Summary
Her præsenterer vi en protokol til at profilere samspillet mellem vært og patogen under infektion med massespektrometri-baserede proteomics. Denne protokol bruger etiketfri kvantificering til at måle ændringer i proteintæthed for både vært (f.eks. makrofager) og patogen (f.eks. Cryptococcus neoformans)i et enkelt eksperiment.
Abstract
De teknologiske resultater af massespektrometri (MS)-baserede kvantitative proteomics åbner mange uopdagede muligheder for at analysere en organismes globale proteom under forskellige forhold. Denne kraftfulde strategi, der anvendes til samspillet mellem mikrobielle patogener med den ønskede vært, karakteriserer udførligt begge perspektiver mod infektion. Heri beskriver arbejdsgangen etiketfri kvantificering (LFQ) af infectome af Cryptococcus neoformans, et svampefakultetativt intracellulært patogen, der er årsagsmidlet til den dødelige sygdom cryptococcosis, i nærværelse af udødeliggjorte makrofagceller. Protokollen indeholder nærmere oplysninger om de korrekte proteinforberedelsesteknikker for både patogen- og pattedyrsceller i et enkelt forsøg, hvilket resulterer i passende peptidindsendelse med henblik på væskekromatografi (LC)-MS/MS-analyse. Den høje gennemstrømning generiske karakter af LFQ giver et bredt dynamisk udvalg af protein identifikation og kvantificering, samt overførbarhed til enhver vært-patogen infektion indstilling, opretholde ekstrem følsomhed. Metoden er optimeret til at katalogisere omfattende, upartiske protein overflod profiler af et patogen inden for infektion-efterligne betingelser. Specifikt giver den metode, der demonstreres her, vigtige oplysninger om C. neoformans patogenese, såsom proteinproduktion, der er nødvendig for virulens og identificerer kritiske værtsproteiner, der reagerer på mikrobiel invasion.
Introduction
Forekomsten af invasive svampeinfektioner er stærkt stigende og er korreleret med uacceptabelt høje dødelighedsrater, oftest rapporteret hos personer med immundefekt prædispositioner1. Cryptococcus neoformans er et berygtet opportunistisk svampepatogen, der er i stand til intracellulær overlevelse inden for værts makrofagceller. Utilstrækkelig svampedræbende intervention resulterer i svampeformidling og livstruende manifestationer af cryptococcal meningitis og meningoencephalitis2,3. Den globale stigning i immunkompromitteret status har krævet en parallel stigning i brugen af svampemidler, hvor mange svampearter, herunder C. neoformans , i stigende grad har udviklet resistens over for4,5,6. Derfor er det bydende nødvendigt at implementere robuste og effektive teknologier til at besvare vitale biologiske spørgsmål vedrørende værtsforsvarsrespons og mikrobiel patogenese.
Den nye tidsalder med teknologiske fremskridt inden for massespektrometri (MS), herunder generering af kraftige beregningsmæssige og bioinformatiske rørledninger, danner grundlaget for en integrativ vision for storstilet analyse af værtspatogenforskning7,8. Konventionel patogenesedrevet proteomisk analyse profilerer almindeligvis infektionssynet fra enten værts- eller patogenperspektivet, herunder omfattende metoder såsom proteinkorrelationsprofilering, affinitetskromatografi kombineret med proteomik og interactomics9. Undersøgelser af virulens af farlige patogener i et værtssystem er af enorm klinisk betydning; Anvendelsen af en analyse med to perspektiver i et enkelt eksperiment blev imidlertid tidligere anset for uopnåelig. For eksempel er patogenets perspektiv mod infektion ofte overvældet af meget rigelige værtsproteiner, hvilket resulterer i reduceret følsomhed til påvisning af lav-rigelige svampeproteiner7. Desuden opfordrer den høje prøvekompleksitet mange mål til at undersøge i et enkelt forsøgssystem og viser sig at være en udfordring at belyse virkningsmekanismer for et specifikt patogenprotein.
Bottom-up proteomics er en populær MS-teknik, der muliggør håndterbar prøveforberedelse, hvor peptider genereres af sekvensspecifik enzymatisk fordøjelse efterfulgt af væskekromatografiadskillelse, identifikation og kvantificering af MS10,11. Her præsenterer vi en metode, der demonstrerer en dataafhængig anskaffelsesstrategi med det formål at opnå en upartisk dækning af en infektionsbaseret proteom eller 'infectome'. Specifikt, label-fri kvantificering (LFQ) kaster afhængighed af kemiske eller metaboliske etiketter for robust og præcis identifikation af protein niveau ændringer på tværs af flere proteomer, reducere prøve håndtering og forarbejdning trin12,13. Denne universelle applikation afhører producerede proteiner på et givet tidspunkt i en celle uafhængigt af enhver forventet proteinproduktion; således kan nye indsigter blive opdaget, der er afgørende for infektion.
Den arbejdsgang, der er beskrevet heri, er optimeret til at udforske ændringer i proteinniveauet i C. neoformans under infektions-efterlignende tilstande med værts immunceller (Figur 1). I stedet for at basere sig på isolering og adskillelse af celletyper udtrækker denne tilgang værts- og patogenproteomet sammen og anvender bioinformatatisk adskillelse ved hjælp af to organismespecifikke databaser til at skelne artsspecifik proteinproduktion. Denne metode giver fordele ved, at et ubegrænset antal prøver behandles uden de ekstra dyre forberedelsestrin, der er nødvendige i isotopbaserede mærkningsundersøgelser eller fraktionering. Desuden understøtter denne arbejdsgang optimerede proteinudvindingsprotokoller, der kan overføres til en bred vifte af svampe- og bakteriepatogener, der er i stand til at målrette og inficere værts immunceller. Samlet set skitserer denne protokol trinene til at fuldføre en upartisk proteinudvinding og prøvebehandling til ms i høj opløsning efterfulgt af data og statistisk analyse, der er i stand til at give et væld af viden om svampeproteiner, der er vigtige for infektion kombineret med omfattende profilering af værtsforsvarsresponset.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En udødeliggjort linje af makrofager afledt af BALB/c mus blev anvendt til følgende protokol godkendt af University of Guelph Animal Utilization Protocol 4193. Især kan andre stammer af mus eller andre kilder til udødeliggjorte celler anvendes på den skitserede protokol med tilstrækkelig testning til at optimere de detaljerede parametre. Følgende protokol navigerer i trinnene, der begynder med et frosset hætteglas med makrofagceller. Celler opbevares i 10% FBS (føtal kvæg serum), 1% L-glutamin og 5% Pen/ Strep (Penicillin-Streptomycin) blanding til DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) og 20% DMSO (dimethyl sulfoxide).
