-676 | Puchase not required. PBS can also be prepared but sterile filteration must be performed before use. |
| Pierce BCA Protein Assay | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
| Pipette, Disposable Serological (10 mL) | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
| Pipette, Disposable Serological (25 mL) Basix | Fisher Scientific | 14955235 | |
| Probe sonciator | ThermoFisher Scientific | 100-132-894 | |
| Protease inhibitor cocktail tablet | Roche | 4693159001 | |
| Sodium dodecyl sulfate | ThermoFisher Scientific | 28364 | 20% (w/v) |
| Spectrophotometer (Nanodrop) | ThermoFisher Scientific | ND-2000 | |
| STAGE tipping centrifuge | Sonation | STC-V2 | |
| Thermal Shaker | VWR | NO89232-908 | |
| Trifluoroacetic acid | ThermoFisher Scientific | 85183 | |
| Trypsin/Lys-C protease mix, MS grade | Pierce | A40007 | Maintain at -20 °C. |
| Ultrasonic bath | Bransonic | A89375-450 | Stored in cold room (4C) |
| Urea | Sigma Aldrich | U1250-1KG | Prepare 40 mM HEPES/8 M Urea in bulk stock solution, flash frozen, store at -20 °C until use. Discard after each use (do not freeze-thaw repeatedly). |
| Yeast-extract peptone dextrose broth | BD Difco | BM20 |
References
- Bongomin, F., Gago, S., Oladele, R., Denning, D. Global and Multi-National Prevalence of Fungal Diseases-Estimate Precision. Journal of Fungi. , (2017).
- Tugume, L., et al. HIV-Associated cryptococcal meningitis occurring at relatively higher CD4 counts. Journal of Infectious Diseases. 219 (6), 877-883 (2019).
- Rajasingham, R., et al. Global burden of disease of HIV-associated cryptococcal meningitis: an updated analysis. The Lancet Infectious Diseases. , (2017).
- Perfect, J. R. The antifungal pipeline: A reality check. Nature Reviews Drug Discovery. , (2017).
- Bermas, A., Geddes-McAlister, J. Combatting the evolution of anti-fungal resistance in Cryptococcus neoformans. Molecular Microbiology. , 1-14 (2020).
- Geddes-McAlister, J., Shapiro, R. S. New pathogens, new tricks: Emerging, drug-resistant fungal pathogens and future prospects for antifungal therapeutics. Annals of the New York Academy of Sciences. , (2018).
- Ball, B., Bermas, A., Carruthers-Lay, D., Geddes-McAlister, J. Mass Spectrometry-Based Proteomics of Fungal Pathogenesis, Host-Fungal Interactions, and Antifungal Development. Journal of Fungi. , (2019).
- Sukumaran, A., et al. Decoding communication patterns of the innate immune system by quantitative proteomics. J Leukocyte Biol. , (2019).
- Salas, D., Stacey, R. G., Akinlaja, M., Foster, L. J. Next-generation interactomics: Considerations for the use of co-elution to measure protein interaction networks. Molecular and Cellular Proteomics. , (2020).
- Aebersold, R., Mann, M. Mass-spectrometric exploration of proteome structure and function. Nature. 537 (7620), 347-355 (2016).
- Mann, M., Kulak, N. A., Nagaraj, N., Cox, J. The Coming Age of Complete, Accurate, and Ubiquitous Proteomes. Molecular Cell. 49 (4), 583-590 (2013).
- Cox, J., et al. Accurate Proteome-wide Label-free Quantification by Delayed Normalization and Maximal Peptide Ratio Extraction, Termed MaxLFQ. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (9), 2513-2526 (2014).
- Ankney, J. A., Muneer, A., Chen, X. Relative and Absolute Quantitation in Mass Spectrometry-Based Proteomics. Annual Review of Analytical Chemistry. , (2018).
- Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).
- Tyanova, S., et al. The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data. Nature Methods. 13 (9), 731-740 (2016).
- Cox, J., et al. Andromeda: A peptide search engine integrated into the MaxQuant environment. Journal of Proteome Research. , (2011).
- Zhong, Z., Pirofski, L. A. Opsonization of Cryptococcus neoformans by human anticryptococcal glucuronoxylomannan antibodies. Infection and Immunity. , (1996).
- Nicola, A. M., et al. Macrophage autophagy in immunity to Cryptococcus neoformans and Candida albicans. Infection and Immunity. , (2012).
- Ball, B., Geddes-McAlister, J. Quantitative Proteomic Profiling of Cryptococcus neoformans. Current Protocols in Microbiology. , (2019).
- Geddes-McAlister, J., Gadjeva, M. Mass spectromerty-based quantitative proteomics of murine-derived polymorphonuclear neutrophils. Current Protocols in Immunology. , (2019).
- Geddes, J. M. H., et al. Secretome profiling of Cryptococcus neoformans reveals regulation of a subset of virulence-associated proteins and potential biomarkers by protein kinase A. BMC Microbiology. , (2015).
- Geddes, J. M. H., et al. Analysis of the protein kinase a-regulated proteome of Cryptococcus neoformans identifies a role for the ubiquitin-proteasome pathway in capsule formation. mBio. 7 (1), 1-15 (2016).
- Al Shweiki, M. H. D. R., et al. Assessment of Label-Free Quantification in Discovery Proteomics and Impact of Technological Factors and Natural Variability of Protein Abundance. Journal of Proteome Research. , (2017).
- Ong, S. E. Stable Isotope Labeling by Amino Acids in Cell Culture, SILAC, as a Simple and Accurate Approach to Expression Proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 1 (5), 376-386 (2002).
- Thompson, A., et al. Tandem mass tags: A novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS. Analytical Chemistry. 75 (8), 1895-1904 (2003).
- Borner, G. H. H. Organellar Maps Through Proteomic Profiling - A Conceptual Guide. Molecular & Cellular Proteomics. , (2020).
- Gingras, A. C., Abe, K. T., Raught, B. Getting to know the neighborhood: using proximity-dependent biotinylation to characterize protein complexes and map organelles. Current Opinion in Chemical Biology. , (2019).
- Kugadas, A., et al. Frontline Science: Employing enzymatic treatment options for management of ocular biofilm-based infections. Journal of Leukocyte Biology. , (2019).
- Yeung, J., Gadjeva, M., Geddes-McAlister, J. Label-Free Quantitative Proteomics Distinguishes General and Site-Specific Host Responses to Pseudomonas aeruginosa Infection at the Ocular Surface. Proteomics. , (2020).
- Yeung, J., Lamb, J., Krieger, J. R., Gadjeva, M., Geddes-McAlister, J. Quantitative Proteomic Profiling ofMurine Ocular Tissue and theExtracellular Environment. Current Protocols in Mouse Biology. 10 (83), (2020).