1. Dyrkning af C. neoformans
- Ved hjælp af en glycerol bestand, streak wildtype C. neoformans stamme (H99) på Gær-ekstrakt peptone dextrose (YPD) agar plade til at isolere enkelte kolonier.
- Inkuber natten over i 16 timer ved 37 °C i en statisk inkubator.
- Vælg en enkelt koloni af vildtype C. neoformans stamme og kultur i 5 mL YPD bouillon i et løst udjævnet 10 mL reagensglas. Udfør i firdobbelt.
- Inkuber natten over i 16 timer ved 37 °C i en rysteinkubator ved 200 omdrejninger i minuttet.
- Den følgende dag subkultur hver overnatning kultur i en 1:100 fortynding i 3 mL YPD bouillon.
- Mål optisk tæthed (OD600nm)værdier af svampekultur for at bestemme midten af logfasen. Afhængigt af spektrofotometeret når C. neoformans wildtype stamme mellem logfasen almindeligvis efter 6 til 8 timers inkubation i YPD med generelle OD600nm værdier fra 1,0 til 1,5.
- Når cellerne når midten af logfasen, skal du tage en 10 μL aliquot af svampecelleaffjedring i et rent 1,5 mL mikrocentrifugerør og fortynde 1:100 i steril 1x fosfat bufferet saltvand (PBS). Tæl antallet af celler ved hjælp af et hæmocytometer.
2. Dyrkning af makrofagceller
BEMÆRK: Sørg for, at arbejdsmiljøet steriliseres, inden cellekulturen fungerer.
- Forberedelse af cellekulturmedium
- Antibiotisk suppleret medium: Tilsæt 10% FBS (føtal kvæg serum), 1% L-glutamin og 5% Pen / Strep (Penicillin-Streptomycin) blanding til DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium). Filtermediet gennem et komplet filtersystem på 0,2 μm og opbevar ved 4 °C.
- Antibiotika-fri medium: Følg identiske protokol, men udelade Pen / Strep blanding.
- Såning af makrofagceller
BEMÆRK: Antibiotisk suppleret medium (2.1.1.) skal opvarmes til 37 °C før cellekulturarbejde.- Tø hurtigt hætteglas med makrofagceller op i 37 °C perlebad.
- Vask celler af fryseopløsning ved at genbruge cellerne i 1 ml antibiotisk suppleret medium.
BEMÆRK: Der kræves ekstra forsigtighed for at sikre, at cellerne ikke lyser på grund af hård pipettering. - Genanvendelige celler overføres til et sterilt 15 mL rør.
- Pellet celler ved centrifugering ved 400 × g i 5 min ved stuetemperatur.
- Fjern forsigtigt supernatant med en serologisk pipette eller vakuum aspirator.
- Forsigtigt resuspend pellet i 10 mL antibiotisk suppleret medium.
- Rørn forsigtigt resuspended celler i en 60 x 15 mm celle kulturbehandlet parabol.
- Inkuber skål ved 37 °C med 5% CO2 natten over.
- Indledende passage af makrofagceller
BEMÆRK: Frosne cellelagre vil typisk indeholde mellem 5 og 10 millioner celler pr. hætteglas (ca. 1 mL). På den efterfølgende dag vil makrofagceller, der har overlevet såningsprotokollen, klæbe til bunden af cellekulturretten og være klar til passaging.- Varmt antibiotisk suppleret medium (trin 2.1.1) til 37 °C før cellekulturarbejde. Sørg for, at arbejdsmiljøet steriliseres, inden cellekulturen fungerer. Visualiser celler ved hjælp af et lysmikroskop for at sikre, at cellerne klæbes og er sunde.
- Fjern cellekulturmediet fra skålen enten med en serologisk pipette eller en vakuumsuger.
- Tilsæt forsigtigt 5-7 mL steril rumtemperatur PBS (fosfat-buffered saltvand) til 60 x 15 mm skålen.
- Vip forsigtigt skålen for at vaske klæbede celler.
- Fjern PBS ved hjælp af en serologisk pipette eller vakuum aspirator.
- Der tilsættes 1 mL kold PBS (opbevaret ved 4 °C) til cellerne, vip skålen for at distribuere PBS over alle celler, og lad den sidde ved stuetemperatur i 1 min.
- Slip celler ved blidt at trykke på skålen, pipetter kold PBS mod cellerne, eller ved hjælp af en celle skraber.
- Tilsæt 9 mL antibiotisk suppleret medium til skålen.
- I en ny 60 x 15 mm skål tilsættes 9 mL frisk antibiotisk suppleret medium og 1 mL genbrugte celler fra den oprindelige skål.
- Når antallet af ønskede passagingplader er fyldt, kan genbrugte celler fra den originale skål kasseres.
- Inkuber den nye ret ved ovennævnte indstillinger (trin 2.2.8).
- Udfør efterfølgende passaging, når cellerne har nået 70-80% sammenløb (ca. hver 2. dag afhængigt af cellelinjen og det anvendte medium).
BEMÆRK: Makrofagceller skal passeres mindst fem gange før infektionsforsøg. Afhængigt af cellelinjen skal infektionsforsøg udføres med 25 til 30 passager. Efter 25 til 30 passager skal cellerne fryses eller kasseres. Afsnit 2.4 eller 2.5 kan vælges på grundlag af forsøgsplanerne. Punkt 2.4 vil blive anvendt i de følgende afsnit.
- Såning af makrofagceller før infektion
- Udfør protokoltrin 2.3.1 til 2.3.7.
- Hvis du bruger et hæmocytometer eller en automatiseret celletæller, bestemmes celletætheden (celler/mL).
- Overfør 0,3 x 106 makrofagceller til en enkelt brønd på en 6-brønds cellekulturplade.
- Det samlede volumen justeres til 1 mL ved hjælp af antibiotisk suppleret medium (trin 2.1.1).
- Gentag trin 2.4.3 og 2.4.4, indtil der er fyldt 8 brønde (4 brønde udfyldt to separate plader).
- Fyld eventuelt de resterende to brønde med 1 mL lufttemperatur PBS for at opretholde fugtniveauet under inkubationen.
- Lad cellerne vokse under inkubationsbetingelser, der er nævnt i trin 2.2.8, i 2 d før infektion.
- Såning af makrofagceller på infektionsdagen
- Udfør protokoltrin 2.3.1 til 2.3.7.
- Hvis du bruger et hæmocytometer eller en automatiseret celletæller, bestemmes celletætheden (celler/mL).
- Seed 1,2 x 106 makrofag celler i en enkelt brønd af en 6-brønd cellekultur plade.
- Det samlede volumen på 1 mL justeres med antibiotisk suppleret medium (2.1.1).
- Gentag 2.4.3 og 2.4.4, indtil der er fyldt 8 brønde (4 brønde udfyldt med to separate plader).
- Fyld eventuelt de resterende to brønde med 1 mL lufttemperatur PBS for at opretholde fugtniveauet under inkubationen.
- Inkuber celler under forhold, der er nævnt i trin 2.2.8 i 3 timer, så cellerne kan klæbe til brønde.
3. Infektion af makrofagceller med C. neoformans
BEMÆRK: Når du når 70-80% sammenløb, vil der være ca. 1,2 x 106 makrofagceller pr. brønd. For at opnå den ønskede mangfoldighed af infektion (MOI) på 100:1 kræves 1,2 x 108 svampeceller for hver reaktion. Kulturer skal indstilles i overensstemmelse hermed i biologisk quadruplicate.
DISCLAIMER: En MOI på 100:1 har opnået ønskelige resultater i vores forskningsgruppe og er ment som et forslag til læserne. En lavere MOI kan være påkrævet for mere smitsomme C. neoformans stammer eller for mindre modstandsdygtige makrofag cellelinjer. Verifikation af infektion (afsnit 3.5) kan bruges til at bestemme den ideelle MOI til bestemte C. neoformans – makrofagkombinationer.
- Forberedelse af svampeceller
- Følg trin 1 for vækst af C. neoformans til midten af log fase.
- Opsamles og centrifuge celler på 1.500 x g i 10 min, forsigtigt vaske pellet med steril stuetemperatur PBS, og gentag for i alt tre vasker.
- Resuspendceller i antibiotikafri cellekulturmedium (trin 2.1.2) for at opnå en koncentration på 1,2 x 108 celler/mL.
- Forberedelse af makrofagceller
- Visualiser hver brønd i 6-brøndspladen for at sikre, at cellerne har nået 70-80% sammenløb. Alternativt kan celler måles for at opnå ca. 1,2 x 106 makrofagceller pr. brønd.
- Følg trin 2.3.1 til 2.3.4.
- Co-kultur af C. neoformans og makrofag celler
- Der tilsættes 1 mL af de genanvendelige C. neoformans celler (trin 3.1.3) til 4 brønde, der indeholder makrofagceller tilberedt i punkt 3.2.
BEMÆRK: Det krævede antal plader skal beregnes, før eksperimentet påbegyndes. Der tilsættes 1 mL antibiotikafrit medium (trin 2.1.2) til tomme brønde. - Tillad celler at inkubere under de anførte betingelser (trin 2.2.8) i 3 timer.
- Fjern cellekulturmediet fra pladen enten med en serologisk pipette eller en vakuumsuger.
- Tilsæt forsigtigt 1 mL steril rumtemperatur PBS.
- Vip forsigtigt pladen for at vaske ikke-vedhæftede eller ikke-phagocytoserede ekstracellulære C. neoformans celler.
- Fjern PBS ved hjælp af en serologisk pipette eller vakuum aspirator, gentag for i alt tre vasker. Gentag 3.3.4 til 3.3.5 to gange mere.
- Der tilsættes 1 mL af de genanvendelige C. neoformans celler (trin 3.1.3) til 4 brønde, der indeholder makrofagceller tilberedt i punkt 3.2.
- Makrofager, der ikke er inficeret
- Ligeledes skal du bruge 4 brønde af en 6 godt plade til at tjene fungere som makrofag-only prøver. Der tilsættes 1 mL antibiotikafrit medium (trin 2.1.2) til disse brønde.
- Gentag trin 3.3.2 til 3.3.6.
- Kontrol af infektion
BEMÆRK: Ved hjælp af en cytotoksicitetsanalyse kan infektionsfærdigheder måles. Følgende protokol vil fremhæve anvendelsen af et cytotoksicitetsprodukt til måling af LDH-frigivelse (lactatdehydrogenase). Andre cytotoksicitetsprodukter kan også anvendes.- Forberedelse af C. neoformans infektion af makrofagceller
- Gentager trin 1, 2 og 3 (op til 3,5). LDH-analysen kan udføres i tre eksemplarer, hvis det foretrækkes.
- Efter trin 3.3.6 tilsættes 1 mL antibiotikafrit medium (2.1.2) til hver brønd i 6-brøndspladen.
- Gentag trin 2.4.3 og 2.4.4, indtil 3 brønde plus 3n brønde er blevet fyldt (hvor n er antallet af målte tidspoint).
- Inkuber celler under de betingelser, der er angivet i trin 2.2.8.
- På udvalgte tidspunkter (f.eks. indsamles 1, 3, 6, 12 og 24 timer) supernatant til måling af LDH-frigivelse i henhold til producentens anvisninger
- Samtidig lyser uinficerede makrofagceller til bestemt værdi for maksimal cytotoksicitet.
- Cytotoksiciteten beregnes på følgende måde:
- Forberedelse af C. neoformans infektion af makrofagceller
4. Prøveindsamling
- Co-kultur og uinficeret makrofagsamling
- Der tilsættes 1 mL kold PBS til cellerne (fra 3.3.6 og 3.4.2) og lad den sidde ved stuetemperatur i 1 min.
- Slip celler fra pladen ved skånsomt at trykke på pladen eller blid pipering kold PBS mod cellerne.
BEMÆRK: Celleskraber bør undgås, da dette kan forårsage lysis af celler. - Pipetter opbrugte celler i et 15 mL rør.
- Centrifuge celler ved 400 x g i 5 min ved stuetemperatur, og fjern supernatanten.
- Celler (som beskrevet i trin 5) straks eller flash frosset i flydende nitrogen og opbevares ved -80 °C til senere behandling.
5. Cellulær proteom
BEMÆRK: Tilstrækkelig lysis skal optimeres til den analyserede celletype (dvs. mængden af cyklusser og amplituder afhænger af cellepillestørrelse og effektprocenten af sondesonotypemodellen).
- Inficeret makrofagcelle lysis
- Resuspend pelleterede celler (trin 4.1.5) i 300 μL på 100 mM Tris-HCl (pH 8.5) bestående af en frisk opløst proteasehæmmercocktailtablet.
BEMÆRK: En protease-hæmmercocktailtablet tilsættes til 10 mL iskold 100 mM Tris-HCl (pH 8.5), inden eksperimentet påbegyndes. - Probe sonicate celler i et isbad i 15 cyklusser af 30 s på og 30 s off, at lyse cellerne.
- Centrifuge celler kort for 30 s ved 400 x g, omhyggelig med ikke at danne en pellet, bare for at fjerne væske på siderne af rør efterfulgt af overførsel af prøve til en 2 mL Lo-binde mikrocentrifuge rør.
- Tilføj 1:10 volumen på 20% SDS til en endelig koncentration på 2%.
- Der tilsættes 1:100 volumen på 1 M dithiothreitol (DTT) til en endelig koncentration på 10 mM og blandes prøven grundigt ved pipetter, efterfulgt af inkubation på en termisk varmeblok ved 95 °C i 10 minutter ved 800 rpm agitation. Dernæst afkøles til stuetemperatur (afkøling kan ske på is).
- Der tilsættes 1:10 volumen på 0,55 M iodoacetamid (IAS) for at opnå en endelig koncentration på 55 mM og blande prøven grundigt ved pipettering. Inkuber ved stuetemperatur i mørke i 20 minutter.
- Tilsæt 100% acetone for at opnå en endelig koncentration på 80% acetone og opbevar prøve natten over ved -20 °C for at udfælde proteiner.
- Resuspend pelleterede celler (trin 4.1.5) i 300 μL på 100 mM Tris-HCl (pH 8.5) bestående af en frisk opløst proteasehæmmercocktailtablet.
- Fordøjelse af proteiner
- Den næste dag opsamles bundfaldspellet ved centrifugering i 10 min ved 10.000 x g og 4 °C. Supernatant kasseres og vaskes pellet med 500 μL på 80% acetone. Gentag for i alt to vaske. Lufttørre pellet ved stuetemperatur efter vask.
- Resolubilisere protein pellet i 100 μL af 8 M urinstof/40 mM HEPES, for at sikre fuldstændig opløselighed, vortex eller sonikat i et isvandsbad i 15 cyklusser på 30 s til og 30 s off.
BEMÆRK: Justeringen af mængden af urinstof/HEPES bestemmes på størrelse med udfældet cellepellet, hvis der sker ændringer, skal alle nedstrømsmængder justeres korrekt. - Kvantificere proteinkoncentrationen ved hjælp af en proteinanalyse (f.eks. BCA-proteinanalyse) i henhold til producentens anvisninger og justere for baggrundsmåling ved blank normalisering med 8 M urea/40 mM HEPES.
- Der tilsættes 300 μL på 50 mM ammoniumbicarbonat for at opnå en endelig koncentration på 2 M urinstof.
BEMÆRK: Mulighed for at normalisere proteinkoncentrationen ved nedstrømsmålinger, foreslog at fordøje 100 μg protein og opbevare den resterende ufordøjede prøve ved flashfrysning i flydende nitrogen og derefter opbevare ved -20 °C på kort sigt eller ved -80 °C på længere sigt. - Tilsæt 2:50 (v/w) enzym-til-protein-forhold mellem trypsin/Lys-C proteaseblanding på is og bank forsigtigt på røret for at blande, inkuber natten over ved stuetemperatur.
- Efter inkubationen standses fordøjelsen ved at tilsætte 1:10 volumenstopopløsning (20% acetonistril, 6% trifluoreddikesyre) og centrifugeprøver ved 10.000 x g i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Saml supernatant (består af fordøjede peptider) og kassér eventuelle pelleted snavs eller bundfald.
- Peptid afsaltning
- Der aktiveres en C18 Stop And Go Extraction (STAGE) spids (bestående af 3 lag C18 harpiks i en 200 μL pipettespids) ved at tilsætte 100 μL 100% acetonitrile og centrifuge ved 1.000 x g i 2 min.
- C18 STAGE-spidsen afbalanceres ved tilsætning af 50 μL buffer B (80% (v/v) acetonistril, 0,5% (v/v) eddikesyre) og centrifuge ved 1.000 x g i 2 min.
- C18 STAGE-spidsen udslibes ved at tilsætte 200 μL buffer A (2% (v/v) acetonitrile, 0,1% (v/v) trifluoreddikesyre, 0,5% (v/v) eddikesyre) og centrifuge ved 1.000 x g i 3-5 min.
- Der tilsættes ~50 μg fordøjet prøve på C18 STAGE-spids og centrifuge ved 1.000 x g i 3-5 min., eller indtil prøven har passeret spinkolonnen. Flash fryse den resterende fordøjet prøve i flydende nitrogen og opbevares ved -20 ° C, indtil det er nødvendigt.
- C18 STAGE spidsen vaskes med 200 μL buffer A og centrifuge ved 1.000 x g i 3-5 min.
- Der tilsættes 50 μL buffer B til C18 STAGE spidsen og centrifuge ved 500 x g i 2 min. Der opsamles eluterede peptider i 0,2 mL PCR-rør.
- Tør de eluttificerede peptider i en vakuumcentrifuge i 30-40 minutter ved maksimal hastighed. Helt tørrede prøver kan opbevares ved stuetemperatur eller ved -20 °C, indtil de forarbejdes.
BEMÆRK: Tørrede og afsaltede peptider er passende prøveindlæg til massespektrometrianlæg til forarbejdning og kan sendes ved omgivelsestemperatur.
6. Massespektrometri
- Rekonstituer peptider i 10 μL Buffer A og mål koncentration, der er nødvendig for at injicere ~1,5 til 3 μg peptider på MS-kolonnen. Mængden af prøven vil afhænge af instrumentering.
- Brug en forudbestemt gradient af acetonitrile (ca. 5-60%) i 0,5% eddikesyre over en ønsket tid (f.eks. 2 h) for at adskille peptider ved højtydende væskekromatografi efterfulgt af elektrosprayionisering i massespektrometeret.
- Anskaf MS-scanninger ved hjælp af et massespektrometer med høj opløsning i dataafhængig anskaffelsestilstand (m/z 300 til 1650).
BEMÆRK: Gradueringsprocent og -længde bestemmes af eksperimentet og brugeren. Præcise indstillinger for massespektrometer afhænger af instrumentering, eksperiment og brugerpræference.
7. Dataanalyse
BEMÆRK: MS-data kan behandles med en lang række bioinformatikrørledninger. I denne protokol beskriver vi behandling ved hjælp af de offentligt tilgængelige MaxQuant- og Perseus-platforme, men anbefaler individuelle brugere at evaluere bioinformatiske værktøjer, der passer til analyse, præference og brug.
- Indlæs ubehandlede datafiler (direkte fra MS-instrumentet) ved hjælp af MaxQuant-softwaren. Identificer proteiner under de ændrede MaxQuant-søgeparametre. mindst to unikke peptider, der er nødvendige for proteinidentifikation ved hjælp af en målafledningsmetode for en falsk opdagelseshastighed på 1%, implementerer etiketfri kvantificering med matchning mellem kørsler, inkorporerer organismerne FASTA-fil opnået fra UniProt-databasen (dvs. Cryptococcus neoformans H99, Mus musculus) for at identificere og kvantificere nuværende peptider med Andromeda-søgemaskinen. Se de offentlige MaxQuant-onlineværktøjer for at få detaljerede selvstudier (se Materialeoversigt).
- Overfør MaxQuant-outputfilen ('proteingrupper.txt') til Perseus.
- Filtrer rækker, der indeholder potentielle falske positiver og forurenende stoffer, samt kun modificeret ved stedpeptider med 'Filterrækkerne baseret på kategorisk kolonne'.
- Transformer dataværdier på log2-skala.
- Opret datasætgrupper ved at give kategorisk anmærkning til rækkerne.
- Filtrer datasæt efter gyldige værdier for at definere en cut-off for proteindetektering.
BEMÆRK: For en streng og robust analyse foreslås en identifikationsgrad på >50%. Hvis der f.eks. blev behandlet fire replikater, vælges et minimumantal på tre gyldige værdier. - Hvis det foretrækkes, skal du imputere data ved at erstatte manglende værdier fra normalfordelingen.
BEMÆRK: Imputerede værdier optimeres baseret på normal fordeling og giver en tilfældig LFQ-intensitet til at erstatte 'NaN'-pladsholdere for at simulere typiske overflodsmålinger. Denne imputation giver en platform for downstream statistisk analyse, der kræver kvantificerbare data. - Tilføj anmærkninger til proteinrækkerne (f.eks. proteinnavne, Gene Ontology-termer).
BEMÆRK: Denne Perseus-arbejdsgang, der genereres, er nu en robust ramme for yderligere bioinformatatisk behandling, statistisk analyse og datavisualisering, se offentlige Perseus onlineværktøjer for detaljerede tutorials (se Materialetabel).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den ovenfor skitserede protokol gør det muligt at identificere og kvantificere proteiner, der stammer fra både svampepatogenet C. neoformans, og værten, makrofagceller, i et enkelt eksperiment. Efter co-kultur indsamles og forarbejdes celler sammen og bioinformatisk adskilt baseret på peptidprofiler, der er specifikke for hver art. Dette er en kraftfuld tilgang til at definere samspillet mellem værtspatogenforholdet under infektion. Antallet af proteiner, der identificeres fra eksperimentet, afhænger af udgangsmaterialet, prøveforberedelsen, gradientlængden, MS-instrumentering og den bioinformatiske arbejdsgang. Ved hjælp af den heri beskrevne protokol identificerer vi typisk ca. 8.000 proteiner fra eksperimentet med 1.500 C. neoformanproteiner og 6.500 værtsproteiner. Efter behandling af datasættene genererer vi et hovedkomponentanalyseområde (PCA) for at observere kritiske faktorer, der driver vores analyse (Figur 2A). Her observerer vi, at den største komponent i adskillelsen mellem dataene er inficeret vs. ikke-inficerede prøver, som vi ville forvente af det eksperimentelle design (komponent 1, 79,8%), og et andet kendetegn ved prøverne er biologisk variation (komponent 2, 5,7%). Dernæst grupperer en Pearson-korrelation kombineret med hierarkisk klyngedannelse ved euklidisk afstand prøverne og muliggør kvantificering af variabiliteten blandt replikaterne (Figur 2B). I vores analyse observerede vi tydelig klyngedannelse af inficerede vs. ikke-inficerede prøver og replikere reproducerbarhed fra 95-96%, hvilket repræsenterer god reproducerbarhed blandt replikaterne. Endelig udfører vi en Student's t-testkorrigeret for flere hypotese test ved hjælp af en Benjamini-Hochberg falsk opdagelse sats (FDR) (p-værdi ≤ 0,05; FDR = 0,01; s0 = 1) for at identificere proteiner med betydelige forskelle i forekomst under infektion sammenlignet med ikke-inficerede kontroller (Figur 2C). Her identificerer vi 760 proteiner med betydelige ændringer i overflod, herunder 117 værtsproteiner med 86, der viser et betydeligt fald og 31 viser en betydelig stigning ved infektion. Især observerer vi også betydelige stigninger i overflod af svampeproteiner, som forventet under infektion. Med disse data udføres efterfølgende analyser, herunder netværkskortlægning, i silicokarakterisering og opfølgende eksperimenter for at validere dataene og udforske de molekylære mekanismer, der understøtter værtsresponset på virulens.
Figur 1: Massespektrometri-baserede proteomics workflow til analyse af makrofager inficeret med C. neoformans. Arbejdsprocessen begynder med en samling makrofager, der enten er inficeret med C. neoformans eller ikke-inficerede kontrolelementer. Proteiner udvindes af mekaniske og kemiske forstyrrelser, efterfulgt af reduktion og alkylering, acetoneudfældning og enzymatisk fordøjelse. Peptider renses på C18 STAGE-spidser, adskilt af højtydende væskekromatografi, udsættes for elektrosprayionisering og måles på et massespektrometer med høj opløsning. Data behandles, analyseres og visualiseres i de offentligt tilgængelige bioinformatikplatforme, MaxQuant (med Andromeda) og Perseus14,15,16. Forsøg udført i biologisk firdoblet. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Repræsentative data for C. neoformans infektion i makrofagceller. (A) Hovedkomponentanalysen viser, at der skelnes mellem inficeret vs. ikke-inficeret makrofag (komponent 1, 79,8%) og klyngedannelse af biologiske replikater (komponent 2, 5,7%). (B) Varmekort over Pearson korrelation afbildet af hierarkisk klyngedannelse ved euklidisk afstand for at vise klyngedannelse af prøver (inficeret vs. ikke-inficeret) og replikere reproducerbarhed (>95%). (C)Vulkanplot af identificerede proteiner. Blå = svampeproteiner med betydelig ændring i overflod; sort = makrofagproteiner med betydelige ændringer i overflod. Student's t-test(p-værdi ≤ 0,05), FDR = 0,01; s0 = 1. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritiske trin i protokollen omfatter forberedelse af makrofagceller og indsamling af co-kulturprøver til proteinbehandling med minimal forstyrrelse af cellerne. Det er vigtigt at udføre trin til vask, podning og fjernelse af vedhængende makrofagceller forsigtigt og omhyggeligt for at forhindre unødvendig lysis af celler før indsamling. Det er også afgørende at fastslå den korrekte MOI til forsøget, da podning med et for højt MOI kan forårsage hurtig makrofagcelledød og vanskeligheder med at indsamle og behandle prøver til MS. Omvendt vil lave MOI-numre føre til færre phagocytoserede svampeceller og begrænset påvisning af svampeproteiner i det biologiske system. For at overvinde sådanne begrænsninger anbefaler vi, at du udfører testforsøg med forskellige MOI'er, understøttet af celledødsanalyser (f.eks. LDH-kvantificering) for at definere antallet af svampeceller, der starter et værtsrespons, men ikke dræber værtscellerne før indsamlingen. Til forsøgene sigter vi mod at identificere infektionsrelaterede svampeproteiner, der kræver en høj MOI (100:1) for tilstrækkeligt at opdage svampeproteiner blandt meget rigelige værtsproteiner. Vi udfører rutinemæssigt makrofagcytotoksicitetsanalyser for at vurdere MOI's indvirkning på værtscelledøden, før vi udfører hele eksperimentet. Timing af inkubation af C. neoformans celler med makrofager er også afgørende, da svampecellerne kan besidde store polysaccharider kapsler og derfor makrofag kræver mere tid til opslugning. Vi vælger at bruge en co-kultur inkubationstid på 3 timer til det skitserede eksperiment, da vi fandt god dækning af svampeproteomet på dette tidspunkt og for at give et 'snap-shot' af værtsrespons; Forskere kan dog ønske at udforske tidligere og senere tidspunkter og observere, hvordan timing påvirker svampe- og værtsproteinproduktionen. Alternativt, priming makrofaget for opsonisering er blevet udført for at hjælpe den fagocytiske proces17,18.
Ved prøveopsamling vil flashfrysning i flydende nitrogen hjælpe med at forhindre uønsket nedbrydning af proteiner ved hjælp af proteaser i prøverne, hvis prøverne ikke behandles med det samme. For MS-baserede proteomicanalyser bør risikoen for kontaminering fra støv eller keratin (f.eks. hud- og hårceller) begrænses ved brug af nitrilhandsker, laboratoriefrakker og vask af alle overflader med 70 % ethanol, inden eksperimenter påbegyndes. Desuden er de protokoller, der er skitseret ovenfor, specifikke for det beskrevne medkulturprøvesæt , men kan ændres til optimering af proteinudvindingsarbejdsgangen efter behov19,20. Mulighederne for at ændre arbejdsgangen og optimere til specifikke celletyper omfatter de valgte mekaniske og kemiske disruptionteknikker, varighed og temperatur af enzymatisk fordøjelse og adskillelse af prøverne. For eksempel er lysis af C. neoformans celler typisk udføres ved mekanisk perle slå; vi har dog observeret øget proteomdækning efter sonde sonikering og anbefaler det derfor til mekanisk forstyrrelse af de inficerede celler19,21,22. For eksempel kan fraktionering af peptidprøver i aliquots ved høj pH-fraktionering eller størrelsesudelukkelseskromatografi reducere prøvekompleksiteten og forbedre dækningsdybden på massespektrometeret9. For at opnå dybdedækning for at identificere ca. 8.000 værts- og svampeproteiner kræves der desuden et massespektrometrisystem med høj opløsning (f.eks. QExactive Exploris, Fusion Lumos, timsTOF Pro).
Anvendelsen af LFQ til kvantificering af ændringer i proteinniveauer under infektion er en pålidelig og omkostningseffektiv tilgang til MS-baserede proteomics12. Det gør det muligt at kvantificere proteiner ved relativ overflod uden behov for yderligere prøvebehandlingstrin. Desuden udføres analysen efter forsøgets afslutning og udlåner sig til universelle applikationer og et fleksibelt studiedesign. Begrænsningerne i LFQ omfatter imidlertid øget instrumenteringstid, da prøver skal køres sekventielt og ikke kan kombineres, sammenlignelighed mellem prøver kan være udfordrende, og behovet for imputation til erstatning af manglende værdier kan være højt23. Alternative metoder til kvantificering af proteintæthed omfatter metaboliske (f.eks. stabil isotopmærkning af aminosyrer i cellekultur) og kemiske (f.eks. tandemmassemærker) mærkningsteknikker, som gør det muligt at kombinere prøver for at reducere instrumenttiden, give pålidelig sammenlignelighed mellem prøverne og almindeligvis føre til mindre manglende værdier24,25. Sådanne tilgange kræver dog yderligere prøvehåndterings- og behandlingstrin, øget kompleksitet og tid i vådlaboratoriets eksperiment samt krav om et fast eksperimentelt design. For at vælge en kvantificeringsmetode, der er optimal til foreslåede eksperimenter, bør brugerne overveje at undersøge design og sammenlignelighed af prøver, kompleksitet i vådlaboratoriet og dataanalyse samt instrumenteringstid og omkostninger.
Nyheden i den præsenterede protokol er evnen til at definere ændringer i proteomet fra både værts- og patogenperspektiverne i et enkelt eksperiment. Dybden af dækningen af begge proteomer giver ny indsigt i, hvordan patogenet indleder infektion, og hvordan værten reagerer i forsvaret. Især fokuserer tilgangen på infektion i hele cellen; Der er dog mulighed for at definere subproteomer eller opdelte infektionsresponser gennem kombination med rumlige lokaliseringsteknikker (f.eks. centrifugering, berigelse, mærkning)26,27. Her beskriver vi samspillet mellem makrofager og svampepatogenet, C. neoformans; Tilgangen er imidlertid universel og kan anvendes på interaktioner mellem en bred vifte af biologiske systemer. For eksempel har vi for nylig brugt en lignende arbejdsgang til at afdække generelle og stedsspecifikke reaktioner af neutrofiler afledt af en murinmodel af okulær keratitis28,29,30. Desuden kan de infectomedatasæt, der genereres fra denne protokol, integreres med in vitro-proteom og sekretomprofilering af et patogen for at detektere proteiner med ændret overflod i nærværelse af værtsceller. Sådanne proteiner, der omtales som infektionsrelaterede proteiner, giver et væld af kendte og nye virulensfaktorer for yderligere karakterisering, herunder tidsmæssig regulering, lokalisering og direkte proteinproteininteraktioner med værten. Samlet set giver den skitserede MS-baserede proteomics-arbejdsgang en ny mulighed for at undersøge det indviklede forhold mellem vært og patogen i et enkelt eksperiment med universalitet og forståelse, der ikke er almindeligt tilgængelig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Forfatterne takker Dr. Jonathan Krieger fra Bioinformatics Solutions Inc. for at drive massespektrometeret for repræsentative eksperimenter samt medlemmer af Geddes-McAlister-gruppen for deres hjælp med eksperimentel opsætning og manuskriptfeedback. Forfatterne anerkender delvist støtte til fra Banting Research Foundation - The Jarislowsky Fellowship Discovery Award, New Frontiers Research Fund - Exploration (NFRFE-2019-00425) og Canadian Foundation for Innovation (JELF 38798) for J.G.M., samt NSERC Canada Graduate Scholarship - Masters and Ontario Graduate Scholarship for B.B., og Queen Elizabeth II Graduate Scholarship in Science and Technology for A.S..
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mM Tris-HCl, pH 8.5 | Fisher Scientific | BP152-1 | Maintain at 4°C |
| 60 x 15 mm Dish, Nunclon Delta | ThermoFisher Scientific | 174888 | |
| 6-well cell culture plate | ThermoFisher Scientific | 140675 | |
| Acetonitrile, MS grade | Pierce | TS-51101 | |
| Acetic Acid | Sigma Aldrich | 1099510001 | |
| Acetone | Sigma Aldrich | 34850-1L | |
| Ammonium bicarbonate (ABC) | ThermoFisher Scientific | A643-500 | Prepare a stock 50 mM ABC solution, stable at room temperature for up to one month. |
| Bel-Art™ HiFlow Vacuum Aspirator Collection System | Fisher Scientific | 13-717-300 | Not essential, serological pipettes can be used to remove media. |
| C18 resin | 3M Empore | 3M2215 | |
| Cell Scrapers | VWR | 10062-906 | Not essential, other methods to release macrophage cells can be used. |
| Centrifugal vaccuum concentrator | Eppendorf | 07-748-15 | |
| Complete Filtration Unit | VWR | 10040-436 | |
| Conical falcon tubes (15 mL) | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
| Countess II Automated Cell Counter | ThermoFisher Scientific | AMQAX1000 | Not essential, haemocytometer can be used as an alternative. |
| CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay | Promega | G1780 | |
| Dithiothreitol (DTT) | ThermoFisher Scientific | R0861 | Prepare bulk stock solution of 1 M DTT, flash frozen and stored at -20 °C until use. Discard after each use (do not freeze-thaw repeatedly). |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement | ThermoFisher Scientific | 10566016 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher Scientific | 12483020 | Heat inactivate by incubating at 60°C for 30 minutes. Prepare 50 ml aliquots and flash freeze. Thaw prior to media preparation |
| Haemocytometer | VWR | 15170-208 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | Prepare 40 mM HEPES/8 M Urea in bulk stock solution, flash frozen, store at -20°C until use. Discard after each use (do not freeze-thaw repeatedly). |
| High-performance liquid chromatography system | ThermoFisher Scientific | LC140 | Gradient length is based on sample complexity, recommended 120 min gradient for infectome samples. |
| High-resolution mass spectrometer | ThermoFisher Scientific | 726042 | |
| Iodoacetamide (IAA) | Sigma Aldrich | I6125 | Prepare 0.55 M bulk stock solution, flash frozen, store at -20°C until use. Discard after each use (do not freeze-thaw repeatedly). |
| L-glutamine | ThermoFisher Scientific | 25030081 | Can be aliquot and frozen for storage. Thaw prior to media preparation. |
| LoBind Microcentrifuge tubes | Eppendorf | 13-698-794 | |
| MaxQuant | https://maxquant.org/ | MaxQuant is a public platform that offers tutorials, such as the MaxQuant Summer School, outlining the computational analysis steps of large MS data sets | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 13864457 | |
| Penicillin : Streptomycin 10k/10k | VWR | CA12001-692 | Can be aliquot and frozen for storage. Thaw prior to media preparation. |
| Peptide separation columns | ThermoFisher Scientific | ES803 | |
| Perseus Software | http://maxquant.net/perseus/ | ||
| Phosphate Buffered Saline | VWR | CA12001-676 | Puchase not required. PBS can also be prepared but sterile filteration must be performed before use. |
| Pierce BCA Protein Assay | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
| Pipette, Disposable Serological (10 mL) | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
| Pipette, Disposable Serological (25 mL) Basix | Fisher Scientific | 14955235 | |
| Probe sonciator | ThermoFisher Scientific | 100-132-894 | |
| Protease inhibitor cocktail tablet | Roche | 4693159001 | |
| Sodium dodecyl sulfate | ThermoFisher Scientific | 28364 | 20% (w/v) |
| Spectrophotometer (Nanodrop) | ThermoFisher Scientific | ND-2000 | |
| STAGE tipping centrifuge | Sonation | STC-V2 | |
| Thermal Shaker | VWR | NO89232-908 | |
| Trifluoroacetic acid | ThermoFisher Scientific | 85183 | |
| Trypsin/Lys-C protease mix, MS grade | Pierce | A40007 | Maintain at -20 °C. |
| Ultrasonic bath | Bransonic | A89375-450 | Stored in cold room (4C) |
| Urea | Sigma Aldrich | U1250-1KG | Prepare 40 mM HEPES/8 M Urea in bulk stock solution, flash frozen, store at -20 °C until use. Discard after each use (do not freeze-thaw repeatedly). |
| Yeast-extract peptone dextrose broth | BD Difco | BM20 |
References
- Bongomin, F., Gago, S., Oladele, R., Denning, D. Global and Multi-National Prevalence of Fungal Diseases-Estimate Precision. Journal of Fungi. , (2017).
- Tugume, L., et al. HIV-Associated cryptococcal meningitis occurring at relatively higher CD4 counts. Journal of Infectious Diseases. 219 (6), 877-883 (2019).
- Rajasingham, R., et al. Global burden of disease of HIV-associated cryptococcal meningitis: an updated analysis. The Lancet Infectious Diseases. , (2017).
- Perfect, J. R. The antifungal pipeline: A reality check. Nature Reviews Drug Discovery. , (2017).
- Bermas, A., Geddes-McAlister, J. Combatting the evolution of anti-fungal resistance in Cryptococcus neoformans. Molecular Microbiology. , 1-14 (2020).
- Geddes-McAlister, J., Shapiro, R. S. New pathogens, new tricks: Emerging, drug-resistant fungal pathogens and future prospects for antifungal therapeutics. Annals of the New York Academy of Sciences. , (2018).
- Ball, B., Bermas, A., Carruthers-Lay, D., Geddes-McAlister, J. Mass Spectrometry-Based Proteomics of Fungal Pathogenesis, Host-Fungal Interactions, and Antifungal Development. Journal of Fungi. , (2019).
- Sukumaran, A., et al. Decoding communication patterns of the innate immune system by quantitative proteomics. J Leukocyte Biol. , (2019).
- Salas, D., Stacey, R. G., Akinlaja, M., Foster, L. J. Next-generation interactomics: Considerations for the use of co-elution to measure protein interaction networks. Molecular and Cellular Proteomics. , (2020).
- Aebersold, R., Mann, M. Mass-spectrometric exploration of proteome structure and function. Nature. 537 (7620), 347-355 (2016).
- Mann, M., Kulak, N. A., Nagaraj, N., Cox, J. The Coming Age of Complete, Accurate, and Ubiquitous Proteomes. Molecular Cell. 49 (4), 583-590 (2013).
- Cox, J., et al. Accurate Proteome-wide Label-free Quantification by Delayed Normalization and Maximal Peptide Ratio Extraction, Termed MaxLFQ. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (9), 2513-2526 (2014).
- Ankney, J. A., Muneer, A., Chen, X. Relative and Absolute Quantitation in Mass Spectrometry-Based Proteomics. Annual Review of Analytical Chemistry. , (2018).
- Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).
- Tyanova, S., et al. The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data. Nature Methods. 13 (9), 731-740 (2016).
- Cox, J., et al. Andromeda: A peptide search engine integrated into the MaxQuant environment. Journal of Proteome Research. , (2011).
- Zhong, Z., Pirofski, L. A. Opsonization of Cryptococcus neoformans by human anticryptococcal glucuronoxylomannan antibodies. Infection and Immunity. , (1996).
- Nicola, A. M., et al. Macrophage autophagy in immunity to Cryptococcus neoformans and Candida albicans. Infection and Immunity. , (2012).
- Ball, B., Geddes-McAlister, J. Quantitative Proteomic Profiling of Cryptococcus neoformans. Current Protocols in Microbiology. , (2019).
- Geddes-McAlister, J., Gadjeva, M. Mass spectromerty-based quantitative proteomics of murine-derived polymorphonuclear neutrophils. Current Protocols in Immunology. , (2019).
- Geddes, J. M. H., et al. Secretome profiling of Cryptococcus neoformans reveals regulation of a subset of virulence-associated proteins and potential biomarkers by protein kinase A. BMC Microbiology. , (2015).
- Geddes, J. M. H., et al. Analysis of the protein kinase a-regulated proteome of Cryptococcus neoformans identifies a role for the ubiquitin-proteasome pathway in capsule formation. mBio. 7 (1), 1-15 (2016).
- Al Shweiki, M. H. D. R., et al. Assessment of Label-Free Quantification in Discovery Proteomics and Impact of Technological Factors and Natural Variability of Protein Abundance. Journal of Proteome Research. , (2017).
- Ong, S. E. Stable Isotope Labeling by Amino Acids in Cell Culture, SILAC, as a Simple and Accurate Approach to Expression Proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 1 (5), 376-386 (2002).
- Thompson, A., et al. Tandem mass tags: A novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS. Analytical Chemistry. 75 (8), 1895-1904 (2003).
- Borner, G. H. H. Organellar Maps Through Proteomic Profiling - A Conceptual Guide. Molecular & Cellular Proteomics. , (2020).
- Gingras, A. C., Abe, K. T., Raught, B. Getting to know the neighborhood: using proximity-dependent biotinylation to characterize protein complexes and map organelles. Current Opinion in Chemical Biology. , (2019).
- Kugadas, A., et al. Frontline Science: Employing enzymatic treatment options for management of ocular biofilm-based infections. Journal of Leukocyte Biology. , (2019).
- Yeung, J., Gadjeva, M., Geddes-McAlister, J. Label-Free Quantitative Proteomics Distinguishes General and Site-Specific Host Responses to Pseudomonas aeruginosa Infection at the Ocular Surface. Proteomics. , (2020).
- Yeung, J., Lamb, J., Krieger, J. R., Gadjeva, M., Geddes-McAlister, J. Quantitative Proteomic Profiling ofMurine Ocular Tissue and theExtracellular Environment. Current Protocols in Mouse Biology. 10 (83), (2020).
